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1、10申请公布号CN104159611A43申请公布日20141119CN104159611A21申请号201380010493022申请日2013022261/601,78620120222USA61K39/395200601A61K31/5377200601A61P35/0020060171申请人阿莱斯亚生物疗法股份有限公司地址加拿大魁北克72发明人GB特姆勃雷E维奥M菲林74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人刘晓东54发明名称共使用簇集蛋白抑制剂和EGFR抑制剂以治疗癌症57摘要表皮生长因子受体EGFR表达和磷酸化在用抗簇集蛋白抗体治疗的癌细胞中增加。这类治疗。
2、还伴随癌细胞的上皮表型复现，如通过癌细胞表面处增加的E钙黏着蛋白表达所确定。簇集蛋白抑制剂可以因此引起上皮至间充质表型的逆转并回复癌细胞对EGFR抑制剂的敏感性。因此提供簇集蛋白抑制剂和EGFR的组合以及它们在治疗癌症中的用途。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014082286PCT国际申请的申请数据PCT/CA2013/0001672013022287PCT国际申请的公布数据WO2013/123588EN2013082951INTCL权利要求书2页说明书20页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书20页附图4页10申请公布号CN10415。
3、9611ACN104159611A1/2页21一种药物组合，包含簇集蛋白抑制剂和EGFR抑制剂。2根据权利要求1所述的药物组合，其中该簇集蛋白抑制剂能够抑制上皮至间充质转变。3根据权利要求1或2所述的药物组合，其中该簇集蛋白抑制剂是抗簇集蛋白抗体或其抗原结合片段。4根据权利要求3所述的药物组合，其中该抗簇集蛋白抗体或抗原结合片段与人簇集蛋白亚基的C末端部分的氨基酸421至443结合。5根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合，其中该EGFR抑制剂是酪氨酸激酶抑制剂或抗EGFR抗体或其抗原结合片段。6根据权利要5所述的药物组合，其中该酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼、厄洛替尼、伊马替尼、拉帕替尼或神马。
4、替尼。7根据权利要求5所述的药物组合，其中该酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼。8根据权利要求5所述的药物组合，其中该抗体是西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗或莫苏珠单抗。9一种治疗癌的方法，包括向患有或疑似患有癌的个体施用簇集蛋白抑制剂和EGFR抑制剂。10根据权利要求9所述的方法，其中该簇集蛋白抑制剂能够抑制上皮至间充质转变EMT。11根据权利要求9或10所述的方法，其中该簇集蛋白抑制剂是抗簇集蛋白抗体或其抗原结合片段。12根据权利要求11所述的方法，其中该抗簇集蛋白抗体或抗原结合片段与人簇集蛋白亚基的C末端部分的氨基酸421至443结合。13根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中该EGFR抑。
5、制剂是酪氨酸激酶抑制剂或抗EGFR抗体或其抗原结合片段。14根据权利要求13所述的方法，其中该酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼、厄洛替尼、伊马替尼、拉帕替尼或神马替尼。15根据权利要求13所述的方法，其中该酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼。16根据权利要求13所述的方法，其中该抗体是西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗或莫苏珠单抗。17根据权利要求9所述的方法，其中该抗簇集蛋白抑制剂和该EGFR抑制剂依次施用。18根据权利要求16所述的方法，其中该抗簇集蛋白抑制剂在该EGFR抑制剂之前施用。19根据权利要求9所述的方法，其中该抗簇集蛋白抑制剂与该EGFR抑制剂同时施用。20根据权利要求9所述的方法，包括在施用。
