具有分化和抗增殖活性的苯甲酰胺类 组蛋白去乙酰化酶抑制剂及其药用制剂 【技术领域】
本发明涉及具有治疗作用的全新小分子化合物的合成及其在治疗与分化和增殖相关的疾病方面的临床应用
背景技术
基因表达异常在许多疾病的发病机理中起着重要作用，这些疾病包括肿瘤、内分泌紊乱、免疫系统疾病、遗传病和神经系统疾病。人的基因组以DNA、组蛋白和非组蛋白包装成的染色质结构存在，染色质结构在决定一个特定基因是否表达时起着重要的作用。总的说来，浓缩的染色质抑制转录，而转录活跃的基因往往位于开放的染色质中。
组成染色质的基本重复单位核小体由DNA双链围绕着含4种组蛋白的组蛋白核心构成。这个组蛋白核心包含一个H3-H4四聚体和两个H2A-H2B二聚体。组蛋白H1附着在核小体间的连接部分，并通过它富含正电核的羧基末端中和DNA链上的负电荷以保持染色质结构的稳定性。核小体这种高度有序的结构确定了染色质组成和基因活化地关系(Ricky W.Johnstone，“Histone deacetylase inhibitors：noveldrugs for the treatment of cancer”，Nature Reviews Drug Discovery 2002，1：287)。组蛋白N末端可以被翻译后修饰，而且因此可以改变染色质的结构和功能。其中一种修饰是组蛋白尾部赖氨酸残基可逆的乙酰化和去乙酰化。组蛋白乙酰化水平是由组蛋白乙酰化酶(Histoneacetylases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDACs)共同控制的。组蛋白N末端除了可以被乙酰化修饰外，还可以被磷酸化、甲基化和ADP-核糖基化。这些修饰影响组蛋白的电性及其功能，进而改变染色质的结构和基因表达(Current Opinion in Oncology2001，13：477-483)。
近几年的研究揭示了组蛋白乙酰化与染色质重建以及基因调控间的紧密联系。很多转录激活物复合体都有内在的组蛋白乙酰化酶活性，相反，转录抑制复合体则具有招募组蛋白去乙酰化酶到目标基因启动子的活性(Bioassays 1998，20：615)。一些特异性转录激活因子，如核受体超家族、cAMP效应器结合蛋白(CREB)、信号传导活化转录因子1(STAT-1)等可以与各种辅激活子和辅抑制子在不同组织和基因中选择性作用，构成了基因选择性表达的调控网络。这些调控网络控制着我们身体机能的平衡，干扰这些网络将会导致疾病或影响疾病的进程。因此，调节这些转录复合体蛋白间的相互作用为治疗肿瘤、内分泌紊乱、免疫系统疾病、遗传病和神经系统疾病提供了新的方法(E.Korzus，Transcription Factor-specific Requirements for Coactivatorand Their Acetyltransferase Functions.Science 1998，279：703-707；N.J.McKenna and B.W.O′Malley，Combinatorial Control of GeneExpression by Nuclear Receptors and Coregulators.Cell 2002，108(4)：465-474；M.J.Pazin and J.T.Kadonaga，What′s Up and Downwith Histone Deacetylation and Transcription？Cell 1997，89(3)：325-328；H.Zhong，R.E.Voll and S.Ghosh，Phosphorylation of NF-B p65 byPKA Stimulates Transcriptional Activity by Promoting a Novel BivalentInteraction with the Coactivator CBP/p300.Molecular Cell 1998，1(5)：661-671；J.S.Steffan，Histone deacetylase inhibitors arrestpolyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila，Nature 2001，413：691-694；US20020115716Λ1，WO0056153Λ1)。
