基于指纹图谱的水产品掺假检测方法及系统 技术领域 本发明涉及食品检测技术领域， 特别涉及一种基于指纹图谱的水产品掺假检测方 法及系统。
背景技术 我国是水产大国， 渔业产量已多年位居世界第一位， 水产品的出口也是世界第一 位。但是我国在水产品的生产加工中也存在着很多问题， 由于水产品加工企业的疏忽甚至 是故意行为导致的水产品掺假问题， 威胁着消费者的生命安全。
目前， 中国食品的可追溯制度更多是建立在企业和行业诚信基础上， 由生产者确 保其标示内容的真实。 但是越来越多的掺假事件证明单纯依靠企业或行业自律是远远达不 到确保水产品质量安全的目的， 这一系列事件的发生使得可追溯系统的的诚信度也受到质 疑。因此需要引入一些有效的检测方法， 对水产品掺假进行检测， 作为可追溯系统的辅助， 确保可追溯信息的真实性。
现在的一些掺假手段往往比较隐蔽， 用传统的检测手段很难检测出来 ； 另外在一 些经过深加工的食品中原材料已经严重变性无法用常规方法鉴别。 因此基于现代分子技术 的指纹图谱技术正被越来越多的应用于食品的检测中， 指纹图谱是指样品经适当处理后， 采用一定的分析手段， 得到能够标示该样品特性的谱图或图像。这些图谱或图像就如人的 指纹一样具有专一性和代表性， 因此被形象地称之为指纹图谱。指纹图谱技术按照所用方 法不同可分为电泳指纹图谱、 波谱指纹图谱和色谱指纹图谱， 这些方法原来应用于物质结 构分析或遗传分析， 有着极高的分辨率、 准确度和灵敏度。
由于指纹图谱抽象程度比较高， 比较复杂， 因此， 传统应用中指纹图谱的识别和判 断需要检测人员丰富的实践经验 ； 又由于个体操作的差异性使得同一物种的指纹图谱也出 现不同程度的差异。这些困难和差异使指纹图谱检测技术， 在传统的物质结构分析或遗传 分析之外的推广受到限制。
发明内容
( 一 ) 要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题是 ： 如何提供一种基于指纹图谱的水产品掺假检测方法 及系统， 从而实现对水产品掺假的自动检测， 克服对检测人员的经验要求过高的问题。
( 二 ) 技术方案
为解决上述技术问题， 本发明提供一种基于指纹图谱的水产品掺假检测方法， 其 包括步骤 ：
A： 根据水产品标准样品的 DNA 建立标准指纹图谱 ；
B： 对所述标准指纹图谱进行处理， 得到对应所述标准指纹图谱的标准一维波形 图；
C： 根据水产品待测样品的 DNA 建立待测指纹图谱 ；D： 对所述待测指纹图谱进行处理， 得到对应所述待测指纹图谱的待测一维波形图； E： 根据所述标准一维波形图和所述待测一维波形图， 对所述标准指纹图谱和所述 待测指纹图谱进行相似度对比， 根据对比结果判断所述待测样品是否掺假。
优选地， 所述步骤 A 具体包括步骤 ：
A1 ： 提取水产品标准样品的 DNA ；
A2 ： 以所述标准样品的 DNA 做为目的 DNA 进行 PCR 扩增， 得到标准 PCR 产物 ；
A3 ： 对所述标准 PCR 产物进行限制性酶切， 对酶切结果进行电泳分析， 得到标准指 纹图谱。
优选地， 所述水产品标准样品包括 ： 鳙鱼、 青鱼、 鲤鱼、 草鱼、 鲢鱼、 罗非鱼或鲫鱼。
优选地， 所述步骤 A2 中采用两对引物进行 PCR 扩增， 所述两对引物中， 第一对为 D6200-F 和 D6200-R， 第二对为 D14800-F 和 D14800-R。
优选地， 所述步骤 A3 中， 采用 6 种酶进行限制性酶切， 所述 6 种酶分别是 ： Sac I， Bgl II， BstX I， Stu I， Ssp I 和 Bln I。
优选地， 所述步骤 B 具体包括步骤 ：