6、该EGFR抑制剂之前检验癌细胞的上皮至间充质表型的逆转。21根据权利要求9至20中任一项所述的方法，其中该癌是前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝细胞癌、结直肠癌、头颈癌、肺癌、胰腺癌或肾细胞癌。22根据权利要求21所述的方法，其中该乳腺癌是三阴性乳腺癌或基底样乳腺癌。23根据权利要求21所述的方法，其中该肺癌是非小细胞肺癌。权利要求书CN104159611A2/2页324根据权利要求9至23中任一项所述的方法，其中该癌包含表征为抵抗EGFR抑制剂的细胞。25根据权利要求9至23中任一项所述的方法，其中该癌包含表达EMT标志物的细胞。26根据权利要求9至25中任一项所述的方法，其中该抗体或。
7、其抗原结合片段包含如SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO45、SEQIDNO46、SEQIDNO47、SEQIDNO48、SEQIDNO49或SEQIDNO50中所述的互补性决定区。27根据权利要求26所述的方法，其中该抗体或抗原结合区包含如SEQIDNO1中所述的CDRH1、如SEQIDNO2中所述的CDRH2和如SEQIDNO3中所述的CDRH3。28根据权利要求26所述的方法，其中该抗体或抗原结合区包含如SEQIDNO45中所述的CDRH1、如SEQIDNO46中所述的CDRH2和如SEQIDNO47中。
8、所述的CDRH3。29根据权利要求27或28所述的方法，其中该抗体或抗原结合区包含如SEQIDNO4中所述的CDRL1、如SEQIDNO5中所述的CDRL2、如SEQIDNO6中所述的CDRL3。30根据权利要求27或28所述的方法，其中该抗体或抗原结合区包含如SEQIDNO48中所述的CDRL1、如SEQIDNO49中所述的CDRL2和如SEQIDNO50中所述的CDRL3。31根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合用于治疗癌的用途。32根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合在制造用于治疗癌的药剂中的用途。33一种试剂盒，包含簇集蛋白抑制剂和EGFR抑制剂。34根据权利要求33所述的试剂。
9、盒，其中该簇集蛋白抑制剂是抗体或其抗原结合片段。权利要求书CN104159611A1/20页4共使用簇集蛋白抑制剂和EGFR抑制剂以治疗癌症技术领域0001本发明涉及簇集蛋白抑制剂与表皮生长因子受体EGFR抑制剂用于治疗癌症的组合。更具体地，本发明涵盖了簇集蛋白抑制剂如抗簇集蛋白抗体恢复癌细胞对EGFR抑制剂的敏感性或增强EGFR抑制剂作用的用途。背景技术0002化疗抗性的形成和侵袭至其他继发部位是实体瘤恶变的共同特征。众所周知化疗药耐药性的形成由参与药物和凋亡抗性的蛋白质过量表达引起。还相当充分地记录了侵袭过程。肿瘤侵袭由增加的癌细胞运动性和造成胞外基质中蛋白质降解的基因表达引起。存在以下日。
10、益增加的证据化疗抗性和肿瘤侵袭可能通过称作上皮至间充质转变EMT的生物学过程共享共同的起点。最近研究已经展示，转化生长因子TGF可能是EMT的关键介体。尽管这些进展，很少治疗途径可用于抑制化疗抗性形成和癌症向其他器官的扩散。最近文献中也已经出现，发生EMT的某些肿瘤细胞去分化并采取干细胞样特性癌干细胞或CSC。如同正常干细胞那样，CSC内在地抵抗化疗和放疗。因此，靶向EMT和CSC维持过程的特定调节物代表了一种增加针对化疗药的反应并防止癌症复发的非常有前景的治疗策略。0003利用充分表征细胞系作为EMT的模型，鉴定了引起EMT后上调的蛋白质。发现这些蛋白质中的一种蛋白质称作簇集蛋白的分泌型蛋白。
11、质SCLU在EMT期间受到刺激，并且本身可以促进EMT过程LENFERINK等人，2009。产生了与SCLU相互作用的几种高亲和力抗体，其中，在基于细胞的测定法中对它们阻断EMT的能力测试时，中和EMT的这些抗体均与SCLU蛋白中的相同关键氨基酸序列结合。这个发现表明SCLU的特定区域负责介导其促进EMT的活性。通过阻断SCLU中的EMT表位，抗体，尤其命名为16B5的抗体，可以阻断EMT，如通过与癌细胞孵育时维持上皮细胞标志物E钙黏着蛋白的膜表达示例。另外，使用前列腺癌和胰腺癌肿瘤的人异体移植物动物研究显示，阻断肿瘤相关性SCLU的活性导致针对标准化疗药物如多西紫杉醇和吉西他滨的反应增加，如。
12、通过肿瘤生长显著减少所测量。总之，这些结果显示，用能够与SCLU中特定区域相互作用的抗体阻断EMT导致肿瘤生长抑制和针对细胞毒药物的反应增加见以编号WO2007/030930公开的国际申请号PCT/CA2006/001505和以编号WO2011/063523公开的国际申请号PCT/CA2010/0001882，所述文献的完整内容通过引用的方式结合在此0004肺癌是最常见癌症的之一和世界范围内死亡的主导原因，每年诊断超过1百万病例并且非小细胞肺癌NSCLC占多于80的全部肺癌。尽管诊断方案和治疗方案的最新改善，大部分患者诊断患有其中中位数存活保持不良的晚期NSCLCADAMO等人，2009。00。