举例来说，细胞的发育和分化受到基因程序表达的调控，这是染色质结构水平上的调控。遗传变异或突变引起组成型激活癌基因如RAS，或者使肿瘤的抑制基因失活如p53，都将会影响包括转录在内的一系列分子进程。此外，一些造成组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶异常作用的遗传变异，如使它们的目标基因错位，或使组蛋白乙酰化酶功能失活，或过量表达组蛋白去乙酰化酶等都会打破细胞正常发育和分化的进程，引起肿瘤的发生和发展(Current Opinion Genet.Development 1999，9：40-48 and 175-184)。一些人类肿瘤产生与组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶活性失调有关，其中的一个例子是在人急性髓细胞白血病患者中，常见到15和17号染色体的异位，异位的结果会产生一种包含RARα、PML和PLZF三种蛋白分子的融合蛋白。这种异常的融合蛋白可以与RAR的顺式作用元件结合，并且通过与SMRT辅抑制子强力结合招募来有高亲和力的组蛋白去乙酰化酶，使得RAR的目标基因表达受到了持续抑制，并且失去了对维生素A酸的反应(Oncogene 2001，20：7204-7215)。维生素A酸受体(RAR)是一种依赖配体激活的转录因子，它对骨髓的分化有非常重要的作用。RAR与RXR构成的异二聚体，可以结合到目标基因启动子区的维生素A酸反应元件上。当缺乏维生素A酸时，RAR/RXR可以通过辅抑制子NCOR和SMRT招募SIN/HDAC来抑制转录；而当加入配体后，HDAC被释放出来，随即RAR/RXR可和TIF2、CBP等具有HAT活性的辅因子结合而激活转录。因此，激活或抑制含有维生素A酸反应元件的基因对骨髓细胞的分化有很重要的作用。并且，外加HDAC的抑制剂可以使急性髓系白血病细胞恢复对维生素A酸诱导分化的能力，暗示异常的组蛋白去乙酰化是白血病发病过程的一个关键因素。
已有报道表明，当组蛋白去乙酰化酶过度表达时会抑制一些抑癌基因的表达，如p53。p53是细胞增殖的一个关键调控者，它可将信号传给控制细胞周期的基因，并在外界压力存在时诱导细胞凋亡。p53功能的实现主要在于它能直接与特异的DNA序列结合并激活转录，如果它的DNA结合区发生突变而使功能失活，则常会导致癌症。有证据表明CBP/p300可以通过使组蛋白和p53乙酰化而上调p53(W.Gu and R.G.Roeder，Activation of p53 Sequence-Specific DNA Bindingby Acetylation of the p53 C-Terminal Domain.Cell 1997，90(4)：595-606.)。相反，哺乳动物体内的HDAC-1、HDAC-2和HDAC-3可以通过使组蛋白和p53去乙酰化而下调p53(L.-J.Juan，et al.，Histone Deacetylases Specifically Down-regulate p53-dependent GeneActivation.The Journal of Biological Chemistry 2000，275(27)：20436-20443)。
上述实验表明，由HDACs介导的非正常的转录抑制作用可以改变染色质的结构，干扰正常的细胞分化，导致肿瘤及其它增生疾病的发生。因此，抑制HDAC的活性可能是治疗肿瘤及其它增生疾病的有效方法。
已经发现了几类组蛋白去乙酰化酶的抑制剂，包括(1)短链脂肪酸，如丁酸和苯丁酸；(2)有机异羟肟酸，如suberoylanilidehydroxamic acid(SAHA)和trichostatin A(TSA)；(3)含2-氨基-8-氧-9，10-环氧癸酰基的环四肽，如trapoxin和HC-toxon；(4)不含2-氨基-8-氧-9，10-环氧癸酰基的环四肽，如Apicidin和FK228；(5)苯甲酰胺类化合物，如MS-275(EP0847992A1，US2002/0103192A1，WO02/26696Λ1，WO01/70675Λ2，WO01/18171Λ2)。