B1 ： 对所述标准指纹图谱进行降噪处理 ；
B2 ： 对降噪处理后的所述标准指纹图谱进行灰度转化， 得到标准灰度图像 ；
B3 ： 对所述标准灰度图像进行锐化处理 ；
B4 ： 对锐化处理的所述标准灰度图像进行泳道识别处理 ；
B5 ： 对泳道识别处理后的所述标准灰度图像进行条带分析， 得到对应所述标准指 纹图谱的标准一维波形图。
优选地， 所述步骤 E 具体包括步骤 ：
E1 ： 根据所述标准一维波形图和所述待测一维波形图， 采用 Nei 系数法计算所述 待测指纹图谱和每个标准指纹图谱的相似度 f ；
E2 ： 比较对应每个标准指纹图谱的相似度 f， 找到相似度 f 的值最大的标准指纹图 谱， 做为结果指纹图谱 ；
E3 ： 判断所述结果指纹图谱对应的标准样品与所述待测样品所标识的原料是否一 致， 如果一致， 所述待测样品未掺假， 否则所述待测样品掺假了。
优选地， 所述步骤 E1 中， 所述相似度 f 的计算公式如下 ：
其中， m 为所述标准一维波形图和所述待测一维波形图共有峰数 ； n1 为所述标准一 维波形图组成峰总数， n2 为所述待测一维波形图组成峰总数 ； Xik 为所述标准一维波形图中 第 k 个共有峰分面积大小， Xjk 为所述待测一维波形图中第 k 个共有峰分面积大小， k 的取 值从 1 到 m ； Xik ＝ k0Xjk， k0 为相应峰面积比例系数。
本发明还提供一种基于指纹图谱的水产品掺假检测系统， 其包括 ： 标准图谱处理 单元、 待测图谱处理单元和对比单元 ；
所述标准图谱处理单元， 用于对水产品标准样品的标准指纹图谱进行降噪、 灰度 转化和数字化处理 ；
所述待测图谱处理单元， 用于对水产品待测样品的待测指纹图谱进行降噪、 灰度 转化和数字化处理 ；
所述对比单元， 用于根据所述标准图谱处理单元和所述待测图谱处理单元的处理 结果， 对所述待测指纹图谱和所述标准指纹图谱进行相似度对比， 并输出对比结果。
优选地， 所述系统还包括掺假案例管理单元、 基本信息管理单元和系统维护单 元；
所述掺假案例管理单元， 用于存储检测出的掺假产品的指纹图谱 ；
所述基本信息管理单元， 用于存储水产品的种属信息和已有标准指纹图谱 ；
所述系统维护单元， 用于存储和管理所述系统的权限信息。
( 三 ) 有益效果
本发明的基于指纹图谱的水产品掺假检测方法及系统， 通过 PCR 技术获得水产品 的标准指纹图谱和待测样品的待测指纹图谱， 进而对两种指纹图谱进行数字化处理， 然后 通过计算机对比技术分析判断待测样品中是否掺假。 整个检测过程快捷、 简单， 并且自动化 程度高， 无需检测人员的经验要求不高， 易于推广。 附图说明
图 1 是本发明实施例所述基于指纹图谱的水产品掺假检测方法的流程图 ； 图 2 是本发明实施例所述鳙鱼和鲤鱼标准指纹图谱 ； 图 3 是本发明实施例所述青鱼、 鲫鱼、 草鱼、 鲢鱼和罗非鱼的标准指纹图谱 ； 图 4 是对应鲢鱼标准指纹图谱的标准一维波形图 ； 图 5 是本发明实施例所述基于指纹图谱的水产品掺假检测系统的结构示意图。具体实施方式
下面结合附图和实施例， 对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施 例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。
图 1 是本发明实施例所述基于指纹图谱的水产品掺假检测方法的流程图。如图 1 所示， 所述方法包括 ：
步骤 A ： 根据水产品标准样品的 DNA(Deoxyribonucleic acid， 脱氧核糖核酸 ) 建 立标准指纹图谱。
所述步骤 A 具体包括 ：
