对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物的应用及制备方法 技术领域 本发明涉及对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物的应用及其制备方法， 特别是涉 及用于检测生物组织中的淀粉样蛋白的试剂， 其可以在全身性淀粉样变性病和其他与淀粉 样蛋白蓄积有关的疾病的诊断中用于检测病灶部位中的淀粉样蛋白。
背景技术 由被称作淀粉样蛋白的纤维状蛋白质在体内各种器官或组织中沉积而引发的疾 病统称作淀粉样变性病。淀粉样变性病的共同特征是， 富含 β- 折叠结构的被称作淀粉样 蛋白的纤维状蛋白质在各种器官中系统性地或在位点局部性地沉积， 以至于在器官或组织 中触发了功能异常。 淀粉样蛋白一般是指生物体内各种淀粉样蛋白的前体蛋白例如淀粉样 蛋白 -β、 突变型转甲状腺素蛋白和 β2- 微球蛋白聚集形成的蛋白凝聚物。淀粉样蛋白尽 管是由任意的淀粉样蛋白的前体蛋白形成的， 但是它们具有富含 β- 折叠的特征性结构。
因此， 能与 β- 折叠结构结合的化合物例如刚果红和硫磺素 T 的特征在于， 它们与淀粉样蛋 白具有亲和性。
根据淀粉样蛋白的沉积模式， 淀粉样变性病分为全身性淀粉样变性病和局限性淀 粉样变性病。
全身性淀粉样变性病是淀粉样蛋白沉积发生在全身各个部分的疾病。 全身性淀粉 样变性病的例子包括 ： 家族性淀粉样变性病 ( 其中肝脏内产生的淀粉样蛋白沉积在全身的 各个器官而导致疾病 )、 老年性 TTR 淀粉样变性病 ( 其中淀粉样蛋白沉积在心脏和大关节 例如手关节中 )、 透析性淀粉样变性病 ( 发生在长期透析患者的骨和关节等部位 )、 反应性 AA 淀粉样变性病 ( 继发性淀粉样变性病， 是由血清淀粉样蛋白 A 产生的淀粉样蛋白沉积导 致的， 所述血清淀粉样蛋白 A 是慢性炎性疾病例如慢性风湿病之后继发的急性期蛋白 )、 和 免疫细胞性淀粉样变性病 ( 其中由免疫球蛋白产生的淀粉样蛋白沉积在全身的各个器官 中 )。
局限性淀粉样变性病是淀粉样蛋白沉积仅发生在某些器官中的疾病。 局限性淀粉 样变性病的例子包括 ： 脑淀粉样变性病例如阿尔茨海默病 ( 其中淀粉样蛋白沉积在脑中 )、 脑血管淀粉样变性病和克雅病、 内分泌淀粉样变性病 ( 其中淀粉样蛋白沉积在伴随 II 型糖 尿病的胰岛和胰岛素瘤中、 或者沉积在心房中 )、 皮肤淀粉样变性病 ( 其中淀粉样蛋白沉积 在皮肤中 )、 和局限性结节性淀粉样变性病 ( 其中结节状淀粉样蛋白沉积在皮肤和肺中 )。
在全身性淀粉样变性病的情况下， 如下进行淀粉样变性病的诊断 ： 首先从皮肤、 肾 和胃肠道等可活组织检查的部位采集组织 ； 并且用刚果红或硫磺素 T 将其染色。刚果红是 一种对淀粉样蛋白的 β- 折叠结构具有高度亲和性的荧光性化合物， 刚果红由于其定向性 而在偏光显微镜下显示双折射， 因此它可以选择性地染色组织中的淀粉样蛋白沉积物。同 样地， 硫磺素 T 也是对淀粉样蛋白具有亲和性的荧光性化合物， 并可与刚果红同样地使用。 在发现组织染色呈阳性后， 组合利用抗体的免疫染色， 进行确诊。然而， 用刚果红或硫磺素 T 染色即使是在偏光显微镜下观察也往往难以判定为阳性。另一方面， 人们考虑用近年来广泛发展的图像诊断装置例如 PET、 SPECT 和 MRI 来 进行全身性淀粉样变性病的图像诊断。
然而， 当刚果红和硫磺素 T 是被标记的、 并且用作图像诊断的探针时， 它们的存在 问题是， 与淀粉样蛋白的结合特异性较差， 以至于不能获得良好的检测灵敏度。
此外， 由于刚果红具有致癌性， 它不适用于人体的诊断。
因此， 已经提出， 将作为刚果红衍生物的双 -(3- 羟基羰基 -4- 羟基 ) 苯乙烯基苯 (BSB) 及其衍生物用作检测淀粉样蛋白的荧光试剂， 它对全身性淀粉样蛋白具有高度的亲 和性和检测灵敏度， 可以用于体内检测 ( 非专利文献 14， 专利文献 7)。据报道， BSB 与由脑 淀粉样变性病和全身性淀粉样变性病产生的淀粉样蛋白具有高度亲和性， 并且其结构中没 有联苯胺结构， 因此它几乎不存在致癌问题， 并且可以是放射性标记的， 用作图像诊断的探 针。
另一方面， 对于作为典型的脑淀粉样变性病的阿尔茨海默病 ( 以下称作 AD)， 因为 不能采集活检标本， 因此已经尝试使用与淀粉样蛋白具有高度亲和性的化合物作为标记物 来在体内检测 AD。
用于脑内淀粉样蛋白的图像诊断的这样的探针大多是疏水性的低分子量化合 物， 其与淀粉样蛋白具有高度的亲和性， 且脑转移性很高， 并且用各种放射性核素例如 11C、11 F 和 123I 标记。例如， 有报告指出， C 或放射性卤素标记的化合物包括各硫磺素衍生 物例如 6- 碘 -2-[4 ′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ] 苯并噻唑 ( 以下称作 TZDM) 和 6- 羟 基 -2-[4′ -(N- 甲基氨基 ) 苯基 ] 苯并噻唑 ( 以下称作 6-OH-BTA-1)( 专利文献 1， 非专利文 献 3) ； 均二苯乙烯化合物例如 (E)-4- 甲基氨基 -4′ - 羟基均二苯乙烯 ( 以下称作 SB-13) 和 (E)-4- 二甲基氨基 -4′ - 碘代均二苯乙烯 ( 以下称作 m-I-SB)( 专利文献 2， 非专利文献 4， 非专利文献 5) ； 苯并噁唑衍生物例如 6- 碘 -2-[4′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ] 苯并噁 唑 ( 以下称作 IBOX) 和 6-[2-( 氟 ) 乙氧基 ]-2-[2-(2- 二甲基氨基噻唑 -5- 基 ) 乙烯基 ] 苯并噁唑 ( 非专利文献 6， 非专利文献 7) ； DDNP 衍生物例如 2-(1-{6-[(2- 氟乙基 )( 甲基 ) 氨基 ]-2- 萘基 } 亚乙基 ) 丙二腈 ( 以下称作 FDDNP)( 专利文献 4， 非专利文献 8) ； 和咪唑 并吡啶衍生物例如 6- 碘 -2-[4′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ]- 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 以 下称作 IMPY)( 专利文献 3， 非专利文献 9)。此外， 对用于图像诊断的某些探针， 已经进行了 人体图像研究， 并且报道了与正常人相比， 在 AD 患者的脑中有显著的放射性蓄积 ( 非专利 文献 10， 非专利文献 11， 非专利文献 12， 非专利文献 13)。
国际公开 WO2007/002540 号小册子公开了一系列具有与淀粉样蛋白有亲和性的 基团的化合物， 该基团通过乙二醇或聚乙二醇与放射性核素标记的位点连接 ( 专利文献 5)。
国际公开 WO2007/063946 号小册子公开了一系列化合物， 其与五元芳香杂环基相 连以防止它们在脑内代谢 ( 专利文献 6)。
[ 专利文献 1]JP-T-2004-506723
[ 专利文献 2]JP-T-2005-504055
[ 专利文献 3]JP-T-2005-512945
[ 专利文献 4]JP-T-2002-523383
[ 专利文献 5] 国际公开 WO2007/002540 小册子 18[ 专利文献 6] 国际公开 WO2007/063946 小册子
[ 专利文献 7] 国际公开 WO2005/016888 小册子
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[ 非专利文献 14]D.M.Skovronsky 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.， 2000， 97， 7609
发明内容 发明要解决的课题
如上所述， 公开了各种化合物可以作为以淀粉样蛋白为对象的图像诊断的探针， 并探索了其临床用途。
在正常小鼠中的实验结果表明， 用 [125I] 标记的 TZDM、 IBOX 和 m-I-SB 都会在施 用 2 分钟后转移到脑内。但是， 这些化合物从正常组织中的清除是不充分的， 并且会随着施 用后时间的推移而在脑中逐渐蓄积 (JP-T-2005-512945 ； Zhi-Ping Zhuang 等人， Nuclear Medicineand Biology， 2001， 28， p.887-894 ； H.F.Kung 等 人， J.Am.Chem.Soc.， 2001， 123， p.12740-12741)。 当从正常组织中的清除不充分时， 就出现了一个问题 ： 在淀粉样蛋白蓄积 11 位点不能获得足够的对比度。用 [ C] 标记的 SB-13 在大鼠的实验中显示了其具有从正常 组织中的清除性能， 但清除速率还谈不上足够快 (Masahiro Ono 等人， Nuclear Medicine and Biology， 2003， 30， p.565-571)。
同时， 据披露， 如用 [125I] 标记的化合物的实验结果所示， 具有咪唑并吡啶骨架的 化合物例如 IMPY 具有在施用后转移到脑中并在淀粉样蛋白上蓄积的性质， 其也具有与上 述化合物不同的从正常组织中迅速消除的优良性质。但是， IMPY 是一种在回复突变试验中 呈阳性的化合物。为了将这种化合物用作图像诊断的探针， 必须充分考虑剂量和给药方式 ( 国际公开 WO 03/106439 号小册子 )。
据报道， FDDNP 在回复突变试验中也是呈阳性的。( 国际公开 WO 03/106439 号小 册子 )。
本发明正是鉴于已经披露了作为靶向淀粉样蛋白的用于图像诊断探针的各种化 合物， 但尚未披露经证实具有临床可接受性的化合物的情况而进行的， 其目的在于通过提 供对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物而能够在体内或体外以高灵敏度检测淀粉样蛋白。
解决课题的方法
本发明人已经发现， 具有咪唑并吡啶 - 苯基骨架的具体的新化合物与淀粉样蛋白 具有亲和性， 并且可以通过使用一系列这样的化合物作为探针， 以高灵敏度在体内或体外 检测淀粉样蛋白。由此完成了本发明。
即， 根据本发明的一个方面， 提供了下述式 (1) 所示的化合物 ：
或其盐， 和包含上述式 (1) 所示的化合物或其盐的用于检测生物组织中沉积的淀 粉样蛋白的试剂。
生物组织可以是已知在淀粉样变性病中淀粉样蛋白沉积于其上的各种组织。 这种 生物组织的典型实例包括脑、 心、 肺、 胰脏、 骨和关节， 最典型的生物组织可举出脑。在脑为 对象的情况下， 典型的淀粉样变性病包括阿尔茨海默病和 Lewy 体痴呆。
在式 (1) 中， A 1、 A2、 A3 和 A4 独立地表示碳或氮， 必要的是， 它们中的至少一个表示
碳。优选地， A1、 A2、 A3 和 A4 中的 3 个以上表示碳， 更优选它们都表示碳。在式 (1) 中， R1 与 A1、 A2、 A3 或 A4 所表示的碳键合。此外， R1 的键合位置优选是 A3 所表示的碳， 即 6- 位的碳。 1
在式 (1) 中， R 可以选自氢、 羟基、 羧基、 硫酸基、 氨基、 硝基、 氰基、 非放射性卤素取 代基， 具有 1-4 个碳原子的烷基取代基和具有 1-4 个碳原子的烷氧基取代基。R1 优选是羟 基、 具有 1-4 个碳原子的烷基取代基或具有 1-4 个碳原子的烷氧基取代基， 更优选羟基、 甲 基取代基或甲氧基取代基。 75 76 123 124 125
R2 可以是放射性卤素取代基， 优选选自 18F、 Br、 Br、 I、 I、 I 和 131I 的放射性 76 123 卤素取代基， 更优选选自 18F、 Br、 I 和 125I 的卤素取代基。
