超临界流体萃取中药血竭有效成分的工艺方法 【技术领域】
本发明涉及天然中草药血竭的提取工艺，特别是一种超临界流体萃取分离中药血竭有效成分的工艺方法，属中草药制备化学化工技术领域。
背景技术
血竭被誉为‘活血之圣药’的珍贵中药，其性甘、温、咸、平，兼具活血化瘀、消肿止痛、止血补血之功效。现代医学研究表明，血竭具有改善机体微循环，调整新陈代谢，改善免疫功能等作用。临床试验表明，血竭具有降血糖、降血脂的功效，是一种极具开发价值的潜在的新一代降糖药物。血竭主要来源于棕榈科黄藤属藤本植物与百合科龙血树属植物的树脂及同属它种植物果实中溶出或分泌的红色树脂。
传统中药提取常用的方法为浸渍法，渗漉法，水煎煮法，回流提取法及连续回流提取法等，所用溶剂为水或有机溶剂。但这些方法对中草药的提取物一般需进一步除去杂质，分离并进行精制，而且存在有机溶剂残留，工艺步骤复杂，耗费时间长等不足之处。近年来，超临界流体萃取技术获得了发展，由于具有适合提取天然热敏性物质、产品无溶剂残留、产品质量稳定、操作方便、萃取效率高且能耗少等优良特性，为中药现代化研究提供了一种高效的提取与分离的全新手段，在中草药有效成分的分离提取领域中具有广阔地应用前景。但目前关于中药血竭超临界流体萃取的研究尚未有人报道。专利号为98110688.9的中国发明专利报道了一种用于治疗糖尿病的血竭中药制剂及其制备方法，但其仅仅停留在动物试验与少量的人体试验方面，未对中药血竭进行进一步分离提取，且抑制活性没有明确报道，因此该专利没有涉及到中药血竭的有效成分提取问题。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种超临界流体萃取中药血竭有效成分的工艺方法。本发明的另一目的是通过采用该工艺方法，能最大程度富集血竭有效成分，制得具有较高α-葡萄糖苷酶抑制活性的降糖药物。
本发明的超临界流体萃取中药血竭有效成分的工艺方法，根据其不同方法和不同阶段采用三种方法：
1.用纯CO2进行非极性超临界萃取法(简称A法)；
2.以有机溶剂作为夹带剂，萃取除去血竭中极性无效成分(简称B法)；
3.A法和B法的综合法(简称C法)，即先用纯CO2超临界萃取中药血竭中的非极性无效组分，然后以有机溶剂作为夹带剂，萃取除去血竭中极性残留的极性无效成分，最终获得高降血糖活性的萃取残余物。
现将上述三种方法分别叙述于后：
一、A法：
一种超临界流体萃取中药血竭有效成分的工艺方法，其特征在于，用纯CO2超临界萃取血竭的非极性无效成分而获得萃取残余物，即为所需的血竭有效成分物质；其工艺方法为：以二氧化碳为溶剂，进行血竭的非极性超临界萃取，萃取压力为10-30Mpa，温度为40-50℃，萃取时间为1-5小时，CO2流量为25-35Kg/h；超临界流体萃取流出物的解析过程为两级，第一级解析压力为7-11Mpa，解析温度为50-60℃，第二级解析压力为4-10Mpa，解析温度为40-50℃；萃取釜中的萃取残余物即为除去非极性无效组分的血竭有效物质。
二、B法
一种超临界流体萃取中药血竭有效成分的工艺方法，其特征在于，用纯CO2和有机溶剂甲醇萃取中药血竭的极性无效组份而获得萃余物，即为所需的血竭有效成分物质；其工艺方法为：以二氧化碳为溶剂，加入有机溶剂甲醇作为夹带剂，进行血竭的极性超临界萃取，萃取压力为10-40Mpa，温度为40-60℃，萃取时间为1-5小时，CO2流量为25-35Kg/h；第一级解析压力为6-11Mpa，解析温度为45-60℃，第二级解析压力为4-9Mpa，解析温度为45-55℃；萃取釜中的萃取残余物即为除去极性无效组份的血竭有效物质。
三、A+B法
