对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物的应用及制备方法 技术领域 本发明涉及对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物的应用及其制备方法， 特别是涉 及用于检测生物组织中的淀粉样蛋白的试剂， 其可以在全身性淀粉样变性病和其他与淀粉 样蛋白蓄积有关的疾病的诊断中用于检测病灶部位中的淀粉样蛋白。
背景技术 由被称作淀粉样蛋白的纤维状蛋白质在体内各种器官或组织中沉积而引发的疾 病统称作淀粉样变性病。淀粉样变性病的共同特征是， 富含 β- 折叠结构的被称作淀粉样 蛋白的纤维状蛋白质在各种器官中系统性地或在位点局部性地沉积， 以至于在器官或组织 中触发了功能异常。 淀粉样蛋白一般是指生物体内各种淀粉样蛋白的前体蛋白例如淀粉样 蛋白 -β、 突变型转甲状腺素蛋白和 β2- 微球蛋白聚集形成的蛋白凝聚物。淀粉样蛋白尽 管是由任意的淀粉样蛋白的前体蛋白形成的， 但是它们具有富含 β- 折叠的特征性结构。 因此， 能与 β- 折叠结构结合的化合物例如刚果红和硫磺素 T 的特征在于， 它们与淀粉样蛋 白具有亲和性。
根据淀粉样蛋白的沉积模式， 淀粉样变性病分为全身性淀粉样变性病和局限性淀 粉样变性病。
全身性淀粉样变性病是淀粉样蛋白沉积发生在全身各个部分的疾病。 全身性淀粉 样变性病的例子包括 ： 家族性淀粉样变性病 ( 其中肝脏内产生的淀粉样蛋白沉积在全身的 各个器官而导致疾病 )、 老年性 TTR 淀粉样变性病 ( 其中淀粉样蛋白沉积在心脏和大关节 例如手关节中 )、 透析性淀粉样变性病 ( 发生在长期透析患者的骨和关节等部位 )、 反应性 AA 淀粉样变性病 ( 继发性淀粉样变性病， 是由血清淀粉样蛋白 A 产生的淀粉样蛋白沉积导 致的， 所述血清淀粉样蛋白 A 是慢性炎性疾病例如慢性风湿病之后继发的急性期蛋白 )、 和 免疫细胞性淀粉样变性病 ( 其中由免疫球蛋白产生的淀粉样蛋白沉积在全身的各个器官 中 )。
局限性淀粉样变性病是淀粉样蛋白沉积仅发生在某些器官中的疾病。 局限性淀粉 样变性病的例子包括 ： 脑淀粉样变性病例如阿尔茨海默病 ( 其中淀粉样蛋白沉积在脑中 )、 脑血管淀粉样变性病和克雅病、 内分泌淀粉样变性病 ( 其中淀粉样蛋白沉积在伴随 II 型糖 尿病的胰岛和胰岛素瘤中、 或者沉积在心房中 )、 皮肤淀粉样变性病 ( 其中淀粉样蛋白沉积 在皮肤中 )、 和局限性结节性淀粉样变性病 ( 其中结节状淀粉样蛋白沉积在皮肤和肺中 )。
在全身性淀粉样变性病的情况下， 如下进行淀粉样变性病的诊断 ： 首先从皮肤、 肾 和胃肠道等可活组织检查的部位采集组织 ； 并且用刚果红或硫磺素 T 将其染色。刚果红是 一种对淀粉样蛋白的 β- 折叠结构具有高度亲和性的荧光性化合物， 刚果红由于其定向性 而在偏光显微镜下显示双折射， 因此它可以选择性地染色组织中的淀粉样蛋白沉积物。同 样地， 硫磺素 T 也是对淀粉样蛋白具有亲和性的荧光性化合物， 并可与刚果红同样地使用。 在发现组织染色呈阳性后， 组合利用抗体的免疫染色， 进行确诊。然而， 用刚果红或硫磺素 T 染色即使是在偏光显微镜下观察也往往难以判定为阳性。
另一方面， 人们考虑用近年来广泛发展的图像诊断装置例如 PET、 SPECT 和 MRI 来 进行全身性淀粉样变性病的图像诊断。
然而， 当刚果红和硫磺素 T 是被标记的、 并且用作图像诊断的探针时， 它们的存在 问题是， 与淀粉样蛋白的结合特异性较差， 以至于不能获得良好的检测灵敏度。
此外， 由于刚果红具有致癌性， 它不适用于人体的诊断。
因此， 已经提出， 将作为刚果红衍生物的双 -(3- 羟基羰基 -4- 羟基 ) 苯乙烯基苯 (BSB) 及其衍生物用作检测淀粉样蛋白的荧光试剂， 它对全身性淀粉样蛋白具有高度的亲 和性和检测灵敏度， 可以用于体内检测 ( 非专利文献 14， 专利文献 7)。据报道， BSB 与由脑 淀粉样变性病和全身性淀粉样变性病产生的淀粉样蛋白具有高度亲和性， 并且其结构中没 有联苯胺结构， 因此它几乎不存在致癌问题， 并且可以是放射性标记的， 用作图像诊断的探 针。
另一方面， 对于作为典型的脑淀粉样变性病的阿尔茨海默病 ( 以下称作 AD)， 因为 不能采集活检标本， 因此已经尝试使用与淀粉样蛋白具有高度亲和性的化合物作为标记物 来在体内检测 AD。
用于脑内淀粉样蛋白的图像诊断的这样的探针大多是疏水性的低分子量化合 物， 其与淀粉样蛋白具有高度的亲和性， 且脑转移性很高， 并且用各种放射性核素例如 11C、11 F 和 123I 标记。例如， 有报告指出， C 或放射性卤素标记的化合物包括各硫磺素衍生 物例如 6- 碘 -2-[4 ′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ] 苯并噻唑 ( 以下称作 TZDM) 和 6- 羟 基 -2-[4′ -(N- 甲基氨基 ) 苯基 ] 苯并噻唑 ( 以下称作 6-OH-BTA-1)( 专利文献 1， 非专利文 献 3) ； 均二苯乙烯化合物例如 (E)-4- 甲基氨基 -4′ - 羟基均二苯乙烯 ( 以下称作 SB-13) 和 (E)-4- 二甲基氨基 -4′ - 碘代均二苯乙烯 ( 以下称作 m-I-SB)( 专利文献 2， 非专利文献 4， 非专利文献 5) ； 苯并噁唑衍生物例如 6- 碘 -2-[4′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ] 苯并噁 唑 ( 以下称作 IBOX) 和 6-[2-( 氟 ) 乙氧基 ]-2-[2-(2- 二甲基氨基噻唑 -5- 基 ) 乙烯基 ] 苯并噁唑 ( 非专利文献 6， 非专利文献 7) ； DDNP 衍生物例如 2-(1-{6-[(2- 氟乙基 )( 甲基 ) 氨基 ]-2- 萘基 } 亚乙基 ) 丙二腈 ( 以下称作 FDDNP)( 专利文献 4， 非专利文献 8) ； 和咪唑 并吡啶衍生物例如 6- 碘 -2-[4′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ]- 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 以 下称作 IMPY)( 专利文献 3， 非专利文献 9)。此外， 对用于图像诊断的某些探针， 已经进行了 人体图像研究， 并且报道了与正常人相比， 在 AD 患者的脑中有显著的放射性蓄积 ( 非专利 文献 10， 非专利文献 11， 非专利文献 12， 非专利文献 13)。
国际公开 WO2007/002540 号小册子公开了一系列具有与淀粉样蛋白有亲和性的 基团的化合物， 该基团通过乙二醇或聚乙二醇与放射性核素标记的位点连接 ( 专利文献 5)。
国际公开 WO2007/063946 号小册子公开了一系列化合物， 其与五元芳香杂环基相 连以防止它们在脑内代谢 ( 专利文献 6)。
[ 专利文献 1]JP-T-2004-506723
[ 专利文献 2]JP-T-2005-504055
[ 专利文献 3]JP-T-2005-512945
[ 专利文献 4]JP-T-2002-523383
[ 专利文献 5] 国际公开 WO2007/002540 小册子 18[ 专利文献 6] 国际公开 WO2007/063946 小册子
[ 专利文献 7] 国际公开 WO2005/016888 小册子
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[ 非专利文献 14]D.M.Skovronsky 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.， 2000， 97， 7609
发明内容 发明要解决的课题
如上所述， 公开了各种化合物可以作为以淀粉样蛋白为对象的图像诊断的探针， 并探索了其临床用途。
在正常小鼠中的实验结果表明， 用 [125I] 标记的 TZDM、 IBOX 和 m-I-SB 都会在施 用 2 分钟后转移到脑内。但是， 这些化合物从正常组织中的清除是不充分的， 并且会随着施 用后时间的推移而在脑中逐渐蓄积 (JP-T-2005-512945 ； Zhi-Ping Zhuang 等人， Nuclear Medicineand Biology， 2001， 28， p.887-894 ； H.F.Kung 等 人， J.Am.Chem.Soc.， 2001， 123， p.12740-12741)。当从正常组织中的清除不充分时， 就出现了一个问题 ： 在淀粉样蛋白蓄 11 积位点不能获得足够的对比度。用 [ C] 标记的 SB-13 在大鼠的实验中显示了其具有从正 常组织中的清除性能， 但清除速率还谈不上足够快 (Masahiro Ono 等人， NuclearMedicine and Biology， 2003， 30， p.565-571)。
同时， 据披露， 如用 [125I] 标记的化合物的实验结果所示， 具有咪唑并吡啶骨架的 化合物例如 IMPY 具有在施用后转移到脑中并在淀粉样蛋白上蓄积的性质， 其也具有与上 述化合物不同的从正常组织中迅速消除的优良性质。但是， IMPY 是一种在回复突变试验中 呈阳性的化合物。为了将这种化合物用作图像诊断的探针， 必须充分考虑剂量和给药方式 ( 国际公开 WO 03/106439 号小册子 )。
据报道， FDDNP 在回复突变试验中也是呈阳性的。( 国际公开 WO 03/106439 号小册子 )。 靶向淀粉样蛋白的图像诊断探针优选是与淀粉样蛋白的亲和性优良并且像 IMPY 一样从正常组织中清除足够迅速， 但是又能抑制毒性例如诱变性的化合物。 但是， 还没有公 开过具有这种性质的化合物。
此外， 根据我们的研究结果， 已经证实了 IMPY 非特异性地蓄积在没有沉积淀粉样 蛋白的白质或其它位置。作为 AD 诊断剂， 必须使用能抑制淀粉样蛋白沉积部位以外的非特 异性蓄积的化合物， 但是还没有公开过这样的化合物。
本发明正是鉴于已经公开了作为靶向淀粉样蛋白的探针的各种化合物、 但是还没 有化合物被证实具有临床可接受的性质的情况下进行的， 其目的在于通过提供对淀粉样蛋 白具有亲和性的新化合物而能够在体内或体外以高灵敏度检测淀粉样蛋白。
解决颗题的方法
本发明人发现， 具有咪唑并吡啶 - 苯基骨架或与之类似骨架 ( 其苯基的碳连接有 氧原子 ) 的特定的新化合物与淀粉样蛋白具有亲和性， 而且诱变性等毒性低， 并且可以通 过使用一系列这样的化合物作为探针， 在体内或体外以高灵敏度检测淀粉样蛋白。由此完 成了本发明。
即， 根据本发明的一个方面， 提供了用于检测沉积在生物组织中的淀粉样蛋白的 试剂， 所述试剂包括下式 (1) 表示的化合物 ：
或其盐。
生物组织可以是已知在淀粉样变性病中淀粉样蛋白沉积于其上的各种组织。 这种 生物组织的典型实例包括脑、 心、 肺、 胰脏、 骨和关节， 最典型的生物组织可举出脑。在脑为 对象的情况下， 典型的淀粉样变性病包括阿尔茨海默病和 Lewy 体痴呆。
在式 (1) 中， R1 和 R2 是卤素取代基， 且它们中的至少 1 个是放射性卤素取代基。 可 以将各种核素用作卤素， 优选可以使用氟、 溴或碘。 作为放射性卤素， 可以使用各种元素， 优 18 75 76 123 124 125 131 18 123 125 选选自 F、 Br、 Br、 I、 I、 I 或 I 的卤素， 更优选选自 F、 I 或 I 的卤素。
