诱导调节性T细胞的增殖或积累的人源细菌.pdf

已显示属于梭菌纲的人源细菌物种在结肠中诱导调节性T细胞(Treg细胞)的积累并抑制免疫功能。包含这些细菌的药物组合物可用于预防和治疗免疫介导的疾病如自身免疫性疾病。

1.  一种诱导调节性T细胞的增殖和/或积累的组合物，所述组合物包含：(a)所述梭菌纲中的一种或多种细菌；(b)(a)的一种或多种细菌的培养上清液；(c)由(a)或(b)获得的一种或多种生理活性物质；或(d)(a)、(b)和(c)的任何2种或3种的组合。

2.  如权利要求1所述的组合物，其中(a)的所述一种或多种细菌是属于梭菌IV簇和梭菌XIVa簇的人源共生细菌(物种)。

3.  如权利要求1所述的组合物，其中(a)的所述一种或多种细菌是属于梭菌XIVa簇的一种或多种人源共生细菌(物种)。

4.  如权利要求1所述的组合物，其中(a)选自由以下各项组成的组：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM14662。

5.  如权利要求1所述的组合物，其中(a)选自由以下各 项组成的组：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、Bliautia coccoides、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae DSM 14662、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、多枝梭菌、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌A4、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA。

6.  一种诱导调节性T细胞的增殖和/或积累的组合物，所述组合物包含作为活性组分的以下各项：(a)包含含有与本文定名为OTU136、OTU46、OTU221、OTU9、OTU296、OTU21、OTU166、OTU73、OTU174、OTU14、OTU55、OTU337、OTU314、OTU195、OTU306、OTU87、OTU86、OTU152、OTU253、OTU259、OTU281、OTU288、OTU334、OTU359、OTU362或OTU367的DNA序列具有至少90％同源性的核苷酸序列的DNA，和含有与以下物种中的一种或多种的DNA具有至少90％同源性的核苷酸序列的DNA的细菌：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、 Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM14662；(b)(a)的一种或多种细菌的培养上清液；(c)由(a)或(b)获得的一种或多种生理活性物质；或(d)(a)、(b)和(c)中的任何2种或3种的组合。

7.  如权利要求6所述的组合物，其中所述同源性百分比为至少97％。

8.  一种诱导调节性T细胞的增殖和/或积累的组合物，所述组合物包含选自由以下各项组成的组的至少两种生物体和/或物质：(a)Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM14662；(b)(a)的一种或多种细菌的培养上清液；(c)由(a)或(b)获得的一种或多种生理活性物质；或(d)(a)、(b)和(c)中的任何2种或3种的组合。

9.  一种诱导调节性T细胞的增殖或积累的组合物，所 述组合物包含作为活性成分的由包含含有与SEQ ID NO.19至44中任一种具有至少90％同源性的核苷酸序列的DNA的细菌获得的至少一种生理活性物质。

10.  根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述调节性T细胞是转录因子Foxp3阳性调节性T细胞、产生IL-10的调节性T细胞或Helios阴性Foxp3阳性调节性T细胞。

11.  根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有免疫抑制效应。

12.  一种药物组合物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的组合物和药学上可接受的组分。

13.  一种在有需要的个体中诱导调节性T细胞的增殖、积累或增殖和积累两者的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求1至11中任一项所述的组合物或如权利要求12所述的药物组合物。

14.  一种在有需要的个体中诱导调节性T细胞的增殖、积累或增殖和积累两者的方法，其包括向所述个体施用选自由以下各项组成的组的至少一种生物体或物质：
(a)包含含有与SEQ ID NO.19至44中任一种具有至少97％同源性的核苷酸序列的DNA的至少一种细菌；
(b)由包含含有与SEQ ID NO.19至44中任一种具有至少90％同源性的核苷酸序列的DNA的细菌获得的至少一种生理活性物质；以及
(c)以下各项中的一种的培养上清液：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、 毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM 14662。

15.  如权利要求14所述的方法，其进一步包括向所述个体施用选自由以下各项组成的组的物质：扁桃仁皮、菊糖、低聚果糖、棉子糖、乳果糖、果胶、半纤维素、支链淀粉、乙酰辅酶A、生物素、甜菜糖蜜、酵母提取物、抗性淀粉、皮质类固醇、美沙拉嗪、氨水杨酸、柳氮磺吡啶、柳氮磺吡啶衍生物、免疫抑制药物、环孢菌素A、巯嘌呤、硫唑嘌呤、泼尼松、甲氨蝶呤、抗组胺剂、糖皮质激素、肾上腺素、茶碱、色甘酸钠、抗白三烯剂、抗胆碱能鼻炎药物、抗胆碱能减充血剂、肥大细胞稳定剂、单克隆抗-IgE抗体、疫苗、抗TNF抑制剂及其组合。

16.  一种在经受一段时间的革兰氏阳性抗生素的个体中增加调节性T细胞的水平的方法，其包括向所述个体施用如权利要求1至11中任一项所述的组合物或如权利要求12所述的药物组合物。

17.  根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中选自由Fop3Treg的表达、IL-10表达的增加、CTLA4表达的增加、IDO表达的增加和IL-4表达的抑制组成的组的一种度量用作所述个体中诱导调节性T细胞的增殖或积累的指标。

18.  一种在有需要的个体中治疗、辅助治疗、降低其严重程度或预防选自自身免疫性疾病、炎性疾病、过敏性疾病和传染性疾病的至少一种疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用如权利要求1至11中任一项所述的组合物或如权利要求12所述的药物组合物。

19.  一种选择个体以使用根据权利要求1至11中任一项所述的组合物或如权利要求12所述的药物组合物进行治疗的方法，其包括：(a)从个体获得一种(至少一种)样品，如粪便样品或结肠活检；(b)测量所述个体的样品中属于梭菌IV簇和XIVa簇的细菌物种的百分比或绝对计数，从而获得所述个体的测量值；(c)将(b)的测量值与从健康个体的样品获得的对应测量值进行比较；以及(d)如果在(b)中获得的测量值小于从健康个体的样品获得的测量值，则选择所述个体以使用根据权利要求1至11中任一项所述的组合物或如权利要求12所述的药物组合物进行治疗。

20.  一种选择诱导调节性T细胞的增殖和/或积累的细菌的方法，其包括：(a)从获自哺乳动物的粪便或活检样品分离所述细菌孢子形成级分；(b)将所述分离的孢子形成级分的连续稀释物铺板；以及(c)从所述培养板挑取单一菌落。

21.  如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其用于例如在根据权利要求19所述的方法选择的受试者中进行治疗或预防。

22.  如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其用于如权利要求13至18中任一项所定义的方法。

23.  如权利要求1至12中任一项所述的组合物用于制造用于如权利要求13至18中任一项所定义的方法的药剂的用途。

24.  一种用于产生诱导调节性T细胞的增殖和/或积累 的细菌培养物的工艺，其包括：(a)从获自哺乳动物的粪便或活检样品分离细菌孢子形成级分；(b)将所述分离的孢子形成级分的连续稀释物铺板；(c)通过测量作为诱导调节性T细胞的增殖或积累的能力的指标的以下各项中的一项或多项而从所述培养板挑取诱导调节性T细胞的增殖和/或积累的单一菌落：Fop3Treg的表达、IL-10表达的增加、CTLA4表达的增加、IDO表达的增加和/或IL-4表达的抑制；以及(e)培养所述挑取的菌落。

