两类孔型的微球PGDT分离介质的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种用悬浮聚合方法制备具有两类孔型PGDT，即聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-二乙烯基苯-三聚异氰尿酸三烯丙酯)微球型分离介质的方法，属于用于生物大分子分离纯化过程的层析介质制备技术。
背景技术
在生物大分子的分离纯化过程中，液相层析被公认为是一种十分有效的手段。随着对生物产品需求的不断增长，对液相层析介质性能的要求也越来越高。因此，制备性能优异的层析介质成为生物分离技术研究的重要课题。
在过去的四十年间，人们研制开发了许多用于过滤或作为催化剂载体的膜和大孔聚合物颗粒，孔径达到100-1000纳米。引人注目的是，当膜地孔径达到500纳米时，只要两边有微小的压力差，便可引发起孔内的对流传质。Van Kreveld等人在1987年《Journal of Chromatography》第397卷发表的论文中指出，只要在层析填料颗粒上有这种横穿粒子的特大的对流传质孔，则被分离溶质便会随流动相一道迅速的接近介质的内孔表面，而不是靠浓度梯度进行扩散传质，因而能加快传质过程。
Afeyan和Regnier等人于1989年申请了灌注层析的美国专利US Pat5019270。灌注层析的关键是以POROS命名的两类孔型分离介质。这种以苯乙烯-二乙烯基苯为骨架的双孔型分离介质含有两种大小不同的孔道：大孔直径为600-800nm，流体以对流形式通过；小孔直径为50-100nm，流体以扩散形式通过。此类介质本身有足够大的孔截面，使流动相对流通过吸附剂颗粒，大大降低了孔内停滞流动相的传质阻力，大幅度提高了柱效。其制备过程是首先合成微球，然后通过乳化作用将其进一步聚集形成聚集体，聚集体再聚集合成所需粒径的分离介质。而且，因介质骨架结构的疏水性强，对蛋白质等生物物质的非特异性吸附强，在其分离中，除了可直接用于反相模式外，在其它模式，如离子交换、亲和和疏水相互作用模式中运用时，一般需对介质表面进行改性，通常采用涂层法。可见，其制备过程非常复杂，成本高。
Yihua Yu等人在1999年《Journal of Chromatography A》第855卷中发表的论文表明以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，二乙烯基苯和三聚异氰尿酸三烯丙酯为交联剂，液体有机溶剂甲苯和正庚烷为致孔剂，通过悬浮聚合反应制备了聚甲基丙烯酸缩水甘油酯型球型分离介质。实验结果表明这类球型分离介质的非特异性吸附较低，具有较高的机械强度。
Minlian Zhang等人在2001年《Journal of Chromatography A》第922卷中发表的论文表明以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，二乙烯基苯和三聚异氰尿酸三烯丙酯为交联剂，液体有机溶剂环己醇和十二烷醇为致孔剂，通过一步原位聚合反应制备了具有两类孔型聚甲基丙烯酸缩水甘油酯分离介质。实验表明流体在两类孔型分离介质中传质行为大大改善。但原位聚合制备的两类孔型分离介质由于其形状不规则，在高流速下容易发生破碎，使其应用受到严格的限制。
发明内容
本发明的目的就是针对上述分离介质及其制备方法上存在的缺陷，提供一种粒径可控，机械性能高的两类孔型的微球PGDT分离介质的制备方法。
本发明的技术方案是：先将单体甲基丙烯酸缩水甘油酯，交联剂二乙烯基苯和三聚异氰尿酸三烯丙酯，液体致孔剂甲苯和正庚烷，以及引发剂偶氮二异丁腈混合均匀，再加入固体致孔剂混合均匀，然后，通过悬浮聚合反应合成聚合物微球。微球用无水乙醇抽提以除去液体致孔剂，用包括盐酸酸洗去除固体致孔剂，再经干燥，即可得到两类孔型PGDT分离介质，其特征在于，固体致孔剂为碳酸钙，用量占反应混合物体积含量的10～30％；固体致孔剂与液体致孔剂体积比为0.5～1；致孔剂用量占反应混合物体积含量的20～60％；交联剂二乙烯基苯与三聚异氰尿酸三烯丙酯的物质的量比为0.5～2，交联剂用量与单体甲基丙烯酸缩水甘油酯的物质的量的比为0.3～0.6；在常压下，聚合温度控制在65～85℃之间。