即， 根据本发明的一个方面， 提供下述式 (2) 所示的化合物 ：
或其盐 ； 和包含式 (2) 所示的化合物或其盐的用于检测生物组织中沉积的淀粉样 蛋白的试剂。生物组织包括对式 (1) 化合物所述的那些生物组织。在式 (2) 中， A 5、 A6、 A7 和 A8 独立地表示碳或氮， 必要的是， 它们中的至少一个表示 5 6 7 8 碳。优选地， A、 A、 A 和 A 中的 3 个以上表示碳， 更优选它们都表示碳。在式 (2) 中， R3 与 A5、 A6、 A7 或 A8 所表示的碳键合。此外， R3 的键合位置优选是 A7 所表示的碳， 即 6- 位的碳。 3 18 75 76 123 124 125
在式 (2) 中， R 可以是放射性卤素取代基， 优选选自 F、 Br、 Br、 I、 I、 I和 131 18 76 123 125 I 的放射性卤素取代基， 更优选选自 F、 Br、 I 和 I 的放射性卤素取代基。 4
R 可以选自氢、 羧基、 硫酸基、 硝基、 氰基、 非放射性卤素取代基、 具有 1-4 个碳原子 4 的烷基取代基和甲氧基取代基。 R 优选为具有 1-4 个碳原子的烷基取代基或甲氧基取代基， 更优选甲基取代基或甲氧基取代基。
上述式 (1) 的化合物是新化合物， 根据本发明的另一个方面， 提供了放射性卤素 标记的有机化合物的制备方法， 包括下述步骤 ：
制备反应溶液的步骤， 该反应溶液包含下述式 (3) 所示的化合物或其盐与放射性 卤离子 ：
其中 A1、 A2、 A3 和 A4 独立地表示碳或氮，
R5 是选自氢、 羟基、 羧基、 硫酸基、 氨基、 硝基、 氰基、 非放射性卤素取代基、 具有 1-4 个碳原子的烷基取代基和具有 1-4 个碳原子的烷氧基取代基的基团，
R6 是选自非放射性卤素取代基、 硝基取代基、 烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基甲 锡烷基取代基、 三苯基甲锡烷基和烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基铵基的基团，
条件是， A 1、 A2、 A3 和 A4 中的至少 1 个表示碳， R5 与 A1、 A 2、 A3 或 A4 所表示的碳键合 ；
和
向该反应溶液赋予反应条件， 以合成下述式 (1) 所示的化合物或其盐的步骤 ：其中 A1、 A2、 A3 和 A4 独立地表示碳或氮，
R1 是选自氢、 羟基、 羧基、 硫酸基、 氨基、 硝基、 氰基、 非放射性卤素取代基、 具有 1-4 个碳原子的烷基取代基和具有 1-4 个碳原子的烷氧基取代基的基团，
R2 是放射性卤素取代基，
条件是， A 1、 A2、 A3 和 A4 中的至少 1 个表示碳， R1 与 A1、 A 2、 A3 或 A4 所表示的碳键合。
在式 (3) 中， A 1、 A2、 A3 和 A4 独立地表示碳或氮， 必要的是， 它们中的至少 1 个表示 1 2 3 4 碳。优选地， A、 A、 A 和 A 中的 3 个以上表示碳， 更优选它们都表示碳。在式 (3) 中， R1 与 A1、 A2、 A3 或 A4 所表示的碳键合。此外， R1 的键合位置优选是 A3 所表示的碳， 即 6- 位的碳。 5
在式 (3) 中， R 可以是选自氢、 羟基、 羧基、 硫酸基、 氨基、 硝基、 氰基、 非放射性卤素 取代基、 具有 1-4 个碳原子的烷基取代基和具有 1-4 个碳原子的烷氧基取代基的基团。R5
优选是羟基、 具有 1-4 个碳原子的烷基取代基或具有 1-4 个碳原子的烷氧基取代基， 更优选 是羟基、 甲基取代基或甲氧基取代基。
R6 可以是选自非放射性卤素取代基、 硝基、 烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基甲锡 烷基取代基、 三苯基甲锡烷基和烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基铵基的基团。
作为非放射性卤素取代基， 可以使用能够作为使用放射性氟或放射性碘的亲核取 代反应的靶点的卤素， 优选可以使用氯、 碘或溴。
上述式 (2) 的化合物是新化合物， 根据本发明的另一个方面， 提供了放射性卤素 标记的有机化合物的制备方法， 包括下述步骤 ：
制备反应溶液的步骤， 该反应溶液包含下述式 (4) 所示的化合物或其盐与放射性 卤离子 ：
其中 A5、 A6、 A7 和 A8 独立地表示碳或氮，
R7 是选自非放射性卤素取代基、 硝基、 烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基甲锡烷基 取代基、 三苯基甲锡烷基和烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基铵基的基团， 且 8
R 是选自氢、 羧基、 硫酸基、 硝基、 氰基、 非放射性卤素取代基、 具有 1-4 个碳原子的 烷基取代基和甲氧基取代基的基团，
条件是， A 5、 A6、 A7 和 A8 中的至少 1 个表示碳， R7 与 A5、 A 6、 A7 或 A8 所表示的碳键合，
和
向该反应溶液赋予反应条件， 以合成下述式 (2) 所示的化合物或其盐的步骤 ：
其中 A5、 A6、 A7 和 A8 独立地表示碳或氮，
R3 是放射性卤素取代基， 且 4
R 是选自氢、 羧基、 硫酸基、 硝基、 氰基、 非放射性卤素取代基和具有 1-4 个碳原子 的烷基取代基和甲氧基取代基的基团，
条件是， A 5、 A6、 A7 和 A8 中的至少 1 个表示碳， R3 与 A5、 A 6、 A7 或 A8 所表示的碳键合。
在式 (4) 中， A 5、 A6、 A7 和 A8 独立地表示碳或氮， 必要的是， 它们中的至少一个表示 5 6 7 8 碳。优选地， A、 A、 A 和 A 中的 3 个以上表示碳， 更优选它们都表示碳。在式 (4) 中， R7 与 A5、 A6、 A7 或 A8 所表示的碳键合。此外， R8 的键合位置优选是 A7 所表示的碳， 即 6- 位的碳。 7
在式 (4) 中， R 可以是选自非放射性卤素取代基、 硝基取代基、 烷基链具有 1-4 个 碳原子的三烷基甲锡烷基取代基、 三苯基甲锡烷基和烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基铵 基的基团。
作为非放射性卤素取代基， 可以使用能够作为使用放射性氟或放射性碘的亲核取 代反应的靶点的卤素， 优选可以使用氯、 碘或溴。 8
R 可以是选自氢、 羧基、 硫酸基、 硝基、 氰基、 非放射性卤素取代基、 具有 1-4 个碳原 8 子的烷基取代基或甲氧基取代基的基团。R 优选是具有 1-4 个碳原子的烷基取代基或甲氧 基取代基， 更优选是甲基取代基或甲氧基取代基。
例如， 可以通过将前体化合物或其盐溶解于惰性有机溶剂中， 向其中加入由公知 方法得到的包含放射性卤离子的溶液来进行制备包含上述式 (3) 或 (4) 所示前体化合物或 其盐和放射性卤离子的反应溶液的步骤。
作为惰性有机溶剂， 可以使用与前体化合物或其盐和放射性卤离子之间不具有反 应性的各种溶剂， 例如， 当所用的放射性卤素是放射性碘时， 可以优选使用甲醇。当所用的 放射性卤素是放射性氟时， 可以优选使用乙腈。
对于在合成上述式 (1) 或 (2) 所示化合物的步骤中赋予反应溶液的反应条件没有 特殊限制， 只要它是允许进行用反应溶液中添加的放射性卤离子置换式 (3) 或 (4) 化合物 6 7 的 R 或 R 的反应的反应条件即可， 可以使用适合放射性卤离子的种类的已知反应条件。
75 在本发明放射性卤素标记的有机化合物的制备方法中， 可以使用例如 18F、 Br、 76 123 124 125 131 2 123 Br、 I、 I、 I 或 I 作为放射性卤离子。 当制备其中 R 所示的放射性卤素取代基是 I、 124 125 131 123 124 125 I、 I 或 I 的式 (1) 的化合物时， 将 I 离子、 I 离子、 I 离子或 131I 离子分别用作放 射性卤离子， 作为式 (3) 的化合物， 优选使用其中 R6 是非放射性碘、 烷基链具有 1-4 个碳原 子的三烷基甲锡烷基取代基或三苯基甲锡烷基取代基的化合物。
当制备其中 R2 所示的放射性卤素取代基是 18F 的式 (1) 的化合物时， 将 18F 离子用 作放射性卤离子， 作为式 (3) 的化合物， 优选使用其中 R6 是硝基取代基或烷基链具有 1-4 个 碳原子的三烷基铵基取代基的化合物。
当制备其中 R2 所示的放射性卤素取代基是 75Br 或 76Br 的式 (1) 的化合物时， 将 75 76 6 Br 离子或 Br 离子分别用作放射性卤离子， 作为式 (3) 的化合物， 优选使用其中 R 是非放
射性溴的化合物。 124 125
当制备其中 R3 所示的放射性卤素取代基是 123I、 I、 I 或 131I 的式 (2) 的化合物 124 125 时， 将 123I 离子、 I 离子、 I 离子或 131I 离子分别用作放射性卤离子， 作为式 (4) 的化合物， 7 优选使用其中 R 是非放射性碘、 烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基或三苯 基甲锡烷基取代基的化合物。
当制备其中 R3 所示的放射性卤素取代基是 18F 的式 (2) 的化合物时， 将 18F 离子用 作放射性卤离子， 作为式 (4) 的化合物， 优选使用其中 R7 是硝基取代基或烷基链具有 1-4 个 碳原子的三烷基铵基取代基的化合物。
当制备其中 R3 所示的放射性卤素取代基是 75Br 或 76Br 的式 (2) 的化合物时， 将 75 76 7 Br 离子或 Br 离子用作放射性卤离子， 作为式 (4) 的化合物， 优选使用其中 R 是非放射性 溴的化合物。
此外， 根据本发明的另一个方面， 提供了用于制备放射性卤素标记的有机化合物 的前体化合物或其盐， 其为下述式 (3) 所示的化合物或其盐 ：
其中 A1、 A2、 A3 和 A4 独立地表示碳或氮，
R5 是选自氢、 羟基、 羧基、 硫酸基、 氨基、 硝基、 氰基、 非放射性卤素取代基、 具有 1-4 个碳原子的烷基取代基和具有 1-4 个碳原子的烷氧基取代基的基团，
R6 是选自非放射性卤素取代基、 硝基、 烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基甲锡烷基 取代基、 三苯基甲锡烷基和烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基铵基的基团，
条件是， A 1、 A2、 A3 和 A4 中的至少 1 个表示碳， R5 与 A1、 A 2、 A3 或 A4 所表示的碳键合。
在式 (3) 中， A1、 A 2、 A3 和 A4 以及 R5 和 R6 的优选实施方案与上述制备方法所述的 实施方案相同。
此外， 根据本发明的另一个方面， 提供了用于制备放射性卤素标记的有机化合物 的前体化合物或其盐的制备方法， 其由下述式 (4) 的化合物或其盐所示 ：
其中 A5、 A6、 A7 和 A8 独立地表示碳或氮，
R7 是选自非放射性卤素取代基、 硝基、 烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基甲锡烷基 取代基、 三苯基甲锡烷基和烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基铵基的基团，