A1、 A 2、 A3 和 A4 独立地表示碳或氮， 必要的是， 它们中的至少 1 个表示碳。优选地， A1、 A2、 A3 和 A4 中的 3 个以上表示碳， 更优选地， 它们全部表示碳。在式 (1) 中， R1 与 A1、 A2、 A3 或 A4 表示的碳键合。
此外， m 是 0-2 的整数。R1 的键合位置优选是 A3 表示的碳， 即 6 位的碳。
上式 (1) 的化合物是新化合物， 根据本发明的另一个方面， 提供一种放射性卤素 标记的有机化合物的制备方法， 其包括 ：
制备反应溶液的步骤， 所述反应溶液包含下式 (2) 表示的化合物或其盐与放射性 卤离子 ：
其中， A1、 A2、 A3 和 A4 独立地表示碳或氮， 3
R 是选自非放射性卤素取代基、 硝基取代基、 具有 1-4 个碳原子的三烷基铵取代 基、 具有 1-4 个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基和三苯基甲锡烷基取代基的基团，
R4 是选自非放射性卤素取代基、 甲磺酰氧基取代基、 三氟甲磺酰氧基取代基和芳 香族磺酰氧基取代基的基团， 且
m 是 0-2 的整数，
条件是， A1、 A 2、 A3 和 A4 中的至少 1 个表示碳， 且 R3 与 A1、 A 2、 A3 或 A4 所表示的碳键 合，
和，
向上述反应溶液赋予反应条件， 以合成下式 (1) 表示的化合物。
其中 A1、 A2、 A3 和 A4 独立地表示碳或氮， 1
R 是卤素取代基，
R2 是卤素取代基， 且
m 是 0-2 的整数，
条件是， R1 和 R2 中的至少 1 个是放射性卤素取代基， A1、 A2、 A3 和 A4 中的至少 1 个 1 表示碳， R 与 A1、 A2、 A3 或 A4 所表示的碳键合。
在式 (2) 中， R3 是选自非放射性卤素取代基、 硝基取代基、 烷基链具有 1-4 个碳原 子的三烷基铵取代基、 烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基和三苯基甲锡烷 基取代基的基团。 作为三烷基甲锡烷基取代基， 可以使用各种取代基， 优选使用三甲基甲锡 烷基取代基和三丁基甲锡烷基取代基。
R4 是选自非放射性卤素取代基、 甲磺酰氧基取代基、 三氟甲磺酰氧基取代基和芳 香族磺酰氧基取代基的基团。 作为芳香族磺酰氧基取代基， 优选可以使用甲苯磺酸、 硝基苯 磺酸和苯磺酸。
作为 R3 和 R4 的非放射性卤素取代基， 可以使用各种卤素， 但是优选可以使用能在 使用放射性氟的亲核取代反应中作为靶标的卤素或能在与放射性碘的同位素交换反应中 作为靶标的卤素， 优选可以使用氯、 碘或溴。R3 和 R4 中的至少 1 个优选是非放射性卤素取 代基。
A1、 A 2、 A3 和 A4 独立地表示碳或氮， 必要的是， 它们中的至少 1 个表示碳。优选地， A1、 A2、 A3 和 A4 中的 3 个以上表示碳， 更优选地， 它们全部表示碳。在式 (2) 中， R3 与 A1、 A2、 A3 或 A4 表示的碳键合。
此外， m 是 0-2 的整数。
此外， 根据本发明， 提供一种具有咪唑并吡啶 - 苯基骨架的化合物， 其中苯基上 的碳原子通过氧原子与末端被取代的烷基链键合， 但是氧原子的键合位置优选是苯基的 3 4′ - 位的碳。另外， R 的键合位置优选是 A3 所表示的碳， 即， 6- 位的碳。
制备包含上述式 (2) 所示的前体化合物或其盐和放射性卤离子的反应溶液的步 骤可以如下进行， 例如， 将所述前体化合物或其盐溶解在惰性有机溶剂中， 向其中添加由公 知方法得到的包含放射性卤离子的溶液。
作为惰性有机溶剂， 可以使用与所述前体化合物或其盐和放射性卤离子之间不具 有反应性的各种溶剂， 例如， 当使用的放射性卤素是放射性碘时， 可以优选使用甲醇 ； 当使 用的放射性卤素是放射性氟时， 可以优选使用乙腈。
对于在合成上述式 (1) 表示的化合物或其盐的步骤中向反应溶液赋予的反应条 件没有特别限制， 只要它是允许进行用被添加到反应溶液中的放射性卤离子置换式 (2) 化 合物的 R3 或 R4 的反应的条件即可， 并且可以使用适合放射性卤离子的种类的公知反应条 件。
在本发明的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法中， 作为放射性卤离子， 可 18 75 76 123 124 125 131 以使用例如 F、 Br、 Br、 I、 I、 I 或 I。 124 125
当制备其中 R1 表示的放射性卤素取代基是 123I， I， I 或 131I 的式 (1) 的化合物 124 125 时， 分别使用 123I 离子， I 离子， I 离子或 131I 离子作为放射性卤离子， 并且， 作为式 (2) 3 的化合物， 优选使用其中 R 是非放射性碘、 烷基具有 1-4 个碳原子的三烷基甲锡烷基取代 基或三苯基甲锡烷基取代基的化合物 ( 此时， R2 和 R4 是非放射性卤素取代基 )。
当制备其中 R1 表示的卤素取代基是 18F 的式 (1) 的化合物时， 使用 18F 离子作为放 射性卤离子， 作为式 (2) 的化合物， 优选使用其中 R3 是硝基取代基或烷基具有 1-4 个碳原 子的三烷基铵取代基的化合物 ( 此时， R2 和 R4 是非放射性卤素取代基 )。
在制备其中 R1 表示的卤素取代基是 75Br 或 76Br 的式 (1) 的化合物时， 分别使用 75 76 Br 离子或 Br 离子作为放射性卤离子， 并且， 作为式 (2) 的化合物， 优选使用其中 R3 是非 放射性溴的化合物 ( 此时， R2 和 R4 是非放射性卤素取代基 )。
当制备其中 R2 表示的卤素取代基是 18F 的式 (1) 的化合物时， 使用 18F 离子作为放 射性卤离子， 并且， 作为式 (2) 的化合物， 优选使用其中 R4 是甲磺酰氧基取代基、 三氟甲磺 1 3 酰氧基取代基或芳香族磺酰氧基取代基的化合物 ( 此时， R 和 R 是非放射性卤素取代基 )。124 125 当制备其中 R2 表示的卤素取代基是 123I、 I、 I 或 131I 的式 (1) 的化合物时， 分 123 124 125 131 别使用 I 离子， I 离子， I 离子或 I 离子作为放射性卤离子， 并且， 作为式 (2) 的化合 4 1 3 物， 优选使用其中 R 是非放射性碘的化合物 ( 此时， R 和 R 是非放射性卤素取代基 )。 2 75
当制备其中 R 表示的卤素取代基是 Br 或 76Br 的式 (1) 的化合物时， 分别使用 75 76 Br 离子或 Br 离子作为放射性卤离子， 并且， 作为式 (2) 的化合物， 优选使用其中 R4 是非 放射性溴的化合物 ( 此时， R1 和 R3 是非放射性卤素取代基 )。
根据本发明的另一个方面， 提供用于合成放射性卤素标记的有机化合物的前体化 合物或其盐， 该前体化合物包含下式 (2) 表示的化合物 ：
其中 A1、 A2、 A3 和 A4 独立地表示碳或氮， 3
R 是选自非放射性卤素取代基、 硝基取代基、 烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基铵 取代基、 烷基链具有 1-4 个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基或三苯基甲锡烷基取代基的基 团，
R4 是选自非放射性卤素取代基、 甲磺酰氧基取代基、 三氟甲磺酰氧基取代基和芳 香族磺酰氧基取代基的基团， 且
m 是 0-2 的整数，
条件是， A 1、 A2、 A3 和 A4 中的至少 1 个表示碳， R3 与 A1、 A 2、 A3 或 A4 所表示的碳键合。 3 4
在式 (2) 中， A1、 A2、 A3 和 A4， 以及 R 和 R 的优选实施方案与上述制备方法中所述 的相同。
发明效果
根据本发明， 可以得到淀粉样蛋白检测试剂及其制备方法以及制备用中间体， 该 淀粉样蛋白检测试剂对淀粉样蛋白具有亲和性， 而且能抑制诱变性等毒性， 因此可用于广 泛的与淀粉样变性病有关的淀粉样蛋白的体外和体内检测。 附图说明
图 1-1 是 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
图 1-2 是 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 对甲苯磺酰氧基丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
图 1-3 是 6- 溴 -2-[4′ -(2″ - 对甲苯磺酰氧基乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
图 1-4 是 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路 线。
图 1-5 是 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路 线。
图 1-6 是 6- 溴 -2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路 图 1-7 是 2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路 图 1-8 是 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的合成路线。
线。
线。 图 1-9 是 [125I]-2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
图 1-10 是 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
图 1-11 是样品溶液中的淀粉样蛋白的浓度与放射性浓度之间的关系。
图 1-12(a) 是注射化合物 I-7 后的脑切片的放射自显影图， 图 1-12(b) 是硫磺素 T 染色的样品的荧光显微镜图像 ( 注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图 )。
图 1-13 是 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成路线。
图 1-14(a) 是注射化合物 I-9 后的脑切片的放射自显影图， 图 1-14(b) 是硫磺素 T 染色的样品的荧光显微镜图像 ( 注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图 )
具体实施方式
( 放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物的合成方法 )
下面， 以 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶为例， 描述本发明一个方面的用于制备放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物的 合成方法。
首先， 将 4′ - 羟基苯乙酮与溴化铜反应， 制备 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1-1， 步 骤 1)。 此时， 反应可根据常规方法进行， 例如在文献 King， L.Carroll & Ostrum， G.Kenneth，Journal of OrganicChemistry， 1964， 29(12)， p.3459-3461 中所述的方法。
