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1、10申请公布号CN104056300A43申请公布日20140924CN104056300A21申请号201410242433822申请日20140530A61L24/0820060171申请人浙江大学地址310058浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号72发明人欧阳宏伟汪燕艳牟秦孙亨74专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司33201代理人黄美娟李世玉54发明名称一种多糖多巴胺复合生物胶及应用57摘要本发明公开了一种多糖多巴胺复合生物胶及应用，所述生物胶按如下方法制备在惰性气体氛围中，将13二甲氨基丙基3乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺钠溶于PH值56的MES缓冲液，制成EDC混合液，然后。
2、将该EDC混合液加入多糖溶液中，在2030反应051小时，再加入多巴胺溶液，2030继续反应14小时，反应物以蒸馏水为透析液透析13天，取截留液冷冻干燥，获得多糖多巴胺复合生物胶；本发明修饰方法简便有效，可增加软骨组织的表面粘性，减少治疗药物或植入细胞的流失，促进软骨损伤的修复。51INTCL权利要求书1页说明书6页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图2页10申请公布号CN104056300ACN104056300A1/1页21一种多糖多巴胺复合生物胶，其特征在于所述生物胶按如下方法制备1在惰性气体氛围中，将多糖溶于PH值56的MES缓冲液中制成。
3、多糖溶液；所述多糖为硫酸软骨素钠盐或透明质酸钠；2在惰性气体氛围中，将13二甲氨基丙基3乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺钠溶于PH值56的MES缓冲液，制成EDC混合液，然后将该EDC混合液加入步骤1制备的多糖溶液中，在2030反应051小时，再加入多巴胺溶液，2030继续反应14小时，反应物以蒸馏水为透析液透析13天，取截留液冷冻干燥，获得多糖多巴胺复合生物胶；所述多巴胺溶液是将多巴胺溶于PH值56的MES缓冲液制成，所述多糖溶液的用量以多糖质量计，所述多糖与13二甲氨基丙基3乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺钠投料质量比为1083083，所述多巴胺溶液用量以多巴胺质量计，所述多糖与多。
4、巴胺质量比为1083。2如权利要求1所述多糖多巴胺复合生物胶，其特征在于所述步骤1将多糖溶于PH值56的MES缓冲液中制成终浓度110MG/ML的多糖溶液。3如权利要求1所述多糖多巴胺复合生物胶，其特征在于所述步骤2所述透析在截留分子量为30003500或800014000的透析袋中进行。4如权利要求1所述多糖多巴胺复合生物胶，其特征在于所述步骤2所述冷冻干燥条件为压力020PA，温度105110，时间4872小时。5如权利要求1所述多糖多巴胺复合生物胶，其特征在于所述步骤1和步骤2所述惰性气体均为氮气或氦气。6如权利要求1所述多糖多巴胺复合生物胶，其特征在于步骤2所述多糖与13二甲氨基丙基3。
5、乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺钠投料质量比为11212，所述多巴胺溶液的用量以多巴胺质量计，所述多糖与多巴胺质量比为112。7一种权利要求1所述多糖多巴胺复合生物胶在制备表面改性软骨中的应用，其特征在于所述的应用为将多糖多巴胺复合生物胶溶于PH值7274的PBS缓冲液中，制成多糖多巴胺复合生物胶溶液，加入催化剂，混合成生物胶溶液，将生物胶溶液注射到软骨表面至完全覆盖，并于2030放置1060MIN，用PBS缓冲液冲洗软骨，即得到表面改性的软骨；所述的多糖多巴胺生物胶溶液浓度为0525MG/ML；所述催化剂为高碘酸钠溶液或质量浓度13的过氧化氢水溶液，所述高碘酸钠溶液是由58MG/ML高碘。