丁酸作为一种细胞增殖的抑制剂和细胞分化的诱导剂，其活性主要源于对组蛋白去乙酰化酶的抑制(A.Nudelman and A.Rephaeli，Novel Mutual Prodrug of Retinoic and Butyric Acids with EnhancedAnticancer Activity.J.Med.Chem.2000，43(15)：2962-2966.)。苯丁酸可以用来单独治疗地中海贫血、弓浆虫病、疟疾等疾病，也可以与维生素A酸联合治疗急性髓细胞白血病(R.P.Warrcll.ct al.，Thcrapcutictargeting of transcription in acute promyelocytic leukemia by use of aninhibitor of histone deacetylase.J.Natl.Cancer Inst.1998，90(21)：1621-1625.)。丙戊酸是抗惊厥药物，也被发现是通过直接抑制组蛋白去乙酰化酶而起作用的(C.J.Phiel et al.，Histone Deacetylase Is aDirect Target of Valproic Acid，a Potent Anticonvulsant，Mood Stabilizer，and Teratogen.The Journal of Biological Chemistry 2001，276(39)：36734-36741；EP1170008A1)。
一些苯甲酰胺类化合物在较低的微摩尔级浓度下就具有组蛋白去乙酰化酶抑制剂活性。其中Mitsui Chemicals公司研制的先导化合物MS-275是第一个被证明在动物体内具有口服抗癌活性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，且没有严重的副作用(A.Saito et al.，A syntheticinhibitor of histone deacetylase，MS-27-275，with marked in vivoantitumor activity against human tumors.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 1999，96(8)：4592-4597；EP 0847992 A1)。目前，MS-275正在马里兰大学的Grccncbaum癌症中心进行白血病的临床研究，同时在美国国家癌症研究院进行实体瘤的临床研究(E.B.Levit，Clinical Trials in Leukemiafocus on New Treatment Approaches.2001 Release-University ofMaryland Medical News 2001 Maryland http：//www.umm.edu/news/releases/karp.html，A Phase I Study of an Oral Histone DeacetylaseInhibitor，MS-275，in Refractory Solid Tumors and Lymphomas.2001，National Cancer Institute)。然而，一些新的有更好性能的化合物仍有待于开发，以便能得到有更强HDAC抑制活性和更低副作用的药物。
技术内容
本发明目的之一在于公开一类基于组蛋白去乙酰化酶设计的具有诱导分化和抗增殖活性的用于治疗与分化和增殖相关的疾病如癌症和牛皮癣的化合物；
本发明目的之二在于公开这一类所述的化合物的制备方法；
本发明目的之三在于公开这一类所述的化合物作为治疗与分化和增殖相关的疾病如癌症和牛皮癣的临床应用。
本发明所说的化合物，其化学结构如通式(I)所示：
其中，A为苯环或杂环，可以含有1至4个取代基，其取代基可以是卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、1至4个碳原子的烷基、1至4个碳原子的烷氧基、1至4个碳原子的氨烷基、1至4个碳原子的烷氨基、2至4个碳原子的酰基、2至4个碳原子的酰氨基、1至4个碳原子的硫代烷基、1至4个碳原子的全氟烷基、1至4个碳原子的全氟烷氧基、1至4个碳原子的羧基、1至4个碳原子的烷氧基羰基、苯基或杂环取代基；