25.  一种通过如权利要求20所述的方法或如权利要求24所述的工艺可获得的或获得的细菌。

诱导调节性T细胞的增殖或积累的人源细菌
技术领域
本文描述的主题涉及一种诱导调节性T细胞的增殖、积累或增殖和积累的人源细菌的组合物，并且所述组合物包含作为活性组分的(a)一种或多种(一种，至少一种)属于梭菌(Clostridia)纲的人源细菌；(b)所述细菌中的一种或多种(一种，至少一种)的培养上清液；(c)由所述细菌中的一种或多种获得的生理活性物质；或(d)前述任何两种或更多种的组合。本文描述的主题还涉及一种用于诱导调节性T细胞的增殖、积累或增殖和积累的方法。包含以上(a)-(d)中任一种的组合物被称为细菌组合物。此外，本主题涉及一种用于通过向有需要的个体施用所述细菌组合物来治疗或预防响应于调节性T细胞的诱导的至少一种疾病或病状，如自身免疫性疾病、炎性疾病以及传染性疾病的方法。
背景技术
数百种共生微生物物种居住在哺乳动物的胃肠道内，在那里它们与宿主免疫系统相互作用。使用无菌(GF)动物的研究表明，共生微生物影响粘膜免疫系统的形成，如派尔集合淋巴结(Peyer’s patch)(PP)和单独的淋巴滤泡(ILF)的组织发生、抗微生物肽从上皮的分泌和粘膜组织中独特淋巴细胞的积累，独特淋巴细胞包括产生免疫球蛋白A的浆细胞、上皮内淋巴细胞、产生IL-17的CD4阳性T细胞(Th 17)和产生IL-22的NK样细胞(非专利文献(NPL)1至7)。因此，肠道细菌的存在增强了粘膜的保护功能，使得宿主能够增加抵抗侵入机体的病原性微生物的强大免疫应答。另一方面，粘膜免疫系统维持了对膳食抗原和无害微生物的无应答性(NPL文献3)。共生细菌和免疫系统 之间交叉效应(cross-talk)的调节异常(肠道生态失调)可能导致针对环境抗原的过度强大的免疫应答，并且可能引起炎性肠病(IBD)(NPL 8至10)。
最近的研究表明单独共生细菌控制粘膜免疫系统中其特异性免疫细胞的分化。例如，脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，其是人类的共生细菌，在小鼠中特异性诱导系统性Th1细胞应答和粘膜性产生IL-10的T细胞应答，并在保护宿主不患结肠炎方面起作用，而结肠炎由病原体引起(NPL 3)。分节丝状菌，其是小鼠的肠道共生细菌，诱导粘膜Th17细胞应答并增强针对宿主胃肠道的病原体感染的抗性(NPL 11至13)。另外，已知由几种共生细菌获得的短链脂肪酸抑制肠道炎症(NPL 14)。此外，已观察到一些肠道微生物群物种的存在大大影响调节性T细胞(下文称为“Treg细胞”)的分化，这有助于维持免疫系统的稳态。虽然已鉴别到可强烈刺激Treg的特定鼠共生细菌物种(NPL 15)，但人共生细菌物种是否对人免疫系统发挥等效的影响仍是未知的。而且，人肠道居住着多于一千种细菌物种，其中多数还未被培养(NPL 16)。先验猜想哪一种(如果存在)可能对Treg具有作用是不可行的。
为了开发具有有益免疫功能的人用药物、膳食补充剂或食品，需要鉴别天然定殖人并且具有免疫调节特性的共生微生物。而且，由于人微生物群中的许多共生体还未被培养，所以有必要开发培养它们的方法以使得它们可由传统工业发酵工艺产生并且随后并入药物或食品制剂中。
CD4⁺T细胞是已被鉴定为抑制免疫性的细胞亚群的调节性T细胞。转录因子Foxp3在CD4⁺T细胞中表达，已知所述CD4⁺T细胞在维持免疫稳态中起重要作用(NPL 8、9、17和18)。表达Foxp3的细胞在结肠中大量存在，而仅有在结肠中局部存在的Treg细胞恒定地以高水平表达IL-10，所述IL-10是免疫抑制性细胞因子(NPL19)。具有从中特异性地除去IL-10的CD4⁺Foxp3⁺细胞的动物发展炎性肠 病(NPL 20)。
因此，需要鉴别具有强烈诱导Treg细胞以便在结肠中以高水平产生IL-10的能力的人源共生细菌物种，并且需要开发培养这类物种的方法。这类物种可用于增强免疫抑制，这进而可用于治疗自身免疫性疾病，如炎性肠病、炎性疾病、过敏或器官移植，以及其它疾病和病状。
引用列表
非专利文献
[NPL1]J.J.Cebra,“Am J Clin Nutr”,May,1999,69,1046S
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[NPL3]J.L.Round、S.K.Mazmanian,“Nat Rev Immunol”,May2009,9,313
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[NPL5]K.Atarashi et al.,“Nature”,October9,2008,455,808
[NPL6]Ivanov,II et al.,“Cell Host Microbe”,October16,2008,4,337
[NPL7]S.L.Sanos et al.,“Nat Immunol”,January2009,10,83
[NPL8]M.A.Curotto de Lafaille、J.J.Lafaille,“Immunity”,May2009,30,626
[NPL9]M.J.Barnes、F.Powrie,"Immunity",September18,2009,31,401
[NPL10]W.S.Garrett et al.,“Cell”,October5,2007,131,33
[NPL11]Ivanov,II et al.,“Cell”,October30,2009,139,485.
[NPL12]V.Gaboriau-Routhiau et al.,“Immunity”,October16,2009,31,677
[NPL13]N.H.Salzman et al.,“Nat Immunol”,11,76.
[NPL14]K.M.Maslowski et al.,“Nature”,October29,2009,461,1282
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[NPL16]J.Quin et al.,"Nature",March4,2010,464,59
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[NPL19]C.L.Maynard et al.,“Nat Immunol”,September2007,8,931
[NPL20]Y.P.Rubtsov et al.,“Immunity”,April2008,28,546
发明概述
技术问题
本发明组合物和方法是鉴于本领域中的上述问题而进行的。本文描述的是鉴别和培养从人分离的肠道共生细菌的方法，所述方法包括优选地强烈诱导调节性T细胞的增殖、积累或增殖和积累。描述的是这样的组合物，又称为细菌组合物，其(1)包含(a)所鉴别的肠道共生(人 源)细菌中的一种或多种；(b)所述细菌中的一种或多种的培养上清液；(c)由所述细菌中的一种或多种或由所述培养上清液中的一种或多种获得的一种或多种生理活性物质；(d)(a)-(c)中的任何两种或三种的组合，并且(2)诱导调节性T细胞(Treg 细胞)的增殖和/或积累。或者，一种组合物包含(a)所鉴别的肠道共生(人源)细菌中的一种或多种；(b)所述细菌中的一种或多种的培养上清液；或(c)由所述细菌或由所述培养上清液获得的一种或多种生理活性物质；其中所述组合物诱导调节性T细胞的增殖和/或积累。在一些实施方案中，所述组合物包含所鉴别的肠道共生(人源)细菌中的一种或多种。在一些实施方案中，所述组合物包含所述细菌中的一种或多种的培养上清液。在一些实施方案中，所述组合物包含由所述细菌或由所述培养上清液获得的一种或多种生理活性物质。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是三种或更多种。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是五种或更多种。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是十七种或更多种。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是二十三种或更多种。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是23种。在具体实施方案中，所述细菌组合物诱导，并且优选地强烈诱导调节性T细胞的增殖、积累或增殖和积累，所述调节性T细胞在结肠(例如,人结肠)中以高水平产生免疫抑制细胞因子如IL-10。
这类细菌组合物适用于例如增强免疫抑制，并且因此适用于治疗自身免疫性疾病。细菌组合物包含作为活性组分的选自由以下各项组成的组的至少一种生物体和/或至少一种物质：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌(Clostridium ramosum)JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌(Flavonifractor plautii)、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌(Clostridium saccharolyticum)WM1、拟杆菌属种(Bacteroides sp.)MANG、解糖梭菌、 闪烁梭菌(Clostridium scindens)、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌(Clostridium bolteae)ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌(Erysipelotrichaceae bacterium)2_2_44A、吲哚梭菌(Clostridium indolis)、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种(Ruminococcus sp.)ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌(Clostridium symbiosum)、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌(Eubacterium contortum)、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌(Oscillospiraceae bacterium)NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌(Clostridiales bacterium)1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM14662；本文所描述/列出的细菌中的至少一种(一种，一种或多种)的培养上清液；由本文所描述/列出的(一种，一种或多种)细菌获得的生理活性物质或前述两种或三种的任何组合。或者，细菌组合物包含作为活性组分的选自由以下各项组成的组的至少一种生物体或至少一种物质：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和 梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM14662；本文所描述/列出的细菌中的至少一种(一种，一种或多种)的培养上清液；由本文所描述/列出的(一种，一种或多种)细菌获得的生理活性物质。
在一些实施方案中，细菌组合物包含选自由以下各项组成的组的至少一种生物体：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM14662。在一些实施方案中，细菌组合物包含本文所描述/列出的细菌中的至少一种(一种，一种或多种)的培养上清液。在一些实施方案中，细菌组合物包含由本文所描述/列出的(一种，一种或多种)细菌获得的生理活性物质。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是三种或更多种。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是五种或更多种。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是17种或更多种。
在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是23种或更多种。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是23 种。细菌组合物可包含这样的任何细菌(梭菌或其它细菌)：其包含含有与本文提供的序列具有足够同源性的核苷酸序列的DNA并且展现出与以下各项中的任一种所发挥的影响大体相同的对调节性T细胞的影响：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides以及Anaerostipes caccae DSM 14662。
在一些实施方案中，存在于细菌组合物中的细菌与本文提供的序列(如但不限于本文定名为OTU的和例如在最后一个实施例之后的页中列出的核苷酸序列)具有至少90％(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同源性。在具体实施方案中，这类细菌包含含有与本文如下定名的一种或多种DNA序列具有至少90％(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同源性的核苷酸序列的DNA：OTU136；OTU46；OTU221；OTU9；OTU296；OTU21；OTU166；OTU73；OTU174；OTU14；OTU55；OTU337；OTU314；OTU195；OTU306；OTU87；OTU86；OTU152；OTU253；OTU259；OTU281；OTU288；OTU334；OTU359；OTU362；或OTU367。或者，细菌包含含有与以下各项中的一种或多种的DNA具有至少90％(90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％)的同源性的核苷酸序列的DNA：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides以及Anaerostipes caccae DSM 14662。
在具体实施方案中，细菌组合物包含这样的细菌(如人源细菌)，所述细菌包含含有与本文提供的序列(如但不限于本文定名为OTU的和例如在最后一个实施例之后的页中列出的核苷酸序列)具有至少97％、98％或99％的同源性的核苷酸序列的DNA。在具体实施方案中，细菌组合物中的细菌包含含有与本文如下定名的一种或多种DNA序列具有至少97％、98％或99％的同源性的核苷酸序列的DNA：OTU136；OTU46；OTU221；OTU9；OTU296；OTU21；OTU166；OTU73；OTU174；OTU14；OTU55；OTU337；OTU314；OTU195；OTU306；OTU87；OTU86；OTU152；OTU253；OTU259；OTU281；OTU288；OTU334；OTU359；OTU362；或OTU367。或者，所述细菌包含含有与以下各项中的一种或多种的DNA具有至少97％、98％或99％的同源性的核苷酸序列的DNA：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟 杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM 14662。梭菌纲的任何细菌可以孢子形式或繁殖体形式存在。
问题的解决方案
如本文所述，除在人微生物群中的多于一千种细菌物种之外，在结肠中还存在着强烈诱导Treg的积累的若干物种。
还如所描述的，虽然来自健康个体的粪便样品中存在的大多数细菌物种不具有刺激Treg的能力，但属于梭菌纲的物种具有在结肠中引起对Treg的强大诱导的能力。此外，本发明人已经获得了每种细菌物种的体外培养物，所述细菌物种经鉴别并表明用体外培养的物种接种小鼠也在结肠中引起Treg的强大积累。
如本文所述，如下组合物抑制免疫功能，所述组合物包含作为活性组分的(a)孢子形式或繁殖体形式的属于梭菌纲的细菌或包含含有与本文提供的序列具有至少90％的同源性的核苷酸序列的DNA的细菌的某些物种中的一种或多种；(b)一种或多种这类细菌的培养上清液；(c)由(a)或(b)获得的一种或多种生理活性物质；或(d)(a)、(b)和(c)中的任何两种或三种的组合，并且诱导调节性T细胞(Treg 细胞)的增殖和/或积累。
更确切地说：
一个实施方案是一种诱导调节性T细胞的增殖、积累或增殖和积累两者的组合物，所述组合物包含作为活性组分的选自由以下各项组成的组的至少一种生物体和/或至少一种物质：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM 14662；本文所描述/列出的细菌中的至少一种的培养上清液；以及由本文所描述/列出的细菌获得的生理活性物质。
在一些实施方案中，活性组分是以下各项中的一种或多种：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、 Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM14662。
在一些实施方案中，所述活性组分是本文所描述/列出的细菌中的一种或多种的培养上清液。在一些实施方案中，所述活性组分是由本文所描述/列出的细菌获得的一种或多种生理活性物质。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是三种或更多种。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是五种或更多种。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是17种或更多种。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是23种或更多种。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌或由所述细菌获得的一种或多种生理活性物质是23种。
如本文所描述的细菌组合物包含以下各项中的至少一种：如本文所描述的一种细菌；由其中存在(生长或保持)所述细菌中的一种(或多种)的培养物获得的至少一种培养上清液或这样一种上清液的级分；由一种或多种细菌(如由本文命名的细菌)获得的一种或多种生理活性物质或前述任何两种或三种的组合。术语组合物/细菌组合物是指所有这类组合。
组合物中的细菌可以是例如：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、 Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM 14662，或包含含有与本文提供的序列(如但不限于本文定名为OTU的和例如在最后一个实施例之后的页中列出的核苷酸序列)至少90％同源性(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性)的DNA的任何细菌(如人源细菌)。
在具体实施方案中，所述细菌包含含有与本文如下定名的一种或多种DNA序列具有至少97％、至少98％或至少99％的同源性的核苷酸序列的DNA：OTU136；OTU46；OTU221；OTU9；OTU296；OTU21；OTU166；OTU73；OTU174；OTU14；OTU55；OTU337；OTU314；OTU195；OTU306；OTU87；OTU86；OTU152；OTU253；OTU259；OTU281；OTU288；OTU334；OTU359；OTU362；或OTU367。或者，所述细菌包含含有与以下各项中的一种或多种的DNA具有至少97％(97％、98％、99％、100％)的同源性的核苷酸序列的DNA：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、 Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides以及Anaerostipes caccae DSM 14662。]
在一个实施方案中，所述组合物诱导调节性T细胞，所述调节性T细胞是转录因子Foxp3阳性调节性T细胞或产生IL-10的调节性T细胞。在另一个实施方案中，所述组合物具有免疫抑制效应。
一个实施方案是一种诱导调节性T细胞的增殖、积累或增殖和/或积累两者并且抑制免疫功能的药物组合物。所述药物组合物包含本文描述的细菌组合物和药学上可接受的组分，如载体、溶剂或稀释剂。在具体实施方案中，这样一种药物组合物包含(a)(1)如本文所描述的孢子形式或繁殖体形式的属于梭菌纲的一种或多种细菌物种；(2)这类细菌的培养上清液；(3)由其获得的生理活性物质；或(4)(1)、(2)和(3)中的任何两种或三种的组合；以及(b)药学上可接受的组分，如载体、溶剂或稀释剂。在具体实施方案中，以上(a)是选自由以下各项组成的组的至少一种生物体或物质：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia  cocoides、Anaerostipes caccae DSM 14662；所述细菌中的一种或多种的培养上清液；以及由所述细菌中的一种或多种获得的生理活性物质。在一些实施方案中，以上(a)是选自由以下各项组成的组的至少一种生物体：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM14662。
在一些实施方案中，以上(1)是所述细菌中的一种或多种的培养上清液。在一些实施方案中，以上(1)是由所述细菌中的一种或多种获得的生理活性物质。在一些实施方案中，所述至少一种生物体或物质是三种或更多种。在一些实施方案中，所述至少一种生物体或物质是五种或更多种。在一些实施方案中，所述至少一种生物体或物质是17种或更多种。在一些实施方案中，所述至少一种生物体或物质是23种或更多种。在一些实施方案中，所述至少一种生物体或物质是23种。在另外的实施方案中，以上(a)(1)是这样的细菌(如人源细菌)，其包含含有与本文提供的序列(如但不限于本文定名为OTU的和例如在最后一个实施例之后的页中列出的核苷酸序列)至少90％同源性(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性)的DNA。在药物组合物的具体实施方案中，所述细菌包 含含有与本文如下定名的一种或多种DNA序列具有至少97％、至少98％或至少99％的同源性的核苷酸序列的DNA：OTU136；OTU46；OTU221；OTU9；OTU296；OTU21；OTU166；OTU73；OTU174；OTU14；OTU55；OTU337；OTU314；OTU195；OTU306；OTU87；OTU86；OTU152；OTU253；OTU259；OTU281；OTU288；OTU334；OTU359；OTU362；或OTU367。或者，所述药物组合物中的细菌包含含有与以下各项中的一种或多种的DNA具有至少97％(97％、98％、99％、100％)的同源性的核苷酸序列的DNA：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM 14662。
所述药物组合物诱导调节性T细胞(Treg细胞)的增殖和/或积累并且抑制免疫功能。
还提供的是一种在个体(例如，有需要的个体，如有诱导调节性T细胞的增殖和/或积累的需要的个体)中诱导调节性T细胞的增殖、积累或增殖和积累两者的方法。所述方法包括向所述个体施用本文描述的细菌组合物或包含本文描述的细菌组合物的药物组合物。在所述方法中，向个体(又称为有需要的个体)施用选自由以下各项组成的组的至少一种生物体或物质：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌 JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM 14662；所述细菌中的一种或多种的培养上清液或所述培养上清液的一种或多种组分；由所述细菌中的一种或多种获得的生理活性物质或前述任何两种或三种的组合，所述个体可以是健康个体或有预防、减轻或治疗病状或疾病的需要的个体。例如，可将所描述的组合物施用于有治疗、减轻严重程度或预防疾病或病状的需要的个体，所述疾病或病状如自身免疫性疾病、炎性疾病、过敏性疾病和传染性疾病。
任选地，细菌组合物的施用可与一段时间的一种或多种抗生素组合或在其之后施用。
任选地，细菌组合物的施用可与至少一种益生元物质的施用组合，相较于其它的人共生细菌物种的生长所述益生元物质优先促进所述细菌组合物中的物种的生长。在一个实施方案中，所述益生元物质是例如不易消化的低聚糖。在具体实施方案中，所述一种或多种益生元物质选自由以下各项组成的组：扁桃仁皮、菊糖、低聚果糖、棉子糖、乳果糖、果胶、半纤维素、支链淀粉、乙酰辅酶A、生物素、甜菜糖蜜、酵母提取物和抗性淀粉。本文还涵盖一种包含所述细菌组合物和至少一种益生元物质的组合物。
所述细菌组合物可与选自由以下各项组成的组的物质组合施用：皮质类固醇、美沙拉嗪、氨水杨酸、柳氮磺吡啶、柳氮磺吡啶衍生物、免疫抑制药物、环孢菌素A、巯嘌呤、硫唑嘌呤、泼尼松、甲氨蝶呤、抗组胺剂、糖皮质激素、肾上腺素、茶碱、色甘酸钠、抗白三烯剂、抗胆碱能鼻炎药物、抗胆碱能减充血剂、肥大细胞稳定剂、单克隆抗-IgE抗体、疫苗、抗TNF抑制剂(如英利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗或依那西普)及其组合。本文还描述一种包含所述细菌组合物和选自由以下各项组成的组的至少一种物质的组合物：皮质类固醇、美沙拉嗪、氨水杨酸、柳氮磺吡啶、柳氮磺吡啶衍生物、免疫抑制药物、环孢菌素A、巯嘌呤、硫唑嘌呤、泼尼松、甲氨蝶呤、抗组胺剂、糖皮质激素、肾上腺素、茶碱、色甘酸钠、抗白三烯剂、抗胆碱能鼻炎药物、抗胆碱能减充血剂、肥大细胞稳定剂、单克隆抗-IgE抗体、疫苗、抗TNF抑制剂(如英利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗或依那西普)及其组合。