然后， 将上述制备的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮与 2- 氨基 -5- 溴吡啶反应， 以制备 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-1， 步骤 2)。该步骤可以根据以下 方法进行。
首先， 将 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮和 2- 氨基 -5- 溴吡啶溶解于惰性溶剂例如乙腈 中， 然后使它们在回流温度下彼此反应 2-6 小时， 以制备呈白色沉淀的 6- 溴 -2-(4′ - 羟 基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的氢溴酸盐。此时使用的溶剂可以是乙腈或通常用于类似反 应的其它溶剂， 例如甲醇和丙酮。 反应温度可以是允许回流的温度， 例如在溶剂是乙腈时为 90℃。 使用的溶剂的量可以是足以实现反应的量， 然而， 需要注意的是， 如果溶剂过多， 则难 以获得反应产物的沉淀。例如， 当使用相当于 10mmol 量的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮进行反 应时， 使用的溶剂的量可以为约 40-50mL。
然后， 将反应液过滤以回收沉淀。将白色沉淀混悬在甲醇 / 水 (1 ∶ 1) 的混合液 中。然后， 向其中添加相对于混悬的沉淀物为非常大地过量的饱和碳酸氢钠水溶液， 以释 放作为沉淀的 6- 溴 -2-(4 ′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。将新生成的沉淀过滤， 以回收作为本步骤的目标化合物的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-1， 步骤 2)。甲醇 / 水的混合液的量没有特殊限制， 只要它足以实现反应即可。然而， 需 要注意的是， 如果混合液的量过多， 则会妨碍产物的析出。例如， 当使用相当于 10mmol 量的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮时， 甲醇 / 水的混合液的使用量可以是约 40-100mL。对于碳酸氢钠 的量没有特殊限制， 只要其相对于作为反应底物的上述沉淀是非常大地过量即可。 例如， 当 反应在上述条件下进行时， 添加到反应液中的饱和碳酸氢钠水溶液的量可为约 25mL。
然后， 将上述制备的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶充分干燥， 并溶解于 N， N- 二甲基甲酰胺， 向其中添加碳酸钾和 3- 溴 -1- 氟丙烷。在室温下将反应溶 液搅拌过夜， 得到 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-1， 步骤 3)。所使用的碳酸钾的量可以是可中和反应过程中由 3- 溴 -1- 氟丙烷产生的氢溴酸 的量， 典型的摩尔比是副原料 3- 溴 -1- 氟丙烷的约 2 倍。可以使用相对于反应底物过量的 3- 溴 -1- 氟丙烷， 其典型的摩尔比是反应底物 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的约 1.5 倍。
将所获得的 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 二噁烷， 在加入三乙胺后， 加入双 ( 三丁基锡 ) 和催化量的四 ( 三苯膦 ) 钯。将该反应混合 物在约 90℃下加热以进行反应约 24 小时， 然后蒸馏除去溶剂， 进行色谱精制， 以得到作为 目标化合物的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-1， 步骤 4)。此时， 所使用的双 ( 三丁基锡 ) 的量可以是满足相对于反应底物为过量 条件的量， 具体地， 它的摩尔比是相对于反应底物 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的约 1.5 倍。
获得 6- 位的取代基是三丁基甲锡烷基取代基以外的三烷基甲锡烷基取代基的化 合物时， 可以在步骤 4 中使用适合目的的各种双 ( 三烷基锡 ) 来代替双 ( 三丁基锡 )。例 如， 当合成 6- 位的取代基是三甲基甲锡烷基取代基的化合物时， 可以在步骤 4 中用双 ( 三 甲基锡 ) 进行与上述同样的反应。
咪唑并吡啶环上的官能团的键合位点为 6- 位碳以外的碳原子的化合物， 可以通过使用吡啶环上溴的键合位置各不相同的各化合物来代替步骤 2 中使用的 2- 氨基 -5- 溴 吡啶而获得。例如， 当官能团的键合位置是咪唑并吡啶环的 8- 位碳时， 可以在步骤 2 中使 用 2- 氨基 -3- 溴吡啶来代替 2- 氨基 -5- 溴吡啶。
此外， 放射性卤素标记的位点是与咪唑并吡啶环的 2- 位的碳原子键合的烷氧基 苯基取代基的前体化合物， 可以通过在步骤 3 中使用 3- 溴 -1- 丙醇来代替 3- 溴 -1- 氟 丙烷， 并将生成的化合物与对甲苯磺酰氯等反应而获得。例如， 可以通过下述方法合成 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 对甲苯磺酰氧基丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。
首先， 将上述制备的 6- 溴 -2-(4 ′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 N， N- 二甲基甲酰胺， 向该溶液中补充用碳酸钾和 3- 溴 -1- 丙醇， 并在室温下搅拌过夜， 得到 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 羟基丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。 将其溶解于吡啶， 并在冰浴 下补充对甲苯磺酰氯， 然后在室温下反应， 得到作为目标化合物的 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 对 甲苯磺酰氧基丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。此时使用的对甲苯磺酰氯的量可以相 对于反应底物是过量的， 典型的摩尔比是反应底物 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 羟基丙氧基 ) 苯 基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的约 2 倍。
与咪唑并吡啶环的 2- 位苯基键合的烷氧基取代基与 4′ - 位以外的位置键合的化 合物， 例如， 在 3′ - 位键合氟丙氧基的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[3′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯 基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶， 可以根据与上述相同的反应合成， 除了在步骤 1 中使用 3′ - 羟 基苯乙酮代替 4′ - 羟基苯乙酮作为反应原料。
( 放射性卤素标记的有机化合物的合成方法 )
下面， 以 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[123I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶为例， 描述根据本发明另一个方面的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法。
在 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[123I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的制备中， 123 首先得到作为标记用的 [ I] 碘化钠溶液。可以通过例如将氙气用作靶标并暴露于质子轰 击的已知方法来获得 [123I] 放射性碘。使用已知方法将该 [123I] 放射性碘制入到 [123I] 碘 化钠溶液中， 并用于标记。
然后， 将标记前体 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于惰性有机溶剂， 向其中添加 [123I] 碘块溶于水而成的溶液、 酸和氧化 123 剂， 使它们反应， 得到作为目标化合物的 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[ I] 碘咪唑 并 [1， 2-a] 吡啶。作为溶解前体化合物的惰性有机溶剂， 可以使用与标记前体和 [123I] 碘 块之间不具有反应性的各种溶剂， 优选可以使用甲醇。
作为酸， 可以使用各种酸， 优选盐酸。
对氧化剂没有特别限定， 只要它可以在反应液中氧化碘即可， 优选过氧化氢或过 乙酸。氧化剂的添加量可以为足以氧化反应液中的碘的量。
可以通过用适合目的的放射性卤素来标记符合合成目的的标记前体， 来合成用 18 碘以外的放射性卤素标记的化合物。例如， 为了合成 2-[4 ′ -(3 ″ -[ F] 氟丙氧基 ) 苯 基 ]-6- 溴咪唑并 [1， 2-a] 吡啶， 可以在相转移催化剂和碳酸钾的存在下， 将标记前体 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 对甲苯磺酰氧基丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶与 [18F] 氟离 子反应。
( 本发明检测试剂的制备方法和使用方法 )根据前体蛋白的种类不同， 淀粉样蛋白具有多种不同结构， 但它们的共同点是具 有 β- 折叠结构。已知以淀粉样蛋白为对象的许多染色试剂例如硫磺素 T 和刚果红靶向该 β- 折叠结构， 并且对不同种类的淀粉样蛋白具有同等的染色能力。
本发明的式 (1) 的化合物对以淀粉样蛋白 β- 蛋白 ( 下文称作 Aβ) 为前体化合 物的淀粉样蛋白具有亲和性， 并且还具有抑制已知能结合广泛的淀粉样蛋白的硫磺素 T 与 淀粉样蛋白结合的活性。
因此， 认为本发明的式 (1) 的化合物与硫磺素 T 同样， 对淀粉样蛋白的 β- 折叠结 构具有亲和性。这启示本发明式 (1) 的化合物对各种淀粉样蛋白具有相同的亲和性。
即， 本发明的淀粉样蛋白检测试剂可以与硫磺素 T 和刚果红同样地， 用于诊断全 身性淀粉样变性病和局限性淀粉样变性病。 全身性淀粉样变性病包括免疫球蛋白性淀粉样 变性病、 反应性从淀粉样变性病、 家族性淀粉样变性病、 透析淀粉样变性病、 老年性淀粉样 变性病等。 局限性淀粉样变性病包括脑淀粉样变性病、 内分泌淀粉样变性病、 皮肤淀粉样变 性病和局限性结节性淀粉样变性病等。