B为苯环或杂环，可以含有1至3个取代基，其取代基可以是卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、1至4个碳原子的烷基、1至4个碳原子的烷氧基、1至4个碳原子的氨烷基、1至4个碳原子的烷氨基、2至4个碳原子的酰基、2至4个碳原子的酰氨基、1至4个碳原子的硫代烷基、1至4个碳原子的全氟烷基、1至4个碳原子的全氟烷氧基、1至4个碳原子的羧基、1至4个碳原子的烷氧基羰基、苯基或杂环取代基；
Z为共价键、1至4个碳原子的烷撑或含有-O-、-S-、-NH-、-CO-、-CS-、-SO-、-SO2-的线性结构、环状结构或线性结构与环状结构的组合；
Y为含有-CO-、-CS-、-SO-、-SO2-的线性结构、环状结构或线性结构与环状结构的组合，其中环A的中心点(W1)、环B的中心点(W2)与Y中所含的作为氢键受体的O原子或S原子(W3)之间的距离满足下列条件：W1-W2＝6.0～12.0，W1-W3＝3.0～6.0，W2-W3＝4.0～8.0；它们之间较佳的距离为：W1-W2＝8.0～10.0，W1-W3＝3.0～5.0，W2-W3＝5.0～8.0；
R1、R2分别为氢或含有1至4个碳原子的烷基，R1、R2还可以一起构成一个共价键；
R3为氢或含有1至4个碳原子的烷基；
R4为氢、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、1至4个碳原子的烷基、1至4个碳原子的烷氧基、1至4个碳原子的氨烷基、1至4个碳原子的烷氨基、2至4个碳原子的酰基、2至4个碳原子的酰氨基、1至4个碳原子的硫代烷基、1至4个碳原子的全氟烷基、1至4个碳原子的全氟烷氧基、1至4个碳原子的羧基、1至4个碳原子的烷氧基羰基；
X1、X2、X3、X4其中之一为卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、1至4个碳原子的烷基、1至4个碳原子的烷氧基、1至4个碳原子的氨烷基、1至4个碳原子的烷氨基、2至4个碳原子的酰基、2至4个碳原子的酰氨基、1至4个碳原子的硫代烷基、1至4个碳原子的全氟烷基、1至4个碳原子的全氟烷氧基、1至4个碳原子的羧基、1至4个碳原子的烷氧基羰基；其余分别为氢、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、1至4个碳原子的烷基、1至4个碳原子的烷氧基、1至4个碳原子的氨烷基、1至4个碳原子的烷氨基、2至4个碳原子的酰基、2至4个碳原子的酰氨基、1至4个碳原子的硫代烷基、1至4个碳原子的全氟烷基、1至4个碳原子的全氟烷氧基、1至4个碳原子的羧基、1至4个碳原子的烷氧基羰基。
本发明所述的“杂环”，是指含一个或多个杂原子(氮、氧或硫)的饱和或不饱和杂环，如四氢吡咯、二氢吡咯、二氢吡唑、哌啶、吗啉、咪唑、吡啶等；
本发明所述的“卤素”，为氟、氯、溴、碘；
本发明所述的“1至4个碳原子的烷基”，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、特丁基等；
本发明所述的“1至4个碳原子的烷氧基”，包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基等；
本发明所述的“1至4个碳原子的氨基烷基”，包括氨基乙基、1-氨基丙基、1-氨基丙基等；
本发明所述的“1至4个碳原子的烷基胺基”，包括N-甲胺基、N-乙胺基、N-异丙胺基等；
本发明所述的“2至4个碳原子的酰基”，包括乙酰基、丙酰基、异丁酰基等；
本发明所述的“2至4个碳原子的酰胺基”，包括乙酰胺基、丙酰胺基、丁酰胺基、异丁酰胺基等；
本发明所述的“1至4个碳原子的硫代烷基”，包括甲硫基、乙硫基、丙硫基等；
本发明所述的“1至4个碳原子的全氟烷基”，包括三氟甲基、五氟乙基等；
本发明所述的“1至4个碳原子的全氟烷氧基”，包括三氟甲氧基、五氟乙氧基等；