13、05NSCLC中的最重要靶之一是表皮生长因子受体EGFR受体酪氨酸激酶的ERBB家族的一个成员，其中所述受体酪氨酸激酶是在癌细胞的增殖和存活中发挥重要作用的细胞膜受体。它是一种巨大的跨膜糖蛋白，充当EGF和几种另外内源性配体的受体。它具有三个结构域，由胞外区、跨膜结构域和胞内酪氨酸激酶TK结构域组成。在功能上，配体说明书CN104159611A2/20页5与EGFR结合诱导受体二聚化，导致促进自身磷酸化和胞内TK结构域激活的结构变化。因此，EGFR激活影响影响细胞增殖、侵袭性、运动性、存活和凋亡的多个下游信号传导途径，包括RAS/RAF/促分裂原活化蛋白激酶MAPK和磷脂酰肌醇3激酶PI3K/。
14、AKT途径SHIGEMATSU等人，2005。0006虽然EGFR普遍表达，但是它经常在肿瘤细胞中被修饰。这些修饰包括基因扩增、配体和/或受体过量表达和激活性突变。EGFR或其原发性配体的过量表达或失调是许多种人实体肿瘤包括肺癌的特征。在NSCLC中，43至83的肿瘤过量表达EGFRADAMO等人，2009。针对EGFR如靶向胞外结构域的单克隆抗体的几种试剂或小分子能够抑制TK活性。0007EGFR在转移性NSCLC中的状态和针对化疗的反应是众多争论的主题。尽管大比例的肿瘤存在增加的EGFR表达，但是一些临床研究已经显示这是一线疗法中反应的低劣预测物BARR等人，2008。另外，尽管与单独化疗。
15、相比，用顺铂、长春瑞滨和西妥昔单抗EGFR单克隆抗体一线治疗的患者中存在轻微但明显的反应，但是在西妥昔单抗和EGFR过量表达之间不存在相关性MIRSHAHIDI和HSUEH，2010。总体上，在NSCLC显中采用EGRF抑制剂的海量临床结果表明，受体的状态在一线疗法中不重要，直至一份最近研究报道这样的结果，所述结果显示与单独化疗相比，用西妥昔单抗和化疗治疗的存在高EGFR表达的患者显示总生存期增加PIRKER等人，2012。从这些结果显而易见，存在涉及肿瘤中EGFR的其他机制，这些机制影响NSCLC患者对EGFR抑制剂的反应。0008EGFR的可能影响抑制剂反应的另外特征是允许小分子与该受体的。
16、TK活性结合的那些特征。一些小分子已经被开发并批准用于癌症适应症，包括吉非替尼和厄洛替尼模拟ATP与该区域结合，因此阻止胞内信号传导的两种小分子。然而，发现这些抑制剂在一线疗法中均在NSCLC中无活性，但是在二线和三线环境下实现明显的临床反应MIRSHAHIDI和HSUEH，2010。有趣地，EGFR过量表达对患者反应无影响，但是发现，EGFR和某些其他基因中的激活性突变是关键的。例如，发现激活性突变导致用吉非替尼治疗的患者中无进展性生存期显著增加COSTANZO等人，2011。此外，用厄洛替尼治疗的也在称作KRAS的基因中具有突变的NSCLC患者显示不反应HERBST和SANDLER，200。
17、8。因此，患者选择对试图理解他们是否将成为EGFRTK抑制剂的反应个体至关重要。0009如上文描述，EMT可以对肿瘤细胞将对治疗作出反应的方式具有极大影响并且癌细胞保持上皮状的能力对这种反应至关重要。在基于细胞的研究中，具有增加的上皮细胞标志物E钙黏着蛋白表达的细胞对EGFR抑制剂更敏感BARR等人，2008。与这些观察结果一致，在E钙黏着蛋白表达和厄洛替尼敏感性之间存在相关性YAUCH等人，2005。在肿瘤水平，已经显示恢复E钙黏着蛋白表达增加对EGFR抑制剂的敏感性WITTA等人，2006。然而，迄今尚未在临床试验中清晰检验EMT和EGFR状态之间的联系。然而，鉴于在EGFR过量表达和针对。
18、EGFR抑制剂的反应之间缺少相关性和缺少激活性EGFR突变对其反应的影响，以下情况是可能的另外的影响如EMT可能直接参与增加NSCLC患者中EGFR抑制剂的功效。0010本申请提供一种采用抗体治疗的方法，其中所述抗体通过抑制表达EGFR的肿瘤中的SCLU阻断EMT。这些肿瘤中的EGFR状态可能包括EGFR基因扩增或EGFR配体的扩增。另外，肿瘤细胞可能包括因EGFR和EGFR蛋白质配偶物而增加的自分泌信号传导。EGFR状说明书CN104159611A3/20页6态可能还包括EGFR中造成受体显示增加的活性的激活性突变。在另一个实施例中，肿瘤可能对EGFR抑制剂敏感或抵抗，所述EGFR抑制剂包括。