本发明的淀粉样蛋白检测试剂不仅可以用作体外活组织检查使用的试剂， 而且由 于使用了能抑制诱变性等毒性的化合物， 因此可以作为放射性诊断剂在体内使用。 本发明的淀粉样蛋白检测试剂， 可以与其他一般公知的放射性诊断剂同样地， 配 制成将上述式 (1) 的放射性卤素标记的化合物根据期望混入任选调节至适当 pH 的水、 生 理盐水或林格液等而成的溶液。此时， 应将本发明化合物的浓度调节至不超过确保本发明 化合物稳定性的浓度。对本发明化合物的剂量没有特殊限制， 只要它足以得到所给予试剂 123 的分布图像即可。例如， 就碘 -123( I) 标记的化合物和氟 -18(18F) 标记的化合物而言， 可 以通过静脉内或局部给予约 50-600MBq/60kg 成人体重。可以通过公知方法使所给予的试 剂分布显像。例如， 可以通过 SPECT 装置使碘 -123(123I) 标记的化合物显像， 另外可以通过 18 PET 装置使氟 -18( F) 标记的化合物显像。
通过对生物体给予本发明的淀粉样蛋白检测试剂， 可以使沉积在生物组织例如 脑、 心脏、 肺、 消化道、 血管、 肝、 胰脏、 肾、 关节和骨中的淀粉样蛋白显像， 并且用于使难以活 检采集的生物组织例如脑、 心脏、 肺、 胰脏、 骨和关节中的淀粉样蛋白沉积显像。
实施例 以下， 通过实施例、 比较例和参考例更详细地描述本发明。然而， 以下的例子决不 限制本发明的范围。
实施例 1
在以下实施例中， 用于实验的各化合物的名称如表 1-1 中所定义。
表 1-1
化合物名称 化合物 I-1通用名 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶化合物 I-2 化合物 I-3 化合物 I-4 化合物 I-5 化合物 I-6 化合物 I-7 化合物 I-8 化合物 I-9
2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 6- 溴 -2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[125I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[123I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 6- 溴 -2-[4′ -(3″ -[18F] 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6-[123I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶实施例 I-1 ： 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4 ′ -(3 ″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
向 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜添加 50mL 乙酸乙酯以得到混悬液， 向其中 添加 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合液 中的溶液。然后， 加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却到室温并过滤。减压 浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过添加活性碳进行脱色操作。然后， 过滤浓缩 得到的溶液。得到的粗产物通过硅胶柱色谱法纯化 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1)， 从乙 酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1-1， 步骤 1)。
将 2.15g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 溴 -4 ′ - 羟 基 苯 乙 酮 和 1.74g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 溴吡啶溶解于 50mL 乙腈中。 将所得溶液在油浴中在 105℃下加热 回流 6 小时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减 压干燥。将所得粗结晶混悬在 20mL 水和 20mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中添加约 25mL 饱和碳酸氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀， 用水充分洗涤， 减压干燥， 得到 2.41g( 相当于 8.32mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-1， 步骤 2)。
将充分干燥而除去水分的 290mg( 相当于 1.0mmol) 的 6- 溴 -2-(4 ′ - 羟基苯 基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 10mL 的 N， N- 二甲基甲酰胺中， 向其中添加 413mg( 相当 于 3.0mmol) 的碳酸钾。用 138μL( 相当于 1.5mmol) 的 1- 溴 -3- 氟丙烷补充该混合物， 然后在室温下搅拌 20.5 小时。反应结束后， 将反应溶液倒入水中， 用氯仿萃取 3 次。用饱 和氯化钠溶液洗涤合并的氯仿层， 然后用无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩。通过再循环制备 型 HPLC(HPLC 装置 ： LC-908( 商品名 ； 日本分析工业公司制 ) ； 色谱柱 ： 2 根 JAIGEL 2H( 商 品名 ； 日本分析工业公司制 ) 串联 ； 流动相 ： 氯仿 ) 精制所得粗产物， 得到 302mg( 相当于 0.866mmol) 的 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-1， 步骤 3)。 将 85mg( 相当于 0.24mmol) 的 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 10mL 的二噁烷中， 向其中添加 2mL 三乙胺。然后， 向其中添加 185μL( 相 当于 0.36mmol) 的双 ( 三丁基锡 ) 和 20mg( 催化量 ) 的四 ( 三苯膦 ) 钯。在将反应混合物 在 90℃下搅拌 24 小时后， 减压蒸馏除去溶剂。通过制备型 TLC( 洗脱液 ： 己烷 / 乙酸乙酯 ＝ 6/4) 精制残余物。再通过再循环制备型 HPLC(HPLC 装置 ： LC-908( 商品名 ； 日本分析工 业公司制 ) ； 色谱柱 ： 2 根 JAIGEL 2H( 商品名 ； 日本分析工业公司制 ) 串联 ； 流动相 ： 氯仿 ) 精制所得粗产物， 得到 42mg( 相当于 74.2μmol) 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(3″ - 氟 丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-1， 步骤 4)。
所得 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 的 NMR 测定结果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.01-7.93(m， 1H)， 7.91-7.87(m， 2H)， 7.75-7.74(m， 1H)， 7.63-7.58(m， 1H)， 7.20-7.11(m， 1H)， 7.00-6.95(m， 2H)， 4.67(dt， JHF ＝ 47.0Hz， J ＝ 6.0Hz， 2H)， 4.15(t， J ＝ 6.0Hz， 2H)， 2.20(dquint， JHF ＝ 26.1Hz， J＝ 6.0Hz， 2H)， 1.64-1.47(m， 6H)， 1.39-1.31(m， 6H)， 1.19-1.04(m， 6H)， 0.91(t， J ＝ 7.2Hz， 9H)。
实施例 I-2 ： 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[125I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 合成
向 53μL 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 125 吡啶的甲醇溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中， 加入 100μL 的 1mol/L 盐酸， 11.1MBq 的 [ I] 碘化钠 ( 体积为 20μL) 和 10μL 的 10％ (W/V) 过氧化氢。将该混合液在室温下静置 10 分钟后， 在下述条件下将该溶液进行 HPLC， 以获得 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[125I] 碘咪 唑并 [1， 2-a] 吡啶级分。
HPLC 条件 ：
色谱柱 ： Phenomenex Luna C18( 商 品 名 ； 由 Phenomenex 公 司 制 ； 规格 ： 4.6 x 150mm)
流动相 ： 含 0.1％三氟乙酸的水 / 含 0.1％三氟乙酸的乙腈＝ 80/20 → 0/100(17 分钟， 线性梯度 )
流速 ： 1.0mL/ 分钟
检测器 ： 紫外可见吸光光度计 ( 检测波长 ： 282nm) 和放射性计数器 (Raytest 公司 制； 型号 ： STEFFI)
向该级分中加入 10mL 水。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商标 ) Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收集 125 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然 125 后让 1mL 乙醇通过， 以洗脱 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡 啶。所得化合物的放射性活度是 5.5MBq( 在合成刚刚结束时 )。此外， 在下述条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 96.0％。
TLC 分析条件 ：
TLC 板 ： RP-18F254( 商品名 ； 由默克公司制 ) 流动相 ： 甲醇 / 水＝ 20/1 检测器 ： 生物图像分析仪， BAS-2500( 型号 ： BAS-2500 ； 由富士胶片株式会社制 ) 123 实施例 I-3 ： 2-(4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成 向 70μL 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4 ′ -(3 ″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的甲醇溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中， 加入 100μL 的 1mol/L 盐酸、 260-330MBq 的 [123I] 碘化钠 ( 体积为 30-60μL)、 20μL 的 1mmol/L 碘化钠溶液和 20μL 的 10 ％ (W/V) 过氧化 氢。将该混合物在 50℃下加热 10 分钟后， 在与实施例 I-2 相同的条件下进行 HPLC， 以获得 123 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶级分。