一种超临界流体萃取中药血竭有效成分的工艺方法，其特征在于，先用纯CO2超临界萃取中药血竭中非极性无效组份，然后以有机溶剂甲醇作为萃取溶剂，萃取中药血竭的极性无效组份，从而获得萃取残余物，即为所需的血竭有效成分物质；其工艺方法为：首先以二氧化碳为溶剂，进行血竭的非极性超临界萃取，萃取压力为10-30Mpa，温度为40-50℃，萃取时间为1-5小时，CO2流量为25-35Kg/h；超临界流体萃取流出物的解析过程为两级，第一级解析压力为7-11Mpa，解析温度为50-60℃，第二级解析压力为4-10Mpa，解析温度为40-50℃；然后加入有机溶剂甲醇作为夹带剂，进行血竭的极性超临界萃取，萃取压力为10-40Mpa，温度为40-60℃，萃取时间为1-5小时，CO2流量为25-35Kg/h；超临界流体萃取流出物的解析过程为两级，第一级解析压力为6-11Mpa，解析温度为45-60℃，第二级解析压力为4-9Mpa，解析温度为45-55℃；萃取釜中的萃取残余物即为除去极性无效组分的血竭有效物质。
本发明方法所制备的中药血竭提取物具备较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可用于制造降糖药物。本发明方法工艺简单，操作方便，产品中无溶剂残留，对人体安全无毒，适合作为药物使用。
现将本发明提取物各项性能试验结果叙述于后：
一、对α-葡萄糖苷酶抑制活力测定
取血竭非极性和极性超临界流体萃取后的萃取残余物，对其作α-葡萄糖苷酶的抑制活性的试验。以德国拜耳公司生产的拜糖苹(有效成分为acarbose)做阳性对照物，并以广西血竭全粉作对比参考。在试管中加入α-葡萄糖苷酶及不同剂量的抑制剂。其测试结果于下表1：
表1 不同剂量抑制剂对α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究抑制剂 剂量(ug) 抑制率(％) ID50 活力提高率％)广西血竭全粉 2 19.46 4.49 4 33.51 6 59.22 8 82.89 10 92.57血竭非极性超临界萃余物 2 30.03 3.13 30.29 4 58.17 6 86.65 8 91.17 10 97.53血竭极性超临界萃余物 2 32.52 3.10 30.96 4 54.21 6 85.60 8 91.41 10 97.81Acarbose 1000 31.5 1.452mg 2000 70.2 3000 79.1 4000 82.5
ID50表示抑制率达50％时所需的剂量。
由表1可知，本发明的提取物其α-葡萄糖苷酶抑制活力是降糖药物拜糖苹的300-380倍，远远高于拜糖萍的降糖效果。广西血竭全粉经过非极性和极性两步超临界流体萃取后，其α-葡萄糖苷酶抑制活性与未提取前的全粉相比分别提高了30.29％和30.96％。
二、对正常小鼠空腹血糖的影响
昆明种小鼠，体重20-22g，分成5组，即阴性对照组、阳性对照组、超临界萃余物低剂量组、超临界萃取残余物中剂量组和超临界萃取残余物高剂量组。实验时，阴性对照组灌胃生理盐水，阳性对照组挂灌胃拜糖苹50mg/kg，超临界萃取残余物低剂量组灌胃提取物150mg/kg，中剂量组灌胃提取物250mg/kg，高剂量组灌胃提取物350mg/kg。连续给药7天，末次给药后禁食10h，眼眶静脉窦取血，离心取血清，按葡萄糖氧氧化酶法测定血糖水平，结果见表2。
表2 血竭超临界萃余物对正常小鼠糖耐量的影响组别 剂量(mg/kg) N 血糖值(mmol/L)阴性对照组 - 7 4.49±0.82阳性对照组 50 8 4.22±0.88*超临界萃余物低剂量组 150 7 4.52±1.10*超临界萃余物中剂量组 250 8 4.25±0.92*超临界萃余物高剂量组 350 8 4.30±1.24*
*P＜0.01v.s.阴性对照组
血竭超临界萃取残余物对正常小鼠糖耐量的影响实验结果表明，超临界萃余物中、高剂量组效果接近于拜糖苹。
三、四氧嘧啶Alloxan诱导的糖尿病小鼠血糖值试验