19、针对EGFR的单克隆抗体或消除EGFR活性的小分子抑制剂。另外，EGFR状态可能还包括先前为EGFR表达阴性的已经获得EGFR的肿瘤。0011当表达SCLU的NSCLC细胞系暴露于抗簇集蛋白抗体时，EGFR的表达和活化均增加。同时，依靠用抗簇集蛋白抗体抑制EMT，NSCLC细胞系还显示增加的E钙黏着蛋白表达。总之，用与EGFR抑制剂组合的簇集蛋白抑制剂治疗的NSCLC患者可以显示针对EGFR抑制剂的反应增加。0012发明简述0013本发明总体上涉及用于癌症治疗簇集蛋白抑制剂和EGFR抑制剂的组合。0014本发明的方法涵盖向有需要的个体施用能够抑制上皮至间充质转变EMT的簇集蛋白抑制剂和EGFR。
20、抑制剂。EGFR抑制剂也可以与簇集蛋白抑制剂分开、同时或依次施用。0015特别当观察到、检测到或疑似存在EGFR抗性时，可以施用簇集蛋白抑制剂。0016本发明的方法还包括施用簇集蛋白抑制剂以便阻止EGFR抗性或以便使癌细胞对EGFR抑制剂敏化。0017附图简述0018图1肺癌细胞系表达簇集蛋白。该图显示源自NSCLC的几个细胞系中簇集蛋白MRNA表达的RTPCR分析上半图。作为对照，还扩增来自肌动蛋白的MRNA下半图以确保每个反应中等量的起始物质。0019图2肺癌细胞系表达簇集蛋白SCLU。该图显示对肺癌细胞系分泌的SCLU的定量。这些量用SCLU特异性ELISA测量并以NG/ML表述。002。
21、0图3H16B5增加肺癌细胞系中的E钙黏着蛋白表达。该图显示与SCLU抑制剂H16B5孵育时A549NSCLC细胞的上皮特征增加。左图显示与对照IGG孵育48小时的细胞，而右图显示相同条件下与H16B5孵育的细胞。0021图4用H16B5处理NSCLC细胞导致增加的EGFR表达。在对照溶媒或H16B5存在的情况下，在从A549或H226细胞制备的完整细胞裂解物中使用EGFR特异性抗体测量EGFR表达。0022图5用H16B5处理NSCLC细胞导致增加的EGFR磷酸化。在对照溶媒或H16B5存在的情况下，在从A549或H226细胞制备的完整细胞裂解物中使用磷酸酪氨酸特异性抗体测量EGFR磷酸化。。
22、0023图6用H16B5处理NSCLC细胞导致增加的EGFR磷酸化。在对照溶媒、H16B5或对照IGG存在的情况下，在从A549或H226细胞制备的完整细胞裂解物中使用磷酸酪氨酸特异性抗体测量EGFR磷酸化。0024图7H16B5与厄洛替尼的组合导致增强的抗肿瘤作用。在H16B5与厄洛替尼的组合存在的情况下，在重组簇集蛋白存在或不存在时确定H1299癌细胞和H460癌细胞的存活。0025发明详述0026上皮的生长因子受体EGFR在几种类型的上皮癌中过量表达。EGFR遗传变异的说明书CN104159611A4/20页7存在可以造成肿瘤对EGFR抑制剂更敏感。然而，对EGFR酪氨酸激酶抑制剂TKI。
23、具有初始反应的患者在平均一年内复发。虽然已经显示EGFR外显子9中的缺失或L858R突变导致有利的临床转归，但是继发性分子事件如突变T790M、L747S和/或D761Y与耐药性和肿瘤复发相关。也已经显示二者均独立于EGFR而激活PI3/AKT途径的MET受体扩增和IGFR信号传导激活驱动继发耐药性。0027申请人已经出乎意料地发现，在用簇集蛋白抑制剂处理的癌细胞中EGFR表达和磷酸化增加。用簇集蛋白抑制剂处理癌细胞还伴随癌细胞的上皮表型复现，如通过细胞表面处增加的E钙黏着蛋白表达所显示。0028因而，簇集蛋白抑制剂不仅可以引起EMT表型的逆转，它们还可以恢复癌细胞对EGFR抑制剂的敏感性。0。
24、029本发明总体上涉及用于癌症治疗簇集蛋白抑制剂和EGFR抑制剂的组合。0030该药物组合可以特别地包含与药物可接受载体结合的簇集蛋白抑制剂和与药物可接受载体结合的EGFR抑制剂。0031本发明的方法涵盖向有需要的个体施用簇集蛋白抑制剂和EGFR抑制剂。EGFR抑制剂可以与簇集蛋白抑制剂分开、同时或依次施用。0032特别当观察到、检测到或疑似存在EGFR抗性时，可以施用簇集蛋白抑制剂。0033本发明的方法还包括施用簇集蛋白抑制剂以便阻止EGFR抗性或以便使癌细胞对EGFR抑制剂敏化。0034在本发明的一个方面，簇集蛋白抑制剂可以在EGFR抑制剂之前施用。例如，簇集蛋白抑制剂可以在施用EGFR抑。
25、制剂之前数小时至几日或几个月施用。在本发明的另一个方面，簇集蛋白抑制剂也可以在每次用EGFR抑制剂治疗的相同时间例如，相同日或在每次用EGFR抑制剂治疗之间施用。0035根据本发明，簇集蛋白抑制剂可以在施用EGFR抑制剂之前以多个剂量例如，每日、每隔1日，一周1次、一周2次等施用。0036该方法也可以包含在施用EGFR抑制剂之前检验癌细胞的上皮至间充质表型逆转。EMT状态可以例如通过测量选自E钙黏着蛋白、RAB25、整联蛋白6、波形纤维蛋白、ZEBL和SIPL的一种或多种基因/蛋白质的表达水平确定。0037簇集蛋白抑制剂可以通过它们损害簇集蛋白表达、分泌或簇集蛋白活性的能力来鉴定。0038簇集。