向该级分中加入 10mL 水。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商标 ) Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收集 123 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然 123 后让 1mL 乙醇通过， 以洗脱 2-[4 ′ -(3 ″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。在合成刚刚结束时， 所得化合物的放射性活度是 112-153MBq。此外， 在与实施例 I-2 相同的条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 97.0％。
实施例 I-4 ： 6- 溴 -2-[4 ′ -(3 ″ - 对甲苯磺酰氧基丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中添加 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液中的溶液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 并 从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1-2， 步骤 1)。
将 2.15g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 溴 -4 ′ - 羟 基 苯 乙 酮 和 1.74g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 溴吡啶溶解于 50mL 乙腈中。 将所得溶液在油浴中在 105℃下加热 回流 6 小时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减 压干燥。将所得粗结晶混悬在 20mL 水和 20mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中添加约 25mL 饱和碳酸氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀， 用水充分洗涤， 减压干燥， 得到 2.41g( 相当于 8.32mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-2， 步骤 2)。
将 1.45g( 相当于 5.0mmol) 充分干燥除去水分的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑 并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 50mL 的 N， N- 二甲基甲酰胺中， 向其中添加 2.07g( 相当于 15.0mmol) 的碳酸钾。 用 680μL( 相当于 7.5mmol) 的 3- 溴 -1- 丙醇补充该混合物， 然后在室温下搅拌 17 小时。反应结束后， 将反应溶液倒入水中， 用氯仿萃取 3 次。用饱和氯化钠溶液洗涤合并 的氯仿层， 用无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩。从甲醇中重结晶所得粗产物， 得到 1.28g( 相当 于 3.67mmol) 的 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 羟基丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-2， 步骤 3)。
将 177mg( 相当于 0.5mmol) 的 6- 溴 -2-[4 ′ -(3 ″ - 羟基丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑 并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 10mL 的吡啶中， 在冰浴下加入 197mg( 相当于 1.0mmol) 的对甲苯 磺酰氯。在将反应溶液在室温下搅拌 16 小时后， 将其倒入水中， 用氯仿萃取 3 次。用饱 和氯化钠溶液洗涤合并的氯仿层， 用无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩。通过再循环制备型 HPLC(HPLC 装置 ： LC-908( 商品名 ； 日本分析工业公司制 ) ； 柱： 2 根 JAIGEL 2H( 商品名 ； 日 本分析工业公司制 ) 串联 ； 流动相 ： 氯仿 ) 精制所得粗产物， 得到 87mg( 相当于 0.17mmol) 的 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 对甲苯磺酰氧基丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-2， 步 骤 4)。
所得 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 对甲苯磺酰氧基丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 的 NMR 测定结果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.26-8.24(m， 1H)， 7.84-7.80(m， 2H)， 7.77-7.74(m， 2H)， 7.74(s， 1H)， 7.50(d， J ＝ 9.7Hz， 1H)， 7.26-7.23(m， 2H)， 7.21(dd， J ＝ 9.7， 2.0Hz， 1H)， 6.84-6.80(m， 2H)， 4.26(t， J ＝ 6.0Hz， 2H)， 3.98(t， J ＝ 6.0Hz， 2H)， 2.35(s， 3H)， 2.13( 五重峰， J ＝ 6.0Hz， 2H)。 13
C-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 125MHz) ： δ158.67， 146.53， 144.79， 144.08， 132.77， 129.80， 127.87， 127.81， 127.28， 126.20， 125.43， 117.87， 114.63， 107.40， 106.76， 66.97， 63.08， 28.85， 21.60。
实施例 I-5 ： 6- 溴 -2-[4′ -(3″ -[18F] 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 合成
让包含 [18F] 氟离子的 H218O( 放射性活度 ： 4210MBq， 在合成开始时校正的值 ) 通 过 Sep-Pak Light QMA( 商品名 ； 由 Japan Waters K.K. 公司制 )， 以吸附和收集 [18F] 氟 离子。然后， 让碳酸钾水溶液 (66.7mmol/L， 0.3mL) 和 20mg( 相当于 53.2μmol)Kryptofix 222( 商品名 ； 由默克公司制 ) 的 1.5mL 乙腈溶液通过该柱， 以洗脱 [18F] 氟离子。
在氦气流下将洗脱液加热至 100℃以蒸发水， 用乙腈 (0.3mL×2) 补充， 共沸蒸干。 向其中添加 5mg( 相当于 10.0μmol) 的上述实施例 I-4 合成的 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 对甲 苯磺酰氧基丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 1.0mL 二甲基甲酰胺溶液， 在 130℃下加 热 10 分钟。 在将反应溶液冷却至 30℃后， 每次用醚 (3.5mL×3) 补充反应溶液， 再让其通过 Sep-Pak Plus Silica( 商品名 ； Japan Waters K.K.)。将已经通过的醚溶液在氦气流下加 热至 60℃并浓缩。用 2mL 的甲醇 / 水 / 三乙胺＝ 800 ∶ 200 ∶ 1 的混合液稀释该浓缩液。
通过 HPLC( 柱 ： Capcell Pak C18 MG(15mm i.d.x 250mm， 由株式会社资生堂制 ) ； 洗脱液 ： 甲醇 / 水 / 三乙胺＝ 700/300/1) 精制所得溶液。用 100mL 水稀释包含目标化合物 的洗脱液级分， 然后让其通过 Sep-Pak Plus C18( 商品名 ； 由 Japan Waters K.K. 公司制 )， 以吸附和收集目标化合物。然后让 20mL 水通过该柱进行洗涤。然后让 4mL 乙醇通过该柱， 以洗脱出 6- 溴 -2-[4′ -(3″ -[18F] 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的乙醇溶液。 所得放射性活度是 769MBq( 合成开始后 107 分钟 )。在下述条件下进行 TLC 分析， 结果， 其 放射化学纯度是 95.9％。
TLC 分析条件 ：
TLC 板 ： 硅胶 60 F254( 商品名 ； 由默克公司制 )流动相 ： 氯仿 / 甲醇 / 三乙胺＝ 500/10/0.5
检测器 ： Rita Star( 商品名 ； 由 Raytest 公司制 )
实施例 I-6 ： 6- 溴 -2-[4 ′ -(2 ″ - 对甲苯磺酰氧基乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中添加 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液中的溶液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 并 从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1-3， 步骤 1)。
将 2.15g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 溴 -4 ′ - 羟 基 苯 乙 酮 和 1.74g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 溴吡啶溶解于 50mL 乙腈中。 将所得溶液在油浴中在 105℃下加热 回流 6 小时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减 压干燥。将所得粗结晶混悬在 20mL 水和 20mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中添加约 25mL 饱和碳酸氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀， 用水充分洗涤， 减压干燥， 得到 2.41g( 相当于 8.32mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-3， 步骤 2)。