在另一个实施方案中，所述细菌组合物可用作用以提高疫苗制剂的功效的佐剂。例如，所述细菌组合物可用作用于预防或治疗自身免疫性疾病或过敏性疾病的疫苗的佐剂。在一些实施方案中，提供一种用于预防或治疗的方法，所述方法包括施用所述细菌组合物并施用疫苗。
对施用本文描述的组合物所引起的对调节性T细胞的增殖或积累的诱导程度的评估可以通过多种方法，如通过测量患者样品(如活检样品或血液样品)中表达Foxp3的Treg的数目、IL-10表达的增加、CTLA4表达的增加、IDO表达的增加、IL-4表达的抑制或个体的细菌组合物定殖来进行。这类评估的结果被用作所述个体中诱导调节性T细胞的增殖或积累的指标。
在一个实施方案中，施用本文描述的组合物导致诱导调节性T细胞，所述调节性T细胞是转录因子Foxp3阳性调节性T细胞或产生IL-10的调节性T细胞。
本文描述的组合物可以通过多种途经施用，并且在一个实施方案中口服施用于有需要的个体，如有需要的患者。所述组合物可以多种口服形式施用，如以孢子形式(干粉剂或溶解于液体制剂中)、肠溶性胶囊、小药囊、或食品基质如酸奶或饮料施用。
还提供一种预测受试者对用本发明的组合物进行的治疗的反应(预测所述受试者是否会响应于治疗)的方法。所述方法包括：(a)在用本文描述的细菌组合物治疗患者之前从他或她获得一种(至少一种，一种或多种)样品，如粪便样品或结肠活检；(b)测量或测定所述样品中选自由以下各项组成的组的至少一种细菌物种的百分比或绝对计数：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides以及Anaerostipes caccae DSM 14662，从而产生百分比或计数；以及(c)将所得百分比或计数(测量值)与健康受试者中的相同测量的基线值进行比较，其中获自所述患者的样品中的低于基线值的百分比或计数表明所述受试者可能有利地响应于所述细菌组合物的施用。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括(d)如果获自所述患者的样品中的百分比或计数低于基线值则向所述患者施用所述细菌组合物。任选地，所述方法可进一步包括测量患者样品(例如粪便样品 或结肠活检)中的属于梭菌IV和XIVa簇的但不存在于所述细菌组合物中的其它共生物种的百分比或绝对计数，其中低于基线的百分比或绝对计数值(测量值)进一步表明所述受试者可能有利地响应于所述细菌组合物的施用。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：如果所述百分比或绝对计数值(测量值)低于基线则向所述患者施用所述细菌组合物。在一个实施方案中，被评估的患者遭受炎性肠病或艰难梭菌感染。
还提供一种监测受试者对用本发明的细菌组合物进行的治疗的反应的方法，其包括：(a)在用本文描述的细菌组合物治疗之前从患者获得一种(至少一种)样品，如粪便样品或结肠活检；(b)在用本文描述的细菌组合物治疗之后从所述患者获得一种(至少一种)相应的样品；以及(c)将在(a)中获得的样品中的选自由以下各项组成的组的至少一种细菌物种的百分比或绝对计数与在(b)中获得的样品中的相同的至少一种细菌物种的百分比或绝对计数进行比较：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM 14662，其中比在(a)中(治疗前)获得的样品中的值更高的在(b)中(用细菌组合物治疗后)获得的样品中的值表明所述受试者已有利地响应于治疗(例如， 这是受试者中增强的免疫抑制的正指示物)。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括(d)基于(c)中的比较向所述患者进一步施用所述细菌组合物或终止向所述患者施用所述细菌组合物。任选地，所述方法可进一步包括测量受试者样品中的属于梭菌IV和XIVa簇的但不存在于所述细菌组合物中的其它共生物种的百分比或绝对计数，其中比治疗前更高的治疗后的值表明所述受试者已有利地响应于治疗。
发明的有利效果
本文描述的组合物和方法的效果
本文描述的组合物在诱导调节性T细胞(Treg细胞)的增殖或积累方面是极优异的，它们包含作为活性组分的如本文描述的属于梭菌纲的选择细菌或其它细菌；这类细菌的培养上清液；由这类细菌获得的生理活性物质；或前述两种或三种的组合。
个体中的免疫性可通过施用所述主题组合物，如通过摄取食品或饮料中的细菌组合物或作为膳食补充剂摄取或通过施用包含所述细菌组合物的药物组合物进行抑制。本主题组合物可用于，例如预防或治疗自身免疫性疾病、过敏性疾病、传染性疾病以及抑制器官移植中的免疫排斥等。另外，如果食品或饮料如健康食品包含所述主题组合物，则健康个体可容易且常规地摄取所述组合物。作为结果，可能诱导调节性T细胞的增殖和/或积累并从而提高免疫功能。
本文描述的组合物为免疫介导的病状提供了自然、长久、患者友好且良性的治疗替代方案。例如，目前使用合成药物治理炎性肠病，所述合成药物可能具有严重的副作用(如皮质类固醇、TNF抑制剂)；不能口服施用(如TNF抑制剂)；具有不方便的剂量给药，涉及一天几个药丸(如美沙拉嗪或柳氮磺吡啶)；或具有有限的功效和短暂的效果(如目前销售的益生菌，例如鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus GG)、嗜酸乳 杆菌(Lactobacillus acidophilus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)等)。
附图简述
[图1A-1B]图1A是示出来自GF小鼠或定殖了未处理的(+huUT，n＝4，编号为#A1至#A4)或氯仿处理的(+huChloro，n＝4，编号为#B1至#B4)人粪便的GF小鼠的结肠固有层(C LPL，左图)和小肠固有层(SILPL，右图)的Foxp3表达门控的CD4细胞的直方图。图1B是示出来自GF小鼠或定殖了未处理的(+huUT)或氯仿处理的(+huChloro)人粪便的GF小鼠的结肠固有层(左图)和小肠固有层(右图)的Foxp3+CD4+细胞中Helios表达的直方图。(A)和(B)中括线上的数字表示群体的百分比。
[图1C-1D]图1C-1D是分别示出来自GF小鼠或定殖了未处理的(+huUT)或氯仿处理的(+huChloro)人粪便的GF小鼠的结肠固有层(左图)和小肠固有层(右图)的CD4+细胞中Foxp3表达的组合数据和Foxp3+CD4+细胞中Helios表达的组合数据的图。(C)和(D)中的每个圈代表单独的动物，并且误差线表示SD。*P<0.05；**P<0.001，未配对t检验。
[图1E]图1E示出来自GF小鼠或定殖了未处理的(+huUT)或氯仿处理的(+huChloro)人粪便的GF小鼠的结肠固有层(上图)和小肠固有层(下图)的CD4+细胞中IL-17和IFN-的胞内表达的代表性流式细胞术点图。(E)中每个象限中的数字表示群体的百分比。
[图1F-1G]图1F-1G分别示出所有小鼠针对来自GF小鼠或定殖了未处理的(+huUT)或氯仿处理的(+huChloro)人粪便的GF小鼠的结肠固有层(左图)和小肠固有层(右图)的CD4+细胞中IL-17和IFN-表达的组合数据。(F、G)中的每个圈代表单独的动物，并且误差线表示SD。*P<0.05；ns，不显著(P>0.05)，未配对t检验。
[图2]图2示出GF小鼠和口服接种(一周一次，持续4周)已预先热压处理的氯仿处理的人粪便悬浮液的GF小鼠的CD4+细胞中Foxp3表达(A中的上图，B中的左图)或Foxp3+CD4+细胞中Helios表达(A中的下图，C中的右图)的代表性图(A)和组合数据(B-C)。(A)中括线上的数字表示群体的百分比。(B、C)中的每个圈代表单独的动物，并且误差线表示SD。ns，不显著(P>0.05)，未配对t检验。
[图3]图3示出来自GF小鼠和口服接种氯仿处理的人粪便的GF小鼠(+huChloro，n＝7，编号为#C1至#C7)的结肠固有层和小肠固有层淋巴细胞的CD4+细胞中Foxp3表达的代表性图(A，此处示出小鼠#C4的数据)和组合数据(B)。(A)中括线上的数字表示群体的百分比。(B)中的每个圈代表单独的动物，并且误差线表示SD。**P<0.001，未配对t检验。
[图4]图4示出来自GF小鼠和与定殖了氯仿处理的人粪便的#C6和#C7ex-GF小鼠共同饲养的GF小鼠(编号为#D1至#D6)的结肠固有层(C LPL)和小肠固有层(SI LPL)的CD4+细胞中Foxp3表达的代表性图(A)和组合数据(B)。(A)中括线上的数字表示群体的百分比。(B)中的每个圈代表单独的动物，并且误差线表示SD。**P<0.001，未配对t检验。
[图5]图5示出来自GF小鼠、接种来自#C4小鼠的2000倍(+x2000，n＝4，编号为#E1至#E4)或20000倍(+x20000，n＝8，编号为#F1至#F8)稀释的粪便悬浮液的GF小鼠的结肠固有层(C LPL)和小肠固有层(SI LPL)的CD4+细胞中Foxp3表达的代表性图和组合数据(A、B)，或Foxp3+CD4+细胞中Helios表达的组合数据(C)。(A)中括线上的数字表示群体的百分比。(B)和(C)中的每个圈代表单独的动物，并且误差线表示SD。*P<0.05；**P<0.001，未配对t检验。
[图6]图6示出来自GF小鼠和接种#F3(n＝5)、#F7(n＝4)或#F8(n＝4)小鼠的粪便悬浮液的GF小鼠的结肠固有层(C LPL)和小肠固有 层(SI LPL)的CD4+细胞中Foxp3表达(A、C)或Foxp3+CD4+细胞中Helios表达(B、D)的代表性图(A、B)和组合数据(C、D)。(A)和(B)中括线上的数字表示群体的百分比。(C)和(D)中的每个圈代表单独的动物，并且误差线表示SD。*P<0.05；**P<0.001，未配对t检验。
[图7]图7示出GF小鼠和接种来自#F8小鼠的盲肠内容物的3个分离菌株的GF小鼠(n＝4，编号为#J1至#J4)的CD4+细胞中Foxp3表达(A、B)或Foxp3+CD4+细胞中Helios表达的代表性图(A)和组合数据(B、C)。(A)中括线上的数字表示群体的百分比。(B)和(C)中的每个圈代表单独的动物，并且误差线表示SD。ns，不显著(P>0.05)，未配对t检验。
[图8]图8示出每个盲肠样品中具有相同最近亲属的OTU的相对丰度(细菌DNA从小鼠#A1、#C4、#F8、#G2、#H3、#I3、#J3和#K3的盲肠内容物提取，在柱中示出)。在每个样品中检测到的OTU的总数目在柱下描绘出。在样品#H3、#I3或#K3中检测到的OTU名称、其最近亲属及其与所述最近亲属的相似性在右表中描绘出。
[图9]图9示出来自GF小鼠和接种来自#G2小鼠的盲肠内容物的培养板的细菌收集物的GF小鼠(n＝4，编号为#K1至#K4)的结肠固有层(C LPL)和小肠固有层(SI LPL)的CD4+细胞中Foxp3表达(A、B)或Foxp3+CD4+细胞中Helios表达(A、C)的代表性图(A)和组合数据(B、C)。(A)中括线上的数字表示群体的百分比。(B)和(C)中的每个圈代表单独的动物，并且误差线表示SD。*P<0.05；**P<0.001，未配对t检验。
[图10]图10示出来自GF小鼠和接种分离的且在表2中示出的23个细菌菌株的混合物(23mix)的GF小鼠的结肠固有层(C LPL)和小肠固有层(SI LPL)的CD4+细胞中Foxp3表达(A、B)或Foxp3+CD4+细胞中Helios表达(A、C)的代表性图(A)和组合数据(B、C)。(A)中括线上的数字表示群体的百分比。(B)和(C)中的每个圈独的代表单动 物，并且误差线表示SD。*P<0.05；**P<0.001，未配对t检验。
[图11]图11示出接种来自+huChlo小鼠的2x104至2x107倍稀释的盲肠样品的成年GF小鼠中Foxp3+CD4+细胞的积累的代表性图。实验进行多于两次。误差线表示SD。**P<0.01，*P<0.05，如学生t检验所计算的。
[图12]图12示出接种分离的且在表2中示出的23个细菌菌株的混合物(23-mix)、氯仿处理的人粪便(+huChlo)和柔嫩梭杆菌(+Faecali)的成年GF小鼠的结肠中Foxp3+CD4+细胞的积累的代表性图。误差线表示SD。**P<0.01，如学生t检验所计算的。
[图13]图13示出是+2x104小鼠的盲肠内容物接种的二次(+2x104-re)和三次(+2x104-re-re)接受者的成年GF小鼠和接种来自+2x104小鼠的2x104倍稀释的盲肠样品的成年GF小鼠(+(2x104)2)中Foxp3+CD4+细胞的积累的代表性图。
[图14]图14示出使用454测序仪对来自已限定小鼠(+hu、+huChlo、+2x104、+2x104-re、(+2x104)2、+23-,mix)的盲肠内容物进行16s rDNA焦磷酸测序的结果。示出每只小鼠中盲肠细菌群落中OTU的相对丰度(％)和所指示的OTU在数据库中的最近菌株和对应分离菌株的数目。
[图15]图15示出接种分离的且在t表4中示出的17个细菌菌株的混合物(17-mix)成年IQI、BALB和B6GF小鼠的结肠中Foxp3+CD4+细胞的代表性图。**P<0.01，如学生t检验所计算的。
[图16]图16示出单定殖了表4中列出的17个菌株(17-mix)中的每个的成年IQI GF小鼠中Foxp3+CD4+细胞的积累的代表性图。
[图17]图17示出定殖了表4中列出的3-mix、5mix-A、5-mix-B、5-mix-C或17-mix的成年IQI GF小鼠中Foxp3+CD4+细胞的积累的代表性图。圈表示单独的动物。实验进行多于两次，结果相似。误差 线表示SD。**P<0.01，*P<0.05，ns，不显著，如学生t检验所计算的。
[图18]图18示出重复接种17-mix(SPF+17mix；n＝5)或对照物(SPF+cont；n＝6)的成年SPF小鼠中Foxp3+CD4+细胞的积累的代表性图。**P<0.01，如学生t检验所计算的。
[图19]图S19示出如通过定量腹泻分数测量的接种17-mix对腹泻OVA模型的作用。*P<0.05，如学生t检验所计算的。
[图20]图20示出在暴露于三硝基苯磺酸(TNBS，在结肠炎实验模型中使用的试剂)后接种表4中列出的17个细菌菌株的混合物(17-mix)的成年小鼠的存活率。
[图21]图21示出溃疡性结肠炎受试者和健康受试者的人粪便微生物群中17-mix菌株中的每个的相对丰度。将MetaHIT数据库中15个健康受试者和20个溃疡性结肠炎受试者的公共可获得的读数与17个菌株的基因组进行比对。示出对于17个菌株基因组的健康组和UC组中的图谱读数的平均数。误差线代表SEM。*P<0.05，如学生t检验所计算的。
表的简述
表1示出从对由小鼠#A1、#C4、#F8、#G2、#H3、#I3、#J3和#K3的盲肠内容物提取的细菌DNA进行16srRNA编码基因扩增和PCR元测序实现的序列分类获得的每个OTU的检测读数和最近亲属的数目(每个样品3400个读数)(基于使用BLAST获得的与核酸数据库中的序列的序列相似性进行分类，>97％同一性)。
表2示出使用BL琼脂板或EG琼脂板从小鼠#F8、#G2、#I1和#K3的盲肠内容物分离的十七个细菌菌株中的每个在已知物种中的最近亲属、与所述最近亲属的最大相似性、其在梭菌簇中的分类、小鼠ID的起源和用于分离的培养基。
表3示出使用BL琼脂板或EG琼脂板从小鼠#F8、#G2、#I1和#K3的盲肠内容物分离的31个细菌菌株中的每个在已知物种中的最近亲属、与所述最近亲属的最大相似性、用于BLAST研究的数据库和菌株之间的相似性。
表4示出分离的31个菌株中的每个的16S rDNA分析。从所述31个菌株中的每个分离细菌DNA并通过菌落-PCR扩增分离株的16S rDNA。对每个扩增的DNA进行纯化、测序并使用ClustalW软件程序进行比对。基于每个菌株的16S rDNA序列，示出其最近物种、与所述最近物种的相似性％和与其它菌株的相似性。包括在23-mix、17-mix、5-mixA、5-mixB、5-mixC和3-mix中的菌株标记在右边柱图中。
实施方案的描述
详述
<具有诱导调节性T细胞的增殖或积累的效应的组合物>
本文描述一种诱导调节性T细胞的增殖、积累或调节性T细胞的增殖和积累两者的组合物。所述组合物包含作为活性成分的以下各项中的一种或多种：选自由以下各项组成的组的一种(至少一种，一种或多种)生物体：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌 WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM14662；所述细菌中的一种或多种的培养上清液；本文描述的一种(至少一种，一种或多种)细菌已经在其中生长的培养基的组分；由本文描述的一种(至少一种；一种或多种)细菌获得的生理活性物质；以及包含含有与本文描述的任何细菌物种的DNA的核苷酸序列具有至少97％同源性的核苷酸序列的DNA的一种(至少一种；一种或多种)细菌。本文描述的细菌是使用实施例19至28中概述的方法从人粪便样品中分离的。
术语“调节性T细胞”是指抑制异常或过度免疫应答并且在免疫耐受中起作用的T细胞。调节性T细胞通常是转录因子Foxp3阳性CD4阳性T细胞。本发明的调节性T细胞还包括转录因子Foxp3阴性调节性T细胞，其是产生IL-10的CD4阳性T细胞。
术语“诱导调节性T细胞的增殖或积累”包括诱导未成熟T细胞向调节性T细胞分化的效应，该分化导致调节性T细胞的增殖和/或积累。另外，“诱导调节性T细胞的增殖或积累”的含义包括体内效应、体外效应和离体效应。因此，包括所有以下效应：通过施用或摄取属于梭菌纲的上述细菌、所述细菌的培养上清液或一种或多种上清液组分、或由所述细菌获得的生理活性物质而在体内诱导调节性T细胞的增殖或积累的效应；通过使属于梭菌纲的上述细菌、所述细菌的培养上清液或一种或多种上清液组分、或由所述细菌获得的生理活性物质作用于培养的调节性T细胞而诱导培养的调节性T细胞的增殖或积累的效应；和通过使属于梭菌纲的上述细菌、所述细菌的培养上清液或一种或多种上清液组分、或由所述细菌获得的生理活性物质作用于从活生物体收集并意图随后将其引入活生物体，如其所获自的生物体或另一生物体的调节性T细胞而诱导调节性T细胞的增殖或积累的效应。诱导调节性T细胞的增殖或积累的效应可例如如下评估。具体地，将属于梭菌纲的上述细菌、所述细菌的培养上清液或一种或多种 上清液组分、或由所述细菌获得的生理活性物质口服施用于实验动物如无菌小鼠，然后分离结肠中的CD4阳性细胞，并通过流式细胞术测量该CD4阳性细胞中含有的调节性T细胞的比例(参考实施例7)。
由本发明的组合物诱导其增殖或积累的调节性T细胞优选是转录因子Foxp3阳性调节性T细胞或产生IL-10的调节性T细胞。
在本发明中，“人源细菌”意指已从获自人个体的粪便样品或胃肠活检样品分离或其祖先是从获自人的粪便样品或胃肠活检样品分离的细菌物种(例如，是获自粪便样品或胃肠活检样品的细菌的子代)。例如，所述细菌物种可以是早先已从获自人的粪便样品或胃肠活检样品分离并且培养了足够时间以产生子代。所述子代可以接着进一步培养或冷冻。所述人源细菌是居住在人个体，优选健康人个体的胃肠道的天然存在的共生体。
在本发明中，术语“梭菌纲”(如“含有属于梭菌纲的细菌的组合物”中的)是指属于厚壁菌门的具有形成孢子的能力的一类革兰氏阳性专性厌氧细菌。要注意的是，虽然目前此纲中的大多数细菌都包括在梭菌目中，但此分类仍然部分基于古老方法并且可能在未来基于使得能够对此纲中的细菌的完整基因组进行测序的测序技术的新进展进行重新定义。表2提供了属于梭菌纲的17种丰富物种的分类的概述，所述物种已被本发明人鉴别为强大的Treg诱导者并且在体外培养。所有这些物种根据当前分类规则落在梭菌科中，并且属于IV、XIVa、XVI和XVIII簇。
本发明的组合物可包括任何上述细菌物种的一个单独菌株(仅一个菌株)，但所述细菌的两个或更多个菌株可以一起使用。例如，表2或表4中列出的菌株中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六或十七个菌株可以任何组合一起用于影响调节性T细胞。在一些实施方案中，表4中列出的23、17、5或3种物种混合物可以一起使用(并且在一种或几种组合物中施 用)以影响调节性T细胞。在一些实施方案中，可以组合以下菌株(所述组合物包含)：如表4中描述的菌株1(OTU136，最近物种：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298)；菌株3(OTU221，最近物种：普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATTC29799)；菌株4(OTU9，最近物种：Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1)；菌株5(OTU296，最近物种：闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA)；菌株6(OTU21，最近物种：Blautia coccoides、毛螺菌科细菌6_1_63FAA)；菌株7(OUT166，最近物种：梭菌属种、难辨梭菌ATCC BAA-613)；菌株8(OTU73，最近物种：参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A)；菌株9(OTU174，最近物种：吲哚梭菌、Anaerostipes caccae DSM 14662)；菌株10(OTU166，最近物种：难辨梭菌、难辨梭菌ATCC BAA-613)；菌株12(OTU55，最近物种：毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1)；菌株13(OTU337，最近物种：Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241)；菌株14(OTU314，最近物种：瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA)；菌株15(OTU195，最近物种：Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981)；菌株16(OTU306，最近物种：共生梭菌、共生梭菌WAL-14163)；菌株18(OTU46，最近物种：多枝梭菌、多枝梭菌)；菌株21(OTU87，最近物种：扭曲真杆菌、梭菌属种D5)；菌株23(OTU152，最近物种：毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1)；菌株24(OTU253，最近物种：颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes)；菌株25(OTU259，最近物种：扭曲真杆菌、梭菌属种D5)；菌株26(OTU281，最近物种：闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA)；菌株27(OTU288，最近物种：毛螺菌科细菌A4、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1)；菌株28(OTU344，最近物种：梭菌属种316002/08、梭菌目细菌1_7_47FAA)；以及菌株29(OTU359，最近物种：毛螺菌科细菌A4、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1)。
在一些实施方案中，可以组合以下菌株(所述组合物包含)：如表 4中描述的菌株1(OTU136，最近物种：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298)；菌株3(OTU221，最近物种：普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATTC29799)；菌株4(OTU9，最近物种：Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1)；菌株6(OTU21，最近物种：Blautia coccoides、毛螺菌科细菌6_1_63FAA)；菌株7(OUT166，最近物种：梭菌属种、难辨梭菌ATCC BAA-613)；菌株8(OTU73，最近物种：参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A)；菌株9(OTU174，最近物种：吲哚梭菌、Anaerostipes caccae DSM 14662)；菌株13(OTU337，最近物种：Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241)；菌株14(OTU314，最近物种：瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA)；菌株15(OTU195，最近物种：Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981)；菌株16(OTU306，最近物种：共生梭菌、共生梭菌WAL-14163)；菌株18(OTU46，最近物种：多枝梭菌、多枝梭菌)；菌株21(OTU87，最近物种：扭曲真杆菌、梭菌属种D5)；菌株26(OTU281，最近物种：闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA)；菌株27(OTU288，最近物种：毛螺菌科细菌A4、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1)；菌株28(OTU344，最近物种：梭菌属种316002/08、梭菌目细菌1_7_47FAA)；以及菌株29(OTU359，最近物种：毛螺菌科细菌A4、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1)。