26、蛋白抑制剂的示例性实施例包括例如因其干扰分泌型簇集蛋白SCLU或TGF的EMT促进作用的能力而鉴定的那些。例如，可以在TGF或SCLU存在的情况下用推定性簇集蛋白抑制剂处理癌细胞例如，4T1乳腺癌细胞，DU145前列腺癌细胞等并且可以如下文描述那样评估EMT的标志物。可以将能够增加上皮标志物表达和/或减少间充质标志物表达的推定性化合物鉴定为合适的簇集蛋白抑制剂。0039可替代地，可以在推定性簇集蛋白抑制剂存在的情况下评估癌细胞的运动性。例如，可以在TGF或SCLU存在的情况下用推定性簇集蛋白抑制剂处理癌细胞并且可以如在PCT/CA2006/001505例如中所述那样实施伤口愈合测定法或黑墨运动。
27、性测定法。可以将能够在这些类型的测定法中抑制或减少癌细胞运动性的推定性化合物鉴定为合适的簇集蛋白抑制剂。应当理解其他技术可以用来鉴定合适的簇集蛋白抑制剂。说明书CN104159611A5/20页80040簇集蛋白抑制剂特别由本发明涵盖，例如包括，抗簇集蛋白抗体或其抗原结合片段。0041根据本发明，簇集蛋白抑制剂包括能够抑制EMT的抗簇集蛋白抗体或抗原结合片段例如，在癌细胞中。0042常使用的EMT的分子标志物例如包括，减少的E钙黏着蛋白、细胞角蛋白和联蛋白膜中表达和/或增加的SNAIL、SLUG、TWIST、ZEB1、ZEB2、N钙黏着蛋白、波形纤维蛋白、A平滑肌肌动蛋白、基质金属蛋白酶等表达。
28、见例如，KALLURI和WEINBERG，THEJOURNALOFCLINICALINVESTIGATION,1196，第14201428页；2009；FASSINA等人，MODERNPATHOLOGY，25；第8699页；2012；LEE等人，JCB；172；第973981页；2006。EMT表型也可以通过增加的移行、侵入能力或失巢凋亡/凋亡抵抗性区分。可以因此通过上皮标志物的减少和间充质标志物或EMT表型的出现检出正在发生上皮至间充质转变的细胞。0043标志物的表达可以总体上通过比较它们在一个状态下与另一个状态相比的细胞表达水平在基因水平或在蛋白质水平例如，包括细胞表面表达来确定。例如，可。
29、以与非癌细胞相比确定癌细胞中一种或多种特异性标志物的表达水平。可选地，可以与对EGFR抑制剂敏感的癌细胞相比，确定抵抗EGFR抑制剂的癌细胞中一种或多种特异性标志物的表达水平。另外，可以评价一种或多种特异性标志物的表达水平高于统计上代表对照的值。0044将从这种治疗获益的个体包括患有癌即，上皮癌的那些，所述癌包括前列腺癌、乳腺癌例如，三阴性或基底样乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝细胞癌、结直肠癌、头颈癌例如，头颈鳞状细胞癌、肺癌例如，非小细胞肺癌、胰腺癌、肾细胞癌等包括这些癌症的晚期形式或转移形式。0045可以用来实施本发明的抗簇集蛋白抗体的示例性实施例包括能够与人簇集蛋白亚基的C末端部分的氨基。
30、酸421和443结合的那些。由本发明涵盖的抗体或抗原结合片段的更具体实施例包括在以编号WO2007/030930公开的国际申请号PCT/CA2006/001505和以编号WO2011/063523公开的国际申请号PCT/CA2010/0001882中描述的那些。0046本发明特别地涵盖具有至少一个与鉴定为16B5、21B12、20E11、16C11和11E2的抗体的互补性决定区相同的互补性决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3的抗体和抗原结合片段。更具体地，本发明特别地涵盖抗体和抗原结合片段，所述抗体和抗原结合片段具有与鉴定为16B5、21B12、20。
31、E11、16C11和11E2的那些还见PCT/CA2006/001505相同或者与鉴定为人源化16B5H16B5、人源化21B12H21B12、H16B5VL共有序列1、H16B5VL共有序列2、H16B5VL共有序列3、H16B5VH共有序列1、H16B5VH共有序列2、H16B5VH共有序列3、H21B12VL共有序列1、H21B12VL共有序列2、H21B12VL共有序列3、H21B12VH共有序列1、H21B12VH共有序列2或H21B12VH共有序列3的那些还见PCT/CA2010/0001882相同的轻链和/或重链。0047鉴定为20E11、16C11和11E2的抗体的轻链可变区和。
32、/或重链可变区的氨基酸序列在SEQIDNOS6267中提出，其中预测的互补决定区以粗体显示。0048抗体和抗原结合片段的其他示例性实施例包括可以与本文中所鉴定的抗体竞争的那些0049本发明涵盖具有本文所述特征的单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体分离株以及抗原结合片段。再次还涵盖了包含单克隆抗体、嵌合抗体、人源化说明书CN104159611A6/20页9抗体或人抗体之间的轻链和/或重链排列的抗体或抗原结合片段。0050本发明的抗体或抗原结合片段因此可以包含人恒定区的氨基酸和/或人抗体的框架氨基酸。0051术语“抗体”指完整抗体、单克隆抗体或多克隆抗体。术语“抗体”还涵盖多特异性。