R8 是选自氢、 羧基、 硫酸基、 硝基、 氰基、 非放射性卤素取代基、 具有 1-4 个碳原子的 烷基取代基和甲氧基取代基的基团，
条件是， A 5、 A6、 A7 和 A8 中的至少 1 个表示碳， R7 与 A5、 A 6、 A7 或 A8 所表示的碳键合。
在式 (4) 中， A5、 A 6、 A7 和 A8 以及 R7 和 R8 的优选实施方案与上述制备方法所述的
实施方案相同。
发明效果
根据本发明， 可以得到淀粉样蛋白检测试剂及其制备方法以及制备用中间体， 该 淀粉样蛋白检测试剂与淀粉样蛋白具有亲和性， 因此可用于广泛的与淀粉样变性病有关的 淀粉样蛋白的体外和体内检测。 附图说明
图 1 是 2-(4′ - 三丁基甲锡烷基苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路 图 2 是 2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。 图 3 是 6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。 图 4 是 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
线。 图 5 是 2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
图 6 是 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 氟苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
图 7 是样品溶液中的淀粉样蛋白浓度与放射性浓度的关系。
图 8(a) 是注射 [123I]-6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶后的脑 切片的放射自显影图， 图 8(b) 是硫磺素 T 染色的样品的荧光显微图像 ( 注射淀粉样蛋白混 悬液的位点的放大图 )。
图 9(a) 是注射 [123I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶后的脑切 片的放射自显影图， 图 9(b) 是硫磺素 T 染色的样品的荧光显微图像 ( 注射淀粉样蛋白混悬 液的位点的放大图 )。
图 10(a) 是注射 [123I]-2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶后的脑切片 的放射自显影图， 图 10(b) 是硫磺素 T 染色的样品的荧光显微图像 ( 注射淀粉样蛋白混悬 液的位点的放大图 )。
具体实施方式
( 放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物的合成方法 )
下面， 以 2-(4′ - 三丁基甲锡烷基苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶为例， 描 述本发明的一个实施方案的制备放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物的合成方法。
首先， 使 2- 溴 -3- 羟基吡啶在甲醇钠的存在下与碘甲烷反应， 制备 2- 溴 -3- 甲氧 基吡啶。 然后用浓硫酸和浓硝酸的混合酸进行硝化， 转化成 2- 溴 -3- 甲氧基 -6- 硝基吡啶， 然后使用钯碳进行溴基团的还原消除和硝基的还原， 合成 2- 氨基 -5- 甲氧基吡啶 ( 图 1， 步 骤 1-3)。在这一系列反应中， 可以根据常规方法例如文献 Joseph G.Lombardino， Journal of Medical Chemistry， 1981， 24， p.39-42 中所述的方法进行反应。
使得到的 2- 氨基 -5- 甲氧基吡啶与 2- 溴 -4′ - 溴苯乙酮反应以溴化 4′ - 位， 制备 2-(4′ - 溴苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1， 步骤 4)。该步骤可以根据如 下方法进行。
首先， 将 2- 溴 -4′ - 溴苯乙酮和 2- 氨基 -5- 甲氧基吡啶溶解于惰性溶剂例如乙腈， 使它们在回流温度彼此反应 2-6 小时， 得到 2-(4′ - 溴苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的氢溴酸盐， 为白色沉淀。在这种情况中使用的溶剂可以是乙腈或其他通常用于类似 反应的溶剂， 例如甲醇和丙酮。反应温度可以是能够回流的温度， 例如当溶剂是乙腈时为 90℃。所用的溶剂的量可以是足以进行反应的用量， 然而， 应注意如果溶剂过多， 则难以得 到反应产物的沉淀。例如， 当相当于 10mmol 的 2- 溴 -4′ - 溴苯乙酮用于反应时， 所用溶剂 量可以为约 40-50mL。
接着， 过滤反应液以回收沉淀。将该白色沉淀混悬于甲醇 / 水 (1 ∶ 1) 的混合液 中。然后， 将碳酸氢钠的饱和水溶液以相对于上述混悬的沉淀物非常大地过量的量加入其 中， 以释放作为沉淀的 2-(4′ - 溴苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。将新生成的沉淀 过滤， 以回收作为本步骤的目标化合物的 2-(4′ - 溴苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡 啶。 甲醇 / 水的混合液的量没有特别限制， 只要它足以实现反应即可。 但是， 应当注意的是， 如果混合液的量过多， 则妨碍结晶析出。例如， 当使用相当于 10mmol 量的 2- 溴 -4′ - 溴 苯乙酮时， 可以使用的甲醇 / 水的混合液的量是约 40-100mL。对碳酸氢钠的量没有特别限 制， 只要它相对于作为反应底物的上述沉淀为非常大地过量即可。 例如， 当在上述条件下进 行反应时， 加入到反应液中的碳酸氢钠饱和水溶液的量可以是约 25mL。 将得到的 2-(4′ - 溴苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于二噁烷， 加入三 乙胺后， 加入双 ( 三丁基锡 ) 和催化量的四 ( 三苯膦 ) 钯。 在约 90℃加热该反应混合物进行 反应， 然后蒸馏出溶剂， 进行色谱纯化， 得到作为目标化合物的 2-(4′ - 三丁基甲锡烷基苯 基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1， 步骤 5)。使用的双 ( 三丁基锡 ) 的量可以为满 足相对于反应底物为过量的条件的量， 具体地， 在摩尔比上其优选为反应底物 2-(4′ - 溴 苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的约 1.5 倍。
可以在步骤 5 中使用适合目的的各种双 ( 三烷基锡 ) 来代替双 ( 三丁基锡 )， 来 得到在 4′ - 位上的取代基为三丁基甲锡烷基取代基以外的三烷基甲锡烷基取代基的化合 物。例如， 当合成 4′ - 位上的取代基为三甲基甲锡烷基取代基的化合物时， 可以在步骤 4 中使用双 ( 三甲基锡 ) 进行与上述同样的反应。
此外， 可以通过下述步骤得到连接咪唑并吡啶环的取代基是羟基取代基的化合 物： 例如， 使上述步骤 4 中得到的 2-(4 ′ - 溴苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶与三 溴化硼等反应， 以进行脱甲基化， 然后进行上述步骤 5 的反应。此外， 对于连接咪唑并吡啶 环的取代基是甲基取代基或乙氧基取代基的化合物， 可分别使用 2- 氨基 -5- 甲基吡啶和 2- 氨基 -5- 乙氧基吡啶代替上述步骤 4 中使用的 2- 氨基 -5- 甲氧基吡啶。
可以通过使用在吡啶环上的烷氧基取代基等的键合位置各不相同的各化合物来 代替上述步骤 4 中使用的 2- 氨基 -5- 甲氧基吡啶， 来得到咪唑并吡啶环上的官能团的键 合位置是 6- 位碳以外的碳原子的化合物。例如， 在上述例子中， 当官能团的键合位置是咪 唑并吡啶环的 8- 位上的碳时， 可以在步骤 4 中使用 2- 氨基 -3- 甲氧基吡啶来代替 2- 氨 基 -5- 甲氧基吡啶。
此外， 可以根据下述方法制备用放射性卤素标记的位点是咪唑并吡啶环的标记前 体化合物， 例如 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。
首先， 根据常规方法例如文献 King， L.Carroll 和 Ostrum， G.Kenneth， Journal of Organic Chemistry， 1964， 29(12)， p.3459-3461 中所述的方法， 使 4′ - 羟基苯乙酮与溴化
铜反应以制备 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 3， 步骤 1)。再使其与 2- 氨基 -5- 碘吡啶在惰 性溶剂例如乙腈中反应， 纯化得到的沉淀， 由此得到 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 3， 步骤 2)。该步骤中的条件可以与上述图 1 步骤 4 中所述同样的方式使用。
接着， 将得到的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于甲醇和二噁 烷的混合液， 向其中加入三甲基甲硅烷基重氮甲烷以进行反应， 蒸馏出溶剂以纯化残余物， 制备 6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 3， 步骤 3)。在该步骤中， 三甲 基甲硅烷基重氮甲烷的量相对于 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶为等量以 上。
将得到的 6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于二噁烷， 加入 三乙胺后， 加入双 ( 三丁基锡 ) 和催化量的四 ( 三苯膦 ) 钯以进行反应， 得到作为目标化合 物的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 4， 步骤 1)。使 用的双 ( 三丁基锡 ) 的量是满足相对于反应底物过量的条件的量， 具体地， 在摩尔比上其优 选为反应底物 2-(4′ - 溴苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的约 1.5 倍。该步骤中的 条件可以与上述图 1 的步骤 5 中所述同样的方式使用。
( 放射性卤素标记的有机化合物的合成方法 ) 以下， 以放射性碘标记的化合物为例， 描述根据本发明另一个方面的放射性卤素 标记的有机化合物的制备方法。
可以通过将如上述操作制备的标记前体化合物溶解于惰性有机溶剂， 向其中加入 123 通过公知方法获得的 [ I] 碘化钠溶液作为放射性卤离子， 再向其中加入酸和氧化剂进行 反应， 以合成放射性碘标记的化合物。 作为溶解标记前体化合物的惰性有机溶剂， 可以使用 123 与标记前体及 [ I] 碘化钠等之间不具有反应性的各种溶剂， 优选可以使用甲醇。
作为酸， 可以使用各种酸， 优选盐酸。
对氧化剂没有特别限定， 只要它可以在反应液中氧化碘即可， 优选过氧化氢或过 乙酸。氧化剂的添加量可以为足以氧化反应液中的碘的量。