6、酸钠水溶液与04MOL/L的NAOH水溶液以体积比5012001混合制成；所述催化剂的体积用量与多糖多巴胺复合生物胶溶液体积比为1100200。8如权利要求7所述应用，其特征在于生物胶溶液注射到软骨表面的注射量为50100L/CM2。权利要求书CN104056300A1/6页3一种多糖多巴胺复合生物胶及应用一技术领域0001本发明涉及一种生物胶，特别涉及一种可直接粘附于受损软骨表面，促进其他生物活性物质或细胞粘附的生物胶的制备以及其在软骨表面的涂覆方法。二背景技术0002软骨由软骨细胞产生的一种特殊的细胞外基质构成，无血液供应，其组成成分主要有透明质酸、硫酸软骨素、II型胶原等。而软骨细胞通常。
7、处于骨软骨交界处，数量有限且因细胞外基质的限制，迁移能力很弱。由于软骨的这些特征，导致其在损伤后较难治愈。近年来发展出的“自体软骨细胞移植”ACI技术，即提取患者体内的健康软骨细胞经体外培养大量扩增后植入病变区修复病变软骨，其有疗效率在7085。但在软骨浅层损伤的治疗中，由于原生软骨表面较差的细胞粘附能力，若直接将种子细胞注射入损伤处，会导致种子细胞大量流失。随着组织工程的发展，多种支架被研发，其可为种子细胞提供良好的生存环境，促进组织修复。但在软骨浅表层损伤中，支架也难以与周围的组织良好的整合，从而导致新生组织与原组织分离，严重影响修复效果。因此，对于浅表层软骨损伤的修复，需要研发一种新的材。
8、料，能良好连接软骨组织与植入细胞或生物活性分子。0003在此，本发明提供了一种生物相容性良好的生物胶对软骨表面进行改性，增加其对于细胞或其他生物活性分子的粘附能力，从而有效提高修复效果。该生物胶使用软骨细胞外基质中的主要组成成分硫酸软骨素或透明质酸作为主要原料，通过接枝多巴胺增加其组织粘性。硫酸软骨素与透明质酸均为天然多糖，均具有良好的生物相容性、生物可降解性、吸收水分和养分的能力、促进软骨细胞增殖等特性；而多巴胺分子中的儿茶酚基团与氨基团易发生氧化而自聚，可在几乎任何材料表面形成紧密附着的聚多巴胺涂层；同时，其也是体内神经递质的一种，具有良好的生物相容性。因此，可以利用多巴胺的组织粘性制备适。
9、用于软骨组织的生物胶，修复浅表层软骨损伤。三发明内容0004本发明目的是提供一种多糖多巴胺复合生物胶及修复浅表层软骨缺损中的应用，具体是通过化学合成方法成功地在多糖分子上修饰多巴胺，制备出多糖多巴胺复合物这一新型生物胶，利用多巴胺氧化自聚合性质，在软骨表面形成一层多糖多巴胺涂层，改善软骨表面细胞及生物活性分子粘附能力差的问题，同时保持软骨表面原有的结构，可有效提高浅表层软骨缺损的修复能力。0005本发明采用的技术方案是0006本发明的目的是一种多糖多巴胺复合生物胶，所述生物胶按如下方法制备制备过程始终处于惰性气体氛围中1在惰性气体氛围中，将多糖溶于PH值56的MES吗啉乙磺酸缓冲液中制成多糖溶。
10、液；所述多糖为硫酸软骨素钠盐或透明质酸钠；2在惰性气体氛围中，将13二甲氨基丙基3乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N羟基琥珀酰亚胺钠SULFONHS溶于PH值56的MES缓冲液制成EDC混合液，然后将该EDC混说明书CN104056300A2/6页4合液加入步骤1制备的多糖溶液中，在2030反应051小时，再向反应液中加入多巴胺溶液，2030继续反应14小时，反应物以蒸馏水为透析液，在透析袋中透析13天，取截留液冷冻干燥，获得多糖多巴胺复合生物胶；所述多巴胺溶液是将多巴胺溶于PH值56的MES缓冲液制成，所述多糖溶液的用量以多糖质量计，所述多糖与EDC和SULFONHS投料质量比为1083083，所。
11、述多巴胺溶液用量以多巴胺质量计，所述多糖与多巴胺质量之比为1083；所述MES缓冲液的用量对本发明没有影响，通常优选所述EDC混合液体积是多糖溶液体积的1/401/100倍，所述多巴胺溶液体积是多糖溶液体积的1/401/100倍。0007进一步，所述步骤1将多糖溶于PH值56的MES缓冲液中制成终浓度110MG/ML优选255MG/ML的多糖溶液。0008进一步，所述步骤2所述透析袋的截留分子量为30003500或800014000。0009进一步，所述步骤2所述冷冻干燥条件为压力020PA，温度105110，时间4872小时，优选10PA，温度105110，时间4872小时。0010进一步，。