33、抗体如双特异性抗体。人抗体通常由各自包含可变区和恒定区的两条轻链和两条重链构成。轻链可变区包含3个CDR，它们在本文中被鉴定为旁侧分布有框架区的CDRL1、CDRL2和CDRL3。重链可变区包含3个CDR，它们在本文中被鉴定为旁侧分布有框架区的CDRH1、CDRH2和CDRH3。0052如本文所用，术语“抗原结合片段”，指抗体的一个或多个片段，所述片段保留与抗原结合的能力例如，KAAG1、分泌形式的KAAG1或其变体。已经显示抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段执行。涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”内部的结合片段的例子包括IFAB片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；II。
34、FAB2片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个FAB片段的双价片段；III由VH和CH1结构域组成的FD片段；IV由抗体单臂的VL和VH结构域组成的FV片段；V由VH结构域组成的DAB片段WARD等人，1989NATURE341544546；和VI分离的互补性决定区CDR，例如VHCDR3。另外，虽然FV片段的两个结构域VL和VH由独立基因编码，但是使用重组方法，可以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成性接头连接，在所述单条多肽链中VL区和VH区配对以形成单价分子称作单链FVSCFV；见例如BIRD等人1988SCIENCE242423426；和HUSTON等人1988PRO。
35、CNATLACADSCIUSA,8558795883。这种单链抗体也意在涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”范围内。另外，抗原结合片段包括结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包括I与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽如重链可变区、轻链可变区、或经接头肽与轻链可变区融合的重链可变区、II与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区、和III与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。可以通过用丝氨酸残基替换一个或多个半胱氨酸残基修饰铰链区，从而防止二聚化。这类结合结构域免疫球蛋白融合蛋白进一步在US2003/0118592和US2003/0133939中公开。使用本领域技术人员已知的常规技术，获得。
36、这些抗体片段，并且按照与完整抗体相同的方式筛选所述片段的有用性。0053典型的抗原结合位点由可变区组成，所述可变区由轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白的配对形成。抗体可变区的结构是非常一致的并且显示非常相似的结构。这些可变区一般由相对同源的以称作互补决定区CDR的3个高变区间插的框架区FR组成。抗原结合片段的总体结合活性经常由CDR的序列决定。FR经常在CDR的三个维度的正确定位和对齐方面发挥作用以便最佳抗原结合。0054本发明的抗体和/或抗原结合片段可以源自例如小鼠、大鼠或任何其他哺乳动物或源自其他来源，如通过重组DNA技术。0055其他簇集蛋白抑制剂可以包括例如并且不限于SIRNA例如，靶向簇。
37、集蛋白的RNA和反义RNA例如，靶向簇集蛋白的RNA。0056反义RNA的示例性实施例例如包括在美国专利号7,569,551所述文献的完整内容通过引用的方式结合在此中描述的那些并且特别地包括OGX011又称作，CUSTIRSEN钠、ONCOGENEX，还见SEQIDNO61。说明书CN104159611A7/20页100057EGFR抑制剂的示例性实施例包括酪氨酸激酶抑制剂，例如，吉非替尼、厄洛替尼、伊马替尼、拉帕替尼或神马替尼SEMAZINIB。EGFR抑制剂的其他示例性实施例例如包括单克隆抗体，如西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗或莫苏珠单抗METUZUMAB。0058将从用本发明药物组合治。