本发明所述的“1至4个碳原子的烷撑”，包括甲撑、乙撑等；
本发明所述的“环的中心点”是指构成环的原子所对应的X、Y、Z轴数值的平均值。
本发明所说的化合物的合成方法如下：
(a)将通式(II)化合物与通式(III)化合物进行缩合反应得到通式(IV)化合物：
R6-B-COOH
(III)
其中，A、Z、Y、B、R1、R2同前所述；R5为-C(＝Q)OH(Q为O或S原子)或含有-NH2的结构；当R5为-C(＝Q)OH(Q为O或S原子)时，R6为含有-NH2的结构；当R5为含有-NH2的结构时，R6为-C(＝Q)OH(Q为O或S原子)。
(b)将通式(IV)化合物与通式(V)化合物进行缩合反应得到目标化合物(I)：
其中，R3、R4、X1、X2、X3和X4同前所述。
上述缩合反应(a)和(b)以肽缩合剂为催化剂，如二环己基碳酰亚胺，N，N-碳酰二咪唑等。
上述缩合反应(a)和(b)的反应温度为0～80℃，反应时间为4～72小时。反应所用溶剂为常用溶剂，如苯、甲苯、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺等。必要时，可以加入碱如氢氧化钠、三乙胺、吡啶等，或加入酸如盐酸、醋酸、三氟乙酸等。
通式(I)所述的化合物，可以采用常见的分离方法进行纯化，如萃取、重结晶、柱层析等。
本发明所述的化合物，具有诱导分化和抗增殖活性，可以用于治疗与分化和增殖相关的疾病如癌症和牛皮癣，尤其对血癌和实体瘤具有优异疗效。
本发明所说的化合物，可以制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂、针剂，可以加入香料、甜味剂、液体或固体填料或稀释剂等常用载体物质(见《药用赋形剂手册》，美国药学协会，1986年10月)。该制剂通常含有1～70％的有效成分，较佳含量为5～50％，其余组分为载体填料、稀释剂或溶剂。
本发明所说的化合物在临床上可以通过口服或注射方式对哺乳动物(包括人)进行给药，其中尤以口服方式最佳。用药剂量为每日0.0001～200mg/kg体重。最佳剂量视个体而定，通常开始时剂量较小，然后逐渐增加用量。
本发明优点在于，所述化合物及其药用制剂对于治疗基因表达异常而引起的如：肿瘤、内分泌紊乱、免疫系统疾病、遗传病和神经系统疾病有很好的疗效。
下面结合实例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围并不仅仅局限于这些实例。本发明所述的百分比除特别注明外，均为重量百分比。
实施例1
4-[N-(3-吡啶丙烯酰基)氨甲基]苯甲酸的制备
于反应瓶中加入0.33克(2.01mmol)N，N-碳酰二咪唑及10毫升四氢呋喃，冷却至0℃，滴加10毫升溶有0.30克(2.01mmol)3-吡啶丙烯酸的四氢呋喃溶液，室温搅拌反应3小时，然后滴加2毫升(2.00mmol)溶有0.30克(2.00mmol)4-氨甲基苯甲酸的1N氢氧化钠溶液，室温继续搅拌反应8小时。将反应混合物真空浓缩，向残留物中加入2毫升饱和氯化钠溶液，并用浓盐酸调节pH值至5。将析出的固体过滤、冰水洗涤、干燥得0.46克(82％)目标化合物。HRMS(C16H14N2O3)计算值(％)：282.2988；实测值(％)：282.2990。元素分析(C16H14N2O3)计算值(％)：C，68.07％；H，5.00％；N，9.92％；实测值(％)：C，68.21％；H，5.03％；N，9.90％。
实施例2
N-(2-氨基-5-氟苯基)-4-[N-(3-吡啶丙烯酰基)氨甲基]
苯甲酰胺的制备
于反应瓶中加入0.29克(1.78mmol)N，N-碳酰二咪唑、0.50克(1.78mmol)4-[N-(3-吡啶丙烯酰基)氨基甲基]苯甲酸及15毫升四氢呋喃，45℃搅拌反应1小时。将反应混合物冷却后，加入到另一含有10毫升四氢呋喃、0.28克(2.22mmol)4-氟-1，2-苯二胺和0.20克(1.78mmol)三氟乙酸的反应瓶中，室温搅拌反应24小时。将析出的固体过滤、四氢呋喃洗涤、干燥得0.40克(57％)目标化合物。