步骤 A1 ： 提取水产品标准样品的 DNA。
在本实施例中， 所述水产品标准样品包括 ： 鳙鱼、 青鱼、 鲤鱼、 草鱼、 鲢鱼、 罗非鱼和 鲫鱼共计 7 种淡水鱼。每种鱼都购买三条， 所有的鱼都经过水产专家在形态学上鉴定。鱼 在实验室中宰杀， 肌肉被分离出来储存在 -80℃冰箱中以备后面提取 DNA 之用。
使用 Sambrook 设计的方法提取鱼的 DNA。取样品肌肉在液氮中研磨成粉末， 将 60mg 粉 末 加 入 到 2ml 离 心 管 中， 并 加 入 1mlDNA 提 取 液。 该 提 取 液 的 成 分 是 10mL 50mmol/L 的 Tris-HCl(pH 8) 其 中 含 有 50mmol/L 的 NaCl， 5mmol/L 的 EDTA(ethylene diamine tetraaceticacid)， 10g/kg 的 SDS(sodium dodecyl sulfate) 和 20mg/L 的 RNA(Ribonucleic Acid， 核糖核酸 ) 酶。 混合液剧烈震荡后在水浴锅中 37℃下水浴 1 小时。水浴完成后， 用苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 25 ∶ 24 ∶ 1( 体积 ) 的混合液洗涤两次， 然后用氯仿 / 异戊醇 24 ∶ 1 的混合液洗涤一次。DNA 用无水乙醇沉淀， 离心晾干后用双蒸水溶解。
DNA 提取物在含有 goldview(0.5μg/mL) 的 1 ％琼脂糖凝胶中电泳， 缓冲液含 有 40mmol/L Trisacetate 和 1mmol/L EDTA(pH 8)， 电泳条件为 120V， 时间为 20min。使 用 Molecular Imager Gel Doc XR 凝 胶 成 像 系 统 成 像， 并 用 Quantity One， version 4.5.2(Bio-Rad) 进行分析， 以判断是否成功提取获得每种鱼的 DNA， 如果提取失败， 重复步 骤 A1， 直至提取成功。
步 骤 A2 ： 以 所 述 标 准 样 品 的 DNA 做 为 目 的 DNA 进 行 PCR(Polymerase Chain Reaction， 聚合酶链式反应 ) 扩增， 得到标准 PCR 产物。
所述步骤 A2 中采用两对引物进行 PCR 扩增， 所述两对引物中， 第一对为 D6200-F 和 D6200-R， 第 二 对 为 D14800-F 和 D14800-R。 所 述 两 对 引 物 为 通 用 引 物， 通过使用 DNAMAN(Lynnon Biosoft， USA) 软 件 的 多 重 对 比 功 能 设 计 的。 在 Genbank 数 据 库 中 查 找到所述 7 种鱼的线粒体全序列， 序列号分别为鳙鱼 (Hypophthalmichthys nobilis) EU343733， 青鱼 (Mylopharyngodon piceus)EU979305， 鲤鱼 (Cyprinus carpio)X61010， 鲫 鱼 (Carassius carassius)AY714387， 草鱼 (Ctenopharyngodon idellus)EU391390， 鲢鱼 (Hypophthalmichthysmolitrix)EU315941 和罗非鱼 (Oreochromis niloticus)GU238433。 所述通用引物设计在线粒体的 Cyt b 基因和 D-Loop 基因上， 这两段基因是线粒体中进化最 快的基因， 分别位于线粒体 6140-6646 和 14791-15344 位置处。表 1 是所述两对通用引物 的信息表。
表 1 通用引物信息表