12、所述步骤1和步骤2所述惰性气体均为氮气或氦气，优选氮气。0011进一步，步骤2所述多糖与EDC和SULFONHS投料质量比为11212更优选11112，所述多巴胺溶液的用量以多巴胺质量计，所述多糖与多巴胺质量比为112优选111。0012本发明还提供一种所述多糖多巴胺复合生物胶在制备表面改性软骨中的应用，所述的应用为将多糖多巴胺复合生物胶溶于PH值7274的PBS缓冲液中，制成多糖多巴胺复合生物胶溶液，加入催化剂，混合成生物胶溶液，将生物胶溶液注射到软骨表面至完全覆盖，并于2030放置1060MIN，用PBS缓冲液冲洗软骨，即得到表面改性的软骨；所述的多糖多巴胺生物胶溶液浓度为0525MG/M。
13、L；所述催化剂为高碘酸钠溶液或质量浓度13的过氧化氢水溶液，所述高碘酸钠溶液是由58MG/ML高碘酸钠水溶液与04MOL/L的NAOH水溶液以体积比5012001优选1001混合制成；所述催化剂的体积与多糖多巴胺复合生物胶溶液体积比为1100200。0013进一步，将生物胶溶液注射到软骨表面的注射量为50100L/CM2。0014本发明所述MES缓冲液是指MES溶于蒸馏水，浓度为01M，用1M盐酸或1M氢氧化钠调节PH至56。0015与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在采用天然软骨中存在的多糖作为生物胶的主要成分之一，通过修饰多巴胺这一生物活性分子达到增加组织粘性的效果，较含氰基丙烯酸盐。
14、的粘合剂、白蛋白戊二醛粘合剂、纤维蛋白胶粘合剂有更好的生物相容性与生物安全性。该修饰方法简便有效，可增加软骨组织的表面粘性，减少治疗药物或植入细胞的流失，促进软骨损伤的修复。0016所述含氰基丙烯酸盐的粘合剂参见文献130017文献1LEAHEY,AB,GOTTSCH,JDSTARK,WJCLINICALEXPERIENCEWITHNBUTYLCYANOACRYLATENEXACRYLTISSUEADHESIVEOPHTHALMOLOGY100,17318019930018文献2SINGER,AJETALPROSPECTIVE,RANDOMIZED,CONTROLLEDTRIALOFTISSU。
15、EADHESIVE2OCTYLCYANOACRYLATEVERSUSSTANDARDWOUNDCLOSURETECHNIQUES说明书CN104056300A3/6页5FORLACERATIONREPAIRSTONYBROOKOCTYLCYANOACRYLATESTUDYGROUPACADEMERGMED5,949919980019文献3WOODWARD,SCETALHISTOTOXICITYOFCYANOACRYLATETISSUEADHESIVEINTHERATANNSURG162,11312219650020所述白蛋白戊二醛粘合剂参见文献450021文献4HERGET,GWETALEXP。
16、ERIMENTALUSEOFANALBUMINGLUTARALDEHYDETISSUEADHESIVEFORSEALINGPULMONARYPARENCHYMAANDBRONCHIALANASTOMOSESEURJCARDIOTHORACSURG19,4920010022文献5MENON,NG,DOWNING,S,GOLDBERG,NHSILVERMAN,RPSEROMAPREVENTIONUSINGANALBUMINGLUTARALDEHYDEBASEDTISSUEADHESIVEINTHERATMASTECTOMYMODELANNPLASTSURG50,63964320030023所述纤维。