38、疗获益的其他个体包括患有抵抗一种或多种EGFR抑制剂的肿瘤的那些个体。可以在施用药物组合之前选择这类个体。0059可以通过评价临床参数如肿瘤复发或通过测量抵抗性的分子标志物例如，EGFR中或EGFR途径RAS/MAPK、磷脂酶C、磷脂酰肌醇3激酶/AKT、SRC/FAK途径等和/或EMT标志物中的突变、扩增，确定EGFR抑制剂抵抗性。0060检验EGFR抑制剂抵抗性因此可以包括确定EGFR中突变例如，酪氨酸激酶结构域中的突变、截短突变、插入的存在，确定EGFR扩增。0061如本文所用“药物可接受载体”或“药用载体”是本领域已知的并且包括但不限于00101M或005M磷酸盐缓冲液或08盐水。另外。
39、，这类药物可接受载体可以是水溶液或非水溶液、悬液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射用有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬液，包括盐水和缓冲的介质。肠胃外溶媒包括氯化钠溶液、RINGER右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化RINGER液或不挥发性油。静脉内溶媒可以包括流体和营养补充物、电解质补充物，如基于RINGER右旋糖的那些等。防腐剂和其他添加物也可以存在，如，例如抗微生物药、抗氧化剂、络合剂、惰性气体等。0062本文所述的实验用16B5的人源化形式H16B5实施。实施例0063实例10064NSCLC细胞系表达SCLU0065我们希望确定簇集蛋白是。
40、否在源自NSCLC肿瘤的细胞系中表达。作为第一步骤，从每个细胞系制备总RNA并用作模板以采用随机引发的寡核苷酸制备CDNA。使用本领域技术人员已知的方法，用人簇集蛋白基因特异性寡核苷酸实施RTPCR。5引物OGS1788由SEQIDNO57中所示的序列编码并且3引物OGS1721由SEQIDNO58中所示的序列编码。PCR产物是1412BP长度。作为每个反应中总RNA量的对照，采用对人持家基因肌动蛋白特异的寡核苷酸进行平行RTPCR反应。5引物OGS387由SEQIDNO59中所示的序列编码并且3引物OGS965由SEQIDNO60中所示的序列编码。PCR产物是746BP长度。如图1中所示，除。
41、一个细胞系之外，分析的全部NSCLC细胞系均含有编码簇集蛋白的MRNA，所述MRNA以不同的水平检测到。如预期，肌动蛋白存在于全部RNA样品中，这表明在每个RTPCR反应中存在大约等量的起始总RNA。这项分析中使用的细胞系是泳道1，A549；泳道2，EKVX；泳道3，HOP62；泳道4，HOP92；泳道5，H322M；泳道6，H226；泳道7，H23；泳道8，H460；和泳道9，H522。0066平行地，我们确定SCLU是否由NSCLC细胞系分泌。A549、H226、H292、H460和H1299细胞从ATCC马纳萨斯，VA购买并根据制造商的说明书培养。在在培养下几日后并且当细胞达到汇合时，收。
42、集来自每个细胞系的条件培养基用于分析。获得设计成测量人簇集蛋白的商业ELISA试剂盒BIOVENDORLLC，CANDLER，NC并且根据制造商的说明书实施分析。说明书CN104159611A108/20页11如图2的表中所显示，全部5种培养基样品均含有范围从136NG/ML至大于100NG/ML水平的SCLU，例外是具有低于10NG/ML水平的H226细胞系。0067总之，这些结果显示，源自NSCLC患者的癌细胞系大量分泌SCLU并且具有响应于抗体如H16B5的潜力，其中所述抗体抑制SCLU的EMT诱导活性。0068实施例20069NSCLC细胞与H16B5的孵育导致上皮细胞标志物E钙黏着蛋。
43、白的表达增加0070我们还通过使用免疫荧光法监测A549细胞表面上的E钙黏着蛋白表达，检查E钙黏着蛋白的表达。简而言之，将细胞接种在盖玻片上并且与10G/ML的对照IGG或H16B5孵育48小时。在这个孵育后，将细胞用多聚甲醛固定并且与小鼠抗人E钙黏着蛋白抗体制造商孵育1小时。在洗涤后，将E钙黏着蛋白染色的细胞与缀合至罗丹明红X的第二抗体孵育。将盖玻片封装并且通过荧光显微术可视化特异性E钙黏着蛋白染色。如图3中所示，A549细胞在它们的细胞表面上具有E钙黏着蛋白的低表达并且与非特异性IGG孵育48小时不增加这种蛋白质的水平见左图。相反，细胞与H16B5孵育造成A549细胞表面上E钙黏着蛋白染色。