所 述 两 对 引 物 分 别 扩 增， 总 的 扩 增 体 系 是 相 同 的， 包 括 30μL10mmol/L 的 Tris-HCl(pH 8)， 50mmol/L KCl， 1.5mmol/L MgCl2， dNTP mix(50μmol/L)， 0.5mmol/L 的引 物， 2 单位 Taq DNA 聚合酶和适当的 DNA 模板。 扩增程序为 95℃预变性 5min， 95℃变性 30s， 55℃退火 30s and 在 72℃延伸 40s， 35 个循环。最后 72℃延伸 10min。
扩增后得到的 PCR 产物在 2％的琼脂糖凝胶上电泳， 使用 100-2000bp 的 DNA 标记， 电泳条件为 120V， 30min。通过电泳分析判断是否成功获得相应的 PCR 产物， 如果没有成功 获得， 重复所述步骤 A2， 直至成功获得。
步骤 A3 ： 对所述标准 PCR 产物进行限制性酶切， 对酶切结果进行电泳分析， 得到标 准指纹图谱。
首先在 DNAMAN(Lynnon Biosoft， USA) 软件上进行酶切分析， 通过酶切分析， 最后 选出了六种酶用于区分本实施例中的 7 种鱼， 它们分别是 Sac I， Bgl II， BstX I， Stu I，
Ssp I 和 Bln I。表 2 是标准 PCR 产物的预期酶切结果表。
表 2 预期酶切结果表
图 2 是 本 发 明 实 施 例 所 述 鳙 鱼 和 鲤 鱼 标 准 指 纹 图 谱 图， 其展示了由引物 D6200F&D6200R 扩增的鳙鱼和鲤鱼 PCR 产物的酶切结果。其中， 泳道 1 为鳙鱼标准品 PCR 结 果； 泳道 2 为鳙鱼被 Sac I 酶切结果 ； 泳道 3 为鲤鱼标准品 PCR 结果 ； 泳道 4 为鲤鱼被 Sac I 酶切结果 ； 泳道 M 为分子标记。如图 2 所示， 鳙鱼和鲤鱼都能够被 Sac I 识别， 但是切割 位点不同， 片段长度也不同， 因此可以区分开来。
图 3 是本发明实施例所述青鱼、 鲫鱼、 草鱼、 鲢鱼和罗非鱼的标准指纹图谱， 其展 示了引物 D14800F&D14800R 扩增的五种鱼的 PCR 产物的酶切结果。其中， 泳道 1 为草鱼标 准品 PCR 扩增结果 ； 泳道 2 为草鱼被 Bgl II 酶切结果 ； 泳道 3 为草鱼被 Ssp I 酶切结果 ； 泳道 4 为青鱼标准品 PCR 扩增结果 ； 泳道 5 为青鱼被 Bln I 酶切结果 ； 泳道 6 为青鱼被 SSp I 酶切结果 ； 泳道 7 为鲢鱼标准品 PCR 结果 ； 泳道 8 为鲢鱼被 SspI 酶切结果 ； 泳道 9 为鲫鱼 标准品 PCR 结果 ； 泳道 10 为鲫鱼被 BstX I 酶切结果 ； 泳道 11 为罗非鱼标准品 PCR 结果 ； 泳道 12 为罗非鱼被 StuI 酶切结果 ； 泳道 M 为分子标记。如图 3 所示， 青鱼、 鲫鱼、 草鱼、 罗 非鱼分别被 Bln I， BstX I， Bgl II， Stu I 特异性识别。鲢鱼没有找到特异性的限制酶， 所 以用 Ssp I 切割， Ssp I 同时可以切割草鱼和青鱼， 但是鲢鱼不能被 Bln I 和 Bgl II 识别， 因此鲢鱼也被鉴别出来。至此， 所有的七种淡水鱼都通过指纹图谱被区别开来。
从图 2 和图 3 中可以看到酶切都很完全， 证明所选的限制酶具有很高的酶切效率 和活性。7 种鱼的酶切结果与表 2 中预期酶切结果相吻合。每种鱼选取了三个平行样本， 为 结果的可靠性提供了保证。
步骤 B ： 对所述标准指纹图谱进行处理， 得到对应所述标准指纹图谱的标准一维 波形图。
所述步骤 B 具体包括 ：