17、蛋白胶粘合剂参见文献680024文献6KJAERGARD,HK,WEISFOGH,US,SORENSEN,H,THIIS,JRYGG,IAUTOLOGOUSFIBRINGLUEPREPARATIONANDCLINICALUSEINTHORACICSURGERYEURJCARDIOTHORACSURG6,52541992DISCUSSION540025文献7OWEN,RJETALPERCUTANEOUSABLATIONOFANINTERNALILIACANEURYSMUSINGTISSUEADHESIVECARDIOVASCINTERVENTRADIOL23,38939120000026文献8D。
18、UNN,CJGOA,KLFIBRINSEALANTAREVIEWOFITSUSEINSURGERYANDENDOSCOPYDRUGS58,8638861999四附图说明0027图1为实施例1硫酸软骨素多巴胺的1H核磁共振1HNMR表征图，曲线A为硫酸软骨素多巴胺表征图谱，曲线B为硫酸软骨素图谱。0028图2为实施例1软骨片扫描电镜照片，A为表面未涂覆生物胶的软骨片，B为涂覆生物胶后的软骨片。0029图3为实施例1软骨细胞在软骨表面的贴壁生长的荧光照片，A为未涂覆生物胶软骨片，B为涂覆生物胶的软骨片。0030图4为实施例1软骨细胞在软骨表面增殖的定量检测结果。五具体实施方式0031下面结合具体实。
19、施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此0032实施例1硫酸软骨素多巴胺复合生物胶及应用00331制备硫酸软骨素多巴胺复合生物胶在氮气环境中，将200MG硫酸软骨素钠盐即硫酸软骨素，购自SIGMA加入40MLMES缓冲液01M，PH55中，搅拌至完全溶解，制成多糖溶液。在氮气环境中，将218MGEDC，247MGSULFONHS溶于1MLMES缓冲液01M，PH55，完全溶解后，制成EDC混合液；然后在氮气环境中，将EDC混合液加入多糖溶液中，25下搅拌反应30MIN。将2162MG多巴胺溶于1MLMES缓冲液01M，PH55，加入上述反应液中，25、氮气条件下反应120MI。
20、N。将反应后的产物取出，置于透析袋MWCO3500中，说明书CN104056300A4/6页6于蒸馏水中透析3天；最后将产物冷冻干燥48小时，10PA，108，得到硫酸软骨素多巴胺生物胶203MG，并于4避光保存。0034硫酸软骨素多巴胺生物胶的表征将005G硫酸软骨素多巴胺生物胶溶于5MLD2O，完全溶解后，转入石英核磁管中，于25进行1HNMR表征，以硫酸软骨素作为对照，见图1所示，6570PPM处新增的峰证明多巴胺被连接到硫酸软骨素表面。00352配制催化剂将833MG高碘酸钠溶于10ML蒸馏水中，取1ML，与001ML04M氢氧化钠水溶液混合。2025避光保存。00363软骨表面涂覆硫。
21、酸软骨素多巴胺生物胶将1MG硫酸软骨素多巴胺生物胶溶于2MLPBS缓冲液PH值为72，015M中，加入001ML催化剂，混合均匀后，获得生物胶注射液，用100L移液枪取25L生物胶注射液，加至025CM2软骨片表面至完全覆盖，室温下保持30MIN，再用2MLPBSPH值为72，015M冲洗软骨片3次，每次5MIN，即得到表面改性的软骨片。同样条件下以未涂覆生物胶的软骨片为对照。0037使用扫描电子显微镜SEM观察表面改性前后软骨表面结构，观察生物胶对软骨表面形貌的影响。将涂覆或未涂覆生物胶的软骨切片5MM5MM02MM，长宽厚度于1535，真空干燥1020PA4872小时，然后用扫描电子显微镜。
22、观察表面形貌。结果见图2所示，从图中可见两者的表面形貌无显著区别，说明该生物胶不会影响软骨原有的形貌结构。0038表面细胞粘附能力检测将5ML软骨细胞悬液与10LDII染料25MG/ML混匀，置于37培养箱中孵育半小时，然后800RPM离心5MIN去除染液，用5MLPBS洗2次，用F12/DMEM11培养基含10胎牛血清与1青霉素链霉素重悬，调节浓度至10000个/ML。将细胞接种至涂覆及未涂覆生物胶的软骨切片7MM7MM1MM表面，培养6小时，去掉培养液，每个切片用1MLPBS洗3次，每次2MIN，用荧光显微镜OLYMPUS于546NM波长处观察细胞在两种表面的粘附情况。结果见图3所示，可见。