可以通过用适合目的的放射性卤素来标记符合合成目的的标记前体， 来合成用碘 18 以外的放射性卤素标记的化合物。例如， 为了合成 2-(4′ -[ F] 氟苯基 )-6- 甲氧基咪唑 并 [1， 2-a] 吡啶， 可以使标记前体 2-(4′ - 硝基苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶与 18 [ F] 氟离子在相转移催化剂和碳酸钾的存在下反应。
( 本发明检测试剂的制备方法和使用方法 )
根据前体蛋白的种类不同， 淀粉样蛋白具有许多不同结构， 但它们的共同点是具 有 β- 折叠结构。已知以淀粉样蛋白为对象的许多染色试剂例如硫磺素 T 和刚果红靶向该 β- 折叠结构， 并且对不同种类的淀粉样蛋白具有同等的染色能力。
本发明式 (1) 和 (2) 的化合物对以淀粉样蛋白 β- 蛋白 ( 下文称作 Aβ) 为前体 化合物的淀粉样蛋白具有亲和性， 并且还具有抑制已知能结合广泛的淀粉样蛋白的硫磺素 T 与淀粉样蛋白结合的活性。
因此， 认为本发明式 (1) 和 (2) 的化合物与硫磺素 T 同样， 对淀粉样蛋白的 β- 折 叠结构具有亲和性。这启示本发明式 (1) 和 (2) 的化合物对各种淀粉样蛋白具有相同的亲 和性。
即， 本发明的淀粉样蛋白检测试剂可以与硫磺素 T 和刚果红同样地用于诊断全身
性淀粉样变性病和局限性淀粉样变性病。 全身性淀粉样变性病包括免疫球蛋白性淀粉样变 性病、 反应性 AA 淀粉样变性病、 家族性淀粉样变性病、 透析淀粉样变性病、 老年性淀粉样变 性病等。 局限性淀粉样变性病包括脑淀粉样变性病、 内分泌淀粉样变性病、 皮肤淀粉样变性 病和局限性结节性淀粉样变性病等。
本发明的淀粉样蛋白检测试剂不仅可以用作体外活组织检查使用的试剂， 而且可 以作为放射性诊断剂在体内使用。
本发明的淀粉样蛋白检测试剂， 可以与其他一般公知的放射性诊断剂同样地， 配 制成将上述式 (1) 或 (2) 的放射性卤素标记的化合物根据期望混入任选调节至适当 pH 的 水、 生理盐水或林格液等而成的溶液。 此时， 应将本发明化合物的浓度调节至不超过确保本 发明化合物稳定性的浓度。对本发明化合物的剂量没有特别限制， 只要它足以得到所给予 123 试剂的分布图像即可。例如， 就碘 -123( I) 标记的化合物和氟 -18(18F) 标记的化合物而 言， 可以通过静脉内或局部给予约 50-600MBq/60kg 成人体重。可以通过公知方法使所给予 的试剂分布显像。例如， 可以通过 SPECT 装置使碘 -123(123I) 标记的化合物显像， 另外可以 18 通过 PET 装置使氟 -18( F) 标记的化合物显像。
通过对生物体给予本发明的淀粉样蛋白检测试剂， 可以使沉积在生物组织例如 脑、 心脏、 肺、 消化道、 血管、 肝、 胰脏、 肾、 关节和骨中的淀粉样蛋白显像， 并且用于使难以活 检采集的生物组织例如脑、 心脏、 肺、 胰脏、 骨和关节中的淀粉样蛋白沉积显像。 实施例 下面通过实施例、 比较例和参考例更详细地描述本发明。 然而， 这些例子绝不限定 本发明的范围。
( 实施例 1)2-(4′ - 三丁基甲锡烷基苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合 成
将 100.0g( 相当于 0.575mol)2- 溴 -3- 羟基吡啶溶解于 310mL 二甲亚砜， 向其中 加入 575mL( 相当于 0.575mol)1mol/L 甲醇钠 - 甲醇溶液。然后将该反应液加热至 90℃， 以 蒸馏出甲醇。将该反应液冷却至 10℃以下后， 加入 93.9g( 相当于 0.662mol) 碘甲烷， 然后 在室温搅拌 20.5 小时。反应完成后， 将该反应液倾入冰水， 用氯仿萃取 2 次。用 1mol/L 氢 氧化钠溶液洗涤合并的氯仿层， 用饱和氯化钠溶液洗涤 2 次。用无水硫酸钠干燥产物， 然后 减压蒸馏出溶剂， 得到 65.4g( 相当于 0.348mol)2- 溴 -3- 甲氧基吡啶 ( 图 1， 步骤 1)。
将 262mL 浓硫酸冷却至 -2℃， 向其中谨慎加入 262mL 90％硝酸。然后向其中谨慎 加入 65.3g( 相当于 0.347mmol)2- 溴 -3- 甲氧基吡啶。将得到的混合物在冰浴中搅拌 10 分钟后， 将该混合物在室温搅拌 30 分钟， 然后加热至 55℃， 再搅拌 1.5 小时。冷却该反应 液后， 将该反应液缓慢倾入碎冰， 生成沉淀。 过滤沉淀， 用水洗涤， 然后用五氧化二磷减压干 燥， 得到 55.7g( 相当于 0.239mmol)2- 溴 -3- 甲氧基 -6- 硝基吡啶 ( 图 1， 步骤 2)。
将 55.6g( 相当于 0.239mol)2- 溴 -3- 甲氧基 -6- 硝基吡啶溶解于 1700mL 乙醇， 在 氩气流中向其中加入 37.3g(50％湿度 )10％钯 - 碳。向该混合物中滴加 283mL 一水合肼。 将该反应混合物加热回流 70 分钟后， 将该反应液冷却至室温。 然后在过滤出钯 - 碳后， 用乙 醇洗涤残余物， 合并洗涤液与滤液。减压浓缩合并的溶液。然后向浓缩液中加入 1300mL 水 和 130mL 浓氨水， 用氯仿将得到的混合物萃取 8 次。用无水硫酸钠干燥合并的氯仿层， 减压
浓缩。减压蒸馏得到的粗产物， 得到 26.2g( 相当于 0.211mol)2- 氨基 -5- 甲氧基吡啶 ( 图 1， 步骤 3)。
将 844mg( 相当于 3.0mmol)2- 溴 -4′ - 溴苯乙酮和 378mg( 相当于 3.0mmol)2- 氨 基 -5- 甲氧基吡啶溶解于 25mL 乙腈。将得到的溶液在油浴中在 105℃下加热回流 3.5 小 时。反应完成后， 将该反应液冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥， 得到 粗结晶。将得到的粗结晶混悬于 7mL 水和 7mL 甲醇的混合液。然后向其中加入约 7mL 饱 和碳酸氢钠溶液， 使用超声洗涤机将该混合物超声处理 5 分钟。过滤回收沉淀， 用水充分洗 涤， 减压干燥， 得到 640mg( 相当于 2.11mmol)2-(4′ - 溴苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1， 步骤 4)。
将 463mg( 相当于 1.5mmol)2-(4′ - 溴苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解 于 25mL 二噁烷， 向其中加入 2mL 三乙胺。然后加入 1.15mL( 相当于 2.25mmol) 双 ( 三丁基 锡 ) 和 19mg( 催化量 ) 的四 ( 三苯膦 ) 钯。将该反应混合物在 90℃搅拌 15 小时后， 减压蒸 馏出溶剂。 通过快速硅胶柱色谱法纯化残余物 ( 洗脱溶剂 ： 己烷 / 乙酸乙酯＝ 5/1 → 4/1)。 此外， 通过再循环制备型 HPLC 纯化得到的粗产物 (HPLC 装置 ： LC-908( 商品名 ； 日本分析工 业社制 ) ； 色谱柱 ： 两根 JAIGEL 2H( 商品名 ； 日本分析工业社制 ) 串联 ； 流动相 ： 氯仿 )， 得 到 419mg( 相当于 0.82mmol)2-(4′ - 三丁基甲锡烷基苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡 啶 ( 图 1， 步骤 5)。
得到的 2-(4′ - 三丁基甲锡烷基苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测 定结果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶 剂 ： 氯 仿 -d1，共 振 频 率 ： 500MHz) ： δ7.89-7.84(m， 2H)， 7.81(s， 1H)， 7.66-7.63(m， 1H)， 7.57-7.46(m， 3H)， 6.96(dd， J ＝ 9.7， 2.4Hz， 1H)， 3.83(s， 3H)， 1.64-1.47(m， 6H)， 1.34( 六 重 峰， J ＝ 7.3Hz， 6H)， 1.15-1.00(m， 6H)， 0.89(t， J ＝ 7.3Hz， 9H)。 13
C-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 125MHz) ： δ149.29， 146.02， 142.90， 136.84， 133.52， 125.23， 119.66， 117.73， 109.16， 107.47， 56.20， 29.12， 27.38， 13.69， 9.62。 123
( 实施例 2)[ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
向 75μL 的 2-(4′ - 三丁基甲锡烷基苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶在甲醇 中的溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中加入 100μL 的 1mol/L 盐酸、 10μL 的 1mmol/L 碘化钠、 160MBq 123 的 [ I] 碘化钠溶液 (80μL 体积 ) 和 20μL 的 10％ (W/V) 过氧化氢。将该混合液在 50℃ 静置 10 分钟后， 在下述条件下对该混合液进行 HPLC， 得到 [123I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲 氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶级分。
HPLC 条件 ：
色谱柱 ： Phenomenex Luna C18( 商品名 ； Phenomenex 公司制 ； 规格 ： 4.6 x 150mm)
流 动 相： 0.1 ％ 三 氟 乙 酸 的 水 溶 液 /0.1 ％ 三 氟 乙 酸 的 乙 腈 溶 液 ＝ 80/20 → 0/100(17 分钟， 线性梯度 )
流速 ： 1.0mL/min
检测器 ： 紫外可见吸光光度计 ( 检测波长 ： 282nm) 和放射性计数器 (Raytest 公司 制； 型号 ： STEFFI)将 10mL 水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商 标 )Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 145mg)， 以使得该柱吸附收 123 集 [ I]-2-(4 ′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 123 1mL 乙醚通过， 以洗脱 [ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。所得化合 物的放射性活度是 27MBq( 在制备刚刚结束时 )。此外， 在下述条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 97％。
TLC 分析条件 ：
TLC 板 ： RP-18F 254( 商品名 ； 由默克公司制 )
流动相 ： 氯仿 / 甲醇 / 三乙胺＝ 100/1/2
检测器 ： 生物图像分析仪， BAS-2500( 型号 ： BAS-2500 ； 由富士胶片株式会社制 ) 125