在一些实施方案中，可以组合以下菌株(所述组合物包含)：如表4中描述的菌株1(OTU136，最近物种：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298)；菌株4(OTU9，最近物种：Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1)；菌株16(OTU306，最近物种：共生梭菌、共生梭菌WAL-14163)；菌株27(OTU288，最近物种：毛螺菌科细菌A4、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1)；以及菌株29(OTU359，最近物种：毛螺菌科细菌A4、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1)。在一些实施方案中，可以组合以下菌株：如表4中描述的菌株6(OTU21，最近物种：Blautia coccoides、毛螺菌科细菌6_1_63FAA)；菌株8(OTU73， 最近物种：参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A)；菌株13(OTU337，最近物种：Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241)；菌株14(OTU314，最近物种：瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA)；以及菌株26(OTU281，最近物种：闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA)。在一些实施方案中，可以组合以下菌株：如表4中描述的菌株3(OTU221，最近物种：普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATTC29799)；菌株7(OUT166，最近物种：梭菌属种、难辨梭菌ATCC BAA-613)；菌株9(OTU174，最近物种：吲哚梭菌、Anaerostipes caccae DSM 14662)；菌株15(OTU195，最近物种：Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981)；以及菌株28(OTU344，最近物种：梭菌属种316002/08、梭菌目细菌1_7_47FAA)。在一些实施方案中，可以组合以下菌株：如表4中描述的菌株1(OTU136，最近物种：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298)；菌株2(OTU46，最近物种：普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATTC29799)；以及菌株3(OTU221，最近物种：普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATTC29799)。
组合使用上述细菌物种(优选属于梭菌XIVa簇或IV簇)的多个菌株可以对调节性T细胞产生优异的效果。除了属于XIVa和IV簇的细菌之外，还可使用多枝梭菌、Clostridium saccharogumia(属于XVIII簇)和参照梭菌属种MLG055(属于XVI簇)。如果使用细菌的多于一个菌株(例如，属于XIVa簇的一个或多个菌株，属于IV簇的一个或多个菌株，属于XVIII或XVI簇的一个或多个菌株或前述任何的组合)，所用的菌株的数目和比例可以广泛地变化。所用的数目和比例可以基于多种因素确定(例如，期望的效应，如调节性T细胞的增殖或积累的诱导或抑制；待治疗、预防或减轻严重程度的疾病或病状；接受者的年龄或性别；健康人中的菌株的典型数量)。
菌株可以存在于单一组合物中，在这种情况下，它们可被一起消耗或摄取(在单一组合物中)，或可以存在于多于一种组合物中(如，各 自可在单独的组合物中)，在这种情况下它们可被单独消耗或所述组合物可以被组合并且消耗或摄取得到的组合(组合的组合物)。可以施用证实是有效的菌株的任何数目或组合(例如1至22，如1至20、1至15、1至10、1至5、1至3、1至2的任何数及之间的任何数，或1至23，如1至23、3至23、5至23、1至20、1至17、3至17、5至17、1至15、1至10、1至5、3至5、1至3、1至2的任何数及之间的任何数)。
在本发明的某些实施方案中，使用本公开所描述的22个或23个(例如，实施例32和表4中的23个菌株)菌株的一些或全部的组合。例如，可以使用所描述的22个或23个菌株中的至少一个、两个或更多个、三个、三个或更多个、四个、四个或更多个、五个、五个或更多个、六个、六个或更多个或任何其它数目，包括22个或23个菌株。在一些实施方案中，可以使用表4中描述的3、5、17或23个菌株的特定组合(所述组合物包含表4中描述的3、5、17或23个菌株的组合)。它们可以彼此组合使用或与引用文献中未描述的菌株组合使用。
属于梭菌纲的细菌细胞，如本文具体描述的那些可以孢子形式或繁殖体形式使用。从高温和压力条件稳定性、延长的保存期、处理方便、抗生素抗性、无需冷链储存与配送观点来看，细菌优选呈孢子形式。从遵守无法容忍其设施中的孢子污染的某些生产组织的指令观点来看，细菌可替代地以营养细胞形式产生(并且稍后施用)。
本发明的术语“由属于梭菌纲的细菌获得的生理活性物质”包括细菌中含有的物质、细菌的分泌产物和细菌的代谢产物。此类生理活性物质可通过借助已知的纯化方法从所述细菌、其培养上清液或仅定殖了属于梭菌纲的细菌的小鼠的肠道的肠道内容物纯化活性组分来鉴别。
获自人的粪便样品的“氯仿处理”是这样一种方法：分离粪便样品中具有形成孢子能力的细菌，并且没有特别限制，只要所述孢子形成 级分是通过用氯仿(例如，3％氯仿)处理人粪便获得的即可，并且具有诱导调节性T细胞(包括哺乳动物调节性T细胞，如鼠调节性T细胞或人调节性T细胞)的增殖或积累的效应。
当在培养基中培养上述“属于梭菌纲的细菌”时，细菌中含有的物质、细菌产生的分泌产物和代谢产物从细菌释放。本发明的组合物中的活性成分“细菌的培养上清液”的含义包括此类物质、分泌产物和代谢产物。培养上清液没有特别限制，只要所述培养上清液具有诱导调节性T细胞的增殖或积累的效应即可。培养上清液的实例包括培养上清液的蛋白级分、培养上清液的多糖级分、培养上清液的脂质级分和培养上清液的低分子量代谢产物级分。
细菌组合物可以药物组合物、膳食补充剂或食品或饮料(其也可以是动物饲料)的形式施用，或可作为动物模型实验的试剂使用。所述药物组合物、膳食补充剂、食品或饮料和试剂诱导调节性T细胞的增殖或积累。本文提出的一个实例揭示由属于梭菌纲的细菌等诱导的调节性T细胞(Treg细胞)抑制效应T细胞的增殖。本发明的组合物可适宜用作具有免疫抑制效应的组合物。免疫抑制效应可例如如下评估。使从口服施用本发明的组合物的实验动物如小鼠分离的调节性T细胞作用于从脾分离的效应T细胞(CD4⁺CD25^-细胞)，并且通过使用[³H]-胸苷的摄取量作为指标测量其增殖能力(参考实施例14)。
本发明的组合物可用作，例如，用于预防或治疗(部分或完全降低其不利影响)自身免疫性疾病，如慢性炎性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化或桥本氏病，过敏性疾病如食品过敏、花粉症或哮喘，传染性疾病如艰难梭菌感染，炎性疾病如TNF介导的炎性疾病(例如，胃肠道的炎性疾病如结肠袋炎、心血管炎性病状如动脉硬化、或炎性肺病如慢性阻塞性肺病)的药物组合物；用于抑制器官移植中的排斥或可能出现组织排斥的其它情况的药物组合物；用于提高免疫功能的补充剂、食品或饮料；或用于抑制效应T细胞的增殖或功能的试剂。
所述组合物有效治疗(降低不利影响或预防)的目标疾病的更多具体实例包括自身免疫性疾病、过敏性疾病、传染性疾病和器官移植中的排斥，如炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、口炎性腹泻、自身免疫性关节炎、类风湿性关节炎、I型糖尿病、多发性硬化、骨髓移植后移植物抗宿主病、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、莱姆关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病、甲状腺炎、哮喘、银屑病、皮炎硬皮病、特应性皮炎、移植物抗宿主病、急性或慢性与器官移植相关的免疫疾病、结节病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、川崎病(Kawasaki’s disease)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、肾病综合征、慢性疲劳综合征、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、过敏性紫癜(Henoch-Schoenlejn purpurea)、肾脏显微性血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、败血性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、多腺体缺陷I型综合征和多腺体缺陷Ⅱ型综合征、施密特氏综合征(Schmidt’s syndrome)、成人(急性)呼吸窘迫综合征、脱发、斑秃、血清反应阴性关节病、关节病、莱特氏病(Reiter’s disease)、银屑病性关节病、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关的关节病、脊柱关节病、动脉粥样硬化疾病/动脉硬化、过敏性结肠炎、特应性过敏反应、食品过敏(如花生过敏、树坚果过敏、鸡蛋过敏、牛奶过敏、大豆过敏、小麦过敏、海鲜过敏、贝类过敏或芝麻籽过敏)、自身免疫性大疱病、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、类天疱疮、线状IgA病、自身免疫性溶血性贫血、库姆斯阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、幼年型恶性贫血、肌痛脑炎/慢性疲劳综合征(Royal Free Disease)、慢性皮肤粘膜念珠菌病、巨细胞动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐源性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关的疾病、丙型肝炎、常见的变异型免疫缺陷病(常见的变异型低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、肺纤维化疾病、隐源性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺疾病、间质性肺炎、结缔组织病相关的间质性肺疾病、混合性结缔组 织病相关性肺疾病、系统性硬化病相关的间质性肺疾病、类风湿性关节炎相关的间质性肺疾病、系统性红斑狼疮相关性肺疾病、皮肌炎/多肌炎相关性肺疾病、干燥综合征相关性肺疾病、强直性脊柱炎相关性肺疾病、血管炎弥漫性肺疾病、含铁血黄素沉着病相关性肺疾病、药物引起的间质性肺疾病、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、淋巴细胞浸润性肺疾病、感染后肺间质疾病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(典型自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、B型胰岛素抵抗黑棘皮症、甲状旁腺功能减退、器官移植相关的急性免疫疾病、器官移植相关的慢性免疫疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、特发性白细胞减少症、自身免疫性中性粒细胞减少、肾疾病NOS、肾小球肾炎、肾脏显微性血管炎、盘状红斑狼疮、红斑狼疮、特发性男性不育或NOS、精子自身免疫性疾病、多发性硬化症(所有亚型)、不依赖胰岛素的糖尿病、交感性眼炎、结缔组织组织疾病继发性肺动脉高压、肺出血肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、肺部表现的结节性多动脉炎、急性类风湿热、类风湿性脊椎炎、斯蒂尔氏病(Still’s disease)、系统性硬化症、高安氏病(Takayasu’s disease)/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺疾病、甲状腺功能亢进、甲状腺肿自身免疫性甲状腺功能减退(桥本氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退症、原发性粘液水肿、晶状体源性葡萄膜炎、原发性小血管炎、白癜风、过敏性鼻炎(花粉过敏)、过敏性反应、宠物过敏、乳胶过敏、药物过敏、过敏性鼻结膜炎、嗜酸性粒细胞性食管炎、嗜酸性细胞增多综合征、嗜酸细胞性胃肠炎皮肤红斑性狼疮、嗜酸性粒细胞性食管炎、嗜酸性细胞增多综合征和嗜酸细胞性胃肠炎及腹泻。
所述组合物有效治疗的目标疾病的另外实例包括结肠癌、囊性纤维化、乳糜泻、2型糖尿病、与孤独症相关的病态免疫。这些疾病的特征是减少胃肠微生物群中的梭菌IV和XIV簇。
本文描述的组合物还可用作用于在例如由于由免疫性引起的过 度炎症或患者微生物群改变产生的损害造成的对传染性疾病的抗性受损的个体中预防或治疗传染性疾病的药物组合物。损害宿主稳态的维持或恢复、并最终导致这种免疫病理学组织损伤的传染性病原体的实例包括沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、艰难梭菌、分支杆菌属(Mycobacterium)(其引起结核病)、原生动物(其引起疟疾)、丝虫属(其引起丝虫病)、血吸虫属(Schistosoma)(其引起血吸虫病)、弓形体属(Toxoplasma)(其引起弓形体病)、利什曼原虫属(Leishmania)(其引起利什曼病)、HCV和HBV(其引起丙型肝炎和乙型肝炎病)和单纯疱疹病毒(其引起疱疹病)。
可通过本领域技术人员已经的药物配制方法由所描述的细菌组合物配制药物制品。例如，所述组合物可以以下列形式口服或胃肠外使用：胶囊剂、片剂、丸剂、小药囊、液体、粉剂、颗粒剂、细颗粒剂、薄膜包衣制品、丸剂、锭剂、舌下制品、咀嚼剂、含服制品、膏剂、糖浆剂、混悬剂、酏剂、乳剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、透皮吸收系统、洗剂、吸入剂、气雾剂、注射剂、栓剂等。
为了配制这些制品，所述细菌组合物可以与药学上可接受的载体或对于摄取如在食品或饮料中可接受的载体适当地组合使用，所述载体包括以下各项中的一种或多种：无菌水、生理盐水、植物油、溶剂、基质、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、芳香剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂、稀释剂、等渗调节剂、安抚剂、填充剂、崩解剂、缓冲剂、包衣剂、润滑剂、着色剂、甜味剂、增稠剂、调味矫正剂、增溶剂和其它添加剂。
为了更有效地诱导结肠中调节性T细胞的增殖或积累，药物制品或制剂，且特别是用于口服施用的药物制品包含能够将本发明的细菌组合物有效递送到结肠的另外组分。可以使用多种能够将所述细菌组合物递送到结肠的药物制品。其实例包括pH敏感型组合物，更具体地，缓冲小药囊制剂或肠溶聚合物，所述肠溶聚合物在通过胃之后当pH变为碱性时释放它们的内容物。当使用pH敏感型组合物配制药 物制品时，pH敏感型组合物优选是组合物分解的pH阈值在约6.8与约7.5之间的聚合物。这样的数值范围是在胃的远端部分当pH向碱性侧转变时的范围，并因此是用于递送到结肠的合适范围。
有效将细菌组合物递送到结肠的药物制品的另一个实施方案是通过延迟内容物(例如，细菌组合物)释放大约3至5小时(其对应于小肠通过时间)来确保递送到结肠的药物制品。在用于延迟释放的药物制品的实施方案中，使用水凝胶作为壳。水凝胶在与胃肠液接触后水化并溶胀，从而有效释放内容物(主要在结肠中释放)。延迟释放剂量单位包括具有包衣或选择性包衣待施用的药物或活性成分的材料的含药物的组合物。此类选择性包衣材料的实例包括体内降解聚合物、可逐渐水解的聚合物、可逐渐水溶的聚合物和/或可酶降解的聚合物。各种各样的有效延迟释放的包衣材料是可获得的，并且包括例如基于纤维素的聚合物如羟丙基纤维素、丙烯酸聚合物和共聚物如甲基丙烯酸聚合物和共聚物，以及乙烯聚合物和共聚物如聚乙烯吡咯烷酮。
能够递送到结肠的组合物的实例还包括特异地粘附到结肠粘膜的生物粘附性组合物(例如，美国专利号6.368.586的说明书中描述的聚合物)，和并入了蛋白酶抑制剂以保护特定的生物药物制品在胃肠道中不会由于蛋白酶的活性而分解的组合物。
能够递送到结肠的系统的实例是通过压力变化将组合物递送到结肠的系统，方式是通过利用由在胃的远端部分的细菌发酵中的气体产生引起的压力变化释放内容物。此类系统没有特别限制，并且其更具体的实例是内容物分散在栓剂基质中并且用疏水性聚合物(例如，乙基纤维素)包衣的胶囊。
能够递送到结肠的系统的另一个实例是将组合物递送到结肠的系统，所述系统被结肠中存在的酶(例如，碳水化合物水解酶或碳水化合物还原酶)特异性地分解。此类系统没有特别限制，且其更具体的实例包括使用食品组分如非淀粉多糖、直链淀粉、黄原胶和偶氮聚 合物的系统。
当用作药物制品时，所述细菌组合物可以与已知的用于免疫抑制的药物组合物组合使用。在一些实施方案中，药物制品可包含所述细菌组合物和已知的药物组合物两者。此类已知的药物组合物没有特别限制，并且可以是选自由以下各项组成的组的至少一种治疗组合物：皮质类固醇、美沙拉嗪、氨水杨酸、柳氮磺吡啶、柳氮磺吡啶衍生物、免疫抑制药物、环孢菌素A、巯嘌呤、硫唑嘌呤、泼尼松、甲氨蝶呤、抗组胺剂、糖皮质激素、肾上腺素、茶碱、色甘酸钠、抗白三烯剂、抗胆碱能鼻炎药物、抗胆碱能减充血剂、肥大细胞稳定剂、单克隆抗-IgE抗体、疫苗(优选其中过敏原的量逐渐增加的用于接种的疫苗)、抗TNF抑制剂(如英利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗或依那西普)及其组合。优选将这些治疗组合物与本文描述的细菌组合物组合使用。所述细菌组合物还可用作佐剂以提高疫苗制剂如用于预防或治疗自身免疫性疾病或过敏性疾的疫苗的功效。
所述细菌组合物可以用作食品或饮料，如健康食品或饮料、婴幼儿食品或饮料、孕妇、运动员、老年人或其它特定人群食品或饮料、功能性食品、饮料、用于特定健康用途的食品或饮料、膳食补充剂、患者食品或饮料、或动物饲料。食品和饮料的具体实例包括各种饮料如果汁、清凉饮料、茶饮料、饮料制品、果冻饮料和功能性饮料；酒精饮料，如啤酒；含碳水化合物的食品，如大米食品产品、面条、面包和面食；糊制品，如鱼火腿、香肠、海鲜糊制品；蒸煮袋产品，如咖喱、沾有厚淀粉调味料的食品和中国汤；汤；乳制品，如牛奶、乳饮料、冰淇淋、奶酪和酸奶；发酵产品，如发酵大豆糊剂、酸奶、发酵饮料和腌菜；豆制品；各种糖果产品，如西方糖果产品(包括饼干、曲奇等)、日本糖果产品(包括蒸豆果酱包子、软赤豆果冻等)、糖果、口香糖、软糖、冷甜点(包括果冻、奶油焦糖和冰冻甜点)；即食食品，如速食汤和速食大豆汤；微波炉加热的食品；等等。另外，实例还包括以粉末、颗粒、片、胶囊、液体、糊剂和果冻形式制备的健康食品和饮料。本发明的组合物可用于包括人类在内的动物。除了人类以外 的动物，没有特别的限制，并且所述组合物可用于各种家畜、家禽、宠物、实验动物等。动物的具体实例包括猪、牛、马、绵羊、山羊、鸡、野鸭、鸵鸟、家鸭、狗、猫、兔、仓鼠、小鼠、大鼠、猴等，但动物不限于这些。
不希望受理论束缚，其中属于厚壁菌门组(梭菌IV和XIVa簇所属的组)的细菌是相对丰富的个体比其中属于拟杆菌门组的细菌是相对丰富的个体获得更多体重。所述细菌组合物能够调节营养素的吸收和改善饲料效力。从这样的观点来看，所述细菌组合物可用于促进体重增加或用于高效力的动物饲料。将受益于体重增加的疾病和病状包括，例如饥饿、癌症、AIDS、胃肠道病症(例如腹腔疾病、胃溃疡、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、胰腺炎、胃炎、腹泻)、甲状腺功能亢进、感染、肾病、心脏病、肺病、结缔组织病、药物引起的体重减轻、食欲减退、阿狄森氏病、老年痴呆症、抑郁症、高血钙症、帕金森氏病和结核。
向不含抗生素的动物饲料加入所述细菌组合物可能使摄取所述动物饲料的动物的体重增加至等于或高于摄取含有抗生素的动物饲料的动物所达到的水平，并且还可能使胃中的病原性细菌降低至等于在消耗典型含有抗生素动物饲料的动物中的水平。所述细菌组合物可用作不需加入抗生素的动物饲料的组分。
另外，与不易并入家畜生产的商业用途中的常规细菌(乳杆菌和双歧杆菌)不同，孢子形式的本发明的细菌组合物可以制丸、喷雾或容易地与动物饲料混合，并且还可加入到饮用水中。
包含所述细菌组合物的动物饲料可以饲喂给多种类型的动物和不同年龄的动物，并且可以以规律间隔饲喂或在某些时间段饲喂(例如，出生时、断奶期间或在迁移或装运动物时)。
所述细菌组合物可用于在人和非人(例如，农场动物或其它食用动物)中促进体重增加并且增强能量吸收。
所述细菌组合物的细菌活性组分可使用本领域熟知的发酵技术来生产。在一个实施方案中，使用可支持属于梭菌纲的细菌物种的快速生长的厌氧发酵罐生产所述活性成分。所述厌氧发酵罐可以是例如搅拌槽反应器或一次性波生物反应器。如BL培养基和EG培养基的培养基，或这些培养基的不含动物组分的类似版本可用于支持所述细菌物种的生长。细菌产物可通过传统技术如离心和过滤从发酵液中纯化并浓缩，并且可任选地通过本领域熟知的技术进行干燥和冻干。
可通过技术领域中熟知的生产技术生产包含本文描述的细菌组合物的食品或饮料。可以向食品或饮料中加入对于通过免疫抑制效应提高免疫功能有效的一种或更多组分(例如，营养素)。另外，损伤食品或饮料可与展示出免疫功能提高之外的功能的另一组分或另一功能性食品组合，从而充当多功能性食品或饮料。
此外，所述细菌组合物可以并入需要可能破坏普通的益生菌菌株的加工步骤的食品。具体地，大多数商业可用的益生菌菌株不能并入到需要例如通过热处理、长期储存、冷冻处理、机械应力或高压处理(例如，挤压成型或滚压成型)进行加工的食品中。另一方面，由于形成孢子的有利性质，本文描述的细菌组合物可容易地并入到此类加工食品中。例如，孢子形式的细菌组合物可以甚至在干燥的食品中存活，并且甚至可以在被摄取后存活。所述细菌组合物可以忍受低温灭菌工艺，通常是在约70℃至约100℃(包括两个端值)的温度下进行的工艺。可将所述细菌组合物并入需要巴氏杀菌步骤的乳制品中。而且，所述细菌组合物可以忍受多年的长期储存；高温加工如烘烤和煮沸；低温加工如冷冻和冷藏；和高压处理如挤压成型和滚压成型。
需要在此类严苛条件下加工的许多类型的食品包括需要在微波炉中加工才能食用的食品(例如，燕麦片)、需要烘烤才能食用的食品(例如，松饼)、需要经受短时间段高温处理灭菌才能食用的食品(例如，牛奶)和需要加热才能饮用的食品(例如，热茶)。
待施用或摄取的细菌组合物的量可考虑如将接受其的个体的年龄、体重、性别、症状、健康状况，以及待施用或摄取的细菌组合物的种类(药物产品、食品或饮料)这类因素来凭经验确定。例如，每次施用或摄取的量一般是0.01mg/kg体重至100mg/kg体重，并且在具体实施方案中是1mg/kg体重至10mg/kg体重。本文还描述一种用于抑制受试者的免疫性(减少免疫应答)的方法，所述方法特征在于，所述受试者如上所述地施用或摄取属于梭菌纲的细菌或由所述细菌获得的生理活性物质。
可向个体施用所述细菌组合物一次，或可施用它多于一次。如果施用所述组合物多于一次，则可规律地施用(例如，每天一次、每两天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每6个月一次或每年一次)或根据需要或不规律地施用。可凭经验确定适当的施用频率(其可根据受试者的宿主遗传学、年龄、性别和健康或疾病情况，以及其它因素)。例如，患者可被施用一个剂量的组合物，并且获自所述患者的粪便样品中的组合物的细菌菌株的水平可在不同时间(例如，在1天后、2天后、1周后、2周后、1个月后)进行测量。当细菌水平降至例如其最大值的一半时，可施用第二个剂量，诸如此类。
包含所述细菌组合物的产品(药物产品、食品或饮料或试剂)或其手册可伴有解释所述产品可用于抑制免疫性的文件或声明(包括所述产品具有免疫抑制效应的声明，和所述产品具有抑制效应T细胞的增殖或功能的效应的声明)。这里，“关于产品或其手册标注注意事项的规定”意指在产品的主体、容器、包装等上提供文件或声明，或在手册、包装插页、活页或公开关于产品的信息的其它印刷品上提供注意事项。
<诱导调节性T细胞的增殖或积累的方法>
如上所述和如实施例中显示的，向个体施用所述细菌组合物使得可能在个体中诱导调节性T细胞的增殖或积累。这提供了一种在个体 中诱导调节性T细胞的增殖或积累的方法，所述方法包括向个体施用选自由以下各项组成的组的至少一种物质：(a)Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM 14662；(b)本文所描述/列出的细菌中的至少一种(一种，一种或多种)的培养上清液；(c)由本文所描述/列出的一种(一种或多种，至少一种)细菌获得的生理活性物质；或(a)、(b)和(c)中的任何两种或三种的组合。将所述细菌组合物以足够的量施用于(提供给)个体以产生所需的诱导调节性T细胞的增殖、积累或增殖和积累两者的效应。将所述细菌组合物施用于有治疗、减轻其严重程度或预防选自自身免疫性疾病、炎性疾病、过敏性疾病和传染性疾病的至少一种疾病需要的个体。
应注意，“个体”或“受试者”可以处于健康状态或疾病状态。
所述方法可进一步包括在所述细菌组合物之前施用至少一种(一种，一种或多种)抗生素或与所述细菌组合物组合施用的任选步骤。所施用的抗生素可以是例如促进梭菌纲的革兰氏阳性细菌的肠重新定殖的抗生素，如减少革兰氏阴性细菌的抗生素。此类抗生素的实例包括氨基糖苷类抗生素(丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素和巴龙霉素)、头孢菌素类抗生素(头孢克罗、 头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松和cefoxotin)、磺胺类药物、氨苄青霉素和链霉素。
此外，在上胃肠道中不被分解并促进肠道微生物在肠道中的生长的益生组合物如扁桃仁皮、菊糖、低聚果糖、棉子糖、乳果糖、果胶、半纤维素(如木葡聚糖和α-葡聚糖)、支链淀粉和抗性淀粉，以及生长因子如乙酰辅酶A、生物素、甜菜糖蜜和酵母提取物，优先有助于组合物中的属于梭菌纲的细菌物种的增殖。一种在个体中诱导调节性T细胞的增殖和/或积累的方法可包括向所述个体施用选自以上的至少一种物质与所述细菌组合物的组合。本文还涵盖一种包含所述细菌组合物和益生[00]组合物的组合物。
