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1、10申请公布号CN104055752A43申请公布日20140924CN104055752A21申请号201410283780522申请日20140624A61K9/68200601A61P3/10200601A61P3/04200601A23L1/2920060171申请人肖新华地址100730北京市东城区帅府园1号北京协和医院内分泌科申请人许建萍72发明人肖新华许建萍54发明名称无糖口香糖在制备影响血GLP1水平的药物或食品中的应用57摘要本发明公开了无糖口香糖在制备影响血GLP1水平的药物或食品中的应用，所述的药物或食品可以用于治疗2型糖尿病或肥胖。51INTCL权利要求书1页说明书7页。
2、19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页10申请公布号CN104055752ACN104055752A1/1页21无糖口香糖在制备影响血GLP1水平的药物或食品中的应用。2根据权利要求1所述的应用，所述的无糖口香糖是指不含有蔗糖、果糖、乳糖的口香糖，所述的无糖口香糖含有或者不含有木糖醇等对血糖影响不明显的甜味剂。3根据权利要求1所述的应用，所述的药物或食品用于治疗2型糖尿病或肥胖。权利要求书CN104055752A1/7页3无糖口香糖在制备影响血GLP1水平的药物或食品中的应用技术领域0001本发明涉及药物领域，特别地，涉及一种无糖口香糖在制备影响血GLP1水平。
3、的药物或食品中的应用。背景技术0002GLP1是于进食后释放的一种胃肠道激素，它是由胰升糖素原在肠道内分泌L细胞加工而来。L细胞分布于整个肠道，数量从小肠近端向大肠远端逐渐增加，密度最高处在回肠末端和结肠。进餐后受营养物质的刺激，L细胞可分泌GLP1，另一种EEC细胞K细胞可分泌抑胃肽GLUCOSEDEPENDENTINSULINOTROPICHORMONE，GIP。0003胰升糖素原的翻译后加工过程由激素原转化酶1/3PC1/3或激素原转化酶2PC2所介导。在胰腺的细胞中的酶主要是PC2，因此产物主要是胰升糖素，而肠道细胞表达PC1/3，因此产物主要是GLP1，GLP2和胃酸分泌调节肽OXY。
4、NTOMODULIN，OM。在大脑神经元中胰升糖素原同样加工为GLP1。在肠L细胞中胰升糖素原经PC1/3酶作用裂解形成4种GLP1同类肽GLP1137、GLP1136酰胺，GLP1737甘氨酸衍生物、GLP1736酰胺，后两者为具生物活性的形式，生物效应相同，因而皆称为GLP1。0004GLP1于餐后数分钟分泌，可持续升高数小时。该激素可增强葡萄糖依赖的胰岛素合成和分泌，同时抑制胰高糖素的分泌，延缓胃排空。研究表明，给大鼠外周灌注GLP1可降低食物摄取同时减轻体重。外源性给予GLP1对健康人和肥胖者均可减少食物摄取。同样可以抑制胃酸分泌，延缓胃排空，抑制胰岛细胞的胰高糖素分泌。实验证明，GL。
5、P1可刺激细胞再生和增殖，在体及离体均可促进细胞存活。这些证据表明给糖尿病患者和肥胖者应用GLP1治疗是合理的。0005GLP1736有力的促胰岛素作用在生理学上和治疗角度均受到高度关注。然而，天然的GLP1半衰期很短，不足2分钟，因其可迅速被二肽激肽酶IVENZYMEDIPEPTIDYLPEPTIDASEIV，DPPIV所降解。EXENDIN4首先从大毒蜥的毒液中分离获取，与GLP1的氨基酸序列呈53同源性，由于其第2位为甘氨酸，故能免受DPPIV迅速降解，可作用于GLP1受体，血浆半衰期比GLP1736长80倍。而EXENDIN939则是GLP1受体的拮抗剂。大鼠三脑室给予GLP1736可。