23、在涂覆生物胶后的软骨表面细胞数显著增加，说明该生物胶可有效改善浅表层软骨损伤治疗中细胞流失的问题。0039表面软骨细胞增殖能力检测将软骨细胞悬液用F12/DMEM11培养基含1青霉素/链霉素调节浓度至10000个/ML。将05ML细胞悬液接种至涂覆及未涂覆生物胶的软骨切片7MM7MM1MM表面，于37培养箱中培养。分别在培养1天、4天、7天时，每片加入005MLCCK8溶液，继续培养3小时，后吸取培养液，用酶标仪测量溶液在450NM处的吸光值。结果见图4所示，可见涂覆生物胶不会影响软骨细胞的活性，在培养第四天与第七天时，涂覆生物胶的软骨表面细胞活性显著高于未涂覆的软骨表面，说明该生物胶具有良好。
24、的生物相容性。通过表面形貌观察及细胞粘附、增殖实验可观测到该生物胶涂层可有效提高细胞粘附率且不影响软骨原有结构与生物相容性。0040软骨片的制备新鲜的猪关节软骨，除去周围组织，用手术刀切成约1CM1CM大小块状，然后使用冰冻切片机沿横切面切成1MM薄片，最后用手术刀修整四周边缘，得到不同尺寸的软骨切片。0041F12/DMEM培养基终浓度组成为F12培养基购自GIBCO与DMEM高糖培养基购自GIBCO按体积比11混合，添加10胎牛血清与1青霉素链霉素。0042实施例2硫酸软骨素多巴胺生物胶00431制备硫酸软骨素多巴胺生物胶200MG硫酸软骨素加入40MLMES缓冲液说明书CN1040563。
25、00A5/6页701M，PH59中，在氮气环境中搅拌至完全溶解，制成多糖溶液。将218MGEDC，247MGSULFONHS溶于1MLMES缓冲液01M，PH59，完全溶解后，获得EDC混合液，加入多糖溶液中，室温、氮气条件下反应30MIN。将2162MG多巴胺溶于1MLMES缓冲液，加入上述反应溶液中，室温25、氮气条件下反应60MIN。将反应后的产物取出，置于透析袋MWCO3500中，于蒸馏水中透析3天；最后将产物冷冻干燥48小时，10PA，108，得到硫酸软骨素多巴胺生物胶冻192MG，并于4避光保存。00442配制催化剂将质量浓度30过氧化氢用蒸馏水稀释至质量浓度3。00453软骨表面。
26、涂覆硫酸软骨素多巴胺生物胶将2MG硫酸软骨素多巴胺溶于2MLPBS缓冲液PH值为72，015M中，加入002ML催化剂，混合均匀后，获得生物胶注射液，用100L移液枪取100L生物胶注射液，加至1CM2软骨片制备同实施例1表面至完全覆盖，室温25下保持30MIN，再用5MLPBS冲洗软骨片3次，每次5MIN，即得到涂覆生物胶的软骨片。后通过表面形貌观察及细胞粘附实验方法同实施例1可观测到该生物胶涂层可有效提高细胞粘附率且不影响软骨原有结构。0046实施例3透明质酸钠多巴胺生物胶00471制备透明质酸钠多巴胺生物胶400MG透明质酸钠加入80MLMES缓冲液01M，PH59中，在氮气环境中搅拌至。
27、完全溶解，制成多糖溶液。将437MGEDC，495MGSULFONHS溶于2MLMES缓冲液01M，PH59，完全溶解后，获得EDC混合液，加入多糖溶液中，室温25、氮气条件下反应30MIN。将432MG多巴胺溶于2MLMES缓冲液01M，PH59，加入上述反应溶液中，室温25、氮气条件下反应60MIN。将反应后的产物取出，置于透析袋MWCO800014000中，于蒸馏水中透析3天；最后将产物冷冻干燥72小时，10PA，108，得到透明质酸钠多巴胺生物胶411MG，并于4避光保存。00482配制催化剂将833MG高碘酸钠溶于10ML蒸馏水中，取1ML，与001ML04M氢氧化钠溶液混合。202。
28、5避光保存。00493软骨表面涂覆透明质酸钠多巴胺生物胶将25MG透明质酸钠多巴胺溶于1MLPBS缓冲液PH值为72，015M中，加入5L催化剂，混合均匀后，获得生物胶注射液，用100L移液枪取25L生物胶注射液，加至025CM2软骨片同实施例1表面至完全覆盖，室温25下保持20MIN，再用2MLPBS冲洗软骨片3次，每次5MIN，即得到涂覆生物胶的软骨片即表面改性软骨。通过表面形貌观察及细胞粘附实验同实施例1可观测到该生物胶涂层可有效提高细胞粘附率且不影响软骨原有结构。0050实施例400511制备透明质酸多巴胺生物胶200MG透明质酸钠加入80MLMES缓冲液01M，PH59中，在氮气环境。