上述抗生素、上述益生组合物或生长因子可以组合使用。此外，可将治疗组合物与选自由所述细菌组合物、抗生素和益生组合物或生长因子组成的组的至少一种物质一起向个体施用。
治疗组合物可以是例如选自由以下各项组成的组的一种治疗组合物：皮质类固醇、美沙拉嗪、氨水杨酸、柳氮磺吡啶、柳氮磺吡啶衍生物、免疫抑制药物、环孢菌素A、巯嘌呤、硫唑嘌呤、泼尼松、甲氨蝶呤、抗组胺剂、糖皮质激素、肾上腺素、茶碱、色甘酸钠、抗白三烯剂、抗胆碱能鼻炎药物、抗胆碱能减充血剂、肥大细胞稳定剂、单克隆抗-IgE抗体、疫苗(优选其中过敏原的量逐渐增加的用于接种的疫苗)、抗TNF抑制剂(如英利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗或依那西普)及其组合。这些治疗组合物可以在所述细菌组合物的施用之前、之后或与之组合施用，并且任选地还与抗生素、益生组合物、生长因子或抗生素、益生组合物和生长因子的任何组合组合施用。
治疗组合物与选自由所述细菌组合物、“抗生素”和“益生组合物或生长因子”组成的组的至少一种物质的组合使用没有特别限制。例 如，向个体口服或胃肠外地同时或施用或在任何适当的时间循序地/单独地施用“一种物质”和所述治疗组合物。
施用所述细菌组合物是否诱导调节性T细胞的增殖和/或积累可通过使用以下各项中的至少一种的增加或增强作为指标进行确定：调节性T细胞的数目、结肠T细胞群中调节性T细胞的比例、调节性T细胞的功能或调节性T细胞的标志物的表达。一种具体方法是测量作为调节性T细胞的增殖或积累的诱导的指标的患者样品(如活检或血液样品)中表达Foxp3的Treg的计数或百分比、IL-10表达的增加(增强)、CTLA4表达的增加(增强)、IDO表达的增加(增强)、IL-4表达的抑制或个体的所施用细菌组合物的定殖。
用于检测此类表达的方法包括在转录水平检测基因表达的RNA印迹、RT-PCR和点印迹；和在翻译水平检测基因表达的ELISA、放射免疫测定、免疫印迹、免疫沉淀和流式细胞术。
可用于测量这种指标的样品包括获自个体的组织和流体，如在活检中获得的血液和粪便样品。
<用于通过监测个体对用细菌组合物进行的治疗的响应来预测所述个体对所述组合物的响应的方法>
还描述一种其中测定了患者样品(例如结肠活检或粪便样品)中的选自由以下各项组成的组的至少一种细菌物种的量(例如计数)或百分比的方法：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤 胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM14662。当个体中选自以上列表的细菌的百分比或计数低于通过对健康个体(例如，还未被鉴别患有所述细菌组合物是其潜在治疗的疾病或病状，如自身免疫性疾病、过敏性病状、癌症、器官排斥的个体)进行类似测定获得的基线时，则确定所述个体可能响应于所述细菌组合物。此测定可例如由临床医生使用来测定个体或患者是否可能受益于用所述细菌组合物进行的治疗，或选择个体或患者用以包括在临床试验中。接着临床医生可以基于所述个体或患者可能受益于治疗的测定而向所述个体或患者施用所述细菌组合物。此测定还可用作监测个体对用所述细菌组合物进行的治疗的响应的方法，其中用细菌组合物治疗后的测定的更高的值(与治疗前的测定相比)表明所述个体已有利地响应于治疗(例如，这是个体中成功的定殖和增强的免疫抑制的正指示物)。任选地，此处描述的预防和监测方法可进一步包括以下步骤：在个体样品中测量属于梭菌IV和XIVa簇的但不存在于所述细菌组合物中的其它共生物种的百分比或绝对计数，其中低于治疗前的基线值表明更高的对治疗正响应的可能性，并且其中治疗后增加的值表明所述个体已有利地响应于治疗。在此处描述的预防和监测方法中，多种已知方法可用于测定组合物的微生物群。例如，可使用16S rRNA测序
<疫苗佐剂组合物和用于通过使用疫苗组合物治疗或预防传染性疾病或自身免疫性疾病的方法>
如上所述和如实施例中所显示的，属于梭菌纲的细菌对结肠中Treg细胞的诱导在局部和全身免疫应答中具有重要作用。所述细菌组合物也可用作用以提高疫苗制剂的功效的佐剂。在一个实施方案中，所述细菌组合物可用作用于预防或治疗自身免疫性疾病或过敏性疾 病的疫苗的佐剂(例如，作为其中过敏原的量逐渐增加的疫苗方案的佐剂)。
自身免疫性疾病和过敏性疾病的实例包括如<具有诱导调节性T细胞的增殖或积累的效应的组合物>中的“目标疾病的具体实例”所描述的那些。
其它实施方案
所述细菌组合物还可施用于还接受抗生素治疗的个体。本发明人已经证明抵抗革兰氏阳性细菌的抗生素如万古霉素和甲硝哒唑可有效消除或大大减少来自哺乳动物的胃肠道的属于梭菌纲的细菌物种，并且随后降低调节性T细胞的水平(实施例5，图30)。不希望受理论束缚，属于梭菌纲的细菌在保存免疫耐受性中的关键作用强烈表明它们的缺乏或降低的水平可在特征为免疫耐受性不足的自身免疫性疾病中起到关键作用。因此，经受针对革兰氏阳性细菌的抗生素的进程的个体(例如，正被治疗病原体如艰难梭菌和贾第虫属(Giardia)感染的个体)，其有经历属于梭菌纲的细菌缺失并且因此经历免疫耐受性不足的高风险，可通过使用所述细菌组合物预防性地“重新住入”。所述细菌组合物可在抗生素治疗之前、同时或之后施用，但优选与抗生素治疗同时施用或在其之后施用。所述细菌组合物优选以孢子形式施用以提高其对残余抗生素的抗性。针对革兰氏阳性细菌的抗生素包括但不限于：万古霉素、甲硝哒唑、利奈唑胺、雷莫拉宁、非达霉素、头孢菌素类抗生素(头孢氨苄、头孢呋辛、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢噻吩、头孢克罗、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯和头孢托罗)；氟喹诺酮类抗生素(环丙沙星、左氟沙星、氧氟沙星、加替沙星、莫西沙星和诺氟沙星)；四环素类抗生素(四环素、米诺环素、土霉素和多西环素)；青霉素类抗生素(阿莫西林、氨苄西林、青霉素V、双氯青霉素、羧苄西林、万古霉素和甲氧西林)；和碳青霉烯抗生素(厄他培南、多利培南、亚胺培南/西司他丁和美罗培南)。
<选择诱导Treg的生物体的方法>
还描述一种获得能够诱导Treg的细菌的方法，其包括：(1)从获自哺乳动物优选人的粪便或活检样品分离细菌孢子形成级分(例如，通过氯仿处理或通过热处理)；(2)任选地，向非人哺乳动物优选无菌非人哺乳动物口服施用所述孢子形成级分；(3)任选地，从所述非人哺乳动物获得粪便样品，稀释所述粪便样品(例如按体积计以10、100、1,000或10,000的因数稀释)，从而产生稀释的粪便样品，并且将稀释的样品口服施用于第二无菌非人哺乳动物，其中任选步骤(3)可重复多于一次；(4)在需氧条件或严格厌氧条件下铺板(1)中获得的孢子形成级分或(3)的非人哺乳动物的肠内容物的样品的连续稀释物；以及(5)从培养板挑取单个菌落。可使用已知的方法如实施例中描述的那些针对细菌诱导调节性T细胞的增殖和/或调节性T细胞的积累的能力对所述菌落进行进一步评估。
以下是实施例，它们描述了具体方面。它们不意图以任何方式受限制。
注意，实施例中使用的小鼠是如下制备或产生的。在以下描述中，小鼠可被称为“SPF”或”GF”。这些“SPF”和“GF”分别表明小鼠维持在不存在特定病原性细菌(无特定病原体，SPF)条件下，和小鼠维持在无菌(GF)条件下。
<小鼠>
维持在SPF或GF条件下的C57BL/6、Balb/c和IQI小鼠购自Sankyo Labo Service Corporation，Inc.(日本)、JAPAN SLC，INC.(日本)、CLEA Japan，Inc.(日本)或Jackson实验室(美国)。GF小鼠和定菌小鼠被饲喂和维持在东京大学(University of Tokyo)、Yakult Central Institute for Microbiological Research或Sankyo Labo Service Corporation，Inc的定菌设施内。Myd88^-/-、Rip2^-/-和Card9^-/-小鼠如NPL1至3所描述产生，并回交8代或更多代，以得到C57BL/6遗传 背景。Foxp3^eGFP小鼠购自Jackson实验室。
<Il10^venus小鼠>
为了形成在Il10启动子控制下的编码Il10和Venus的双顺反子基因座，首先创建了靶向构建体。具体地，将盒(IRES-Venus-SV40polyA信号盒，参考非专利文献4)插入到Il10基因的终止密码子和polyA信号(外显子5)之间，该盒由内部核糖体进入位点(IRES)、黄色荧光蛋白(Venus)和SV40polyA信号(SV40polyA)制成，并紧邻新霉素抗性基因(neo)排列。接下来，使用获得的靶向构建体以引起与小鼠基因组中的Il10基因区的同源重组。由此产生具有Il10^venus等位基因的Il10^venus小鼠(参考图1)。注意，在图1中，“tk”代表编码胸苷激酶的基因，”neo”代表新霉素抗性基因，并且”BamH1”代表限制性酶BamH1的切割位点。
从Il10^venus小鼠中提取基因组DNA，用BamH1处理，并通过使用图1中显示的探针进行DNA印迹。图2显示了获得的结果。野生型和Il10^venus等位基因分别检测为具有19kb和5.5kb大小的条带。因此，如从获得的结果明显的，在Il10^venus小鼠基因组中出现同源重组。
另外，通过使用FACSAria分选Il10^venus小鼠的结肠固有层中的CD4⁺Venus^-细胞或CD4⁺Venus⁺细胞。然后，通过稍后描述的方法在ABI7300系统上进行实时RT-PCR，以确定表达的IL-10mRNA的量。发现，由于仅在CD4⁺Venus⁺细胞中检测到了IL-10mRNA的形成，所以Il10^venus小鼠中IL-10mRNA的表达正确地反映于Venus的表达中。注意，此类Il10^venus小鼠的无菌状态是在Central Institute for Experimental Animals(日本川崎)建立的。将处于无菌状态的Il10^venus小鼠维持在Sankyo Labo Service Corporation，Inc.(日本东京)的乙烯基隔离器中，并用于以下实施例。
如下进行实施例中的实验和分析。
<向小鼠定殖鼠细菌的方法及其分析>
根据NPL5和6中的描述，产生了其中定殖SFB或梭菌属的小鼠。将获得的定菌小鼠的盲肠内容物或粪便溶解在无菌水或厌氧稀释溶液中。将溶解的盲肠内容物或粪便原样或在氯仿处理后口服施用于GF小鼠。将乳杆菌属的3个菌株和拟杆菌属的16个菌株以厌氧方式彼此分开地培养在BL或EG琼脂培养基中。收获培养的细菌、悬浮于厌氧TS培养液中并强制口服施用于GF小鼠。通过对粪便颗粒的涂片制品进行显微观察来评估小鼠中细菌的定殖状态。
<肠固有层淋巴细胞的分离和流式细胞术>
收集小肠和结肠并纵向打开。还分离盲肠并将盲肠内容物直接在-80℃下冷冻或悬浮于2ml PBS中，然后添加40％甘油(最终浓度20％)，在液氮中急速冷冻并储存在-80℃下直到使用。在PBS中洗涤结肠和小肠以除去所有腔内容物，并且在含有5mM EDTA的汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中在37℃下振荡20分钟。使用镊子除去上皮细胞、肌肉层和脂肪组织后，将固有层切成小块并与含有4％胎牛血清、1mg/ml胶原酶D、0.5mg/ml分散酶和40微克/ml DNA酶I的RPMI1640(全部来自Roche Diagnostics)在37℃下在振荡水浴中孵育1小时。消化的组织用含有5mM EDTA的HBSS洗涤，重悬于5ml40％Percoll(GE Healthcare)并覆盖于15-ml Falcon管中的2.5ml80％Percoll上。通过在800g在25℃离心20分钟进行Percoll梯度分离。从Percoll梯度的界面收集固有层淋巴细胞并悬浮于冰冷的PBS中。对于调节性T细胞的分析，在分析中用LIVE/DEAD可固定的紫色死细胞染色试剂盒(Invitrogen)标记分离的淋巴细胞以排除死细胞。细胞用含有PBS、2％FBS、2mM EDTA和0.09％NaN3的染色缓冲液洗涤并用PECy7标记的抗-CD4Ab(RM4-5，BD Biosciences)对表面CD4进行染色。Foxp3和Helios的胞内染色使用Alexa700标记的抗-Foxp3Ab(FJK-16s,eBioscience)、Alexa647标记的抗-Helios(22F6,eBioscience)和Foxp3染色缓冲液套装(Foxp3Staining Buffer Set) (eBioscience)进行。对于Th1和Th17细胞的分析，在GolgiStop(BD Biosciences)存在下用50ng/ml佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA,Sigma)和1微克/ml离子霉素(Sigma)刺激分离的淋巴细胞4小时。在孵育4小时后，在PBS中洗洗涤细胞，用LIVE/DEAD可固定的紫色死细胞染色试剂盒标记并用PECy7标记的抗-CD4Ab对表面CD4进行染色。洗涤细胞，在Cytofix/Cytoperm中固定，用Perm/Wash缓冲液(BD Biosciences)透化，并用APC-标记的抗-IL-17Ab(eBio17B7,eBioscience)和FITC-标记的抗-IFN-γAb(XMG1.2,BD Biosciences)染色。用LSR Fortessa(BD Biosciences)分析Ab染色的细胞，并使用Flow Jo软件(Treestar)分析数据。
<实时RT-PCR>
由使用Rneasy迷你试剂盒(RNeasy Mini Kit)(Qiagen)制备的RNA，通过使用MMV反转录酶(Promega KK)合成cDNA。所获得的cDNA通过使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)和ABI7300实时PCR系统(Applied Biosystems)的实时RT-PCR，或使用SYBR Premix Ex Taq(TAKARA)和Light Cycler480的实时RT-PCR进行分析。对于每个样品，将获得的值针对GAPDH的量进行标准化。引物组通过使用Primer Express版本3.0(Applied Biosystems)进行设计，并选择在初始评价中表现出90％或更高序列一致性的那些。使用的引物组如下所示：
Foxp3
5′-GGCAATAGTTCCTTCCCAGAGTT-3′(SEQ ID NO：1)
5′-GGGTCGCATATTGTGGTACTTG-3′(SEQ ID NO：2)
CTLA4
5′-CCTTTTGTAGCCCTGCTCACTCT-3′(SEQ ID NO：3)
5′-GGGTCACCTGTATGGCTTCAG-3′(SEQ ID NO：4)
GITR
5′-TCAGTGCAAGATCTGCAAGCA-3′(SEQ ID NO：5)
5′-ACACCGGAAGCCAAACACA-3′(SEQ ID NO：6)
IL-10
5′-GATTTTAATAAGCTCCAAGACCAAGGT-3′(SEQ ID NO：7)
5′-CTTCTATGCAGTTGATGAAGATGTCAA-3′(SEQ ID NO：8)
GAPDH
5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′(SEQ ID NO：9)
5′-TCTCCACTTTGCCACTGCAA-3′(SEQ ID NO：10)
Mmp2
5′-GGACATIGTCTTTGATGGCA-3′(SEQ ID NO：11)
5′-CTTGTCACGTGGTGTCACTG-3′(SEQ ID NO：12)
Mmp9
5′-TCTCTGGACGTCAAATGTGG-3′(SEQ ID NO：13)
5′-GCTGAACAGCAGAGCCTTC-3′(SEQ ID NO：14)
Mmp13
5′-AGGTCTGGATCACTCCAAGG-3′(SEQ ID NO：15)
5′-TCGCCTGGACCATAAAGAA-3′(SEQ ID NO：16)
Ido1
5′-AGAGGATGCGTGACTTTGTG-3′(SEQ ID NO：17)
5′-ATACAGCAGACCTTCTGGCA-3′(SEQ ID NO：18)。
<大肠上皮细胞(IEc)的制备和培养>
首先，收集结肠，纵向切开，并用PBS润洗。随后，将结肠用1mM二硫苏糖醇(DTT)在37℃在振荡仪上处理30分钟，然后涡旋一分钟以破坏上皮完整性。收集释放的肠上皮细胞(IEC)，并悬浮于5ml 20％percoll。将悬浮液覆盖于15-ml Falcon管中的2.5ml80％percoll上。然后，将管在25℃和780g离心20分钟以通过percoll密度梯度离心进行细胞分离。收集界面处的细胞，并用作结肠IEC(纯度：90％或更高，存活率：95％)。将收集获得的IEC悬浮于含有10％FBS的RPMI中，并将1x10⁵个IEC细胞在24-孔板中培养24小时。之后，收集培养上清液，并通过ELISA(Promega)测量活性TGF-β1水平。
同时，对于体外T细胞培养，在存在或不存在25微克/ml抗-TGF-β抗体(R&D)下，将1.5x10⁵个MACS纯化的脾CD4⁺T细胞与其中培养从GF小鼠或梭菌属定殖的小鼠分离的IEC的50％条件培养基一起和与25ng/ml hIL-2(Peprotech)一起培养在圆底96-孔板的每个孔中。注意，圆底板结合了10微克/ml抗-CD3抗体和抗-CD28抗体(BD Bioscience)。5天培养之后，收集CD4⁺T细胞，并进行实时PCR。
<结肠炎实验模型>
将来自梭菌属定殖的小鼠的粪便悬浮液口服施用给C57BL/6小鼠(2周龄)，使其在常规环境中生长六周。
为了制备DSS诱导的结肠炎模型，将2％(wt/vol)DSS(试剂级，DSS盐，分子量＝36至50kD，由MP Biomedicals生产)与饮用水一起施用于小鼠，持续六天。
同时，为了制备噁唑酮诱导的结肠炎模型，通过在小鼠上透皮应用150微升3％噁唑酮(4-乙氧基亚甲基-2-苯基-2-噁唑啉-5-酮,Sigma-Aldrich)/100％乙醇溶液将小鼠预先敏化。五天之后，在轻度麻醉下向预先敏化的小鼠再次直肠内施用150微升1％噁唑酮/50％乙醇溶液。注意，直肠内施用通过使用3.5F导管进行。
每天分析每只小鼠的体重、潜血、裸眼可见的出血(总出血)和粪便硬度。此外，以数值评价体重损失百分比、肠出血(无出血、潜血(hemoccult+)或裸眼可见的出血)和粪便硬度(正常粪便、稀粪或腹泻)， 并根据“S.Wirtz、C.Neufert、B.Weigmann、M.F.Neurath,Nat Protoc2,541(2007)”中的描述计算疾病活性指数(DAI)。
<OVA特异性IgE反应>
向BALB/c SPF小鼠接种来自梭菌属定殖的小鼠(2周龄)的粪便悬浮液，并且在常规环境中生长。然后，向小鼠(在4周龄和6周龄时)腹膜内注射总共0.2ml的1微克OVA(V级，Sigma)和2mg明矾(Thermo Scientific)。每周从小鼠的尾根部收集血清，并通过ELISA(Chondrex)测量OVA-特异性IgE。然后，在其8周龄时，收集脾细胞，以每孔1x10⁶个细胞接种到96-孔板，并用OVA(100微克/ml)刺激三天。之后，收集培养上清液，并通过ELISA(R&D)测量IL-4和IL-10水平。
<统计分析>
对照组和实验组之间的差异通过学生t-检验评价。
<氯仿处理和给GF小鼠口服接种粪便样品>
将健康志愿者(日本人，男性，29岁)的人粪便(2g)悬浮于20ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并通过70微米细胞滤过器以消除团块和碎片。将粪便悬浮液与或不与氯仿(最终浓度3％)混合，并在振荡水浴中孵育60分钟。将不经氯仿处理的粪便悬浮液口服接种给无菌(GF)小鼠(250微升/小鼠)。通过用N2气鼓泡30分钟蒸发氯仿后，将含有人肠道细菌的氯仿抗性(孢子形成)级分的等份接种给IQI GF小鼠。将每组ex-GF小鼠单独保持在乙烯基隔离器中3或4周。
<共同饲养实验>
为了评价诱导Treg的人细菌是否可以水平地转移，将IQI GF小鼠与定殖氯仿处理的人粪便的ex-GF小鼠(实施例21小鼠)共同饲养在乙烯基隔离器中4周(6只小鼠，定名为小鼠#D1至#D6
<给GF小鼠接种稀释的盲肠内容物>
将接种氯仿处理的人粪便的ex-GF小鼠(#C4)的冷冻盲肠内容物悬浮于10倍体积(w/v)的PBS中，通过70微米细胞滤过器并用3％氯仿处理。然后将悬浮液用PBS稀释2000倍(对于4只小鼠，定名为小鼠#E1至#E4)或20000倍(对于8只小鼠，定名为小鼠#F1至#F8)并口服接种给GF IQI小鼠(2.5x10⁵或2.5x10⁴个细胞/250微升/小鼠)。4周后，从结肠和小肠收集淋巴细胞并分析Foxp3+Treg细胞比例和它们的Helios表达。冷冻盲肠内容物并储存在-80℃下直到使用。
<重新定殖实验>
将接种20000倍稀释物的ex-GF小鼠(#F3、7和8)的冷冻盲肠内容物悬浮于10倍体积(w/v)的PBS中，通过70微米细胞滤过器并用3％氯仿处理。将悬浮液口服接种给GF IQI小鼠(5、4或4只小鼠；分别定名为小鼠#G1至#G5、#H1至#H4或#I1至#I4)。4周后，收集结肠和小肠并分析Foxp3+Treg细胞比例和它们的Helios表达。将盲肠内容物悬浮于20％甘油溶液中，于液氮中快速冷冻并在-80℃下储存。
<培养的细菌定殖实验>
将#G2小鼠的盲肠内容物的甘油储备物用PBS稀释并接种到BL琼脂板上。48小时后，用刮板通过刮擦收集所有细菌菌落，并接种给GF IQI小鼠(4只小鼠，定名为小鼠#K1至#K4)。使用BL琼脂板从#F8小鼠的盲肠内容物的冷冻储备物分离六个细菌菌株。将这些分离的菌株接种给GF IQI小鼠(4只小鼠，定名为小鼠#J1至#J4)。(培养方法的细节在下面描述。)
<16S rRNA基因定量PCR分析
使用QIAamp DNA Stool微型试剂盒(QIAGEN)，从如上所述的健康志愿者的人粪便(人粪便)或强饲氯仿处理的人类粪便的GF小鼠 的盲肠内容物(B-4小鼠的盲肠内容物)或SPF ICR小鼠的粪便(SPF小鼠的粪便)分离细菌基因组DNA。分离的DNA用作定量PCR的模板。扩增程序包括一个循序的95℃持续1分钟，接着50个循环的95℃持续10秒和60℃持续30秒。使用LightCycler 480(Roche)进行定量P CR分析。相对量通过ΔCt方法计算并且标准化为总细菌的量。使用以下引物组：总细菌，5’-GGTGAATACGTTCCCGG-3’(SEQ ID NO.:45)和5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.:46)；梭菌XIVa簇(球形梭菌(Clostridium coccoides)亚群)，5’-AAATGACGGTACCTGACTAA-3’(SEQ ID NO.:47)和5’-CTTTGAGTTTCATTCTTGCGAA-3’(SEQ ID NO.:48)；梭菌IV簇(柔嫩梭菌(Clostridium le ptum))5’-CCTTCCGTGCCGSAGTTA-3’(SEQ ID NO.:49)和5’-GAATTA AACCACATACTCCACTGCTT-3’(SEQ ID NO.:50)；拟杆菌属，5’-GAGAGGAAGGTCCCCCAC-3’(SEQ ID NO.:51)和5’-CGCTACTTGGCTGGTTCAG-3’(SEQ ID NO.:52)；长双歧杆菌属，5’-CGGGTGAGTAATGCGTGACC-3’(SEQ ID NO.:53)和5’-TGATAGGACGCGACCCCA-3’(SEQ ID NO.:54)。注意，与氯仿处理前的人粪便相比，强饲氯仿处理的人类粪便的小鼠展现出高水平的孢子形成细菌，如梭菌XIVa簇和IV簇，和非孢子形成细菌如拟杆菌属和长双歧杆菌属的严重减少。
<从盲肠内容物分离DNA用于16S rRNA基因元序列(Metasequence)分析>
通过在5000x g，4℃下离心10分钟收集A1-1、A2-4、B-4、E-3、E-7、E-8、F-2、G-3、H-3、I-3和J-3的盲肠内容物，悬浮于含有10mM Tris-HCl和1mM EDTA(pH8)的10ml Tris–EDTA中，并且然后用于DNA分离。向细胞悬浮液加入溶菌酶(SIGMA，15mg/ml)。在37℃下轻轻混合孵育1小时后，加入纯化的无色肽酶(Wako)(最终2000单位/ml)并在37℃下孵育30分钟。然后，向细胞悬浮液加入十二烷基硫酸钠(最终1％)并充分混合。随后，向悬浮液加入蛋白酶K(Merck)(最终1mg/ml)并将混合物在55℃下孵育1小时。分离高分 子量DNA并通过苯酚/氯仿提取、乙醇和最终的聚乙二醇沉淀进行纯化。
<16S rRNA基因元序列>
使用一个DNA等份用于PCR扩增和细菌16S rRNA基因的测序。跨越基因的可变区1-2(V1-2)的约330bp扩增子通过使用以下各项产生(i)：修饰的引物8F(5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG+条形码+agrgtttgatymtggctcag-3’(SEQ ID NO.:55))，其由454个接头序列(adaptor sequence)(加下划线的)、样品特异性的错误校正条形码(10个碱基，粗体)和通用细菌引物8F组成；以及
(ii)修饰的引物338R(5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG+tgctgcctcccgtaggagt-3’(SEQ ID NO.:56))，其包含454个接头序列(adaptor sequence)(加下划线的)和细菌引物338R。对每个粪便D NA样品进行聚合酶链反应：每个50微升反应包含40ng DNA、5微升10XEx Taq缓冲液(TAKARA)、5微升2.5mM dNTP混合物、0.2微升Ex Taq和0.2μM各引物。PCR条件包括在96℃进行2分钟的初始变性步骤，随后20个循环的变性(96℃，30秒)、退火(55℃，45秒)和扩增(72℃，1分钟)以及最终的在72℃下进行10分钟的扩增步骤。由每个样品产生的扩增子随后使用AMPur XP(Beckman Cou lter)来纯化。DNA的量使用Quant-iT Picogreen dsDNA测定试剂盒(I nvitrogen)和TBS-380迷你荧光计(TBS-380mini Fluorometer)(Turner Biosystems)进行定量。扩增的DNA用作454GS Junior(Roche)焦磷酸测序的模板。根据制造商的手册(GS Junior Titanium Series,emPC R Amplification Method Manual-Lib-L and Sequencing Method Manual)使用GS Junior Titanium emPCR Kit-Lib-L、GS Junior Tita nium测序试剂盒和GS Junior Titanium PicoTiterPlate试剂盒(都来自Roche)进行测序。基于序列相似性(>97％同一性)将所得的序列(对于每个样品产生3400个读数)分类为OTU。使用BLAST将每个OTU的代表性序列与核酸数据库(Ribosomal Database Project)中的序列进 行比较以确定最近亲属。然后，基于最近亲属将OTU分类为多个种。所有最近亲属的数据和读数数目显示于表1中。