将 621mg( 相当于 10.0mmol) 的乙二醇溶解于 100mL 的二氯甲烷中。在冰浴下， 向该溶液中加入 3.49g( 相当于 15.0mmol) 的氧化银， 350mg( 相当于 2.1mmol) 的碘化钾和 2.10g( 相当于 11.0mmol) 的对甲苯磺酰氯。将所得混合物在 0℃下搅拌 2 小时。从反应混 合物中滤出不溶物， 再用乙酸乙酯洗涤不溶物。将洗涤液与滤液合并， 浓缩该混合物。通过 快速硅胶柱色谱 ( 洗脱液 ： 己烷 / 乙酸乙酯＝ 1/1) 精制所得粗产物， 得到 643mg( 相当于 2.97mmol) 的对甲苯磺酸 2- 羟基乙酯 ( 图 1-3， 步骤 3)。
向 639mg( 相当于 2.95mmol) 对甲苯磺酸 2- 羟基乙酯的 10mL 四氢呋喃溶液中， 加 入 388mg( 相当于 1.34mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶和 780mg( 相 当于 2.97mmol) 的三苯膦。再向其中添加 6mL 的 N， N- 二甲基甲酰胺， 以完全溶解内容物。 向该反应混合物中加入 0.58mL( 相当于 2.95mmol) 的偶氮二甲酸二异丙酯。在将反应混 合物在室温下搅拌 17 小时后， 浓缩反应溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱液 ： 己烷 / 乙酸 乙酯＝ 65/35) 精制所得粗产物。从包含目标化合物的级分中滤出氯仿中的不溶物质。此 外， 通过再循环制备型 HPLC(HPLC 装置 ： LC-908( 商品名 ； 日本分析工业公司制 ) ； 色谱柱 ： 2 根 JAIGEL2H( 商品名 ； 日本分析工业公司制 ) 串联 ； 流动相 ： 氯仿 ) 精制所得粗产物， 得到 79.7mg( 相当于 164μmmol) 的 6- 溴 -2-[4′ -(2″ - 对甲苯磺酰氧基乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑 并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-3， 步骤 4)。
所得 6- 溴 -2-[4′ -(2″ - 对甲苯磺酰氧基乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 的 NMR 测定结果如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 基 甲 酰 胺 -d7， 共振频率： 500MHz) ： δ8.73-8.71(m， 1H)， 8.19-8.17(m， 1H)， 7.81-7.77(m， 2H)， 7.73-7.70(m， 2H)， 7.41-7.38(m， 1H)， 7.39-7.36(m，2H)， 7.20(dd， J ＝ 9.5， 1.9Hz)， 6.85-6.81(m， 2H)， 4.34-4.31(m， 2H)， 4.19-4.15(m， 2H)。 13
C-NMR( 溶剂 ： 二甲基甲酰胺 -d7， 共振频率 ： 125MHz) ： δ158.32， 145.91， 145.24， 143.84， 133.15， 130.18， 127.83， 127.54， 127.19， 127.15， 126.90， 117.56， 114.86， 108.73， 105.80， 69.28， 65.88， 20.69。
参考例 I-1 ： 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 非放 射性氟化形式 ) 的合成
作为评价本发明化合物与淀粉样蛋白的亲和性、 脂溶性和诱变性的样品， 合成非 放射性氟化形式的 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中添加 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液中的溶液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 并 从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1-4， 步骤 1)。
将 2.15g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 溴 -4 ′ - 羟 基 苯 乙 酮 和 1.74g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 溴吡啶溶解于 50mL 乙腈中。 将所得溶液在油浴中在 105℃下加热 回流 6 小时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减 压干燥。将所得粗结晶混悬在 20mL 水和 20mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中添加约 25mL 饱和碳酸氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀， 用水充分洗涤， 减压干燥， 得到 2.41g( 相当于 8.32mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-4， 步骤 2)。
将 290mg( 相当于 1.0mmol) 充分干燥除去水分的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑 并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 10mL 的 N， N- 二甲基甲酰胺中， 向其中添加 413mg( 相当于 3.0mmol) 的碳酸钾。用 138μL( 相当于 1.5mmol) 的 1- 溴 -3- 氟丙烷补充该混合物， 然后在室温 下搅拌 20.5 小时。反应结束后， 将反应溶液倒入水中， 用氯仿萃取 3 次。用饱和氯化钠 溶液洗涤合并的氯仿层， 用无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩。通过再循环制备型 HPLC(HPLC 装置 ： LC-908( 商品名 ； 日本分析工业公司制 ) ； 柱： 2 根 JAIGEL 2H( 商品名 ； 日本分析 工业公司制 ) 串联 ； 流动相 ： 氯仿 ) 精制所得粗产物， 得到 302mg( 相当于 0.866mmol) 的 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-4， 步骤 3)。
所得 6- 溴 -2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结 果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶 剂 ： 氯 仿 -d1， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.23(dd， J ＝ 1.9， 0.2Hz， 1H)， 7.88-7.83(m， 2H)， 7.51-7.48(m， 1H)， 8.21(dd， J ＝ 9.5， 1.9Hz， 1H)， 6.99-6.95(m， 2H)， 2 3 4.67(dt， JHF ＝ 47.1Hz， J ＝ 5.9Hz， 2H)， 4.15(t， J ＝ 5.9Hz， 2H)， 2.19(dquint， JHF ＝ 25.9Hz， J ＝ 5.9Hz， 2H)。 13
C-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 125MHz) ： δ159.01， 146.61， 144.07， 127.81， 1 127.38 ， 126.15 ， 125.41 ， 117.87 ， 114.78 ， 107.41 ， 106.71 ， 80.71(d ，J CF ＝ 164.6Hz) ，3 2 63.59(d， JCF ＝ 5.3Hz)， 30.43(d， JCF ＝ 19.7Hz)。 19 2 3
F-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 470MHz) ： δ-222.07(dd， JHF ＝ 47.1Hz， JHF ＝ 25.9Hz)。
参考例 I-2 ： 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 非放 射性氟化形式 ) 的合成
作为评价本发明化合物与淀粉样蛋白的亲和性、 脂溶性和诱变性的样品， 合成非 放射性氟化形式的 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中添加 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液中的溶液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 并 从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1-5， 步骤 1)。
将 441mg( 相当于 2.0mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮和 449mg( 相当于 2.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 碘吡啶溶解于 15mL 乙腈中。将所得溶液在油浴中在 110℃下加热回流 5 小 时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。 将所得粗结晶混悬在 10mL 水和 10mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中添加约 10mL 饱和碳酸 氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀， 用水充 分洗涤， 减压干燥， 得到 526mg( 相当于 1.56mmol) 的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1，2-a] 吡啶 ( 图 1-5， 步骤 2)。