步骤 B1 ： 通过中值滤波， 对所述标准指纹图谱进行降噪处理， 以去除所述标准指 纹图谱中的背景噪音。
步骤 B2 ： 通过加权平均值法， 对降噪处理后的所述标准指纹图谱进行灰度转化， 得到标准灰度图像。由于所述标准指纹图谱是彩色数字图像， 而对电泳图像的分析是针
对灰度图像进行的， 因此要将彩色图像转换为灰度阶。其实质是将图像三原色中的分量 R(Red)、 G(Green)、 B(Blue) 进行转换。由于三分量的取值范围为 0-255， 因此转化后的灰度 图像的灰度最高级别为 256。
所述加权平均值法的公式如下 ：
R’ ＝ G’ ＝ B’ ＝ (wrR+wgG+wbB)/3 (1)
其中， R’ ， G’ ， B’ 为输出值， wr， wg， wb 分别为 R， G， B 的权值。
步骤 B3 ： 通过 Laplacian 变换， 对所述标准灰度图像进行锐化处理。Laplacian 变 换主要用于改善因光线漫反射造成的图像模糊。在摄影片对图像进行记录的光化过程中， 光点漫反射到其周围区域造成图像模糊， 这种情况下， 不模糊的图像等于模糊图像减去它 的 Laplacian 变换的常数倍。另外， 不是由于光的漫反射造成的图像模糊， 使用 Laplacian 变换处理也可以使图像变得更清晰。经过锐化处理后图像的细节得到了提升， 一些临近的 条带可以被区分开来方便后续的处理。
Laplacian 算子表达式如下 ：
Laplacian 算子也可以用下面的矩阵来表示 ：
步骤 B4 ： 对锐化处理的所述标准灰度图像进行泳道识别处理。
本实施例采用了最大亮度搜索的方法来调整分隔线， 把指纹图谱对应的灰度图像 中不同的泳道分割开来， 以进行后续的条带分析。所述最大亮度搜索法是指， 两条泳道之 间的区域其亮度往往较泳道内的亮度大， 在灰度图上， 其灰度值较大。因此， 对于选定区域 m×n， 两条泳道间分隔线的位置满足下式 ：
根据 (4) 确定相邻两条泳道间的分割线， 进而将不同的泳道分割开来。
步骤 B5 ： 对泳道识别处理后的所述标准灰度图像进行条带分析， 得到对应所述标 准指纹图谱的标准一维波形图。图 4 是对应鲢鱼标准指纹图谱的标准一维波形图。如图 4 所示， 其中横坐标表示泳道 8 中不同电泳距离对应的碱基对个数， 纵坐标表示泳道 8 中不同 电泳距离对应的亮度值。所述步骤 B5 依次得到对应所述 7 种鱼的标准指纹图谱的标准一 维波形图。若标准灰度图像的背景暗 ( 灰度值较小 )， 谱带亮 ( 灰度值较大 )， 则一维波形 图中每一个大的波峰可视为谱带， 而小波则视为是噪声 ； 若相反， 即背景亮， 谱带暗， 则一维 波形图中较大的波谷可视为谱带， 而较小波谷则视为是噪声。 当背景亮谱带暗时， 可事先将 图像转化成背景暗谱带亮的图像， 以利于分析。波峰值为某一谱带 ( 或噪声 ) 最大亮度， 其 波宽为谱带 ( 或噪声 ) 振幅， 于是可得一系列波峰值。
步骤 C ： 根据水产品待测样品的 DNA 建立待测指纹图谱。本实施例中所述水产品 待测样品是原料为所述 7 种淡水鱼中至少一种的水产品食品。
所述步骤 C 具体包括 ：
步骤 C1 ： 提取水产品待测样品的 DNA。所述步骤 C1 与所述步骤 A1 基本相同， 其不 同之处仅在于 DNA 的提取对象为待测样品。
步骤 C2 ： 以所述待测样品的 DNA 做为目的 DNA 进行 PCR 扩增， 得到待测 PCR 产物。 所述步骤 C2 和所述步骤 A2 基本相同， 其不同之处仅在于， 在进行 PCR 扩增时， 采用所述两 对引物分别进行 PCR 扩增， 并根据对所得 PCR 产物的电泳分析， 判断哪一对引物适用于所述 待测样品的 DNA， 然后将采用该引物得到的 PCR 产物做为待测 PCR 产物。