<细菌菌株的分离>
通过在需氧条件或严格厌氧条件(80％N210％H210％CO2)下将盲肠样品的连续稀释物铺在BL琼脂板(Eiken Chemical)或EG琼脂板上而从#F8、#G2、#I1和#K3的盲肠内容物分离细菌菌株，所述BL琼脂板或EG琼脂板包含具有以下组分(量以每升表示)的培养基：肉提取物500ml；月示蛋白胨No.3(10.0g，Difco)；酵母提取物(5.0g，Difco)；Na2HPO4(4.0g)；D(+)-葡萄糖(1.5g)；可溶性淀粉(0.5g)；L-胱氨酸(0.2g)，L-半胱氨酸-HCl-H2O(0.5g)；Tween80(0.5g)；Bacto Agar(16.0g，Difco)；去纤维蛋白的马血(50ml)。在37℃下培养2或4天后，挑取每个单个菌落并通过ABCM培养液或EG琼脂板在37℃下再培养2或4天。将分离的菌株收集到EG储备培养基(10％DMSO)中并在-80℃下储存。对于用以再接种小鼠的分离菌株的悬浮液，TS培养基(27.5g胰酶解酪蛋白大豆培养液w/o右旋糖、0.84g Na2CO3、0.5g L-半胱氨酸-HCl-H2O、1000ml蒸馏水，用NaOH调节pH至7.2+/-0.2，然后在115摄氏度下热压处理15分钟)。为了鉴别分离的菌株，进行16SrRNA编码基因测序。使用KOD FX(TOYOBO)，16S rRNA基因特异性引物对：用于吲哚梭菌、难辨梭菌、拟杆菌属种MANG、毛螺菌科细菌DJF_VP30、A.colihominis、瘤胃球菌属种ID8、C.lavalense、共生梭菌和扭曲真杆菌的8F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.:57))和519R(5’-ATTACCGCGGCKGCTG-3’(SEQ ID NO.:58))或用于C.saccharogumia、多枝梭菌、F.plautii、C.hathewayi、闪烁梭菌、梭菌属种2335、梭菌属种14616和参照梭菌属种MLG055的1513R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.:59))以及GeneAmp PCR System9700(Applied Biosystems)通过菌落-PCR扩增16S rRNA基因。扩增程序包括一个循环的98℃持续2分钟，接着40个循环的98℃持续10秒、57℃持续30秒和68℃持续40秒。使用 Illustra GFX PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(Gel Band Purification Kit)(GE Healthcare)从反应混合物纯化每个扩增的DNA。使用BigDye Terminator V3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)和Applied Biosystems3730xl DNA分析仪(Applied Biosystems)进行序列分析。使用BLAST将所得序列与核酸数据库中的序列进行比较以确定最近亲属。所有分离菌株的最近亲属和同一性％、最近亲属的属种信息、梭菌簇、由其获得的小鼠ID、分离菌株的最大相似性和培养基概述于表2中。
实施例1
实施例1：首先，研究结肠固有层中调节性T细胞(Treg细胞)的积累是否依赖于共生细菌。具体地，从在不存在特定病原性细菌(SPF)下饲喂的Balb/c小鼠的外周淋巴结(pLN)或从该小鼠的结肠或小肠(SI)固有层中分离淋巴细胞。通过抗体对CD4和Foxp3进行染色。然后，通过流式细胞术分析CD4⁺淋巴细胞中Foxp3⁺细胞的比例。结果显示Foxp3⁺Treg细胞以高频率存在于在无特定病原性微生物(SPF)环境下保持的小鼠的胃肠道的固有层，特别是结肠固有层。另外，还发现结肠固有层中Foxp3⁺Treg细胞的数目逐渐增加直至其出生后三个月，而外周淋巴结中Foxp3⁺Treg细胞的数目从出生后两周基本保持恒定。
实施例2
实施例2：接下来，研究了实施例1中发现的结肠中Treg细胞的时间积累是否与肠道共生微生物群的定殖有关系。具体地，分析了从在无菌(GF)或SPF环境下饲喂的小鼠(8周龄：Balb/c小鼠、IQI小鼠和C57BL/6小鼠)的小肠、结肠和外周淋巴结分离的淋巴细胞中CD4的表达和Foxp3的表达。在三次或更多次的独立实验中获得了相似的结果。
另外，从SPF小鼠和GF小鼠(Balb/c小鼠或C57BL/6小鼠)收集 固有层淋巴细胞。用抗体染色CD4和Foxp3。然后，通过FACS分析固有层淋巴细胞。
另外，从随水口服施用抗生素八周的小鼠(SPF C57BL/6小鼠)的结肠固有层、小肠固有层(SI)、派尔集合淋巴结(PP)和肠系膜淋巴结(MLN)分离淋巴细胞。用抗体染色CD4和Foxp3。然后，通过FACS分析淋巴细胞。在两次或更多次的独立实验中获得了相似的结果(个体小鼠的CD4⁺细胞中Foxp3⁺细胞的比例)。注意，根据以下文献的描述组合使用以下抗生素：
氨苄西林(A；500mg/L，Sigma)
万古霉素(V；500mg/L，NACALAI TESQUE，INC.)
甲硝哒唑(M；1g/L，NACALAI TESQUE，INC.)
新霉素(N；1g/L，NACALAI TESQUE，INC.)
Rakoff-Nahoum,J.Paglino,F.Eslami-Varzaneh,S.Edberg,R.Medzhitov,Cell118,229(2004年7月23日)
Fagarasan等,Science298,1424(2002年11月15日)
如从所述结果明显的，GF小鼠的小肠和外周淋巴结中Foxp3⁺CD4⁺细胞的频率和绝对数目等于或大于SPF小鼠的那些。另外，口服施用抗生素八周的SPF小鼠的小肠固有层、派尔集合淋巴结和肠系膜淋巴结中Treg细胞的数目等于或大于还未接受抗生素的SPF小鼠的那些。同时，GF小鼠的结肠固有层中Foxp3⁺CD4⁺细胞的数目与SPF小鼠的数目相比显著下降。此下降在不同遗传背景的小鼠(Balb/c、IQI和C57BL/6)中以及在于不同动物设施中饲喂的小鼠中常观察到。另外，还显示施用抗生素的SPF C57BL/6小鼠的结肠固有层中Treg细胞的数目显著下降。
实施例3
实施例3：接下来，直接检查实施例2中显示的GF小鼠的结肠固有层中Treg细胞的数目的下降是否归因于微生物群的不存在。具体地，向GF-IQI小鼠口服施用购自The Jackson Laboratory的B6SPF小鼠的粪便悬浮液(惯例化)。施用三周后，从结肠固有层分离淋巴细胞，并分析CD4⁺淋巴细胞中的Foxp3的表达。结果显示小肠固有层中Treg细胞的数目未改变。然而，结肠固有层中Treg细胞的数目显著增加。因此，说明宿主-微生物相互作用在结肠固有层中Foxp3⁺Treg细胞的积累中起重要作用，而小肠固有层中Treg细胞的积累具有不同的机制。
实施例4
实施例4：接下来，根据M.N.Kweon等,J Immunol174,4365(2005年4月1日)中描述的方法研究了小鼠的肠相关淋巴样组织与小鼠的结肠固有层中Foxp3⁺细胞的数目之间的关系。具体地，将100微克胞外域重组蛋白(淋巴毒素β受体(LTβR)与人IgG1的Fc区之间的融合蛋白(LTβR-Ig)，参考Honda等，J Exp Med193，621(2001年3月5日))腹膜内注射到受孕后14天的怀孕C57BL/6小鼠中。再次将LTβR-Ig腹膜内注射到由这种小鼠获得的胎儿，以产生从中完全去除单独的淋巴滤泡(ILF)、派尔集合淋巴结(PP)和结肠斑(CP)的小鼠。然后，通过FACS分析用LTβR-Ig处理的小鼠和用大鼠IgG处理的小鼠(对照)的结肠固有层中的CD4⁺细胞中Foxp3⁺细胞的比例。结果显示，单独的淋巴滤泡、派尔集合淋巴结和结肠斑缺陷的小鼠(用LTβR-Ig处理的小鼠)的结肠固有层中Foxp3⁺细胞的比例反而是增加的。因此，这表明GF小鼠和用抗生素治疗的小鼠的结肠固有层中Treg细胞的数目的降低是由于促进结肠固有层中Treg细胞的积累和由肠道微生物引起的特定信号的传播没有发生，而不是简单地由于无组织的肠相关的淋巴样组织的继发效应。
实施例5
实施例5：为了研究特定的肠道菌群是否诱导结肠Treg细胞的积累，将万古霉素作为针对革兰氏阳性细菌的抗生素或多粘菌素B作为针对革兰氏阴性细菌的抗生素施用给SPF小鼠(自4周龄)持续四周，并分析CD4⁺细胞群中Foxp3⁺细胞的比例(CD4中的Foxp3⁺[％])。
结果显示，施用万古霉素的小鼠的结肠中Treg细胞的数目与对照的数目相比显著下降。相比之下，未观察到施用多粘菌素B对小鼠Treg细胞的数目的影响。这些事实表明革兰氏阳性共生细菌在Treg细胞的积累中起主要作用。
实施例6
实施例6：最近的报道表明孢子形成细菌在肠道T细胞应答中起重要作用(参见V.Gaboriau-Routhiau等，Immunity31，677(2009年10月16日))。在此方面，将对3％氯仿具有抗性的粪便微生物(孢子形成级分)口服施用于GF小鼠，然后分析CD4⁺细胞群中Foxp3⁺细胞的比例(CD4中的Foxp3⁺[％])。
施用氯仿处理的粪便三周后，施用小鼠中Treg细胞的数目显著增加到与强制施用未处理的粪便的SPF小鼠和GF小鼠的数目相同的水平。
因此，组合考虑实施例5中显示的结果，这揭示了本土微生物群的特定组分很可能属于革兰氏阳性组，并且孢子形成级分在Treg细胞诱导中起重要作用。
实施例7
实施例7：接下来，鉴定了实施例4至6中表明诱导结肠中Treg细胞的积累的肠道微生物群的物种。具体地，将分节丝状菌(SFB)、拟杆菌属种的16个菌株(Bactero.(普通拟杆菌(B.vulgatus)的6个菌 株、B.acidifaciens组1的7个菌株和B.acidifaciens组2的3个菌株))、乳杆菌的3个菌株(Lacto.(嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)和L.murinum))和梭菌属种的46个菌株(Clost.，参考“Itoh,K.和Mitsuoka,T.Characterization of clostridia isolated from faeces of limited flora mice and their effect on caecal size when associated with germ-free mice.Lab.Animals19:111-118(1985))”)或从在常规环境下饲喂的小鼠(SPF)收集的微生物群口服施用于GF-Balb/c小鼠或GF-IQI小鼠。将小鼠在乙烯基隔离器中维持三周。然后，从这些小鼠的结肠和小肠分离CD4细胞。通过流式细胞术分析结肠和小肠中Treg细胞的数目。
属于梭菌属的细菌通过如下对16S rRNA基因进行测序来分类。具体地，细菌的16S rRNA基因通过PCR使用16S rRNA基因特异性引物对：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:60)和5’-ATTACCGCGGCKGCTG-3’(SEQ ID NO:61)来扩增(参见T.Aebischer等,Vaccination prevents Helicobacter pylori-induced alterations of the gastric flora in mice.FEMS Immunol.Med.Microbiol.46,221-229(2006))。然后将1.5-kb PCR产物引入pCR-Blunt载体。对插入序列进行测序并使用ClustalW软件程序进行比对。由梭菌属的46个菌株的菌株1-41获得的16S rRNA基因的所得序列以SEQ ID NO:21-61显示。使用Mega软件通过邻接方法用得到的梭菌属的41个菌株的序列和从Genbank数据库获得的已知细菌的序列构建系统树。
结果显示，在定殖分节丝状菌(SFB)的GF小鼠中未观察到对结肠中Treg细胞的数目的影响。此外，其中定殖乳杆菌的三个菌株的混合物的小鼠产生相似的结果。另一方面，显示在定殖了梭菌属种的46个菌株的小鼠中强烈诱导结肠固有层中Foxp3⁺细胞的积累。重要的是，这种积累的促进与小鼠的遗传背景无关，并且尽管仅定殖了单一属的肠道微生物群，这种积累导致与SPF小鼠中的增加相似的数目增加。还显示，梭菌属的定殖没有改变小肠固有层中Treg细胞的 数目。注意，当定殖拟杆菌属种的16个菌株时，结肠中的Treg细胞的数目显著增加。然而，增加的程度根据细菌定殖的小鼠的遗传背景而变化。
实施例8
实施例8：接下来，通过流式细胞术分析SPF小鼠、GF小鼠、乳杆菌属定殖的小鼠和梭菌属定殖的小鼠的胸腺和结肠的LP淋巴细胞中的CD4表达、Foxp3表达和Helios表达。
结果显示，SPF小鼠或梭菌属定殖的小鼠中发现的大多数Foxp3⁺细胞不表达Helios。注意，Helios是已知在由胸腺获得的天然Treg细胞中表达的转录因子(参见A.M.Thornton等，J Immunol184，3433(2010年4月1日))。因此，这表明SPF小鼠和梭菌属定殖的小鼠中的大多数Treg细胞是在外周部分中诱导的Treg细胞(所谓的iTreg细胞)。
实施例9
实施例9：接下来，研究了梭菌属等的定殖是否对其它T细胞有影响。具体地，在GF IQI小鼠中定殖SFB、拟杆菌属种的16个菌株(Bactero.)、梭菌属种的46个菌株(Clost.)或从在常规环境下饲喂的小鼠收集的微生物群(SPF)。三周后，从这些小鼠中分离结肠固有层中的淋巴细胞，并在Golgistop(BD Bioscience)存在下用PMA(50ng/ml)和离子霉素(1微克/ml)刺激四小时。给予刺激后，通过使用抗-IL-17PE抗体(TC11-18H10)和抗-IFN-g FITC抗体(BD Bioscience)根据cytofix/cytoperm试剂盒(BD Bioscience)的手册对胞内细胞因子进行染色。然后，通过流式细胞术分析CD4⁺淋巴细胞中IFN-γ⁺细胞或IL-17⁺细胞的比例。结果显示，梭菌属的定殖对结肠中的Th1细胞(CD4⁺IFN-γ⁺细胞)没有任何影响，并且仅引起Th17细胞(CD4⁺IL-17⁺细胞)的轻微增加。因此，这表明梭菌属是特异性地诱导Treg细胞的细菌属。
实施例10
实施例10：已报告梭菌属种的46个菌株对结肠中CD8⁺肠道上皮内淋巴细胞(IEL)的积累具有影响。因此，可以想象梭菌属在不同方面调节免疫系统，并且梭菌属展现出诱导和维持Treg细胞特别是结肠中的Treg细胞的显著能力，如上所述。另外，已知一种细胞因子，转化生长因子-β(TGF-β)，在Treg细胞产生的调节中起重要作用。
从这考虑，检查了梭菌属的定殖是否提供富含TGF-β的结肠环境。具体地，首先，将GF小鼠、梭菌属定殖的小鼠和乳杆菌属定殖的小鼠的完整结肠培养24小时，并且通过ELISA测量其培养上清液的活性TGF-β(TGF-β1)的浓度(分析的小鼠的数目为每组四只)。
结果显示，梭菌属定殖的小鼠的结肠中产生的TGF-β的量显著大于GF小鼠和乳杆菌属定殖的小鼠产生的量。
接下来，将GF小鼠和梭菌属定殖的小鼠的肠上皮细胞(IEC)培养24小时，并通过ELISA测量其培养上清液的活性TGF-β(TGF-β1)的浓度(分析的小鼠的数目为每组四只)。
结果显示，在从梭菌属定殖的小鼠分离的IEC的培养上清液中检测到TGF-β，而在从GF小鼠分离的IEC的培养上清液中没有检测到TGF-β。
接下来，如上所述，在存在或不存在抗-TGF-β抗体下，将脾CD4⁺T细胞与其中培养从GF小鼠或梭菌属定殖的小鼠分离的IEC的50％条件培养基一起和与抗-CD3抗体一起培养5天。然后，收集T细胞，并通过实时RT-PCR分析Foxp3的表达。
结果显示，当将从梭菌属定殖的小鼠获得的IEC的培养上清液加入到脾CD4⁺T细胞时，加速了向表达Foxp3的细胞的分化。同时，向Treg细胞的分化被抗-TGF-β抗体抑制。
研究了MMP2、MMP9和MMP13的表达，认为它们有助于潜在TGF-β的活化。还研究了吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达，认为其参与Treg细胞的诱导。具体地，将梭菌属的46个细菌菌株(Clost.)或乳杆菌属的3个细菌菌株(Lacto.)口服施用给C57BL/6无菌小鼠。施用后三周，收集IEC，并通过实时RT-PCR分析MMP2、MMP9、MMP13和IDO基因的相对mRNA表达水平(分析的小鼠的数目为每组三只)。
有关潜在TGF-β的活化与上述MMP之间的关系，参见D'Angelo等,J.Biol.Chem.276,11347-11353,2001；Heidinger等,Biol.Chem.387,69-78,2006；Yu等,Genes Dev.i4,163-176,2000。有关IDO与Treg细胞的诱导之间的关系，参见G.Matteoli等,Gut59,595(2010年5月)。
结果显示，与上述TGF-β的产生一致，编码MMP2、MMP9和MMP13的基因的转录产物在由梭菌属定殖的小鼠获得的IEC中以比GF小鼠和乳杆菌属定殖的小鼠中的水平更高的水平表达。
此外，IDO仅在梭菌属定殖的小鼠中表达。
因此，这揭示梭菌属活化IEC，并导致TGF-β和其它诱导Treg细胞的分子在结肠中的产生。
实施例11
实施例11：接下来，研究了梭菌属定殖诱导的Treg细胞的积累是否取决于病原体相关的分子模式识别受体的信号传播。具体地，检查了Myd88^-/-(Myd88(Toll-样受体的信号传导接头)缺陷的)、Rip2^-/-(Rip2(NOD受体接头)缺陷的)和Card9^-/-(Card9(Dectin-1信号传播的必需信号传播因子)缺陷的)SPF小鼠中的每一个的结肠固有层中Treg细胞的数目。另外，使梭菌属在Myd88^-/-GF小鼠中定殖，并研究Treg细胞的数目的变化。结果显示，具有病原体相关的分子模式 识别受体的相关因子缺陷的每种SPF小鼠的Treg细胞的数目相对于用作对照的同窝的野生型小鼠的数目没有变化。另外，发现当梭菌属种定殖于Myd88缺陷的GF小鼠时，诱导结肠固有层中Treg细胞的积累。因此，这表明诱导结肠固有层中Treg细胞的积累的机制不是依赖于主要病原体相关的分子模式的识别路径的激活，如大多数细菌所引起的那样，而是依赖于特定的共生细菌物种。
实施例12
实施例12：已知肠道Foxp3⁺Treg细胞通过IL-10产生发挥一些免疫抑制功能(参考NPL9)。同时，已知具有已从中特异性地除去IL-10的CD4⁺Foxp3⁺细胞的动物发展炎性肠病(参考NPL18)。在此方面，首先，检查各种组织的淋巴细胞中IL-10的表达。具体地，从SPF Il10^venus小鼠的各种组织分离淋巴细胞，并通过流式细胞术分析CD4的表达和Venus的表达。
从Il10^venus小鼠中分离结肠固有层中的淋巴细胞，并通过FACS检测细胞表面上的T细胞受体β链(TCRβ)的表达。
从Il10^venus小鼠中分离结肠固有层中的淋巴细胞。在Golgistop(BD Bioscience)存在下用PMA(50ng/ml)和离子霉素(l微克/ml)刺激淋巴细胞四小时。然后，在给予刺激后，通过使用抗-IL-17PE抗体、抗-IL-4APC抗体(11B11)和抗-IFN-g FITC抗体(BD Bioscience)根据cytofix/cytoperm试剂盒(BD Bioscience)的手册对胞内细胞因子进行染色。
另外，从Foxp3^eGFP报告小鼠的脾(Spl)分离Foxp3⁺CD4⁺细胞和Foxp3^-CD4⁺细胞，并且从Il10^venus小鼠的结肠固有层和小肠(SI)固有层分离Venus⁺细胞。对获得的细胞进行关于预定基因的表达的分析。基因表达通过实时RT-PCR使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)和ABI7300实时PCR系统(Applied Biosystems)进行分析。这里，每个细胞的值针对GAPDH的量进行标准化。
结果显示，在保持在SPF条件下的小鼠的颈部淋巴结(外周淋巴结)、胸腺、外周血、肺和肝中几乎没有检测到Venus⁺细胞(产生IL-10的细胞)。同时，在其脾、派尔集合淋巴结和肠系膜淋巴结中，轻微地检测到Venus⁺细胞。另一方面，在小肠固有层和结肠固有层的淋巴细胞中发现许多Venus⁺细胞。另外，肠中的大多数Venus⁺细胞是CD4阳性的，并且还是T细胞受体β链(TCRβ)阳性的。发现Venus⁺CD4⁺T细胞表达Foxp3和其它Treg细胞相关的因子如细胞毒性T-淋巴细胞抗原(CTLA-4)和糖皮质激素诱导的TNFR-相关蛋白(GITR)，尽管Venus⁺CD4⁺T细胞不显示Th2(产生IL-4的)和Th17(产生IL-17的)表型中的任一个。显示肠道Venus⁺细胞中CTLA-4的表达水平高于从Foxp3^eGFP报告小鼠中分离的脾GFP⁺Treg细胞中的表达水平。
实施例13
实施例13：Venus⁺细胞可以基于胞内Foxp3表达分类成至少两个亚群，即，Venus⁺Foxp3⁺双阳性(DP)Treg细胞和Venus⁺Foxp3^-Treg细胞。后一亚群的细胞对应于1型调节性T细胞(Tr1)(参考NPL8和9)。在此方面，对实施例8中观察到的Venus⁺细胞(产生IL-10的细胞)进行了关于Foxp3的表达的研究。具体地，通过FACS分析了保持在GF或SPF条件下的Il10^venus小鼠的结肠固有层和小肠固有层中CD4、Foxp3和Venus的表达，并在SPF和GF Il10^venus小鼠之间比较肠道固有层中Venus⁺细胞的数目。
另外，通过流式细胞术分析了SPF Il10^venus小鼠的各种组织中的CD4细胞中Venus和Foxp3的胞内表达。
为了研究共生细菌的存在是否对于胃肠道中调节性细胞中IL-10的表达具有任何影响，制备了无菌(GF)Il10^venus小鼠。然后，使预定物种的细菌定殖在所获得的GF Il10^venus小鼠中。定殖细菌物种之后三周，通过流式细胞术分析结肠和小肠中表达Foxp3和/或Venus的CD4⁺细胞群(V⁺F^-，Venus⁺Foxp3^-细胞；V⁺F⁺，Venus⁺Foxp3⁺细胞；和V^-F⁺， Venus^-Foxp3⁺细胞)。
为了检查共生细菌的存在是否对于胃肠道中的调节性细胞中的IL-10表达具有任何影响，将抗生素随水一起口服给予每组五只或六只Il10^venus小鼠持续10周。组合使用了以下抗生素。
氨苄西林(A；500mg/L Sigma)
万古霉素(V；500mg/L NACALAI TESQUE，INC.)
甲硝哒唑(M；1g/L NACALAI TESQUE，INC.)
新霉素(N；1g/L NACALAI TESQUE，INC.)
然后，将结肠固有层、小肠(SI)固有层、肠系膜淋巴结(MLN)和派尔集合淋巴结(PP)中的淋巴细胞的CD4和Foxp3用抗体染色，并通过FACS分析。结果获自两次或更多次独立实验，这些实验产生相似的结果。
结果显示，小肠固有层中富含Venus⁺Foxp3^-细胞，即Tr1-样细胞，并且Venus⁺Foxp3⁺DP Treg细胞以高频率存在于SPF小鼠的结肠中。相比之下，虽然也在其它组织中观察到了充足数目的Foxp3⁺细胞，但是几乎在所有这些细胞中都没有观察到Venus的表达。
另外，显示结肠中具有Venus⁺Foxp3^-、Venus⁺Foxp3⁺和Venus^-Foxp3⁺的所有调节性T细胞级分在GF条件下显著下降。此外，还在用抗生素治疗的SPF Il10^Venus小鼠中观察到Venus⁺细胞的相似降低。
梭菌属种的定殖强烈诱导结肠中具有Venus⁺Foxp3^-、Venus⁺Foxp3⁺和Venus^-Foxp3⁺的所有调节性T细胞级分，并且其诱导程度等于SPF小鼠中的那些。另外，发现乳杆菌属的3个菌株的定殖或SFB的定殖对于结肠中Venus⁺和/或Foxp3⁺细胞的数目具有极小的影响。此外，拟杆菌属种的16个菌株的定殖也诱导Venus⁺细胞，但是定殖 的影响对Venus⁺Foxp3^-Tr1-样细胞是特异性的。另一方面，发现测试的细菌物种中没有一个对小肠固有层中产生IL-10的细胞的数目发挥任何显著影响(参考图26)。
因此，显示结肠中定殖的梭菌属或由所述细菌获得的生理活性物质提供了诱导IL-10⁺调节性T细胞在结肠固有层中积累或IL-10在T细胞中表达的信号。显示小肠中Venus⁺细胞的数目不受其中没有共生细菌存在或共生细菌减少的情形的显著影响，并且IL-10⁺调节性细胞(Tr1-样细胞)独立于共生细菌在小肠固有层中积累。
实施例14
实施例14：研究了梭菌属诱导的Venus⁺细胞是否具有与SPF小鼠的结肠中的Venus⁺细胞相似的免疫抑制功能。具体地，将从脾分离的CD4⁺CD25^-细胞(效应T细胞，Teff细胞)以2x10⁴/孔接种到平底96-孔板，并与经受30Gy辐射照射处理的2x10⁴个脾CD11c⁺细胞(抗原递呈细胞)、0.5微克/ml抗-CD3抗体和大量Treg细胞一起培养三天。另外，对于最后6个小时，培养CD4⁺CD25-细胞，向其中加入[³H]^-胸苷(1微Ci/孔)。注意，实施例14中使用的Treg细胞是从Foxp3^eGFP报告小鼠的脾分离的CD4⁺GFP⁺T细胞或定殖梭菌属的小鼠或SPF Il10^venus小鼠的结肠固有层中的CD4⁺Venus⁺T细胞。然后，基于[³H]-胸苷的摄入量确定细胞的增殖，并通过每分钟的计数(cpm)值表示。
结果显示，其中定殖梭菌属的小鼠的Venus⁺CD4⁺细胞抑制CD25-CD4⁺活化的T细胞的体外增殖。抑制活性稍微优于从Foxp3^eGFP报告小鼠分离的GFP⁺细胞的抑制活性，但是等于从SPF Il10^Venus小鼠分离的Venus⁺细胞的抑制活性。因此，显示梭菌属诱导具有足够的免疫抑制活性的表达IL-10的T细胞，并从而在维持结肠中的免疫稳态中起关键作用。