上述的碳酸钙颗粒的粒径为0.5～3μm，密度为2.71g/ml。
下面对本发明进行详细说明。
本发明的关键技术有四点：一是固体致孔剂的选择。加入固体致孔剂的目的是在分离介质中生成100nm以上的对流孔，用于致孔的固体颗粒应具有适当的粒径和密度，本发明中采用超细碳酸钙粒子为固体致孔剂，其密度为2.71g/ml，粒径为0.5～3μm，可用于制备结构均一的两类孔型分离介质。关键技术之二是有机致孔剂的选择。根据单体和交联剂的类型，选择适宜的有机致孔剂，以便合成具有大的比表面积的两类孔型分离介质。本发明采用甲苯和正庚烷为液体致孔剂，可以使合成的分离介质比表面积大，吸附容量大，同时具有较好的机械强度。关键技术之三是调节固体致孔剂和液体致孔剂的配比，可以实现对所制备的分离介质的传质和吸附性能的控制。关键技术之四是聚合方法的选择。本发明选择目前多数分离介质制备所采用的悬浮聚合方法。
本发明制备的两类孔型PGDT分离介质同现有的两类孔型分离介质相比较，其明显的优点是：制备过程简单、操作方便、成本低；可以实现两类孔型分离介质中对流孔和扩散孔的孔径同时可控，改变交联剂的配比和用量，有机溶剂的配比和用量可以调节扩散孔的孔径，改变固体颗粒的粒径可以调节对流孔的孔径；此分离介质的骨架结构为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯型聚合物，其亲水性好，非特异性吸附弱；骨架结构中含有大量的环氧基，易于修饰配基，例如，离子交换基团，亲和配基等，用在蛋白质等生物大分子的分离中，吸附容量大，洗脱条件温和；在大规模的生物大分子制备型分离中具有良好的应用前景。
附图说明
附图为以本发明方法所制备的两类孔型PGDT分离介质的电镜拍摄相图。图中，1为穿透孔区，2为扩散孔区。
具体实施方式
下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
实施例1
称取5.00克甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，1.70克二乙烯基苯(DVB)，1.46克三聚异氰尿酸三烯丙酯(TAIC)，1.84克甲苯，1.33克正庚烷，0.12克偶氮二异丁睛加入到50ml锥形瓶中，混合均匀，加入12.9克碳酸钙，混合均匀。40℃下在超级恒温水浴中预聚24小时。在装有搅拌器、回流冷凝管和温度计的三口瓶中，加入1％聚乙烯醇溶液后，将反应混合物加入。在氮气保护下，调节搅拌速度，待液滴分散成适当粒度后，以1℃/3分钟的速度缓慢升温至65℃，反应3小时，再以同样的速度升温至75℃，反应1小时，最后升温至85℃，反应2小时。然后将聚合物微球转入尼龙沙袋中，乙醇抽提24小时，脱除有机致孔剂。再将抽提后的微球浸泡在0.2M盐酸溶液中，去除固体致孔剂，真空干燥后，得到上述两类孔型PGDT分离介质6.0克。利用二乙胺修饰分离介质，取5.0克分离介质与25ml二氧六环和25ml二乙胺混合后，于60℃下反应6.5小时。待反应结束后，蒸馏水充分洗涤，真空干燥(＜1Torr，1Torr＝133.332Pa)，得到可用于阴离子交换模式下分离蛋白质等生物物质的两类孔型PGDT分离介质。此分离介质的体积平均粒径为45.6μm，比表面积为52.1m2/g，静态吸附容量为73.3mgBSA/g湿分离介质。重力沉降法装柱，在180.0cm/h的流速下，动态吸附容量高达33.2mgBSA/ml柱体积(51.8mgBSA/g湿分离介质)。
实施例2
称取5.00克GMA，1.01克DVB，1.05克TAIC，1.19克甲苯，0.87克正庚烷，0.12克偶氮二异丁睛加入到50ml锥形瓶中，混合均匀，加入14克碳酸钙，混合均匀。按实施例1中的方法合成可用于阴离子交换模式下吸附蛋白的PGDT两类孔分离介质6.0克。体积平均粒径为49.1μm，其比表面积为28.7m2/g，静态吸附容量为34.9mgBSA/g湿分离介质。重力沉降法装柱。在180.0cm/h的流速下，动态吸附容量达到13.4mgBSA/ml柱体积(21.3mgBSA/g湿分离介质)。