( 实施例 3)[ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
向 75μL 的 2-(4′ - 三丁基甲锡烷基苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶在甲 醇中的溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中加入 100μL 的 1mol/L 盐酸、 10μL 的 1mmol/L 碘化钠、 32MBq 125 的 [ I] 碘化钠溶液 (20μL 体积 ) 和 20μL 的 10％ (W/V) 过氧化氢。将该混合液在 50℃ 静置 10 分钟后， 在与实施例 2 相同的条件下对该溶液进行 HPLC， 得到 [125I]-2-(4′ - 碘苯 基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶级分。
将 10mL 水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商 标 )Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 145mg)， 以使得该柱吸附收 125 集 [ I]-2-(4 ′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 125 1mL 乙醚通过， 以洗脱 [ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。所得化合 物的放射性活度是 15MBq( 在制备刚刚结束时 )。此外， 在下述条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 92％。
( 实施例 4)2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
( 非放射性碘化形式 )
将获自实施例 1 的 100mg( 相当于 0.20mmol)2-(4′ - 三丁基甲锡烷基苯基 )-6- 甲 氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 2.0mL 二氯甲烷， 向其中加入 37mg( 相当于 0.29mmol) 碘。 将该反应混合物在 0℃的温度搅拌 30 分钟， 然后向其中加入饱和碳酸氢钠水溶液和饱和 硫代硫酸钠水溶液， 用二氯甲烷萃取 3 次。用无水硫酸钠干燥合并的二氯甲烷层， 然后减 压浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化得到的粗产物 ( 洗脱溶剂 ： 己烷 / 乙酸乙酯＝ 2/1)， 得到 44.5mg( 相当于 0.13mmol)2-(4 ′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 2， 步骤 1)。
得到的 2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结果 ( 内标 物： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 500MHz) ： δ7.75-7.71(m， 3H)， 7.64-7.62(m， 2H)， 7.59(d， J ＝ 1.8Hz， 1H)， 7.49(d， J ＝ 10.1Hz， 1H)， 6.96(dd， J ＝ 10.1， 1.8HZ， 1H)， 3.81(s， 3H)。 13
C-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 125MHz) ： δ149.80， 144.94， 143.27， 138.12， 133.91， 127.88， 120.56， 118.05， 109.72， 107.79， 93.45， 56.57。( 实施例 5)6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成 ( 非放射性 碘化形式 )
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 溴化铜中， 得到混悬液， 向其中 加入 8.18g( 相当于 60.0mmol)4′ - 羟基苯乙酮在 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿混合液中的 溶液。然后回流得到的混合物。5 小时后， 将该反应溶液冷却至室温， 过滤。减压浓缩得到 的滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过添加活性炭进行脱色操作。然后过滤得到的溶液， 浓缩。通过快速硅胶柱色谱法纯化得到的粗产物 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1)， 从乙酸 乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol)2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 3， 步 骤 1)。
将 441mg( 相 当 于 2.0mmol)2- 溴 -4 ′ - 羟 基 苯 乙 酮 和 449mg( 相 当 于 2.0mmol)2- 氨基 -5- 碘吡啶溶解于 15mL 乙腈。将得到的溶液在油浴中在 110℃下加热回 流 5 小时。反应完成后， 将该反应溶液冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压 干燥。将得到的粗结晶混悬于 10mL 水和 10mL 甲醇的混合液中。然后向其中加入约 10mL 饱和碳酸氢钠溶液， 使用超声洗涤机将得到的混合物超声处理 5 分钟。从得到的混合物中 过滤回收沉淀， 用水充分洗涤， 减压干燥， 得到 0.53g( 相当于 1.56mmol)2-(4 ′ - 羟基苯 基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 3， 步骤 2)。
将 0.40g( 相当于 1.2mmol)2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 30mL 甲醇和 50mL 二噁烷的混合液， 向其中加入 1.2mL( 相当于 2.4mmol) 三甲基甲硅烷基重 氮甲烷 (2M 己烷溶液 )。将该反应混合物在室温搅拌 24.5 小时， 然后减压蒸馏出溶剂。使 残余物从乙酸乙酯中重结晶， 得到 223mg( 相当于 0.64mmol)6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。
得到的 6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结果 ( 内标 物： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.37-8.34(m， 1H)， 7.88-7.84(m， 2H)， 7.72(s， 1H)， 7.40(d， J ＝ 9.4Hz， 1H)， 7.31(dd， J ＝ 9.4， 1.6HZ， 1H)， 6.99-6.95(m， 2H)， 3.86(s， 3H)。 13
C-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 125MHz) ： δ159.86， 146.32， 144.18， 132.32， 130.28， 127.41， 125.90， 118.32， 114.22， 106.88， 74.76， 55.33。
( 实施例 6)6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合 成
将获自实施例 5 的 87.6mg( 相当于 0.25mmol)6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑 并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 10mL 二噁烷， 向其中加入 2mL 三乙胺。然后加入 190μL( 相当于 0.375mmol) 双 ( 三丁基锡 ) 和 20mg( 催化量 ) 的四 ( 三苯膦 ) 钯。将该反应混合物在 90℃ 搅拌 21.5 小时后， 减压蒸馏出溶剂。 通过快速硅胶柱色谱法纯化残余物 ( 洗脱溶剂 ： 己烷 / 乙酸乙酯＝ 3/1)。 此外， 通过再循环制备型 HPLC 纯化得到的粗产物 (HPLC 装置 ： LC-908( 商 品名 ； 日本分析工业社制 ) ； 色谱柱 ： 两根 JAIGEL 2H( 商品名 ； 日本分析工业社制 ) 串联 ； 流动相 ： 氯仿 )， 得到 53mg( 相当于 0.10mmol)6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 4， 步骤 1)。得到的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测 定结果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.01-7.93(m， 1H)， 7.92-7.87(m， 2H)， 7.74(s， 1H)， 7.60-7.56(m， 1H)， 7.18-7.09(m， 1H)， 6.99-6.94(m， 2H)， 3.84(s， 3H)， 1.66-1.46(m， 6H)， 1.35( 六 重 峰， J ＝ 7.3Hz， 6H)， 1.19-1.02(m， 6H)， 0.91(t， J ＝ 7.3Hz， 9H)。 13
C-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 125MHz) ： δ159.45， 145.56， 145.01， 131.00， 129.95 ， 127.22 ， 126.70 ， 121.69 ， 116.80 ， 114.06 ， 106.24 ， 55.23 ， 28.94 ， 27.24 ， 13.59 ， 9.74。
( 实施例 7)[123I]-6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
向 50μL 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶在甲醇 中的溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中加入 50μL 的 1mol/L 盐酸、 10μL 的 1mmol/L 碘化钠、 318MBq 的 123 [ I] 碘化钠溶液 (50μL 体积 ) 和 10μL 的 10％ (W/V) 过氧化氢。 将该混合液在 50℃静置 123 10 分钟后， 在与实施例 2 相同的条件下对该溶液进行 HPLC， 得到 [ I]-6- 碘 -2-(4′ - 甲 氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶级分。