实施例15
实施例15：接下来，研究了大量梭菌属的定殖对局部免疫应答和所造成的Treg细胞的增殖的影响。
<葡聚糖硫酸酯钠(DSS)诱导的结肠炎模型>
首先，如上所述制备DSS诱导的结肠炎模型，并研究梭菌属的接种和Treg细胞的增殖对模型小鼠的影响。具体地，将对照小鼠和接种梭菌属的小鼠用2％DSS处理，然后持续六天观察和测量体重损失、粪便硬度和出血，然后以数值评价。另外，在第6天，收集结肠、解剖和通过HE染色进行组织学分析。
结果显示，结肠炎的症状如体重损失和直肠出血在具有大量梭菌属的小鼠(下文还称为“梭菌属丰富的小鼠”)中与对照小鼠(在常规环境下生长6周并且未接种粪便悬浮液的C57BL/6小鼠)相比被显著抑制。与梭菌属丰富的小鼠相比，在对照小鼠中显著观察到结肠炎症的所有典型特征，如结肠变短、水肿和出血。此外，组织学特征如粘膜糜烂、水肿、细胞浸润和隐窝小囊损失在DSS-处理的梭菌属丰富的小鼠中没有在对照小鼠中严重。
<噁唑酮诱导的结肠炎模型>
接下来，如上所述制备噁唑酮诱导的结肠炎模型，并研究梭菌属的接种和Treg细胞的增殖对模型小鼠的影响。具体地，将对照小鼠和接种梭菌属的小鼠用噁唑酮敏化，并随后将其直肠内部用1％噁唑酮/50％乙醇溶液处理。然后，观察和测量体重损失。另外，解剖结肠，并通过HE染色进行组织学分析。
结果显示在对照小鼠中结肠炎伴随有持续的体重损失。同时，梭菌属丰富的小鼠的体重损失降低。另外，还揭示梭菌属丰富的小鼠的结肠中具有组织学疾病如粘膜糜烂、水肿、细胞浸润和出血的部分减少。
实施例16
实施例16：接下来，研究了大量梭菌属的定殖和所造成的Treg细胞的增殖对全身免疫应答(系统IgE产生)的影响。具体地，如上所述，通过以2周间隔两次施用明矾吸附的卵清蛋白(OVA)免疫对照小鼠和接种梭菌属的小鼠。然后，从这些小鼠中收集血清，并通过ELISA研究其OVA-特异性IgE水平。另外，从每组的小鼠中收集脾细胞，并且研究由体外OVA再刺激造成的IL-4和IL-10产生。
结果显示，与在对照小鼠中相比在梭菌属丰富的小鼠中IgE水平显著更低。此外，与对照小鼠相比，用OVA和明矾敏化的梭菌属丰富的小鼠的脾细胞中由OVA再刺激造成的IL-4产生被降低并且从而IL-10产生增加。
因此，组合考虑实施例15中显示的结果，结肠中梭菌属对Treg细胞的诱导在局部和全身免疫应答中起重要作用。
实施例17
实施例17：接下来，用属于IV簇的梭菌属的三个菌株(图49中列出的菌株22、23和32)定殖GF Balb/c。三周后，通过FACS分析结肠Foxp3⁺Treg细胞。结果显示，定殖梭菌属的三个菌株的定菌小鼠显示在GF小鼠和接种所有46个菌株的小鼠之间的中等Treg诱导模式。
实施例18
实施例18：接下来，研究了从人获得的粪便样品的孢子形成(例如，氯仿抗性的)级分是否和从小鼠获得的粪便样品的孢子形成级分具有相似的诱导调节性T细胞的增殖或积累的效应。
将来自健康志愿者(日本人，男性，29岁)的人粪便用磷酸盐缓冲盐水(PBS)悬浮，与氯仿(最终浓度3％)混合，并且然后在振荡水浴中孵育60分钟。通过用N₂气鼓泡蒸发氯仿后，将含有人肠道细菌的氯仿抗性(例如，孢子形成)级分的等份口服接种给无菌(GF)小鼠(IQI，8 周龄)。将处理的小鼠在乙烯基隔离器中保持3周。收集结肠，并纵向打开，洗涤以除去粪便内容物，并且在含有5mM EDTA的汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中在37℃下振荡20分钟。除去上皮细胞和脂肪组织后，将结肠切成小片并与含有4％胎牛血清、1mg/ml胶原酶D、0.5mg/ml分散酶和40微克/ml DNA酶I的RPMI1640(全部由Roche Diagnostics生产)在37℃下在振荡水浴中孵育1小时。消化的组织用含有5mM EDTA的HBSS洗涤，重悬于5ml40％Percoll(由GE Healthcare生产)并覆盖于15-ml Falcon管中的2.5ml80％Percoll上。通过在780g在25℃离心20分钟进行Percoll梯度分离。收集界面细胞并悬浮于含有PBS、2％FBS、2mM EDTA和0.09％NaN₃的染色缓冲液中并用藻红蛋白标记的抗-CD4Ab(RM4-5，由BD Biosciences 生产)对表面CD4进行染色。Foxp3的胞内染色用Alexa647标记的抗-Foxp3Ab(FJK-16s，由eBioscience生产)和Foxp3Staining Buffer Set(由eBioscience生产)进行。通过流式细胞术分析CD4阳性淋巴细胞群中Foxp3阳性细胞的百分比。
结果显示，当在GF小鼠中定殖人肠道细菌的孢子形成(例如，氯仿抗性的)级分时，诱导小鼠结肠固有层中Foxp3+调节性(Treg)细胞的积累。
接下来，通过强饲氯仿处理的人粪便研究了有哪些物种的细菌生长。
具体地，使用QIAamp DNA Stool微型试剂盒(由QIAGEN生产)，从如上所述的健康志愿者的人粪便(人粪便)或强饲氯仿处理的人粪便的GF小鼠的粪便颗粒(GF+Chloro.)分离细菌基因组DNA。使用LightCycler480(由Roche生产)进行定量PCR分析。相对量通过ΔCt方法进行计算并且标准化为样品的总细菌量、稀释度和重量。使用以下引物组：
总细菌
5’-GGTGAATACGTTCCCGG-3’(SEQ ID NO:62)和5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO:63)
梭菌XIVa簇(球形梭菌亚群)
5’-AAATGACGGTACCTGACTAA-3’(SEQ ID NO:64)和5’-CTTTGAGTTTCATTCTTGCGAA-3’(SEQ ID NO:65)
梭菌IV簇(柔嫩梭菌)
5’-GCACAAGCAGTGGAGT-3’(SEQ ID NO:66)和5’-CTTCCTCCGTTTTGTCAA-3’(SEQ ID NO:69)
拟杆菌属
5’-GAGAGGAAGGTCCCCCAC-3’(SEQ ID NO:67)和5’-CGCTACTTGGCTGGTTCAG-3’(SEQ ID NO:68)。
结果显示，与氯仿处理前的人粪便相比，强饲氯仿处理的人粪便具有大量的孢子形成细菌，如梭菌XIVa簇和IV簇，和非孢子形成细菌如拟杆菌属的严重减少。
实施例19
实施例19：将来自健康志愿者(日本人，男性，29岁)的人粪便(2g)用20ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)悬浮，与或不与氯仿(最终浓度3％)混合，并且在振荡水浴中孵育60分钟。然后通过用N2气鼓泡30分钟蒸发氯仿。将未处理的人粪便的悬浮液(定名为‘huUT’)和氯仿处理的人粪便(定名为‘huChloro’)的悬浮液口服接种给无菌(GF)小鼠(IQI，8周龄)(250微升/小鼠)。将huUT的悬浮液接种给4只GF小鼠，编号为#A1至#A4，并将huChloro的悬浮液接种给4只GF小鼠，编号为#B1至#B4。接种粪便悬浮液等的这种GF小鼠等在后文还被称为“ex-GF小鼠”。将每组ex-GF小鼠单独保持在乙烯基隔离器中以避免 进一步的微生物污染。3周后，单独收集每只小鼠的小肠和结肠固有层淋巴细胞，并通过流式细胞术检查表面CD4和胞内Foxp3、Helios、IL-17和IFN-γ的表达。对于胞内IL-17和IFN-γ染色，用PMA和离子霉素体外刺激分离的淋巴细胞4小时。Foxp3是Treg细胞的分化和功能所必需的转录因子。Helios是Ikaros转录因子家族的成员，并且Helios-Foxp3+Treg细胞已表明是在外周诱导的Treg细胞[所谓的诱导的Treg(iTreg)细胞]。如图1A-1D所示，与GF小鼠相比，两组ex-GF小鼠的小肠和结肠固有层中CD4+T细胞内的Foxp3+Treg细胞的百分比都增加。还观察到两组ex-GF小鼠的小肠和结肠中Foxp3+Treg细胞中Helios-细胞的百分比显著增加。特别地，除Foxp3+Treg细胞之外，还在exGF+huUT小鼠中观察到表达IL-17的CD4+细胞(即，Th17细胞)的显著积累，而它在exGF+huChloro小鼠中仅被少量观察到(图1E、1F)。在两组小鼠中，CD4+细胞中IFN-γ+细胞的百分比都未改变(图1E、1G)。
实施例20
实施例20：为了研究死亡细菌是否也对Treg细胞的诱导有影响，对氯仿处理的人粪便的悬浮液进行热压处理(121℃，20分钟)并口服接种给GF小鼠(一周一次，持续4周)。4周后，处死小鼠，并通过流式细胞术检查每只小鼠的结肠固有层淋巴细胞的CD4、Foxp3和Helios表达。如图2所示，死亡细菌的接种对Foxp3+细胞或Helios-Foxp3+细胞的数目没有影响。这些结果不排除所接种的死亡细菌的量不足的可能性，但表明活细菌是Treg细胞的诱导所需要的。
实施例21
实施例21：为了证实氯仿抗性的细菌对Treg细胞的诱导，在不同的一天从同一人获得另一粪便，用氯仿处理，并接种给IQI GF小鼠(7只小鼠，编号为#C1至C7)。3-4周后，处死小鼠#C1至#C5，并单独收集每只小鼠的小肠和结肠固有层淋巴细胞，并通过流式细胞术 检查CD4和Foxp3的表达。与实施例19的发现结果一致，氯仿处理的人粪便的定殖显著诱导结肠和小肠固有层中Foxp3+CD4+Treg细胞的积累(图3)。这些结果进一步支持氯仿抗性的孢子形成细菌可诱导小肠固有层中Treg细胞的分化、增殖和/或募集这一见解。
实施例22
实施例22：为了测试人肠道细菌的氯仿抗性的孢子形成级分所引起的Treg细胞诱导是否是水平传播的，将IQI GF小鼠(6只小鼠，编号为#D1至#D6)与小鼠#C6和#C7在相同笼中的乙烯基隔离器中共同饲养4周。分离结肠和小肠的固有层淋巴细胞并检查CD4和Foxp3。共同饲养的小鼠展现出CD4+细胞中Foxp3+细胞百分比的显著增加(图4)。因此，人肠道细菌所引起的Treg细胞诱导是可水平传播的。这些结果使得我们假定肠道微生物群的主要组分而不是微量组分对Treg细胞诱导的作用。
实施例23
实施例23：解冻小鼠#C4的盲肠内容物的冷冻储备物，悬浮于其10倍体积(w/v)的PBS中，并通过70微米细胞滤过器。然后用3％氯仿处理悬浮液，用PBS稀释2000或20000倍，并口服接种给GF IQI小鼠(分别为2.5x10⁵或2.5x10⁴个细菌细胞/250微升/头)。将2000倍稀释的样品口服接种给4只小鼠(定名为exGF+2000，编号为#E1至#E4)，而20000倍稀释的样品接种给8只小鼠(定名为exGF+20000，编号为#F1至#F8)。3周后，分离小肠固有层淋巴细胞并检查CD4、Foxp3和Helios。2000倍和20000倍稀释的样品均相似地诱导小肠固有层中Foxp3+CD4+细胞的显著积累(图5)。因此，口服接种的细菌的剂量可最小减至小于2.5x10⁴个细菌细胞。
实施例24
实施例24：将小鼠#F3、#F7或#F8的盲肠内容物的冷冻储备物 悬浮于其10倍体积(w/v)的PBS中，通过70微米细胞滤过器，并用3％氯仿处理。然后，将小鼠#F3的粪便悬浮液口服接种给5只GF小鼠(编号为#G1至#G5)，将小鼠#F7的粪便悬浮液口服接种给4只GF小鼠(编号为#H1至#H4)，并且将小鼠#F8的粪便悬浮液口服接种给4只GF小鼠(编号为#I1至#I4)。4周后，分离结肠和小肠固有层的淋巴细胞并通过流式细胞术检查CD4、Foxp3和Helios表达。与未处理的GF小鼠相比，所有#F、#G和#H小鼠都展现出肠固有层中CD4⁺细胞中Foxp3⁺细胞百分比的显著增加(图6)。因此，在exGF+20000小鼠中人肠道细菌定殖所引起的Treg细胞诱导也是可传播的。此外，如在稍后元16S rDNA测序数据(图8)所示，这些小鼠通常具有与20种已知细菌物种(嗜胺梭菌(C.aminophilum)、H.saccgarovorans、断链真杆菌(E.fissicatena)、丝状螺旋杆菌(H.filiformis)、梭状梭菌(C.clostridioforme)、吲哚梭菌、难辨梭菌、拟杆菌属种MANG、毛螺菌科细菌DJF_VP30、瘤胃球菌属种ID8、C.lavalense、共生梭菌、扭曲真杆菌、C.saccharogumia、多枝梭菌、普氏梭杆菌、闪烁梭菌、梭菌属种2335、梭菌属种14616和参照梭菌属种MLG055)具有16S rDNA序列相似性的细菌。
实施例25
实施例25：在需氧条件下将#F8小鼠的盲肠内容物的冷冻储备物用0.85％NaCl连续稀释并铺板到BL琼脂上。在37℃下培养2或4天后，观察到50个单独菌落。在50个菌落中挑取29个，在37℃下通过ABCM培养液再培养2或4天，并于-80℃下储存在EG储备培养基(10％DMSO)中。分离每个菌落的基因组DNA，并分析16S rRNA编码基因序列。每个菌落的16S rRNA序列揭示所观察的29个菌落表现为三个菌株，各自与多枝梭菌具有100％相似性、与Clostridium saccharogumia具有99.75％相似性、与普氏梭杆菌具有100％相似性、与Clostridium hathewayi具有99.17％相似性、与闪烁梭菌具有99.23％相似性或与梭菌属种2335具有99.66％相似性。在选自原始50个菌落的29个菌落中，只存在Clostridium saccharogumia、多枝梭菌和普 氏梭杆菌(分别为25、3和1个菌落)。使这3个分离的菌株繁殖，混合并接种给GF IQI小鼠(4只小鼠，编号为#J1至J4)。3-4周后，收集结肠固有层淋巴细胞，并通过流式细胞术检查CD4、Foxp3和Helios的表达。在结肠中这些细菌菌株的定殖不诱导Foxp3+细胞或Helios-细胞或仅微弱地诱导它们(图7)。这些结果表明Clostridium saccharogumia和多枝梭菌(两者都在XVIII簇内)的组合不足以诱导小鼠结肠中的Treg细胞。普氏梭杆菌的效应是不清楚的，因为所述菌株仅表现为所选择的29个菌落中的1个。
实施例26
实施例26:将#G2小鼠的盲肠内容物的冷冻甘油储备物用PBS悬浮，接种到BL琼脂板上，并孵育48小时，类似于实施例19中进行的程序。与实施例19不同，使用刮板通过刮擦收集板上的所有细菌，悬浮于TS培养液中并接种给GF IQI小鼠(4只小鼠，编号为#K1至#K4)。应注意，在此实验中使用的细菌悬浮液包括在板上未繁殖但存活的细菌。4周后，分离K1～K4小鼠的结肠和小肠固有层淋巴细胞并检查CD4、Foxp3和Helios表达。与未处理的GF小鼠相比，所有4只小鼠都展现出肠固有层中CD4⁺细胞中Foxp3⁺细胞百分比的显著增加(图9A、9B)和Foxp3⁺Treg细胞中Helios-细胞百分比的显著增加(图9A、9C)。考虑到接种BL琼脂上繁殖的6个细菌菌株的小鼠无法诱导Treg细胞，在板上未繁殖但存活的细菌可能是Treg细胞诱导的原因。
实施例27
实施例27：从小鼠#A1、#C4、#F8、#G2、#H3、#I3、#J3和#K3的盲肠内容物提取细菌DNA。通过PCR扩增细菌16S rRNA编码基因的可变区1-2(V1-2)，并用作元测序的模板。基于序列相似性(>97％同一性)将所得的序列(每个样品3400个读数)分类成操作分类单位(OTU)。使用BLAST将每个OTU的代表性序列与核酸数据库中的序 列进行比较以确定它们在已知物种中的最近亲属。对于每个OTU检测到的读数的数目和最近亲属显示于表1中。每个盲肠样品中具有相同最近亲属的OTU的相对丰度显示于图8中。在小鼠#A1中，鉴别到153个OTU(它们的最近亲属是93个物种)，并且其中一半与拟杆菌属物种有关。相比之下，在小鼠#C4中，鉴别到113个OTU，并且其中大多数与属于梭菌科的物种有关。在小鼠#F8、#G2、#H3、#I3、#J3和#K3中，鉴别到97-68个OTU。在其中在肠道中观察到Treg细胞积累的这些小鼠中，大多数细菌由与以下物种具有16S rDNA序列相似性的细菌组成：嗜胺梭菌、H.saccgarovorans、断链真杆菌、丝状螺旋杆菌、梭状梭菌、吲哚梭菌、难辨梭菌、拟杆菌属种MANG、毛螺菌科细菌DJF_VP30、瘤胃球菌属种ID8、C.lavalense、共生梭菌、扭曲真杆菌、C.saccharogumia、多枝梭菌、普氏梭杆菌、闪烁梭菌、梭菌属种2335、梭菌属种14616和参照梭菌属种MLG055。
在未观察到Treg积累的小鼠#J3中，检测到3个OTU。每个与C.saccharogumia、多枝梭菌或普氏梭杆菌具有16S rDNA序列相似性。这些结果表明这三种物种的组合不足以诱导肠道Treg细胞积累。
实施例28
实施例28：使用BL琼脂板或EG琼脂板从小鼠#F8、#G2、#I1和#K3的盲肠内容物分离细菌菌株。申请人从EG琼脂板挑取144个菌落并从BL琼脂板挑取116个菌落。对这些克隆的16S rRNA编码序列的BLAST研究揭示它们属于17个物种，并且各自与以下物种具有93％-100％的相似性：吲哚梭菌、难辨梭菌、拟杆菌属种MANG、毛螺菌科细菌DJF_VP30、A.colihominis、瘤胃球菌属种ID8、C.lavalense、共生梭菌、扭曲真杆菌、C.saccharogumia、多枝梭菌、普氏梭杆菌、C.hathewayi、闪烁梭菌、梭菌属种2335、梭菌属种14616和参照梭菌属种MLG055(表2)。它们都属于梭菌IV、XIVa或XVIII簇(2个物种为IV簇、12个物种为XIVa簇、1个物种为XVI簇并且2个物种为XVIII簇)。
实施例29
实施例29：在实施例28中选择的菌落中，捡取另外的菌落并分离并使用EG和BL培养基培养这些菌株。这些克隆的16S rRNA编码序列的BLAST研究揭示它们属于总计31个物种(包括在实施例28中提及的物种)，并且各自与以下物种具有93％-100％的相似性：Clostridium saccharogumia、多枝梭菌JCM1298、多枝梭菌、普氏梭杆菌、Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799、Clostridium hathewayi、解糖梭菌WM1、拟杆菌属种MANG、解糖梭菌、闪烁梭菌、毛螺菌科细菌5_1_57FAA、毛螺菌科细菌6_1_63FAA、梭菌属种14616、难辨梭菌ATCC BAA-613、参照梭菌属种MLG055、丹毒丝菌科细菌2_2_44A、吲哚梭菌、Anaerostipes caccae、难辨梭菌、毛螺菌科细菌DJF_VP30、毛螺菌科细菌3_1_57FAA_CT1、Anaerotruncus colihominis、Anaerotruncus colihominis DSM 17241、瘤胃球菌属种ID8、毛螺菌科细菌2_1_46FAA、Clostridium lavalense、Clostridium asparagiforme DSM 15981、共生梭菌、共生梭菌WAL-14163、扭曲真杆菌、梭菌属种D5、颤螺菌科细菌NML 061048、Oscillibacter valericigenes、毛螺菌科细菌A4、梭菌属种316002/08和梭菌目细菌1_7_47FAA、Blautia cocoides、Anaerostipes caccae DSM14662(表3)。将细菌菌株储备物储存在10％甘油储备物加用于生长培养物的培养基中，并将管储存在-80℃下冷冻器中。
实施例30
实施例30：为了研究实施例29中的菌株是否具有在GF小鼠中诱导Treg的能力，使用TS培养基以等量的培养基体积混合表3上的31个菌株并接种给GF小鼠。16S rRNA序列的详细分析揭示31个菌株中的8个与其它菌株重叠(参见表3，由星号指示)，产生23个不同的细菌菌株。如图10所示，当口服施用给GF小鼠时，23个菌株的混合物(23mix)诱导非常强的Treg水平(在结肠固有层中为35％-40％，在小肠中>10％；图10)。观察到23mix定殖的这些Treg大多数是 Helios^-。
实施例31
实施例31：为了研究人肠道细菌的氯仿抗性的级分中的肠道微生物群的大量成员而非微量成员是否驱动Treg细胞的诱导，向成年GF小鼠接种来自已经接种如实施例19所述的人肠道细菌的氯仿抗性的级分的小鼠(+huChlo小鼠)的稀释的盲肠样品。如图11所示，即使当将huChlo小鼠盲肠样品分别稀释(稀释2x10⁴和2x10⁵)以产生+2x10⁴小鼠和2x10⁵小鼠时，在这些成年GF小鼠中也诱导Treg。
实施例32
实施例32：为了研究实施例30中的23个菌株的混合物是否具有比柔嫩梭杆菌(Faecalibacterium prausnitzii，众所周知的人梭菌菌株，特征为增强调节性细胞功能)更有效地在成年GF IQI小鼠中诱导Treg的能力，将表4中的23个菌株等量地与培养基混合以产生混合物，然后将所述混合物施用给成年IQI GF小鼠。为了比较，将柔嫩梭杆菌施用给另一组IQI GF小鼠。如图12所示，当口服施用给成年IQI GF小鼠时，23个菌株的混合物(23-mix)比柔嫩梭杆菌诱导更高的Treg水平。柔嫩梭杆菌(+Faecali.)显示出可忽略不计的Treg诱导水平。
实施例33
实施例33：为了研究实施例31中描述的+2x104小鼠中微生物群是否是稳定的，对成年GF小鼠连续进行口服接种以产生+2x10⁴-re小鼠(第二次接种)和+2x10⁴-re-re小鼠(第三次接种)。如图13所示，在+2x10⁴-re小鼠和+2x10⁴-re-re小鼠中存在显著的Treg诱导。为了进一步消除微生物群中对于Treg细胞诱导不必要的组分，将实施例31描述的+2x10⁴小鼠的盲肠内容物再次稀释2x10⁴倍并口服接种给另一组成年GF小鼠(+(2x10⁴)²小鼠)。如图13所示，+(2x10⁴)²小鼠在结肠中展现出显著Treg细胞积累。
实施例34
实施例34：为了评估实施例19、实施例31和实施例33中描述的+huUT(+hu)、+huChlo、+2x10⁴、+2x10⁴-re和+(2x10⁴)²中肠道微生物群的组成，从这些成年小鼠的盲肠内容物提取细菌DNA。扩增细菌16S核糖体DNA(rDNA)的可变区(V1-V2)，并使用454测序仪进行元测序。基于序列相似性(>96％同一性)将所得的序列(每个样品3400个读数)分类成操作分类单位(OTU)。使用BLAST将每个OTU的代表性序列与保存在公共可获得的16S和基因组数据库中的序列进行比较以确定其最近物种。如图14所示，在+hu小鼠中，属于拟杆菌门的OTU占约50％的盲肠微生物群体。相比之下，在+huChlo小鼠中大多数OTU与属于梭菌的物种有关。在+2x10⁴、+2x10⁴-re和+(2x10⁴)²小鼠中，大多数细菌由与图14中列出的属于XIVa簇(又称为柔嫩梭菌组)、IV簇、XVI簇和XVIII簇的约20种梭菌物种具有16S rDNA序列相似性的细菌组成。
实施例35
实施例35：接种实施例30中分离的23个菌株的小鼠(+23-mix小鼠)的盲肠内容物的16S rDNA元分析证实图14和表4中列出的23个菌株中的17个的存在。为了确定这17个菌是否可诱导Treg细胞，将这17个菌株的混合物接种给成年GF小鼠(+17-mix小鼠)，将每个细菌菌株培养在2mL EG液体培养基中并生长至汇合，并且然后将这些起始培养物混合到50mL管中(2mLx17个菌株＝34mL)。将这些细菌离心沉淀成颗粒，并悬浮于10mL PBS中。将包含约1x10⁶-1x10⁷各菌株的200μL等份用于接种成年GF小鼠。如图15所示，当口服施用给成年IQI、BALB和B6小鼠时，17个菌株的混合物能够在这些小鼠模型中诱导Treg。
实施例36
实施例36：为了研究实施例35中明确的17个菌株的每一个是 否能单独诱导Treg，用17个菌株中每个的一个单定殖成年GF小鼠。如图16中所示，用单独菌株单定殖的成年GF小鼠展现出低至中等水平的Treg。重要的是，没有单独菌株诱导与17个菌株的混合物相同程度的Treg。
实施例37
实施例37：为了研究实施例35中描述的17个菌株的亚群是否可诱导Treg，制成随机选择的3-5个菌株的组合：3-mix、5mixA、5-mixB和5-mix C，如表4所示，并用于接种成年GF小鼠。如图17所示，只有5-物种混合物诱导Treg细胞频率的显著增加，其增加幅度与在+17-mix小鼠中观察到的相比是中等的。
实施例38
实施例38：为了研究实施例35中描述的17个菌株的混合物(17-mix)的施用的益处，向成年SPF小鼠口服接种17-mix或对照培养基并且在三周后评估Foxp3+Treg细胞的诱导。如图18所示，在处理三周后存在结肠Foxp3⁺Treg(CD4)细胞的频率的显著增加。
实施例39
实施例39：为了评价在过敏性腹泻动物模型中17-mix的施用的益处，向成年SPF小鼠口服接种17-mix或对照培养基，同时用卵清蛋白(OVA，过敏性腹泻的诱导物)处理。如图19中所示，相对于对照小鼠，在饲喂17-mix的小鼠中腹泻的发生和严重程度(腹泻分数)显著降低。
实施例40
实施例40：为了评价在结肠炎动物模型中17-mix的施用的益处，向成年SPF小鼠口服接种17-mix或对照培养基，同时用三硝基苯磺酸(TNBS，常用的结肠炎实验诱导物)处理。如图20所示，在暴露于 TNBS时SPF17-mix小鼠展示出比对照小鼠更低的死亡率。
实施例41
实施例41：为了评价17-mix中呈现的菌株作为溃疡性结肠炎的诊断和监测工具的有用性，我们使用17个菌株的草图基因组序列和通过欧洲MetaHIT项目产生的公共可获得的人粪便微生物群基因组检查健康和溃疡性结肠炎(UC)人受试者中17个菌株的相对丰度。与健康受试者(N＝15)相比，UC受试者(N＝20)显示出17个菌株的减少，如图21所示。
SEQ ID NO.:OTU136；OTU46；OTU221；OTU9；OTU296；OTU21；OTU166；OTU73；OTU174；OTU14；OTU55；OTU337；OTU314；OTU195；OTU306；OTU87；OTU86；OTU152；OTU253；OTU259；OTU281；OTU288；OTU334；OTU359；OTU362；或OTU367分别为SEQ ID NO.19-44。
工业实用性
如上所述，本文描述的组合物和方法通过利用属于梭菌纲的某些人源细菌或由所述细菌获得的生理活性物质等使得可能提供用于诱导调节性T细胞(Treg细胞)的增殖或积累的优异且良好表征的组合物。因为所述细菌组合物具有免疫抑制效应，所以所述细菌组合物可用于，例如，预防或治疗自身免疫性疾病或过敏性疾病，以及抑制器官移植中的免疫排斥等。另外，健康个体可容易地且常规地摄取所述细菌组合物，如以食品或饮料形式(例如，健康食品)，以提高其免疫功能。