昆明种小鼠，体重20-22g，禁食24小时，腹腔注射Alloxan200mg/kg，一天一次，72h后禁食10h，静脉窦取血离心取血清测定，选取血糖值在11.1mmol/L以上者进行实验。分组时各组动物平均血糖值之差不大于0.5mmol/L。小鼠共分5组，即阴性对照组、阳性对照组、超临界萃取残余物低剂量组、超临界萃取残余物中剂量组和超临界萃余物高剂量组。实验时，阴性对照组灌胃生理盐水，阳性对照组挂灌胃拜糖苹50mg/kg，超临界萃取残余物低剂量组灌胃提取物150mg/kg，中剂量组灌胃提取物250mg/kg，高剂量组灌胃提取物350mg/kg。连续给药10d，末次给药后禁食10h，眼眶静脉窦取血，离心取血清，按葡萄糖氧氧化酶法测定血糖水平，结果见表3。
表3 血竭超临界萃余物对Alloxan诱导的糖尿病小鼠血糖量的影响组别 剂量(mg/kg) N 血糖值(mmol/L)阴性对照组 - 8 24.65±4.52阳性对照组 50 8 15.52±3.92*超临界萃余物低剂量组 150 8 17.21±3.98*超临界萃余物中剂量组 250 9 15.54±4.05*超临界萃余物高剂量组 350 8 15.85±4.21*
*P＜0.01v.s.阴性对照组
四氧嘧啶Alloxan诱导的糖尿病小鼠血糖值实验结果表明，超临界萃取残余物中、高剂量组效果接近于拜糖苹。
【附图说明】
图1为本发明超临界流体萃取中药血竭方法的工艺流程图。
【具体实施方式】
现结合附图将本发明的实施例详细叙述于后：
实施例一：
超临界流体萃取A法：将粉碎过筛后的血竭细粉2.5kg，装入萃取釜中，萃取溶剂二氧化碳由CO2钢瓶放出，经过过滤，储罐，在CO2储罐中经冷却液化后，由高压泵升压至设定的萃取压力20MPa，使CO2成为超临界流体状态，CO2超临界流体的流量为30kg/h，。在一定萃取压力下，经过热交换器加热到设定的萃取温度45℃，随后送入萃取釜与血竭细粉接触并进行溶解萃取。二氧化碳流体和萃取物一起进入分离釜I，进行第一级解析，解析压力为7MPa，温度为60℃，一级解析结束，旋转分离釜I的三通解析阀，放出一级解析后的萃取物I，接着二氧化碳流体和未解析的萃取物再进入分离釜II，进行第二级解析，解析压力为6.4MPa，温度为40℃，二级解析结束，旋转分离釜II的三通解析阀，放出二级解析后的萃取物II。二氧化碳气体通过过滤器净化，再适当补充二氧化碳，经调节压力与温度，将临界状态的二氧化碳流体经过流量计后进入储罐，实现循环使用。总的萃取时间为2小时。最后得到除去非极性无效成分的血竭有效成分萃取残余物。
实施例二：
超临界流体萃取B法：将粉碎过筛后的血竭细粉2.5kg装入萃取釜中，萃取溶剂二氧化碳由CO2钢瓶放出，经过过滤，储罐，在CO2储罐中经冷却液化后，由高压泵升压至设定的萃取压力20MPa，使CO2成为超临界流体状态，CO2超临界流体的流量为30kg/h，。在一定萃取压力下，经过热交换器加热到设定的萃取温度45℃，随后送入萃取釜与血竭细粉接触；同时有机溶剂储罐中的甲醇通过高压泵泵入萃取釜，作为夹带剂，根据要求，调节甲醇夹带剂与二氧化碳流体的流量比例，一般为15％。有机溶剂甲醇与二氧化碳在萃取釜中混合进行萃取。萃取压力为25MPa，温度40℃，流体和萃取物一起进入分离釜I，进行第一级解析，解析压力7MPa，温度60℃，一级解析结束，旋转分离釜I的三通解析阀，放出一级解析后的萃取物I，接着流体和未解析的萃取物再进入分离釜II，进行第二级解析，二级解析压力6.4MPa，温度40℃，二级解析结束，旋转分离釜II的三通解析阀，放出二级解析后的萃取物II。二氧化碳气体通过过滤器净化，再适当补充二氧化碳和有机溶剂甲醇，二氧化碳经调节压力与温度，将临界状态的二氧化碳流体经过流量计后进入储罐，实现循环使用。总的萃取时间为3小时。最后得到除去极性无效成分的血竭有效成分萃取残余物2.2kg。
实施例三：
超临界流体萃取C法：将粉碎过筛后的血竭细粉2.5kg，按上述实施例一和实施例二同样的方法，先进行血竭的非极性无效成分萃取，得萃取物2.36kg，接着以此萃取残余物为原料，进行有机溶剂甲醇的极性超临界萃取，去除极性无效成分，最终得到血竭有效成分萃取残余物1.90kg。