将 673mg( 相当于 2.0mmol) 充分干燥除去水分的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑 并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 25mL 的 N， N- 二甲基甲酰胺中， 向其中添加 831mg( 相当于 6.0mmol) 的碳酸钾。用 275μL( 相当于 3.0mmol) 的 1- 溴 -3- 氟丙烷补充该混合物， 然后在室温下 搅拌 24 小时。反应结束后， 将反应溶液倒入水中， 用氯仿萃取 3 次。用水和饱和氯化钠溶 液洗涤合并的氯仿层， 用无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩。 将所得粗产物通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱液 ： 氯仿 ) 精制， 再通过再循环制备型 HPLC(HPLC 装置 ： LC-908( 商品名 ； 日本分析工 业公司制 ) ； 柱： 2 根 JAIGEL 2H( 商品名 ； 日本分析工业公司制 ) 串联 ； 流动相 ： 氯仿 ) 精 制， 得到 349mg( 相当于 0.881mmol) 的 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-5， 步骤 3)。
所得 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结 果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.37-8.35(m， 1H)， 7.88-7.84(m， 2H)， 7.72(s， 1H)， 7.42-7.39(m， 1H)， 7.32(dd， J ＝ 9.4， 1.6Hz， 1H)， 6.99-6.96(m， 2H)， 2 3 4.67(dt，JHF ＝ 47.0Hz， J ＝ 6.0Hz， 2H)， 4.15(t， J ＝ 6.0Hz， 2H)， 2.20(dquint， JHF ＝ 25.9Hz， J ＝ 6.0Hz， 2H)。 13
C-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 125MHz) ： δ159.01， 146.23， 144.16， 132.36， 1 130.28 ， 127.42 ， 126.05 ， 118.31 ， 114.77 ， 106.90 ， 80.72(d ，J CF ＝ 164.6Hz) ， 74.80 ，3 2 63.57(d， JCF ＝ 5.3Hz)， 30.42(d， JCF ＝ 20.2Hz)。 19 2 3
F-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 470MHz) ： δ-222.09(dd， JHF ＝ 47.0Hz， JHF ＝ 25.9Hz)。
参考例 I-3 ： 6- 溴 -2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 非放 射性氟化形式 ) 的合成
作为评价本发明的化合物与淀粉样蛋白的亲和性、 脂溶性和诱变性的样品， 合成 非放射性氟化形式的 6- 溴 -2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中添加 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液中的溶液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 并 从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1-6， 步骤 1)。
将 2.15g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 溴 -4 ′ - 羟 基 苯 乙 酮 和 1.74g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 溴吡啶溶解于 50mL 乙腈中。 将所得溶液在油浴中在 105℃下加热 回流 6 小时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减 压干燥。将所得粗结晶混悬在 20mL 水和 20mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中添加约 25mL 饱和碳酸氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀， 用水充分洗涤， 减压干燥， 得到 2.41g( 相当于 8.32mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-6， 步骤 2)。
将 578mg( 相当于 2.0mmol) 充分干燥除去水分的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑 并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 20mL 的 N， N- 二甲基甲酰胺中， 向其中添加 830mg( 相当于 6.0mmol) 的碳酸钾。用 510μL( 相当于 3.0mmol) 的对甲苯磺酸 2- 氟乙基酯补充该混合物， 然后在 室温下搅拌 44.5 小时。反应结束后， 将反应溶液倒入水中， 用氯仿萃取 3 次。用水和饱和 氯化钠溶液洗涤合并的氯仿层， 用无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩。将所得粗产物通过快速 硅胶柱色谱 ( 洗脱液 ： 氯仿 / 甲醇＝ 100/1) 精制、 再通过再循环制备型 HPLC(HPLC 装置 ： LC-908( 商品名 ； 日本分析工业公司制 ) ； 柱： 2 根 JAIGEL 2H( 商品名 ； 日本分析工业公司 制 ) 串联 ； 流动相 ： 氯仿 ) 精制、 进而通过制备型 TLC( 洗脱液 ： 氯仿 / 甲醇＝ 50 ∶ 1) 精制， 得到 446mg( 相当于 1.33mmol) 的 6- 溴 -2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-6， 步骤 3)。
所得 6- 溴 -2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结 果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.23-8.21(m， 1H)， 7.87-7.84(m， 1H)， 7.72(s， 1H)， 7.51-7.47(m， 1H)， 7.20(dd， J ＝ 9.5， 1.9Hz， 1H)， 7.01-6.97(m， 2H)， 4.84-4.71(m， 2H)， 4.30-4.21(m， 2H)。 13
C-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 125MHz) ： δ158.62， 146.46， 144.06， 127.85， 1 127.41 ， 126.58 ， 125.42 ， 117.87 ， 114.91 ， 107.49 ， 106.74 ， 81.86(d ，J CF ＝ 170.8Hz) ，2 67.15(d， JCF ＝ 20.2Hz)。 19 2 3
F-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 470MHz) ： δ-223.80(dd， JHF ＝ 47.4Hz， JHF ＝ 27.6Hz)。
参考例 I-4 ： 2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 非放 射性氟化形式 ) 的合成
作为评价本发明的化合物与淀粉样蛋白的亲和性、 脂溶性和诱变性的样品， 合成 非放射性氟化形式的 2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中添加 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液中的溶液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 并从 乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmo l) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1-7， 步骤 1)。
将 441mg( 相当于 2.0mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮和 449mg( 相当于 2.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 碘吡啶溶解于 15mL 乙腈中。将所得溶液在油浴中在 110℃下加热回流 5 小 时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。 将所得粗结晶混悬在 10mL 水和 10mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中添加约 10mL 饱和碳酸 氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀， 用水充 分洗涤， 减压干燥， 得到 526mg( 相当于 1.56mmol) 的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-7， 步骤 2)。
将 368mg( 相当于 1.1mmol) 充分干燥除去水分的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑 并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 15mL 的 N， N- 二甲基甲酰胺中， 向其中添加 453mg( 相当于 3.3mmol) 的碳酸钾。 用 280μL( 相当于 1.6mmol) 的对甲苯磺酸 2- 氟乙基酯补充该混合物， 然后在室 温下搅拌 22 小时。 反应结束后， 将反应溶液倒入水中， 用氯仿萃取 3 次。 用水和饱和氯化钠 溶液洗涤合并的氯仿层， 用无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩。 所得粗产物通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱液 ： 己烷 / 乙酸乙酯＝ 1/1)、 再通过再循环制备型 HPLC(HPLC 装置 ： LC-908( 商品名 ； 日本分析工业公司制 ) ； 柱： 2 根 JAIGEL 2H( 商品名 ； 日本分析工业公司制 ) 串联 ； 流动相 ： 氯仿 ) 精制， 得到 222mg( 相当于 0.580mmol) 的 2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪 唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-7， 步骤 3)。
所得 2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结 果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.35-8.33(m， 1H)， 7.88-7.84(m， 2H)， 7.70(s， 1H)， 7.39(d， J ＝ 9.4Hz， 1H)， 7.31(dd， J ＝ 9.4， 1.8Hz， 1H)， 7.01-6.97(m， 2H)， 4.84-4.71(m， 2H)， 4.30-4.22(m， 2H)。 13