[表1B-1]
表1B


[表1B-2]


[表2]
表2


[表3-1]
表3

[表3-2]








OTU3(SEQ ID NO.：70)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCACTAAGACGGATTTC
TTCGGATTGAAGTCTTTGTGACTGAGCGGCGGACGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGCC
TCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGACCGC
ATGGTCTGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGTTG
GAGGGTAACGGCCCACCGAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGG
TGAACGGCCAC
ATTGGGACTGAGACACGGCCCAG
OTU9(SEQ ID NO.：22)
GATGAACGCTGGCGGCGGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGGTTTCGAGTGAAG
TTTTGGATGGA ATTGAAATTGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTG
CCTTACACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGGCC
GCATGGTCTGGTGCGAAAAACTCCGGTGGTGTAAGATGGACCCGCGTCTGATTAGGTAGT
TGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU14(SEQ ID NO.：28)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGGTTTCAATGAAGTT
TTCGGATGGAATTGAAATTGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTTACACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGGCCG
CATGGTCTGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTAAGATGGACCCGCGTCTGATTAGGTAGTT
GGTGGGGTAACGGCCACCAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCAC
ATTGGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU15(SEQ ID NO.：71)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCATTAAGACAGATTTC
TTCGGATTGAAGTCTTTGTGACTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGGCCG
CATGGTCTGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTAAGATGGACCCGCGTCTGATTAGGTAGTT
GGTGGGGTAACGGCCCACCAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU21(SEQ ID NO.：24)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGCTAAGACAGATTTC
TTCGGATTGAAGTCTTTGTGGCTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGACCG
CATGGTCTGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGTT
GGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU23(SEQ ID NO.：72)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATTTTGGAAGGAAGT
TTTCGGATGGAATTCCTTAATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAACCT
CCCTACTACAGGGGAGTAACAGCTGGAACGGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGAAT
CGCATGATTCGGTGTGAAAGCTCCGGCAGTATAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCTGGT
TGGCGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCTTGAGAGAGTGGACGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU38(SEQ ID NO.：73)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGGTTTCAATGAAGTT
TTCGGATGGAATTGAAATTGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGACCG
CATGGTCTGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGTT
GGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGCCCAG
OTU46(SEQ ID NO.：20)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCGAGCACT TGTGCTCGAGT
GGCGAACGGGTGAGTAATACATAAGTAACCTGCCCTAGACAGGGGGATAACTATTGGAAA
CGATAGCTAAGACCGCATAGGTACGGACACTGCATGGTGACCGTATTAAAGTGCCTCAAA
GCACTGGTAGAGGATGGACTTATGGCGCATTAGCTGGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAA
GGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCC
CAG
OTU49(SEQ ID NO.：74)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACACGCAAGACGAACGAAGCAATTAAAATGAAGTT
TTCGGATGGATTTTTGATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTACC
GCATGGTACGTGTGAAAACTACCGGTGGTGTGAGATGGAGTCCCGCGTCTGATTAGCCAG
TTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGC
CACATTGGGGACTGAGACACGGGCCCAA
OTU55(SEQ ID NO.：29)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGTTACACGGAGGAAGTT
TTCGGATGGAATCGGTATAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCTGCC
CTGTACCGGGGGATAACACTTAGAAATAGGTGCTAATACCGCATAAGCGCACGGAACCGC
ATGGTTCCGTGTGAAAAACTACCGGTGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GGCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCA
CATTGGGACTGAGACACAGCCCA
OTU57(SEQ ID NO.：75)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGGTTTCGATGAAGTT
TTCGGATGGATTTGAAATCGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGT GGGTAACCTGC
CTTACACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGGCCG
CATGGTCTGGTGCGAAAAACTCCGGTGGTGTAAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GGCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU73(SEQ ID NO：26)
GATGAACGCTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAAGTGAAGATAGCTTGCTA
TCGGAGCTTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTAGATAACCTGCCTGTATGACCGGGAT
AACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGGATAGGCAGAGAGGAGGCATCTCTTCTCTGTTA
AAGTTGGGATACAACGCAAACAGATGGATCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAC
GGCCCACCAAGGCGATGATGCATAGCCGGCCTGAGAGGGCGAACGGCCACATTGGGACTG
AGACACGGCCCAA
OTU86(SEQ ID NO.：35)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATTNTTGGAAGGAAG
TTTCGGATGGAATTCCTTAATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAACCT
ACCCTATACAGGGGGATAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGAAT
CGCATGATTCGGTGTGAAAAGCTCCGGCAGTATAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCTGG
TTGGCGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCTTGAGAGAGTGGACGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU87(SEQ ID NO.：34)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGCTTTACTTAGATTT
CTTCGGATTGAAAGTTTTGCGACTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTG
CCTCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAG ACCACAGTACC
GCATGGTACAGTGGGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGT
TGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU89(SEQ ID NO.：76)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATTTTGGAAGGAAGT
TTTCGGATGGAATCGGTATAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCTGC
CCTGTACCGGGGGATAACACTTAGAAATAGGTGCTAACACCGCATAAGCGCACGGAACCG
CATGGTTCTGTGTGAAAAAACTCCGGTGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCCAGT
TGGCGAGGGTAACGGCCTACCAAAGACGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGG
CCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU92(SEQ ID NO.：77)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGAGTTATGCAGAGGAAGTT
TTCGGATGGAATCGGCGTAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCTGCC
CTGTACCGGGGGATAACACTTAGAAATAGGTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGCTTCAC
ATGAGGCAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTAAGATGGACCCGCGTCTGATTAGGTAGTTG
GTGGGGTAACGGCCCACCAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCAC
ATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU101(SEQ ID NO.：78)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATTAAGATGAAGTT
TTCGGATGGAATCTTGATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTGCCG
CATGGCAGTGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGA TTAGCCAGTT
GGCGGGGTAACGGCCACCGAAAGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCA
CACTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU111(SEQ ID NO.：79)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGTTACACAGAGGAAGTT
TTCGGATGGAATCGGTATAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCTGCC
CTGTACCGGGGGATAACACTTAGAAATAGGTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGCTTCAC
ATGAAGCAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCTGGTTG
GCGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCTTGAGAGAGTGGACGGCCAC
ATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU114(SEQ ID NO.：80)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGCTGTTTTCAGAATC
TTCGGAGGAAGAGGACAGTGACTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGCAACCTGC
CTCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGACCG
CATGGTGTAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GGCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU119(SEQ ID NO.：81)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATTAAGATGAAGTT
TTCGGATGGAATCTTGATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTGCCG
CATGGCAGTGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GCGGGGTAACGGCCCGACCAAAGCGACGGATCAGTAGCCGACCTGAGAG GGTNACCGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU125(SEQ ID NO.：82)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGCTGTTTTCAGAATC
TTCGGAGGAAGAGGACAGTGACTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGCAACCTGC
CTCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGACCG
CATGGTGTAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGGTAGTT
GGTGGGTAAAGGCTACCGAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGACGAGGGTGACCGGCCA
CGATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU131(SEQ ID NO.：83)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATTAAGATGAAGTT
TTCGGATGGAATCTTGATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTGCCG
CATGGCAGTGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GCGGGTAACGGCCACCGAAAGCGACGATCAGTAGCCGACCTGACGAGGGTNACCGGCACA
TTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU136(SEQ ID NO.：19)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCGAGCACTTGTGCTCGAGT
GGCGAACGGGTGAGTAATACATAAGTAACCTGCCCTTTACAGGGGGATAACTATTGGAAA
CGATAGCTAAGACCGCATAGGTAAAGATACCGCATGGTAAGTTTATTAAAAGTGCCAAGG
CACTGGTAGAGGATGGACTTATGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAG
GCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC
AG
OTU137(SEQ ID NO.：84)
GATGAACGCTGGC GGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATTAAGATGAAGTT
TTCGGATGGAATCTTGATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTGCC
GCATGGCAGTGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGGTAGT
TGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU144(SEQ ID NO.：85)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGGTTTCGATGAAGTT
TTTGGATGGAATTGAAATTGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTTACACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGGCCG
CATGGTCTGGTGCGAAAAACTCCGGTGGTGTAAGATGGACCCGCGTCTGATTAGGTAGTT
GGTGGGGTAACGGCCCACCGAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCA
CATTGGGACCTGAGACACGGGCCCA
OTU152(SEQ ID NO.：36)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGTTAGACAGAGGAAGTT
TTCGGATGGAATCGGTATAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCTGCC
CTGTACCGGGGGATAACACTTAGAAATAGGTGCTAATACCGCATAAGCGCACGGAACCGC
ATGGGTTCTGTGTGA AAACTCCGGTGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCCAGTTG
GCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCAC
ATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU161(SEQ ID NO.：86)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATTT TAGATGAAGTT
TTCGGATGGATTCTGAGATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGACAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTACCG
CATGGTACGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GGCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU163(SEQ ID NO.：87)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGTTACACGGAGGAAGTT
TTCGGATGGAATCGGTATAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCTGCC
CTGTACCGGGGGATAACACTTAGAAATAGGTGCTAATACCGCATAAGCGCACGGAACCGC
ATGGTTCCGTGTGAAAAACTCCGGTGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGGTAGTTG
GTGGGGTAACGGCCCACCAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCAC
ATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU165(SEQ ID NO.：88)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAGCACCCTTGACTGAGGT
TTCGGCCAAATGATAGGAATGCTTAGTGGCGGACTGGTGAGTAACGCGTGAGGAACCTAC
CTTCCAGAGGGGACGAACAGTTGGAACGACTGCTAATACCGCATGACGCATGACCGGGGC
GATCCCGGGCCGATGTCAAAGATTTTATTCGCTGGAAGATGGCCTCGCGTCTGATTAGCT
AGATGGTGGGGTAACGGCCC ACCATGGCGACGATCAGTAGCCGGACTGAGAGGTTGACCG
GCCACATTGGGACTG AGATACGGCCCA
OTU166(SEQ ID NO.：25)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATTAAA ATGAAGTT
TCGGATGGATTTTGATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGAT AACCTGCCT
CACACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTACCGCA
TGGTACGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGCCAGTTGG
CGGGGTAACGGCCCACCAA AGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACG
ATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU173(SEQ ID NO.：123)
GACGAACGCTGGCGGCGCGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGAGTTGTGTTGAAAGCTTG
CTGGATATACAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGCCTCATACAG
GGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGATCGCATGGTCTG
GTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAACTAGTTGGAGGGGTA
ACGGCCCACCAAGGCGACGAGTCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACGATTGGG
ACTGAGACACGGCCCAG
OTU174(SEQ ID NO.：27)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATTTTGGAAGGAAGT
TTTCGGATGGAATTCCTTAATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAACCT
GCCCTATACAGGGGGATAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGAAT
CGCATGATTCGGTGTGAAAAGCTCCGGCAGTATAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCTGG
TTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCTTGAGAGAGTGG ACGGC
CACATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU181(SEQ ID NO.：89)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATTTAAAATGAAGT
TTTCGGATGGATTTTTGATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGATAACCTG
CCTCACGACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAA GCGCACAGTAC
CGCATGGTACGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGCCAG
TTGCGGGGTAACGGCCCACCGAAAGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGC
CACATTGGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU182(SEQ ID NO.：90)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCGGGCAGCAATGCCCGAGT
GGCGAACGGGTGAGTAATACATAAGTAACCTGCCCTTTACAGGGGGATAACTATTGGAAA
CGATAGCTAAGACCGCATAGGTAAAGATACCGCATGGTAAGTTTATTAAAAGTGCCAAGG
CACTACGAGGGAGTAGTGATATGCGCATAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGC
GACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG
OTU189(SEQ ID NO.：91)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATTTTAGATGAAGTT
TTCGGATGGATTCTGAGATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGACACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGCTTCAC
ATGAAGCAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCCAGTTG
GCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCAC
ATTGGGACTGAGACACGGCCCAG
OTU195(SEQ ID NO.：32)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATTTTAGATGAAGTT
TTCGGATGGATTCTGAGATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGACGAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTACC
GCATGGTACGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGCCAGT
TGGCGGGTAACGGCCCACCGAAAGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU196(SEQ ID NO.：92)
GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAGCACCCCTGAATGAGGT
TTCGGCCAAAGGAAGGGAATGCTTAGTGGCGGACTGGTGAGTAACGCGTGAGGAACCTGC
CTTTCAGAGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATGACACATGAATGGGGC
ATCCCATTGATGTCAAAGATTTATCGCTGAAAGATGGCCTCGCGTCCCATTAGCTAGTAG
GCGGGGTAACGGCCCACCTAGGCGACGATGGGTAGCCGGACTGAGAGGTTGACCGGCCAC
ATTGGGACTGAGATACGGCCCA
OTU199(SEQ ID NO.：93)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCGAGCACTTGTGCTCGAGT
GGCGAACGGGTGAGTAATACATAAGTAACCTGCCCTAGACAGGGGGAGTAACTATTGGAA
CGATAGCTAAGACCGCATAGGTACGGACACTGCGTGGTGACCGTATTAAAAGTAGCCTCA
AAGACACTGGTAGAGGATGGACTTATGGCGCATTAGCTGGTTGGCGGGGTAACGGCCCAC
CCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACAC
GGCCCAG
OTU202(SEQ ID NO.：94)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATTTAACGGAAGTT
TTCGGATGGAAGTTGAATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTTGTACTGGGGGACAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTATCG
CATGATACAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTACAAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGTT
GGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGCCCAG
OTU204(SEQ ID NO.：95)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCACTAAGACGGATTTC
TTCGGATTGAAGTCTTTGTGACTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGACCACAGTACCG
CATGGTACAGTGGGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGTT
GGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU211(SEQ ID NO.：96)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGC AAGTCGAGCGAAGCGGTTTCGATGAAGTT
TTCGGATGGATTTGAAATCGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTTACACTGGGGGATAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGAATCG
CATGATTCGGTGCGAAAAGCTCCGGCAGTATAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCTGGTT
GGCGGGGTAACGGCCCACC AAGGCGACGATCAGTAGCCGGCTTGAGAGAGTGGACGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU214(SEQ ID NO.：97)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATTAAGATGAAGTT
TTCGGATGGAATCTTGATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTCATACAGGGGGAGTAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGGCT
GCATGGCCTGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGT
TGGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU221(SEQ ID NO.：21)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGGTGCTCATGACGGAGGA
TTCGTCCAACGGATTGAGTTACCCAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGGAACCTGC
CTTGGAGAGGGGAATAACACTCCGAAAGGAGTGCTAATACCGCATGATGCAGTTGGGTCG
CATGGCTCTGACTGCCAAAGATTTATCGCTCTGAGATGGCCTCGCGTCTGATTAGCTAGT
AGGCGGGGTAACGGCCCACCTAGGCGACGATCAGTAGCCGGACTGAGAGGTTGACCGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU224(SEQ ID NO.：98)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCACCTTGGCGGATTTC
TTCGGATTGAAGCCTTGGTGACTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CCTGTACCGGGGGATAACACTTAGAAATAGGTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGCTTCA
CATGAAGCAGTGTGAAAAACTCCGGCGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GACAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCA
CATTGGGACTGAG ACACGGCCCA
OTU225(SEQ ID NO.：99)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGAAGTTATGCAGAGGAAGT
TTTCGGTATGGAATCGGCGTAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCTG
CCCTGTACCGGGGGAGTAACACTTAGAATAGGTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGCTTC
ACATGAGGCAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCCAGT
TGGCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU237(SEQ ID NO.：100)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATTGAAGGAAGTTT
TCGGATGGAATTCGATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGATAACCTGCCT
CACACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTGCCGCA
TGGTACGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGCCAGTTGG
CGGGGTAACGGCCCACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACA
TTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU246(SEQ ID NO.：101)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGAGTTATGCAGAGGAAGTT
TTCGGATGGAATCGGCGTAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCTGCC
CTATACAGGGGGATAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGAATCGC
ATGATTCGGTGTGAAAAGCTCCGGCAGTATAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCTGGTTG
GCGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCTTGAGAGAGTGGACGGCCAC
ATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU253(SEQ ID NO.：37)
GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAATCGAACGGAGCACCCTTGACTGAGGT
TTCGGCCAAATGATAGGAATGCTTAGTGGCGGACTGGTGAGTAACGCGTGAGGAACCTGC
CTTCCAGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATGACGCATGACCGGGG
CATCCCGGGCATGTCAAAGATTTTATCGCTGGAAGATGGCCTCGCGTCTGATTAGCTAGA
TGGTGGGGTAACGGCCCACCATGGCGACGATCAGTAGCCGGACTGAGAGGTTGACCGGCC
ACATTGGGACTGAGATACGGGCCCAG
OTU259(SEQ ID NO.：38)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGCTTTACTTAGATTT
CTTCGGATTGAAAAGTTTTGCGACTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCT
GCCTCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGACCACGGTAC
CGCATGGTACAGTGGGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAG
TTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGC
ACATTGGGACCTGAGACACGGCCCAA
OTU262(SEQ ID NO.：102)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAAC ACATGCAAGTCGAACGAAGCATTTTAGATGAAGTT
TTCGGATGGATTCTGAGATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGACAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTACCG
CATGGTACAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GGCGGGGTAACGGCCCACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCA
CATTGGGGACCTGAGACACGGCCCA
OTU268(SEQ ID NO.：103)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGCTGTTTTCAGAATC
TTCGGAGGAAGAGGACAGTGACTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGCAACCTGC
CTCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGACCG
CATGGTGTAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGGTAGTT
GGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGACGGGTGACCGGCA
CATTGGGGACTGAGACACGGGCCCAA
OTU269(SEQ ID NO.：104)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATTTTAGATGAAGTT
TTCGGATGGATTCTGAGATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGACGAACAGTTAGAAATAGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTAC
CGCATGGTACAGTGTGAAAAACTACCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGCTGATTAGTCCA
GTTGGCGGGGTAACGGCCGACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGG
CCGACAGTTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU277(SEQ ID NO.：105)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCACTAAGACGGATTTC
TTTGGATTGAAGTCTTTGTGACTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGATCG
CATGGTCTGGTGTGGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGT
TGGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCC
ACGATTGGGACTGAGAC ACGGCCCAG
OTU279(SEQ ID NO.：106)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGTTAGACAGAGGAAGTT
TTCGGATGGAATCGGTATAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACCTGCCC
TGTACCGGGGGAGTAACACTTAGAAATAGGTGCTAATACCGCATAAGCGCACGGAACCGC
ATGGTTCTGTGTGAAAAACTACCGGTGGTAC AGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GGCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU280(SEQ ID NO.：107)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCTTTGTAAAGGAGCTTGCT
TCTTTACGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATAAGCAATCTGCCCATCGGCCTGGG
ATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGGATAGGTTAGTTTCTGGCATCAGGGACTAAT
TAAAGTTGGGATACAACACGGATGGATGAGCTTATGGCGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTA
ACGGCCCACCTAGGCGATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGAC
TGAGACACGGCCCAA
OTU281(SEQ ID NO.：39)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCGCTTCCGCCTGATTT
TCTTCGGAGATGAAGGCGGCTGCGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGCAAC
CTGCCTTGCACTGGGGGATAACAGCCAGAAATGGCTGCTAATACCGCATAAGACCGAAGC
GCCGCATGGCGCTGCGGCCAAAGCCCCGGCGGTGCAAGATGGGCCCGCGTCTGATTAGGT
AGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCG
GCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU286(SEQ ID NO.：108)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCACTAAG ACGGATTTC
TTCGGATTGAAGTCTTTGTGACTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGATCG
CATGGTCTGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GGCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGGCCCAA
OTU287(SEQ ID NO.：109)
GACGAACGCTGGCGGCGCGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGACACATCCGACGGAATAG
CTTGCTAGGAAGATGGATGTTGTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGC
CTCGGAGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGGTGGTCGGGGGA
CATCCCCTGGCCAAGAAAGGATTATATCCGCTCTGAGATGGGCTCGCGTCTGATTAGCTA
GTTGGCGGGTAATGGCCCG ACCGA AGGCAACGATCAGTAGCCGGACTGAGAGGTTGAACG
GCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCCAG
OTU288(SEQ ID NO.：40)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGAGTTATGCAGAGGAAGTT
TTCGGATGGAATCGGCGTAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCTGCC
CTGTACCGGGGGATAACACTTAGAAATAGGTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGCTTCAC
ATGAAGCAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCCAGTTG
GCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCAC
ATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU296(SEQ ID NO.：23)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCGCCTGGCCCCGACTT
CTTCGGAACGAGGAGCCTTGCGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGCAACCT
GCCTTGCACTGGGGGATAACAGCCAGAAATGGCTGCTAATACCGCATAAGACCGAAGCGC
CGCATGGCGCAGCGGCCAAAGCCCCGGCGGTGCAAGATGGGCCCGCGTCTGATTAGGTAG
TTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGC
CACATTGGGACTGAGAC ACGGCCCA
OTU297(SEQ ID NO.：110)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATCTTATAGGAAGTT
TTCGGATGGAATATGGGATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGAGTAACAGTTAGAAATGGCTGCTAATACCCCACTAAGCGCACGGTAC
CGCATGGTACGGTGTGAAAAACCCAGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGCCAG
TTGGCGGGGTAACGGCCCGACCAAACGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCG
GCCGACATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU303(SEQ ID NO.：111)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATTTTAGATGAAGTT
TTCGGATGGATTCTGAGATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGACAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTACCG
CATGGTACAGCGTGAAAAACTCCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GGCGGGGTAACGGCCCACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCAC
ATTGGGGACTGAGACCACGGGCCCAA
OTU304(SEQ ID NO.：112)
ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGC
TGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCCGATGGAGGGG
GATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACC
TTAGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAAAGGC
TCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGA
CACGGTCCAG
OTU306(SEQ ID NO.：33)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCGACTTAACGGAAGTT
TTCGGATGGAAGTTGAATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTTGTACTGGGGGACGAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTATC
GCATGATACAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTACAAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGT
TGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU307(SEQ ID NO.：113)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATCTTATAGGAAGTT
TTCGGATGGAATATGGGATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGAGTAACCTG
CCTCACACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGGCTGCTAATACCCCATAAGCGCACAGTACC
GCATGGTACGGTGTGAAAAACCCAGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGCCAGT
TGGCGGGTAACGGCCGACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCAC
GATTGGGACCTGAGACACGGGCCCA
OTU312(SEQ ID NO.：114)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGTTATATCGAGGAAGTT
TTCGGATGGAATCAGTATAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCTGCC
CTGTACCGGGGGATAACACTTAGAAATAGGTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGCTTCAC
ATGAAGCAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGTTG
GAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCAC
ATTGGGACTGAGACACGGCCCAG
OTU313(SEQ ID NO.：115)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCGGGCAGCAATGCCCGAGT
GGCGAACGGGTGAGTAATACATAAGTAACCTGCCCTTTACAGGGGGATAACTATTGGAAA
CGATAGCTAAGACCGCATAGGTAAAGATACCGCATGGTAAGTTTATTAAAGTGCCAAGGC
ACTGGTAGAGGATGGACTTATGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGG
CGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA
A
OTU314(SEQ ID NO.：31)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGCTGTTTTCAGAATC
TTCGGAGGAAGAGGACAGTGACTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGCAACCTGC
CTCATACAGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGACCG
CATGGTGTAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGGTAGTT
GGTGGGGTAAGGCCGTACCAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCA
CATTGGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU319(SEQ ID NO.：116)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGTTAGACAGAGGAAGTT
TTCGGATGGAATCGGTATAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCTGCC
CTGTACCGGGGGATAACACTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTACCGC
ATGGTACAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCCTCTGATTAGCCAGTTG
GCGGGGTAACGGCCCACCAAAGCGACGATC AGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCACA
TTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU326(SEQ ID NO.：117)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATTAAAATGAAGTT
TTCGGATGGATTTTTGATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGCTTCA
CATGAAGCAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GGCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCA
CATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU328(SEQ ID NO.：118)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAGTGCCTTAGAAAGAGGA
TTCGTCCAATTGATAAGGTTACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGGAACCTGC
CTCGGAGTGGGGAATAACAGACCGAAAGGTCTGCTAATACCGCATGATGCAGTTGGACCG
CATGGTCCTGACTGCCAAAGATTTATCGCTCTGAGATGGCCTCGCGTCTGATTAGCTTGT
TGGCGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGACTGAGAGGTTGGCCGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU333(SEQ ID NO.：119)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAGTGCTCATGACAGAGGA
TTCGTCCAATGGAGTGAGTTACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGTAACCTGC
CTTGGAGTGGGGAATAACAGGTGGAAACATCTGCTAATACCGCATGATGCAGTTGGGTCG
CATGGCTCTGACTGCCAAAGATTTATCGCTCTGAGATGGACTCGCGTCTGATTAGCTGGT
TGGCGGGTAACGGCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGACTGAGAGGTTGGCCGGCCAC
ATTGGGACTGAGACACGGCCCAG
OTU334(SEQ ID NO.：41)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCATCCCATAGGAAGTT
TTCGGATGGA ATATGGGATGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGGATAACAGTTAGAAATGGCTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTACCG
CATGGTACGGTGTGAAAAACCCAGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GGCGGGGTAACGGCCCACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCA
CATTGGGGACTGAGACACGGCCCA
OTU337(SEQ ID NO.：30)
GACGAACGCTGGCGGCGCGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGAGCTTACGTTTTGAAGTT
TTCGGATGGATGAATGTAAGCTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCC
TTTCAGAGGGGGATAACAGCCGGAAACGGCTGCTAATACCGCATGATGTTGCGGGGGCAC
ATGCCCCTGCAACCAAAGGAGCAATCCGCTGAAAGATGGGCTCGCGTCCGATTAGCCAGT
TGGCGGGGTAACGGCCCACCAAAGCGACGATCGGTAGCCGGACTGAGAGGTTGAACGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCAG
OTU339(SEQ ID NO.：120)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCAATTAAAATGAAGTT
TTCGGATGGATTTTTGATTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGATAACCTGC
CTCACACTGGGGATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTACCGC
ATGGTACGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTGTGAGATGGATCCGCGTCTGATTAGCCAGTTG
CGGGGTAACGGCCCGACCAAGCGACGATCAGTAGCCGACCGTGAGAGGTGACCGGCCCAC
ATTGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU340(SEQ ID NO.：121)
GACGAACGCTGGCGGCGCGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGAGTTGTGTTGAAAGCTTG
CTGGATATACAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCTCTCAGAG
TGGAATAACGTTTGGAAACGAACGCTAATACCGCATAACGTGAGAAGAGGGCATCCTCTT
TTTACCAAAGATTTATCGCTGAGAGATGGGCTCGCGGCCGATTAGGTAGTTGGTGAGATA
ACAGCCCACCAAGCCGACGATCGGTAGCCGGACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGAC
TGAGACACGGCCCAG
OTU353(SEQ ID NO.：122)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACAC ATGCAAGTCGAGCGAAGCACCTTGACGGATTCT
TCGGATTGAAGCCTTGGTGACTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGCC
TCATACAGGGGGGATAAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGACC
GC ATGGTCTGGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGT
TGGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCC
ACATTGGGACTGAGGACACGGCCCA
OTU359(SEQ ID NO.：42)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGTTATATCGAGGAAGTT
TTCGGATGGAATCAGTATAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCTGCC
CTGTACCGGGGGATAACACTTAGAAATAGGTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGCTTCAC
ATGAAAGCAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCCAGTT
GGCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGGAGAGGGTGAACGGCC
ACATTGGGACTGAGACACGGCCCG
OTU362(SEQ ID NO.：43)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGAAGCGGTTTCGATGAAGTT
TTCGGATGGATTTGAAATCGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGC
CTTACACTGGGG ATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGGCCGC
ATGGTCCGGTGTGAAAACTCCGGTGGTGTAAGATGGACCCGCGTCTGATTAGGTAGTTGG
TGGGTAACGGCCCACCAAGCCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACAT
TGGGACTGAGACACGGCCCAA
OTU367(SEQ ID NO.：44)
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGTTACACAGAGGAAGTT
TTCGGATGGAATCGGTATAACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAACCCGCC
CTGTACCGGGGGATAACACTTAGAAATAGGTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGCTTCAC
ATGAAGCAGTGTGAAAACTCCGGTAGGTACAGGATGGTCCCGCGTCTGATTAGCCAGTTG
GCAGGGTAACGGCCTACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTCAACGGCCAC
ATTGGGACTGAGACACGGCCCAA