将 10mL 水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商 标 )Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收 123 集 [ I]-6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 123 1mL 乙醚通过， 以洗脱 [ I]-6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。所得化 合物的放射性活度是 86MBq( 在制备刚刚结束时 )。此外， 在与实施例 2 相同的条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 98％。
( 实施例 8)2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 非放射性碘化形似 ) 的合成
将 40mL 乙酸乙酯加入到 3.70g( 相当于 16.6mmol) 溴化铜中， 得到混悬液， 向其中 加入 1.0mL( 相当于 8.27mmol)4′ - 氟苯乙酮。然后加热回流得到的混合物。3 小时后， 将 该反应溶液冷却至室温， 过滤。减压浓缩得到的滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 浓缩。通 过硅胶柱色谱法纯化得到的粗产物 ( 洗脱溶剂 ： 己烷 / 乙酸乙酯＝ 10/1)， 得到 1.82g( 相 当于 8.39mmol)2- 溴 -4′ - 氟苯乙酮 ( 图 5， 步骤 1)。
将 1.82g( 相 当 于 8.39mmol)2- 溴 -4 ′ - 氟 苯 乙 酮 和 1.29g( 相 当 于 5.87mmol)2- 氨基 -5- 碘吡啶溶解于 40mL 乙腈。将得到的溶液在油浴中在 110 ℃下加热 回流 1.5 小时。反应完成后， 将该反应溶液冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。将得到的粗结晶混悬于 20mL 水和 10mL 甲醇的混合液中。然后向其中加入约 30mL 饱和碳酸氢钠溶液， 使用超声洗涤机将得到的混合物超声处理 5 分钟。从得到的混合 物中过滤回收沉淀， 用水充分洗涤， 减压干燥， 得到 1.28g( 相当于 3.79mmol)2-(4′ - 氟苯 基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 5， 步骤 2)。
得到的 2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 )21101909658 A CN 101909664
1说明书17/25 页H-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 基 甲 酰 胺 -d7， 共振频率 ： 500MHz) ： δ9.06(s， 1H)， 8.44(s， 1H)， 8.01-7.98(m， 2H)， 7.72(d， J ＝ 9.6Hz， 1H)， 7.57(d， J ＝ 9.6Hz， 1H)， 7.38-7.34(m， 2H)。
( 实施例 9)6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 氟苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
将 338mg( 相当于 1.00mmol)2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 4.0mL 二噁烷， 向其中加入 2mL 三乙胺。 然后加入 0.76mL( 相当于 1.5mmol) 双 ( 三丁基锡 ) 和 76.3mg( 催化量 ) 的四 ( 三苯膦 ) 钯。将该反应混合物在 90℃搅拌 18 小时后， 减压蒸 馏出溶剂。通过快速硅胶柱色谱法纯化残余物 ( 洗脱溶剂 ： 己烷 / 乙酸乙酯＝ 5/1)， 得到 310mg( 相当于 0.618mmol)6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 氟苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 6， 步骤 1)。
得到的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 氟苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结 果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶 剂 ： 氯 仿 -d1， 共振频率 ： 500MHz) ： δ7.98(s， 1H)， 7.94-7.90(m， 2H)， 7.77(s， 1H)， 7.60-7.58(m， 1H)， 7.17-7.10(m， 3H)， 1.64-1.48(m， 6H)， 1.35( 六 重 峰， J＝ 7.3Hz， 6H)， 1.19-1.05(m， 6H)， 0.91(t， J ＝ 7.3Hz， 9H)。1 C-NMR( 溶 剂 ： 氯 仿 -d1，共 振 频 率 ： 125MHz) ： δ162.7(d， JCF ＝ 246.7Hz)， 4 3 145.7， 144.3， 131.4， 130.3(d， JCF ＝ 2.9Hz)， 130.1， 127.7(d， JCF ＝ 8.6Hz)， 122.2， 117.1， 2 115.6(d， JCF ＝ 21.1Hz)， 106.9， 29.0， 27.3， 13.7， 9.8。 123
( 实施例 10)[ I]-2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
向 60μL 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 氟苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 浓度 ： 1mg/ mL) 在甲醇 / 二甲亚砜 ( 混合比＝ 9/1) 的混合液中的溶液中， 加入 40μL 的 1mol/L 盐酸、 123 15μL 的 1mmol/L 碘化钠、 150.1MBq 的 12μL[ I] 碘化钠和 15μL 的 10％ (W/V) 过氧化氢。 将该混合液在 50℃静置 10 分钟后， 在下述条件下对该混合液进行 HPLC， 得到 2-(4′ - 氟苯 123 基 )-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶级分。
HPLC 条件 ：
色谱柱 ： Phenomenex Luna C18( 商品名 ； Phenomenex 公司制 ； 规格 ： 4.6x 150mm)
流动相 ： 0.1％三氟乙酸 /0.1％乙腈＝ 20/80 → 0/100(17 分钟 )
流速 ： 1.0mL/min
检测器 ： 紫外可见吸光光度计 ( 检测波长 ： 282nm) 和放射性计数器 (Raytest 公司 制； 型号 ： STEFFI)
将 10mL 水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商 标 )Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 145mg)， 以使得该柱吸附收 123 集 [ I]-2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 1mL 乙 123 醚通过， 以洗脱 2-(4′ - 氟苯基 )-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。所得化合物的放射性 活度是 28.8MBq( 在制备刚刚结束时 )。
( 参考例 1)[123I]-IMPY 的合成
根据下述步骤制备用于测定 logP 辛醇和评价脑中蓄积性的 [123I]-IMPY。
根据文献 (Zhi-Ping Zhuang 等人， J.Med.Chem， 2003， 46， p.237-243) 中所述的方
13法， 合成 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(N， N- 二甲氨基 ) 苯基 ]- 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶， 将其 溶解于甲醇中 ( 浓度 ： 1mg/mL)。 向 53μL 所得溶液中， 加入 75μL 的 1mol/L 盐酸， 60-70μL 123 的 224-253MBq[ I] 碘化钠， 10μL 的 1mmol/L 碘化钠溶液和 15μL 的 10％ (W/V) 过氧化 氢。在将混合液在 50℃下静置 10 分钟后， 将该溶液在与实施例 2 相同的条件下进行 HPLC， 123 以得到 [ I]-IMPY 级分。
将 10mL 水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商 标 )Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收 123 123 集 [ I]-IMPY。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 1mL 乙醚通过， 以洗脱 [ I]-IMPY。在合成刚刚 结束时， 所得化合物的放射性活度是 41-57MBq。此外， 在与实施例 2 相同的条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 93.0％。
( 实施例 11) 与淀粉样蛋白的结合性的测定
通过下述的体外结合试验评价本发明的化合物与淀粉样蛋白的亲和性。
( 方法 )
(1) 将 Aβ1-40( 和光纯药工业公司制 ) 溶解于磷酸盐缓冲液 (pH7.4) 并在 37℃下 振荡 72 小时， 以获得 1mg/mL 的凝集 Aβ( 以下， 在本实施例中， 称作淀粉样蛋白 ) 的混悬液 ( 以下， 在本实施例中， 称作淀粉样蛋白混悬液 )。
(2) 根 据 文 献 (Naiki， H.， 等 人， Laboratory Investigation 74， p.374-383(1996)) 所述的方法， 基于使用硫磺素 T( 由 Fluka 公司制 ) 的荧光分光光度法， 进行该淀粉样蛋白混悬液的定性实验， 以证实在 (1) 中获得的凝集 Aβ 是淀粉样蛋白 ( 测 定条件 ： 激发波长 446nm， 荧光波长 490nm)。
(3) 制备由上述实施例 3 所述的方法合成的 [125I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的乙醇溶液 ( 放射性浓度 ： 27MBq/mL)， 用包含 1％牛血清白蛋白的磷 酸盐缓冲液 (pH 7.4) 稀释， 以制备 2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的总 量相当于 2nmol/L 浓度的溶液。
(4) 向 96 孔微量培养板的各孔中加入 50μL 的如上述 (3) 制备的溶液、 和将淀粉 样蛋白混悬液溶解于包含 1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 而得到的 50μL 溶 液 ( 可以根据样品溶液中的淀粉样蛋白浓度来调节淀粉样蛋白的浓度 )， 以制备最终浓度 为 25， 62.5， 250， 625 和 1000nmol/L 的淀粉样蛋白溶液 ( 作为 2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的总量相当于 400pmol)。