步骤 C3 ： 对所述待测 PCR 产物进行限制性酶切， 对酶切结果进行电泳分析， 得到待 测指纹图谱。所述步骤 C3 和所述步骤 A3 基本相同， 其不同之处仅在于， 在进行限制性酶切 时， 依次使用所述 6 种酶对所述待测 PCR 产物进行限制性酶切， 然后对各自的酶切结果进行 电泳分析， 从而找到适用于所述待测 PCR 产物的酶， 然后将对应该种酶的指纹图谱做为待 测指纹图谱。
步骤 D ： 对所述待测指纹图谱进行处理， 得到对应所述待测指纹图谱的待测一维 波形图。所述步骤 D 与所述步骤 B 基本相同， 其不同之处仅在于， 处理对象为所述待测指纹 图谱， 输出结果为待测一维波形图。
步骤 E ： 根据所述标准一维波形图和所述待测一维波形图， 对所述标准指纹图谱 和所述待测指纹图谱进行相似度对比， 根据对比结果判断所述待测样品是否掺假。 所述步骤 E 具体包括 ：
步骤 E1 ： 根据所述标准一维波形图和所述待测一维波形图， 采用 Nei 系数法计算 所述待测指纹图谱和每个标准指纹图谱的相似度 f。
所述相似度 f 的计算公式如下 ：
其中， m 为所述标准一维波形图和所述待测一维波形图共有峰数 ； n1 为所述标准一 维波形图组成峰总数， n2 为所述待测一维波形图组成峰总数 ； Xik 为所述标准一维波形图中 第 k 个共有峰分面积大小， Xjk 为所述待测一维波形图中第 k 个共有峰分面积大小， k 的取 值从 1 到 m ； Xik ＝ k0Xjk， k0 为相应峰面积比例系数。
步骤 E2 ： 比较对应每个标准指纹图谱的相似度 f， 找到相似度 f 的值最大的标准指 纹图谱， 做为结果指纹图谱。
步骤 E3 ： 判断所述结果指纹图谱对应的标准样品与所述待测样品所标识的原料 是否一致， 如果一致， 所述待测样品未掺假， 否则所述待测样品掺假了。
本实施例虽然仅以 7 种淡水鱼为例说明本发明方法， 但是， 本发明方法同样适用 其他鱼类， 以及贝类、 虾、 蟹等水产品的掺假检测。
图 5 是本发明实施例所述基于指纹图谱的水产品掺假检测系统的结构示意图。如 图 5 所示， 所述系统包括 ： 标准图谱处理单元、 待测图谱处理单元、 对比单元、 掺假案例管理 单元、 基本信息管理单元和系统维护单元。
所述标准图谱处理单元， 用于对水产品标准样品的标准指纹图谱进行降噪、 灰度 转化和数字化处理。
所述待测图谱处理单元， 用于对水产品待测样品的待测指纹图谱进行降噪、 灰度 转化和数字化处理。
所述对比单元， 用于根据所述标准图谱处理单元和所述待测图谱处理单元的处理 结果， 对所述待测指纹图谱和所述标准指纹图谱进行相似度对比， 并输出对比结果。
所述掺假案例管理单元， 用于存储检测出的掺假产品的指纹图谱。
所述基本信息管理单元， 用于存储水产品的种属信息和已有标准指纹图谱。
所述系统维护单元， 用于存储和管理所述系统的权限信息。
本发明实施例所述基于指纹图谱的水产品掺假检测方法及系统， 通过 PCR 技术获 得水产品的标准指纹图谱和待测样品的待测指纹图谱， 进而对两种指纹图谱进行数字化处 理， 然后通过计算机对比技术分析判断待测样品中是否掺假。整个检测过程快捷、 简单， 并 且自动化程度高， 无需检测人员的经验要求不高， 易于推广。
以上实施方式仅用于说明本发明， 而并非对本发明的限制， 有关技术领域的普通 技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下， 还可以做出各种变化和变型， 因此所有 等同的技术方案也属于本发明的范畴， 本发明的专利保护范围应由权利要求限定。