6、以抑制摄食，而EXENDIN939可抑制该作用，提示该作用是通过GLP1受体起到的。6天内重复大鼠脑室给予GLP1可降低大鼠体重。进一步研究表明，大鼠脑室给予EXENDIN939可增加摄食量。揭示了GLP1736在调节食欲方面的生理作用。短期给予GLP1或EXENDIN4均可减少进食量，长期给予GLP1类似物可降低体重，给肥胖的健康受试者餐时注射GLP15天可降低体重055KG，各种GLP1类似物降低体重的效果无显著性差异。0006此外，研究表明GLP1还有能量平衡以外的作用。中枢或外周给予GLP1可以通过GLP1受体特异性机制降低大鼠的体温。中枢及外周给予GLP1均可导致大鼠渴感缺乏和利尿。。
7、中枢的GLP1受体活化具有神经保护作用，脑室内注射GLP1可使海马区的U波说明书CN104055752A2/7页4减低，GLP1可保护海马神经元免受淀粉样蛋白的细胞毒作用损害。0007对心血管系统，GLP1可以减少缺血再灌注损伤后的梗死面积并对血管内皮细胞具有保护作用。0008GLP1作用于外周组织。主要通过直接作用于组织特异性GLP1受体所完成。然而，肝脏、脂肪和肌肉中GLP1的作用似乎是通过间接的机制完成的。0009GLP1是重要的饱感激素，其作用于下丘脑引起饱感可有两条途径一是神经性，进食后迷走神经活动增强，刺激位于下丘脑的迷走神经核的受体。另一是体液性，回肠及结肠的L细胞将GLP1分泌。
8、入血循环，通过脉络丛被摄取而达到下丘脑。生理性GLP1及其类似物对体重的影响通过中枢神经系统和脂肪细胞介导。大鼠脑室注射GLP1能显著减少大鼠的能量摄入，此作用被中枢GLP1受体介导至下丘脑和丘脑外侧核，到达最后区和下穹窿，从而控制能量摄入。0010GLP1除作用于下丘脑外，还可作用于脑干迷走神经网络。静脉注射GLP1可诱导脑干和下丘脑侧脑室核团CFOS的表达。然而，脑干下丘脑迷走神经切断术不能减弱GLP1对摄食的抑制作用，提示GLP1可能有除脑干弓形核以外的其他作用区域。0011GLP1作用于B细胞，与七次跨膜的G蛋白偶联受体相结合，使细胞内的CAMP和活化的蛋白激酶APROTEINKINA。
9、SEA，PKA浓度升高。GLP1直接通过CAMP/PKA的途径增强B细胞葡萄糖依赖的胰岛素分泌作用。B细胞的葡萄糖代谢导致细胞内产生大量的ATP，使得ATP/ADP比值升高，使KATP通道关闭。GLP1关闭KATP通道可能是通过PKA介导的磷酸化过程实现的。GLP1可以引起外钙内流，该作用可能源于L通道的大量活化。GLP1同样可以通过非钙离子依赖的方式刺激胰岛素释放，这是通过动员分泌囊泡到快速释放池达到的，该作用即可通过PKA途径也可以不通过该途径。0012肠道神经系统是调节L细胞释放GLP1的重要途径之一。肠道神经系统的迷走神经传出纤维通过释放乙酰胆碱ACETYLCHOLINE，ACH和促胃。
10、酸激素释放肽GASTRINRELEASINGPEPTIDE，GRP刺激L细胞分泌GLP1。肠道交感神经对GLP1分泌起抑制作用，交感神经节后纤维受刺激后释放去甲肾上腺素，激活肾上腺素能受体，从而抑制L细胞分泌GLP1，这种抑制作用可被酚妥拉明阻断。营养物质在小肠腔内的进一步移动直接刺激L细胞引起第二个迟发的GLP1和GLP2分泌高峰。目前已清楚葡萄糖通过SGLT1的摄取是刺激GLP1分泌的主要机制。0013大脑中，胰升糖素原特异表达于嗅球和孤束核尾部NTS。表达PC1/3和PC2的神经元在NTS中均有，PC1/3神经元在中部较多，PC2在NTS侧面较丰富。最近证明，变形小神经胶质细胞也有GLP。