(5) 将该微量培养板以指定速度 (400rpm) 在 22℃下振荡 3 小时。然后让各孔内 的混合液通过玻璃纤维过滤器 ( 商品名 ； MulutiscreenTM-FC， 由 Millipore 制造 ) 过滤， 以 125 从游离的 [ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶中分离与淀粉样蛋白结 125 合的 [ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。
(6) 用包含 1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (0.5mL×5 次 ) 洗涤过滤该样品溶 液后的玻璃纤维过滤器， 然后用 Autowell Gamma 系统 ( 由 Aloka 公司制， 型号 ： ARC-301B) 测定该玻璃纤维过滤器的放射性计数。
(7) 另外， 使用实施例 4 中制备的 2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡 啶 ( 非碘化形式 ) 的甲醇溶液， 进行与上述 (3) 中所述同样的操作， 以制备 15μmol/L 的 2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶液。将 50μL 该溶液加入到装有上述(3) 制备的 50μL 溶液的 96 孔微量培养板的各孔中， 其中， 再加入将淀粉样蛋白混悬液溶解 于包含 1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 而得的 50μL 溶液 ( 根据样品溶液中的 淀粉样蛋白浓度调整淀粉样蛋白浓度 ) 和包含 1％牛血清白蛋白的 100μL 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)， 以制备终浓度是 25、 62.5、 250、 625 和 1000nmol/L 的淀粉样蛋白的溶液。对各微 量培养板进行与上述 (5) 和 (6) 中同样的操作， 以测定残存在玻璃纤维滤器上的放射性计 数 ( 以下称作 B)。
(8) 使用在 (6) 和 (7) 中测定的放射性计数值、 应用下述公式 (1) 计算与淀粉样蛋 125 白特异性结合的 [ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的放射性计数， 并 且评价与淀粉样蛋白添加量之间的关系。
放射性计数＝ A-B···(1)
上述 (8) 中计算的放射性计数与样品溶液中的淀粉样蛋白浓度之间的关系如图 5 所示。正如在该图中所示， 上述 (8) 中计算的放射性计数值显示与淀粉样蛋白浓度成正比 增加的趋势。在本实验的条件下， 淀粉样蛋白和与淀粉样蛋白结合的化合物保持在玻璃纤 维中。此外， 从上述 (8) 中计算的放射性计数值中基本上除去了玻璃纤维上残存的与淀粉 样蛋白的结合无关的放射性。因此， 本实施例中测定的玻璃纤维上的放射性计数是反映与 淀粉样蛋白特异性结合的化合物量的值。因此， 上述 (8) 中测定的放射性计数值随着淀粉 样蛋白浓度的增加而增加这一事实强烈启示， [125I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶是具有与淀粉样蛋白结合的性质的化合物。
上述结果意味着， [125I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶能够高 度结合淀粉样蛋白。
( 实施例 12-14， 比较例 1) 基于辛醇萃取法的分配系数的测定
测定采用一般已知作为化合物通过血脑屏障 ( 以下称作 BBB) 的渗透性指标的基 于辛醇萃取法的分配系数 ( 以下称作 logP 辛醇 )。
( 方法 )
用 含 有 10mg/mL 抗 坏 血 酸 的 生 理 盐 水 溶 液 分 别 稀 释 实 施 例 7 制 备 的 123 [ I]-6- 碘 -2-(4 ′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的乙醚溶液 ( 实施例 12)、 实施 123 例 2 制备的 [ I]-2-(4 ′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的乙醚溶液 ( 实施 123 例 13)、 实施例 10 制备的 [ I]-2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的乙醚溶液 123 ( 实施例 14)、 和参考例 1 制备的 [ I]-IMPY 的乙醚溶液 ( 比较例 1)， 调整至放射性浓度为 20-30MBq/mL。分别向 2mL 辛醇中各添加 10μL 所制备的样品溶液， 再添加 2mL 的 10mmol/ L 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)， 随后搅拌 30 秒。在用低速离心机离心分离 (2000rpm×60 分钟 ) 各混合液后， 对辛醇层和水层各自取样 1mL， 用 Autowell Gamma 系统 ( 型号 ： ARC-301B， 由 Aloka 制 ) 测定放射性计数。使用所测得的放射性计数， 根据式 (2) 计算 logP 辛醇。
( 结果 )
结果如表 1 所示。如该表所示， 全部化合物显示的 logP 辛醇值都在 1 ～ 3 之间。已 知能渗透通过 BBB 的化合物显示的 logP 辛醇值在 1 ～ 3 之间 (Douglas D.Dischino 等人，
J.Nucl.Med.， (1983)， 24， p.1030-1038)。因此， 这表明， 所有化合物都具有与 IMPY 同等的 BBB 渗透性。
表1： 本发明化合物的 logP 辛醇值
实验 比较例 1 实施例 12 实施例 13 实施例 14
化合物 [123I]-IMPY [123I]-6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 [123I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 [123I]-2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶logP 辛醇值 1.9 1.7 2.3 2.3( 实施例 15-16， 比较例 2) 脑中转移性和清除性的测定使用 [123I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶和 [123I]-2-(4′ - 氟 苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶， 测定在雄性 Wistar 大鼠 (7 周龄 ) 的脑中放射性蓄积的 经时变化。
( 方法 )
在硫喷妥钠麻醉下， 将上述实施例 2 中制备的 [123I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 实施例 15)、 上述实施例 10 中制备的 [123I]-2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 实施例 16) 溶解于含有 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液中的溶液 ( 放射性浓度为 20-30MBq/mL) 各 0.05mL 注射到 Wistar 大鼠 (7 周龄 ) 的尾静脉中。在注 射后 2， 5， 30 和 60 分钟后通过从腹部大动脉放血来处死这些大鼠， 移取脑， 测定脑质量， 再 用单道分析仪 ( 检测器型号 ： SP-20， 应用光研株式会社制 ) 测定脑的放射性 ( 以下， 在本实 施例中称作 A)。 此外， 按照与上述相同的方式测定全身其余部分的放射性 ( 以下， 在本实施 例中称作 B)。使用这些测定结果， 根据下述式 (3) 计算在各解剖时间点的每单位脑重量的 放射性蓄积量 (％ ID/g)( 实施例 15 和 16)。
另外， 制备 [123I]-IMPY 溶解于含有 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液的溶液 ( 放 射性浓度为 20-30MBq/mL)。进行与上述同样的操作， 计算在各解剖时间点的每单位脑重量 的放射性蓄积量 (％ ID/g)。
在各时间点， 将 3 只动物分别用于实施例 15、 实施例 16 和比较例 2。
结果如表 2 所示。如表 2 所示， [123I]-2-(4 ′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 实施例 15) 和 [123I]-2-(4 ′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 实施例 123 16)， 在注射后 2 分钟的时间点， 显示出与 I-IMPY 同等的蓄积， 随后在 60 分钟内显示出迅 123 速消除的趋势。这些结果启示， [ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶和 123 123 [ I]-2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶与 [ I]-IMPY 同样， 具有优良的脑转移性和从脑中的迅速清除性。
表2： 本发明化合物在静脉注射后的脑中放射性蓄积 ( 大鼠 )
( 实施例 17) 使用 [123I]-6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的脑 内淀粉样蛋白的显像确认
进行下述实验以检验通过本发明的化合物是否可以使脑内的淀粉样蛋白显像。
( 方法 )
(1) 将 Aβ1-40( 和光纯药工业公司制 ) 溶解于磷酸盐缓冲液 (pH7.4)， 并在 37℃下 振荡 72 小时， 以获得 1mg/mL 的凝集 Aβ 混悬液 ( 以下， 在本实施例中称作淀粉样蛋白混悬 液 )。
(2) 在硫喷妥钠麻醉下， 将 2.5μL( 相当于 25μg) 的该淀粉样蛋白混悬液注射到 雄性 Wistar 大鼠 (7 周龄 ) 一侧的杏仁核中。作为对照， 将 2.5μL 的磷酸盐缓冲生理盐水 溶液 (pH 7.4) 注射到该大鼠另一侧的杏仁核中。在注射淀粉样蛋白混悬液和磷酸盐缓冲 生理盐水溶液 (pH 7.4)1 天后检查该大鼠。
(3) 将 [123I]-6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于含有 10mg/ mL 抗坏血酸的生理盐水溶液， 得到样品溶液 ( 放射性浓度为 32MBq/mL)。在硫喷妥钠麻 醉下， 将该样品溶液通过尾静脉注射到大鼠中 ( 剂量 ： 0.5mL， 给予的放射性活度 ： 相当于 16MBq)。
(4) 在注射 60 分钟后移取脑， 用切片机 ( 型号 ： CM3050S， 由 LEICA 制造 ) 制成厚度 10μm 的脑切片。将该脑切片在显像板上曝光 20 小时， 然后使用生物图像分析仪 ( 型号 ： BAS-2500 ； 由富士胶片株式会社制 ) 进行图像分析。