44、的强度明显增加见右图。这表示细胞的上皮特征是极高的。0071实施例30072用H16B5抑制SCLU引起NSCLC细胞中EGFR表达和磷酸化的增加0073在这个实例中，我们检验了使用H16B5抑制EMT是否导致对NSCLC细胞系中EGFR的状态的任何影响。为了解决这个问题，将条件优化以测量这些细胞中受体的表达和磷酸化。已知EGFR在暴露于其配体包括EGF后非常迅速地磷酸化。与这种磷酸化平行相伴，受体内化并再循环以及其从细胞表面丧失存在。选择分泌相对高水平SCLU的两个细胞系A549和H226用于这项分析。将细胞接种在多孔板中并用10G/MLH16B5、10G/ML对照IGG或溶媒PBS处理48。
45、小时。在这种孵育后，将细胞用EGF10NG/ML处理并将细胞在不同时间收获并转化成裂解物。这些裂解物由SDSPAGE电泳，将蛋白质转移至尼龙膜并且用于蛋白质印迹中以检验EGFR的表达或磷酸化。为了测量EGFR的表达，使用一种命名为克隆1005的商业抗体SANTACRUZ，BIOTECH，SANTACRUZ，CA，而用命名为克隆4G10的抗磷酸酪氨酸抗体MILLIPORE,ETOBICOKE,ON监测EGFR的磷酸化。如图4中所示，如预期，用溶媒对照处理48小时、随后用EGFR处理的A549细胞显示EGFR表达下降，所述EGFR表达在10分钟后迅速恢复上半图比较泳道1与泳道2。相反，用H16B5。
46、抗SCLU抗体处理的A549细胞保护细胞免于EGF诱导的受体降解上半图比较泳道5与泳道6。为了控制每条泳道中蛋白质的量，将膜用抗肌动蛋白抗体克隆AC15，SIGMA，OAKVILLE，ON再印迹，其中所述肌动蛋白在凝胶上分离的不同样品之间等量表达。使用相同方案检验另一个NSCLC细胞系H226下半图和并且观察到的结果与采用A549细胞时观察到的那些结果相似。在这种情况下，当细胞用对照处理48小时时，EGF诱导的EGFR降解甚至更明显下半图，泳道14。在细胞用H16B5处理的情况下，未见EGFR减少下半图，泳道58。这再次显示用抗体抑制SCLU导致EGFR表达的维持。因此，这些研究结果表明，细胞。
47、将显示增加的EGFR抑制剂敏感性。0074还检验了这些细胞中EGFR的激活。在这个实例中，膜用仅与酪氨酸磷酸化形式的受体相互作用的抗体印迹。在A549细胞中，如预期，在EGF不存在的情况下未见EGFR的磷说明书CN104159611A119/20页12酸化见图5，上半图，泳道1和泳道5。然而，当细胞用EGF处理时，检测到磷酸化酪氨酸残基的出现，甚至在2分钟后也是如此上半图，泳道2和泳道6。与未处理的细胞相比，用H16B5处理48小时的细胞显示EGFR上更高量的磷酸化酪氨酸残基。EGFR磷酸化的这种差异重现于H226细胞中见图5，下半图，比较泳道24与泳道68。作为另外的对照，A549细胞在暴露。
48、于EGF之前还用对照抗体处理48小时图6。再次，EGFR磷酸化的量的变化仅见于用H16B5处理的细胞中比较泳道2、3对照和泳道8、9IGG与泳道5、6H16B5。0075总之，我们的结果显示肺癌细胞中阻断EMT影响这些细胞中的EGFR状态。具体而言，用单克隆抗体如H16B5抑制SCLU诱导EMT的活性是借以改变这些癌细胞中EGFR状态的机制之一。我们显示，用H16B5处理的肺癌细胞具有增加的E钙黏着蛋白表达并且因此更有上皮性质。预期EGFR敏感性增加与通过用抗体阻断SCLU而抑制EMT的组合增加EGFR抑制剂的功效。最后，预期表达EGFR并发生EMT的任何癌细胞均以类似于肺癌细胞的方式响应于S。
49、CLU的抑制剂，如单克隆抗体。0076实施例40077用于在H16B5存在的情况下增加癌细胞对EGFR抑制剂的敏感性的方法0078通过用抗簇集蛋白抗体阻断SCLU而抑制癌细胞中的EMT，导致细胞表面上增加的EGFR表达或增加的EGFR磷酸化或这两种情况。因此期望EGFR的抑制剂在其中用簇集蛋白抑制剂抑制EMT的条件下具有增加的功效。0079例如，将癌细胞系接种在多孔平板中并且当接近于汇合时，将细胞用抗簇集蛋白抗体例如，H16B5处理以抑制EMT。它可以有用于先验地以已知诱导物如SCLU、TGF、EGFR的配体如EGF或其他相似分子诱导EMT。0080还将EGFR抑制剂例如，阻断配体与受体结合或阻止EGFR二聚化的单克隆抗体、TK抑制剂等与抗簇集蛋白抗体一起或稍后例如，数小时后添加至各孔。在某种情况下，可以将EGFR抑制剂在抗簇集蛋白抗体之前添加至各孔。0081EGFR抑制剂可以按范围从1FMOL/L至100毫摩尔/L的不同浓度添加。为了确定用H16B5抑制SCLU时EGFR抑制剂的细胞毒性是否增加，使用标准方案如增殖测定法、侵袭测定法、凋亡测定法或迁移测定法确定剩余细胞的数目。适用于这种测定法的癌细胞包括抗EGFR抑制剂的癌细胞或表达野生型EGFR、含有激活性突变的EGFR、EGFR基因扩增和其中可能改变EGFR状态的其他情况的癌细胞。0。