29、中搅拌至完全溶解，获得多糖溶液。将218MGEDC，247MGSULFONHS溶于2MLMES缓冲液，完全溶解后，获得EDC混合液，加入多糖溶液中，室温25、氮气条件下反应30MIN。将2162MG多巴胺溶于2MLMES缓冲液，加入上述反应溶液中，室温25、氮气条件下反应60MIN。将反应后的产物取出，置于透析袋MWCO800014000中，于蒸馏水中透析3天；最后将产物冷冻干燥48小时，10PA，108，得到透明质酸多巴胺生物胶209MG，并于4避光保存。00522配制催化剂将833MG高碘酸钠溶于10ML蒸馏水中，取1ML，与001ML04M氢氧化钠溶液混合。2025避光保存。说明书CN1。
30、04056300A6/6页800533软骨表面涂覆透明质酸多巴胺生物胶将10MG透明质酸多巴胺溶于1MLPBS缓冲液中，加入5L催化剂，混合均匀后，获得生物胶注射液，用100L移液枪取25L生物胶注射液，加至025CM2软骨片表面至完全覆盖，室温25下保持20MIN，再用2MLPBS冲洗软骨片3次，每次5MIN，即得到涂覆生物胶的软骨片。通过表面形貌观察及细胞粘附实验同实施例1可观测到该生物胶涂层可有效提高细胞粘附率且不影响软骨原有结构。0054实施例500551制备透明质酸多巴胺生物胶200MG透明质酸钠加入80MLMES缓冲液01M，PH55中，在氮气环境中搅拌至完全溶解，制成多糖溶液。将。
31、218MGEDC，247MGSULFONHS溶于2MLMES缓冲液01M，PH55，完全溶解后，获得EDC混合液，加入多糖溶液中，室温25、氮气条件下反应30MIN。将2162MG多巴胺溶于2MLMES缓冲液01M，PH55，加入上述反应溶液中，室温25、氮气条件下反应120MIN。将反应后的产物取出，置于透析袋MWCO800014000中，于蒸馏水中透析3天；最后将产物冷冻干燥48小时，10PA，108，得到透明质酸多巴胺生物胶214MG，并于4避光保存。00562配制催化剂将质量浓度30过氧化氢用蒸馏水稀释至质量浓度3。00573软骨表面涂覆透明质酸多巴胺生物胶将20MG透明质酸多巴胺溶于。
32、1MLPBS缓冲液PH值为72，015M中，加入10L催化剂，混合均匀后，获得生物胶注射液，用100L移液枪取50L生物胶注射液，加至1CM2软骨片同实施例1表面至完全覆盖，室温25下保持60MIN，再用5MLPBS冲洗软骨片3次，每次5MIN，即得到涂覆生物胶的软骨片。通过表面形貌观察及细胞粘附实验同实施例1可观测到该生物胶涂层可有效提高细胞粘附率且不影响软骨原有结构。0058实施例600591制备透明质酸多巴胺生物胶240MG透明质酸钠加入80MLMES缓冲液01M，PH55中，在氮气环境中搅拌至完全溶解，制成多糖溶液。将460MGEDC，52119MGSULFONHS溶于2MLMES缓冲。
33、液01M，PH55，完全溶解后，获得EDC混合液，加入多糖溶液中，室温25、氮气条件下反应30MIN。将720MG多巴胺溶于2MLMES缓冲液01M，PH55，加入上述反应溶液中，室温25、氮气条件下反应120MIN。将反应后的产物取出，置于透析袋MWCO800014000中，于蒸馏水中透析3天；最后将产物冷冻干燥48小时，10PA，108，得到透明质酸多巴胺生物胶292MG，并于4避光保存。00602配制催化剂将833MG高碘酸钠溶于10ML蒸馏水中，取1ML，与001ML04M氢氧化钠溶液混合。2025避光保存。00613软骨表面涂覆透明质酸多巴胺生物胶将20MG透明质酸多巴胺溶于1MLPBS缓冲液PH值为72，015M中，加入10L催化剂，混合均匀后，获得生物胶注射液，用100L移液枪取100L生物胶注射液，加至1CM2软骨片同实施例1表面至完全覆盖，室温25下保持60MIN，再用5MLPBS冲洗软骨片3次，每次5MIN，即得到涂覆生物胶的软骨片。通过表面形貌观察及细胞粘附实验同实施例1可观测到该生物胶涂层可有效提高细胞粘附率且不影响软骨原有结构。说明书CN104056300A1/2页9图1图2图3说明书附图CN104056300A2/2页10图4说明书附图CN104056300A10。