11、1免疫反应物质，提示至少在特定病理条件下，活性的小神经胶质细胞能释放GLP1。免疫组化和层析证实中枢神经系统中胰升糖素原的加工过程与L细胞中GLP1的生成过程一样，是与胰升糖素和胃酸分泌调节肽等摩尔分泌的。还证实，外周的GLP1可通过简单扩散的方式迅速被大脑获取。但仍未能证明，外周的GLP1是否可以影响血脑屏障所覆盖的大脑区域。0014GLP1的分泌虽然可以被肠腔内的营养物质所刺激，但仍然存在神经调节机制，因为早在进餐5到10分钟时血浆GLP1水平就有升高，这时营养物质还未达到L细胞分布较为丰富的低位小肠。但是，GLP1分泌的神经内分泌调节机制尚不清楚。2011年欧洲内分泌年会上，日本学者报告。
12、同样热卡的食物以每口嚼5次和每口嚼30次的方式进食，餐后说明书CN104055752A3/7页5血GLP1和PYY水平不同，嚼30次者激素水平升得更高，而GLP1和PYY是重要的饱感激素。目前该两项激素为食欲调节领域的研究热点。研究提示不同进食方式对于血中GLP1等饱感激素分泌的影响不同。为传统的细嚼慢咽有益健康的说法提供了有利的证据。2012年CGFORDE等观察到以不同方式咀嚼30多种食物，结果发现相同热卡的食物每口嚼的越少，嚼的次数越多获得的饱感越强烈。00152011年国内学者观察咀嚼对胃肠道激素分泌的影响。分别给予16名瘦男性和14名肥胖男性志愿者相同试验餐，总热卡2200KJ68C。
13、，21F，11P，规定每口10G，嚼15次或40次。结果发现对照日胖人进食快，每克食物嚼的次数少。每口嚼40次者较嚼15次少进食119。肥胖组空腹血糖和胰岛素水平增高。空腹GHRELIN和GLP1浓度肥胖组低于正常组。每口咀嚼15次或40次，血糖和胰岛素水平无差别。不论胖人还是瘦人，每口嚼40次摄取的能量更低，餐后GHRELIN浓度更低，不论哪种咀嚼方式餐后GHRELIN都是短暂下降然后再升高。所有受试者的GLP1水平均在餐后半小时达峰，瘦组嚼40次者30，60，90，120分更高，肥胖组60和90分更高。每口嚼40次者餐后血中GLP1和CCK水平更高。因此，改进咀嚼方法可能是控制肥胖的有效方。
14、法。0016但是，目前国际上关于咀嚼过程对食欲影响的研究结论尚未一致。2013年美国学者RICHARDDMATTES等通过改变口香糖的硬度控制咀嚼过程，并且规定咀嚼的力度。比较组间饱感、急性能量摄入、胃肠消化过程和肽类激素分泌的差别。考虑到啮齿类动物体内脂肪含量不同导致的差别，结果分为消瘦和肥胖两组比较。消瘦组BMI1825KG/M2，肥胖组BMI3035KG/M2。每组分别空腹咀嚼软和硬质的口香糖每秒钟1次，共15分钟，然后饮一定量的果汁。结果发现所有人随着时间的进程饥饿感逐步增强，饱感下降P0001。但是咀嚼未对饱感产生明显影响，任何类型的口香糖均未影响结果。BMI和性别差异对结果不产生影。
15、响。然而，咀嚼口香糖后的进食量和BMI有显著相关性P0035。与不嚼口香糖相比，消瘦组咀嚼硬口香糖和软口香糖分别少摄入11381和14782KCAL/D。肥胖组嚼软和硬口香糖分别多进食170100和216122KCAL/D。与自身相比，瘦人在咀嚼口香糖日进食更少P0056，胖人咀嚼口香糖日进食更多P0059，但差别无显著性。组间比较不嚼口香糖时，每日能量摄入量不同BMI组无差别，但是咀嚼口香糖日肥胖者进食显著高于消瘦组P005。GLP1水平随时间推移而变化，但不受是否咀嚼口香糖的影响。研究者认为支持咀嚼影响食欲的证据很弱，但是考虑到咀嚼在调节食欲和能量方面有作用的强烈合理性，否定其可能性是困难。