1H MR(300MHz，DMSO-d6)：δppm：4.49(2H，d)，4.84(2H，br.s)，6.60(1H，t)，6.80(2H，m)，6.96(1H，t)，7.18(1H，d)，7.42(2H，d)，7.52(1H，d)，7.95(2H，d)，8.02(1H，d)，8.56(1H，d)，8.72(1H，br.t)，8.78(1H，s)，9.60(1H，br.s。IR (KBr)cm-1：3310，1655，1631，1524，130，750。HRMS(C22H19N4O2F)计算值(％)：390.4170；实测值(％)：390.4172。元素分析(C22H19N4O2F)计算值(％)：C，67.68％；H，4.40％；N，14.35；实测值(％)：C，67.52％；H，4.38％；N，14.42％。
实施例3
4-(N-肉桂酰氨甲基)苯甲酸的制备
于反应瓶中加入0.33克(2.01mmol)N，N-碳酰二咪唑及10毫升四氢呋喃，冷却至0℃，滴加10毫升溶有0.30克(2.01mmol)3-吡啶丙烯酸的四氢呋喃溶液，室温搅拌反应3小时，然后滴加2毫升(2.00mmol)溶有0.30克(2.00mmol)4-氨甲基苯甲酸的1N氢氧化钠溶液，室温继续搅拌反应8小时。将反应混合物真空浓缩，向残留物中加入2毫升饱和氯化钠溶液，并用浓盐酸调节pH值至7。将析出的固体过滤、冰水洗涤、干燥得0.51克(91％)目标化合物。HRMS(C17H15NO3)计算值(％)：281.3242；实测值(％)：281.3240。元素分析(C17H15NO3)计算值(％)：C，72.58％；H，5.38％；N，4.98％；实测值(％)：C，72.42％；H，5.37％；N，4.87％。
实施例4
N-(2-氨基-5-氟苯基)-4-(N-肉桂酰氨甲基)
苯甲酰胺的制备
于反应瓶中加入0.29克(1.78mmol)N，N-碳酰二咪唑、0.50克(1.78mmol)4-(N-肉桂酰氨甲基)苯甲酸及15毫升四氢呋喃，45℃搅拌反应1小时。将反应混合物冷却后，加入到另一含有10毫升四氢呋喃、0.28克(2.22mmol)4-氟-1，2-苯二胺和0.20克(1.78mmol)三氟乙酸的反应瓶中，室温搅拌反应16小时。将析出的固体过滤、四氢呋喃洗涤、干燥得0.45克(64％)目标化合物。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δppm：4.42(2H，d)，4.92(2H，br.s)，6.62(1H，t)，6.78(2H，m)，7.01(1H，t)，7.32(5H，m)，7.54(5H，m)，8.76(1H，br.t)，9.58(1H，br.s)。IR(KBr)cm-1：3306，1618，1517，1308，745。HRMS(C23H20N3O2F)计算值(％)：389.4292；实测值(％)：389.4294。元素分析(C23H20N3O2F)计算值(％)：C，70.94％；H，5.18％；N，10.79；实测值(％)：C，70.72％；H，5.18％；N，10.88％。
实施例5
化合物N-(2-氨基-5-氟苯基)-4-[N-(3-吡啶丙烯酰基)氨甲基]苯甲酰胺(CS02100055)、N-(2-氨基苯基)-4-[N-(4-氟苯基丙烯酰基)氨甲基]苯甲酰胺(CS02100019)和N-(2-氨基苯基)-4-[N-(3-吡啶甲氧基羰基)氨甲基]苯甲酰胺(MS275，EP0847992)的组蛋白去乙酰化酶体外抑制活性
实验采用HDAC比色分析试剂盒(BIOMOL Rcscarch Laboratorics，PA，USA)完成。所有操作均按照实验手册进行。首先将被测试的化合物按不同浓度加到96孔板中，然后与HeLa细胞的核提取物混合并加入组蛋白去乙酰化酶的底物，37℃放置10分钟后用终止显色液终止反应，随后在酶标仪上用405nm波长读取结果。抑制率的计算参照说明书进行。实验结果见表1。
表1.MS275、CS02100055和CS02100019对组蛋白去乙酰化酶的体外抑制 化合物 不同浓度下的抑制百分率IC50(μM) 1μM 5μM 10μM 50μM MS-275 14.7 19.1 64.1 82.3 8.4 CS02100055 17.5 37.3 62.1 78.4 7.2 CS02100019 11.3 24.9 28.4 29.8 ＞50.0