(5) 在用生物图像分析仪完成图像分析后， 用硫磺素 T 进行病理学染色， 使用荧光 显微镜 ( 尼康公司制 ； 型号 ： TE2000-U 型 ； 激发波长 ： 400-440nm ； 检测波长 ： 470nm) 进行显 像。由此确认了淀粉样蛋白沉积在切片上 ( 图 8b)。
( 结果 )
图 8 显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠的脑切片的放射自显影图和硫磺素 T 染色 的图像。 如该图所示， 在注射淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到显著的放射性蓄积。 由放射性蓄积位点的硫磺素 T 染色的结果， 证明了淀粉样蛋白存在于该位点上。另一方面， 与其他位点相比， 在注射生理盐水溶液一侧的杏仁核中没有观察到显著的放射性蓄积。
这些结果启示， [123I]-6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶具有在 脑内的淀粉样蛋白上蓄积的性能和使脑内淀粉样蛋白显像的能力。
( 实施例 18) 使用 [123I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的脑 内淀粉样蛋白的显像确认
进行下述实验以检验通过本发明的化合物是否可以使脑内的淀粉样蛋白显像。
( 方法 )
除了将 [123I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于含有 10mg/ mL 抗坏血酸的生理盐水溶液 ( 放射性浓度 20MBq/mL) 以下， 进行与实施例 17 同样的操作， 123 得到样品溶液， 由此确认 [ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶能够使脑 内淀粉样蛋白显像。
( 结果 )
图 9 显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠的脑切片的放射自显影图和硫磺素 T 染色 的图像。 如该图所示， 在注射淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到显著的放射性蓄积。 由放射性蓄积位点的硫磺素 T 染色的结果， 证明了淀粉样蛋白存在于该位点上。另一方面， 与其他位点相比， 在注射生理盐水溶液一侧的杏仁核中没有观察到显著的放射性蓄积。
这些结果启示， [123I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶具有在脑 内淀粉样蛋白上蓄积的性质和使脑内淀粉样蛋白显像的能力。
( 实施例 19)[123I]-2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的脑内淀粉样蛋 白的显像确认 进行下述实验以检验通过本发明的化合物是否可以使脑内的淀粉样蛋白显像。
( 方法 )
除了将 [123I]-2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于含有 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液 ( 放射性浓度 20MBq/mL) 以外， 进行与实施例 17 同样的操作， 得 123 到样品溶液， 由此确认 [ I]-2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶能够使脑内淀粉 样蛋白显像。
( 结果 )
图 10 显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠的脑切片的放射自显影图和硫磺素 T 染 色的图像。如该图所示， 在注射淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到样本中显著的放 射性蓄积。由放射性蓄积位点的硫磺素 T 染色的结果， 证明了淀粉样蛋白存在于该位点上。 另一方面， 与其他位点相比， 在注射生理盐水溶液一侧的杏仁核中没有观察到显著的放射 性蓄积。
这些结果启示， [123I]-2-(4′ - 氟苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶具有在脑内淀 粉样蛋白上蓄积的性质和使脑内淀粉样蛋白显像的能力。
( 实施例 20) 脑中转移性和清除性的测定
使用 [123I]-6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶， 测定在雄性 Wistar 大鼠 (7 周龄 ) 的脑中放射性蓄积的经时变化。
( 方法 )
除了使用 [123I]-6- 碘 -2-(4 ′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于含有 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液的溶液 ( 放射性浓度 20-30MBq/mL) 作为样品以外， 通过 进行与实施例 15-16 同样的操作， 测定上述大鼠脑中放射性蓄积的经时变化。
结果如表 3 所示。如表 3 所示， [123I]-6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶在注射后 2 分钟的时间点， 显示出与 123I-IMPY( 参考上述比较例 2) 同等的蓄积， 随后在 60 分钟内显示出迅速消除的趋势。这些结果启示， [123I]-6- 碘 -2-(4′ - 甲氧基苯
基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶与 [123I]-IMPY 同样， 具有优良的脑转移性和从脑中的迅速清除性。
表3： 本发明化合物在静脉注射后在脑中的放射性蓄积 ( 大鼠 )
( 实施例 21) 使用 [123I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的各 器官中放射性分布率的测定
为了证明本发明化合物能分布于靶器官中和具有良好的清除到体外的性质， 使用 123 [ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶测定 SD 大鼠 (8 周龄 ) 的各器官 中的放射性蓄积的经时变化。
向 100μL 2-(4′ - 三丁基甲锡烷基苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的乙 腈溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中加入 100μL 的 1mol/L 硫酸、 10μL 的 1mmol/L 碘化钠、 60μL 的 123 728MBq[ I] 碘化钠和 10μL30％ (W/V) 过氧化氢。将该混合液在 40℃静置 10 分钟后， 在 123 2-a] 下述条件下对该混合液进行 HPLC， 得到 [ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 吡啶级分。
HPLC 条件 ：
色谱柱 ： YMC-Pack Pro C8( 商品名 ； YMC 制 ； 规格 ： 4.6 x 150mm)
流动相 ： 10mM 甲酸 (pH 3.0)/ 乙腈＝ 80/20 → 10/90(0 分钟→ 30 分钟 )
流速 ： 1.0mL/min
检测器 ： 紫外可见吸光光度计 ( 检测波长 ： 254nm) 和放射性计数器 (Raytest 公司 制： 型号 STEFFI)
将 10mL 水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商 标 )Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收 123 集 [ I]-2-(4 ′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 123 1mL 乙醚通过， 以洗脱 [ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。所得化合 物的放射性活度是 448MBq。此外， 在下述条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学 纯度是 98％。
TLC 分析条件 ：
TLC 板 ： 硅胶 60 F254( 商品名 ； 默克公司制 )
流动相 ： 乙酸乙酯 / 甲醇 / 二乙胺＝ 100/4/1
检测器 ： Rita Star( 商品名 ； Raytest 公司制 )
用含有 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液稀释 [123I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧 基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的乙醚溶液并且调整至 8-12MBq/mL 放射性浓度。在无麻醉下， 将各 0.2mL 制备的样品溶液分别给予上述大鼠的尾静脉中。 在给药后 5、 30、 60 和 180 分钟， 通过 从腹部大动脉放血来处死这些大鼠， 摘取表 4 中所记载的各器官。使用与实施例 15 同样的 方法对采集的各器官的质量和放射性进行测定。此外， 测定在摘取器官后的大鼠全身的放
射性 ( 以下称作全身的其余部分 )。 使用这些测定结果， 根据下述式 (4) 计算在各个时间点 每单位器官质量的放射性分布率 (％ ID/g)。
在各时间点使用 3 只动物进行实验。
RT ： 靶器官的放射性 (cpm) S
R ： 全部器官的放射性总和 (cpm) R
R ： 全身其余部分的放射性 (cpm) T
M ： 靶器官的质量 (g)
结果如表 4 所示。 如表 4 所示， [123I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶在给予后 5 分钟分布于各器官上， 随后大部分放射性分布于小肠和大肠。此外， 其放射 123 性分布从小肠转移至大肠。因此， 发现 [ I]-2-(4′ - 碘苯基 )-6- 甲氧基咪唑并 [1， 2-a] 吡啶在给予后迅速随胆汁排泄并且具有良好的体外清除性。
此外， 对认为淀粉样蛋白会蓄积的脑、 心脏、 肺、 胰脏和骨等进行观察， 发现在给药 后 5 分钟的时间点， 在所有这些器官中出现了显著的放射性蓄积， 由此证明了实施例 13 化 合物的分布。此外， 给药后 5 分钟的时间点与给药后 180 分钟的时间点之比 (( 给药后 5 分 例如 ： 脑为 钟的时间点的％ ID/g)/( 给药后 180 分钟的时间点的％ ID/g)) 显示出了高值， 43、 心脏为 12、 肺为 7、 胰脏为 8、 骨为 3。由此显示， 在被认为淀粉样蛋白会蓄积的器官中发 生了迅速的放射性分布和迅速的清除。
由上述可见， 实现了对生物组织中的淀粉样蛋白检测试剂来说所需要的给药后早 期的放射性分布以及迅速的体外清除性。
表4
产业实用性
本发明的用于检测生物组织中淀粉样蛋白的试剂可以用作淀粉样变性病例如全 身性淀粉样变性病中的淀粉样蛋白的体外和体内诊断剂。