16、的。该研究控制咀嚼的过程、时间、次数未发现对GLP1的分泌有影响。然而，改变方案或结合这些试验仍值得探索。0017口香糖作为传统的洁齿工具，被口腔科医师所重视。2008年FREDERICKACURRO等学者报道咀嚼口香糖不仅可短时间消耗能量，提高心率，而且可以通过增加颈内动脉血流量来增加脑血流量。咀嚼口香糖可能还存在许多间接的治疗作用。该作用通过咬和咀嚼的动作刺激神经通路而产生，这个过程中产生许多中枢和周围的神经递质。脑血流量的增高提示中枢活动增强从而影响神经递质的产生，递质可控制和传递信息到很多大脑区域，从而影响整体临床疗效。该学者同时指出，设计临床研究来捕获咀嚼口香糖的细微作用效果是困难的。
17、。0018传统研究结果已经证实，进食后肠道L细胞和K细胞在营养物质的刺激下可以分泌GLP1和GIP，但是这种分泌要基于对营养物质的摄入，不利于减重。大鼠试验证实，咀嚼说明书CN104055752A4/7页6可以通过中脑的三叉神经核激活组胺神经元，从而通过下丘脑的室旁核和腹内侧核H1受体抑制生理性进食，这两个部位是已知的饱感中枢。同时，该组胺神经元激活并加速内脏脂肪细胞的脂肪分解，上调UNCOUPLINGPROTEINUCP家族的表达，通过交感神经的传出纤维调节外周能量消耗。咀嚼可以激活传出信号的事实使科学家推测咀嚼能够通过神经内分泌机制增加L细胞的GLP1分泌，但迄今为止在人类中这种神经内分泌。
18、机制的存在尚未被证实。由此可见，现有技术中对于咀嚼对血中GLP1水平影响的报道结论不一。发明内容0019本发明的目的是提供无糖口香糖在制备影响血GLP1水平的药物或食品中的应用。为实现上述发明目的，本发明拟采用如下技术方案0020本发明涉及无糖口香糖在制备影响血GLP1水平的药物或食品中的应用。0021在本发明的一个优选实施方式中，所述的无糖口香糖是指不含有蔗糖、果糖、乳糖的口香糖，所述的无糖口香糖含有或者不含有木糖醇等对血糖影响不明显的甜味剂。0022在本发明的一个优选实施方式中，所述的药物或食品用于治疗2型糖尿病或肥胖。具体实施方式0023下面结合实施例对本发明作进一步描述。0024实施例。
19、10025实验内容0026观察一组健康非肥胖男性志愿者，空腹状态下以固定频率咀嚼无糖口香糖半小时，测定血中肠促胰岛素GLP1和GIP水平的变化，同时测定血糖、胰岛素水平并评价饱感和饿感，分析咀嚼动作对GLP1水平是否具有调节作用。0027实验方法0028一、招募健康志愿者12名健康非肥胖男性志愿者，年龄2050岁之间，BMI18BMI30KG/M2，没有慢性心、肝肾疾病及精神病史。向志愿者介绍研究目的和内容，签署知情同意书。0029二、试验步骤00301志愿者试验前空腹12小时，试验前日进正常饮食，禁止饮酒，试验当天8点来医院，报告头一天晚餐时间。003128点15分埋置套管针，以肝素盐水封管。
20、生理盐水100ML肝素钠2500U。同时测定指血血糖，抽基线血测定胰岛素、GLP1和GIP，评价基础状态下的饱感和饿感。00323给予每位志愿者一块硬质无糖口香糖，以2分钟为一周期，每周期80次的频率咀嚼无糖口香糖，共30分钟。00334于咀嚼的0、5、10、15、20、25和30采集血标本，每点4ML，同时测指血血糖。测定胰岛素的标本置于血清管，离心取血清置20冰箱保存。测定GLP1和GIP的血标本采集后立即置入冰浴的BDTMP800采血管中，于采血半小时内4低温离心，2800RPM的速率离心15分钟，取血清分离至冻存管中，立即置入80冰箱，保存至测定，标本在3个月内测定。说明书CN1040。
21、55752A5/7页700345次日不咀嚼口香糖，以相同时间点抽对照血标本。00356饱感及饿感测量采用100MM线，于取血点读数，分别测量饱感和饥饿感。0为最低程度的饱感或饿感，100为最大程度的饱感或饿感。00367实验前及试验结束后测血压及心率。0037三、激素测定方法00381为了准确测定GLP1和GIP激素的水平，需要解决的关键问题是如何防止激素的快速降解。003911在于血标本的搜集方法。因为GLP1的N端第二位为丙氨酸，极易被DPPIV酶所降解，半衰期不足两分钟，造成测定结果不准确，而GIP的分子结构N端第二位也为丙氨酸。我们经过搜索文献，发现目前GLP1测定的采血方法有添加DP。