实施例6
化合物N-(2-氨基-5-氟苯基)-4-[N-(3-吡啶丙烯酰基)氨甲基]苯甲酰胺(CS02100055)、N-(2-氨基苯基)-4-[N-(4-氟苯基丙烯酰基)氨甲基]苯甲酰胺(CS02100019)和N-(2-氨基苯基)4-[N-(3-吡啶甲氧基羰基)氨甲基]苯甲酰胺(MS275，EP0847992)癌细胞体外生长抑制活性
用MTS法测定生长抑制率。在96孔板中接种待测细胞每孔5000个(不同生长速度的细胞接种量不同)。培养24小时后加入不同浓度的待测化合物，继续培养48小时后每孔加入20μlMTS检测底物(Promega)，37℃孵浴2小时后在酶标仪上用490nm波长读取结果。相对活细胞量以实验组/对照组×100％计算。对细胞生长抑制50％的化合物浓度标为GI50。所有化合物都溶在DMSO中，并在加药时进行1∶1000的稀释，使DMSO的终浓度≤0.1％。每个实验都独立重复三次，实验结果见表2。
表2.MS-275、CS2100055和CS02100019对肿癌细胞的生长抑制作用 化合物 不同肿瘤细胞的GI50(μM)* U2OS HeLa DU-145 SMMC-7721 HepG2 293 MCF-7 231 H292 MS-275 1.0 25 13 20 3.2 16 6.3 5.0 16 CS02100055 2.0 40 25 16 4.0 50 5.0 7.9 50 CS02100019 2.5 50 50 50 3.2 25 5.0 7.9 50 化合物 不同肿瘤细胞的GI50(μM)* LNCaP SK-N-SII PANC-I SK-OV-3 SGC-7901 Raji IIL-60 28SC Jurkat Ms-275 2.5 50 5.0 50 50 6.3 0.32 4.0 1.6 CS02100055 4.0 50 6.3 50 50 4.0 0.4 5.8 1.5 CS02100019 10 50 5.0 50 50 2.0 0.5 2.0 1.0 CS02100019 10 50 5.0 50 50 2.0 0.5 2.0 1.0
*细胞来源：
U2OS：人骨肉瘤细胞 HeLa：人宫颈癌细胞
DU-145：人前列腺癌细胞 SGC-7901：人胃癌细胞
SMMC-7721：人肝癌细胞 HepG2：人肝癌细胞
293：人胚肾细胞 MCF-7：人乳腺癌细胞
MDA-MB-231：人乳腺癌细胞 H292：人肺癌细胞
LNCaP：人前列腺癌细胞 SK-N-SH：人神经母细胞瘤
PANC-1：人胰腺癌细胞 SK-OV-3：人卵巢癌细胞
28SC：人单核巨噬细胞 Raji：人Burkitt淋巴瘤
HL-60：人髓系白血病细胞 Jurkat：人T淋巴细胞白血病
实施例7
化合物N-(2-氨基-5-氟苯基)-4-[N-(3-吡啶丙烯酰基)氨甲基]苯甲酰胺(CS02100055)、N-(2-氨基苯基)-4-[N-(3-吡啶甲氧基羰基)氨甲基]苯甲酰胺(MS275，EP0847992)和Trichostatin A(TSA)核激素受体转录激活作用
核受体的转录激活实验是用报告基因系统完成。具体操作如下：在转染的前一天将U2OS细胞接种到96孔板，使转染时的密度为50-80％。用FuGene6转染试剂(Roche)将下列各核受体的cDNA表达载体转染细胞，分别是糖皮质激素受体(GR)、过氧化物增殖激活受体γ(PPARγ)、雌激素受体α(ERα)和雌激素受体β(ERβ)，同时还共转染相应的荧光素酶报告基因质粒和内参质粒β-gal。其中GR和PPARγ还共转染了维甲类X受体(RXR)。转染后24小时加各种化合物和溶剂对照(DMSO)。药物作用24小时后裂解细胞并进行荧光素酶活性的检测，同时还测定β-半乳糖苷酶的活性以校正转染效率。实验结果如图1所示。
图1中Trichostatin A、MS-275和CS2100055对核受体的转录激活作用[LD代表每种核受体的配体，CS55代表CS2100055，纵坐标表示相对诱导倍数。在所有实验中，化合物浓度如下：TSA0.2μM，MS-275μM，CS551μM。地塞米松(0.1μM)、罗格列酮(10μM)和雌二醇(0.01μM)分别作为GR、PPARγ和ER的配体。