22、PIV抑制剂和APPROTIN两种方法，目的均为防止GLP1的快速降解，但有些文章认为APPROTIN对GLP1的保护作用有限。0040经过市场调研，我们了解到BD公司研制的采血管BDTMP800含有DPPIV抑制剂、蛋白酶和酯酶，可以更好地保护激素的生物活性，对比试验发现用该试管采血的激素测定结果好于其他方法。BDTMP800采血管分为2ML和85ML两种型号，我们采用2ML管。00412GLP1采用放免法测定LINCO，GLP1A35HK。GIP采用MIL1IPORE公司ELISA试剂盒EZRMGIP55K；MILLIPORE，BILLERICA，MA测定。00423胰岛素的测定0043血。
23、清管采血2ML，分离血浆，采用西门子公司ADVIACENTAURXPIMMUNOASSAYSYSTEM化学发光法测定，批内变异5，批间变异98。00444血糖的测定0045于各采血点采指尖血以罗氏血糖仪测指血血糖。0046结果00471表1显示志愿者的临床特征，分为试验日和对照日，行自身前后对照。0048004900502表2比较咀嚼口香糖与不咀嚼口香糖情况下血糖、胰岛素、活性GLP1和GIP的浓度。0051表2实验日和对照日血糖、胰岛素、GLP1和GIP的浓度说明书CN104055752A6/7页800520053P0050054结果表明，实验日和对照日各点血糖和胰岛素水平无显著差别。GLP。
24、1水平实验日30分钟显著高于对照日P005，其他各点无显著差别。GIP水平实验日及对照日各点无显著差别。00553表3比较咀嚼口香糖与不咀嚼口香糖情况下饱感和饿感的不同00560057P0050058结果表明，饱感评价实验日与对照日相比，5分，15分和30分钟时饱感显著增高P005，其余各点无显著性差别。饿感在各时间点均无显著差别。0059本发明采用无糖硬质口香糖，以固定频率咀嚼口香糖的方法观察咀嚼动作对血中GLP1和GIP水平的影响，结果发现空腹状态下以每2分钟80次的方法咀嚼口香糖，可以使血中GLP1水平较不咀嚼口香糖的对照组下降更慢，咀嚼30分钟时两组差异有显著性。而GIP水平与对照组相。
25、比无差异。实验组与对照组的血糖和胰岛素水平无显著性差异。表明血中GLP1水平的变化不是血糖改变所诱导的，同时观察到GIP的水平并未随GLP1水平的改变而改变，说明咀嚼动作本身可以刺激GLP1的分泌，神经系统调节GLP1分泌的机制独立于GIP的调节而存在，并且表明咀嚼动作对GIP的分泌不产生影响。0060咀嚼口香糖对于饱感的影响早于血中激素的变化，于咀嚼5分，15分和30分钟时饱感显著高于对照组。血GLP1水平实验日始终倾向高于对照日，到30分钟时GLP1显示说明书CN104055752A7/7页9出显著高于对照组，实验组GLP1的水平随着时间的变化下降趋势不明显，与志愿者的自我感觉相一致。而饥。
26、饿感两组无明显差异，进一步研究可测定GRELIN的水平加以验证。0061结论0062健康人餐前咀嚼无糖口香糖可以在不影响血糖水平的情况下增加饱感，延缓GLP1水平的下降，而对血胰岛素、GIP水平无显著性影响。表明咀嚼无糖口香糖这种不增加热卡摄入的方法有可能成为2型糖尿病和肥胖患者控制进食量、减轻体重的一种经济有效的方法。虽然既往的研究在此方面观点不一，但是我们的研究得出了阳性结果，进一步进行大规模的临床试验验证是有价值的。0063以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。说明书CN104055752A。