C-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 125MHz) ： δ158.62， 146.08， 144.16， 132.38， 2 130.30 ， 127.44 ， 126.52 ， 118.30 ， 114.91 ， 106.99 ， 81.86(d ，J CF ＝ 170.8Hz) ， 74.82 ， 3 67.15(d， JCF ＝ 20.6Hz)。24101909657 A CN 101909663
19说明书21/38 页2 3 F-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1， 共振频率 ： 470MHz) ： δ-223.74(dd， JHF ＝ 47.4Hz， JHF ＝27.7Hz)。
参考例 I-5 ： 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶 ( 非放 射性氟化形式 ) 的合成
作为评价本发明的化合物与淀粉样蛋白的亲和性、 脂溶性和诱变性的样品， 合成 非放射性氟化形式的 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中添加 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液中的溶液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 再 从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1-8， 步骤 1)。
将 646mg( 相当于 3.0mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮和 668mg( 相当于 3.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 碘吡啶溶解于 20mL 乙腈中。将所得溶液在油浴中在 110℃下加热回流 8 小 时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。 将所得粗结晶混悬在 10mL 水和 10mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中添加约 15mL 饱和碳酸 氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 3 分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀， 用水充 分洗涤， 减压干燥， 得到 737mg( 相当于 2.19mmol) 的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶 ( 图 1-8， 步骤 2)。
将 339mg( 相当于 1.0mmol) 充分干燥除去水分的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑 并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 20mL 的 N， N- 二甲基甲酰胺中， 向其中添加 414mg( 相当于 3.0mmol) 的碳酸钾。用 138μL( 相当于 1.5mmol) 的 1- 溴 -3- 氟丙烷补充该混合物， 然后在室温下 搅拌 22 小时。反应结束后， 将反应溶液倒入水中， 用氯仿萃取 3 次。用饱和氯化钠溶液洗 涤合并的氯仿层， 用无水硫酸钠干燥， 过滤并浓缩。将所得粗产物在 N， N- 二甲基甲酰胺中 重结晶， 得到 236mg( 相当于 0.594mmo1) 的 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶 ( 图 1-8， 步骤 3)。
所得 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 嘧啶的 NMR 测定结 果 ( 内标物 ： 二甲亚砜 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 亚 砜 -d6， 共振频率 ： 500MHz) ： δ9.27(d， J ＝ 2.3Hz， 1H)， 2 8.55(d， J ＝ 2.3Hz， 1H)， 8.15(s， 1H)， 7.94-7.90(m， 2H)， 7.06-7.02(m， 2H)， 4.62(dt， JHF ＝ 3 47.2Hz， J ＝ 6.1， 2H)， 4.14(t， J ＝ 6.1Hz， 2H)， 2.13(dquint， JHF ＝ 25.5Hz， J ＝ 6.1Hz， 2H)。 13
C-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 亚 砜 -d6， 共振频率 ： 125MHz) ： δ159.16， 154.12， 146.54， 1 146.26 ， 139.00 ， 127.60 ， 126.06 ， 115.21 ， 106.52 ， 81.15(d ，J CF ＝ 161.7Hz) ， 74.43 ， 3 2 64.07(d， JCF ＝ 5.8Hz)， 30.13(d， JCF ＝ 19.7Hz)。 19 2
F-NMR( 溶剂 ： 二甲亚砜 -d6， 共振频率 ： 470MHz) ： δ-220.13(tt， JHF ＝ 47.2Hz， 3 JHF ＝ 25.5Hz)。
参考例 I-6 ： [125I]-IMPY 的合成25101909657 A CN 101909663
125说明书22/38 页根据下述步骤来合成在用于评价与淀粉样蛋白结合的比较例中使用的 [ I]-IMPY。
根据在文献 (Zhi-Ping Zhuang 等人， J.Med.Chem， 2003， 46， p.237-243) 中所述的 方法， 合成 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶， 并溶于甲醇 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中。向 53μL 所得溶液中， 加入 75μL 的 1mol/L 盐酸， 20μL 125 的 13.5MBq 的 [ I] 碘化钠和 10μL 的 10％ (W/V) 过氧化氢。在将该混合液在 50℃下静 置 10 分钟后， 将该溶液在与实施例 I-2 相同的条件下进行 HPLC， 以得到 [125I]-IMPY 级分。
向该级分中加入 10mL 水。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商标 ) Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收集 125 125 [ I]-IMPY。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 1mL 乙醇通过， 以洗脱 [ I]-IMPY。在合成刚刚结 束时， 所得化合物的放射性活度是 2.6MBq。 此外， 在与实施例 I-2 相同的条件下进行 TLC 分 析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 98.0％。
参考例 I-7 ： [123I]-IMPY 的合成
根 据 下 述 步 骤 来 合 成 在 用 于 评 价 logP 辛 醇 和 脑 中 蓄 积 性 的 比 较 例 中 使 用 的 123 [ I]-IMPY。
根据在文献 (Zhi-Ping Zhuang 等人， J.Med.Chem， 2003， 46， p.237-243) 中所述的 方法， 合成 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶， 并 溶于甲醇 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中。向 53μL 所得溶液中， 加入 100μL 的 1mol/L 盐酸， 20-50μL 123 的 190-240MBq 的 [ I] 碘化钠、 10μL 的 1mmol/L 碘化钠溶液和 10μL 的 10％ (W/V) 过氧 化氢。在将混合液在 50℃下静置 10 分钟后， 将该溶液在与实施例 I-2 相同的条件下进行 123 HPLC， 以得到 [ I]-IMPY 级分。
向该级分中加入 10mL 水。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商标 ) Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收集 123 123 [ I]-IMPY。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 1mL 乙醇通过， 以洗脱 [ I]-IMPY。在合成刚刚结 束时， 所得化合物的放射性活度是 47-56MBq。此外， 在与实施例 I-2 相同的条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 98.0％。
参考例 I-8 ： 2-(4′ - 羟基苯基 )-6-[125I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
为 了 制 作 用 于 计 算 logPHPLC 的 算 式， 根 据 下 述 步 骤 合 成 2-(4 ′ - 羟 基 苯 125 基 )-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中添加 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液中的溶液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 并 从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1-9， 步骤 1)。
将 2.15g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 溴 -4 ′ - 羟 基 苯 乙 酮 和 1.74g( 相 当 于 10.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 溴吡啶溶解于 50mL 乙腈中。 将所得溶液在油浴中在 105℃下加热 回流 6 小时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。将所得粗结晶混悬在 20mL 水和 20mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中添加约 25mL 饱和碳酸氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀， 用水充分洗涤， 减压干燥， 得到 2.41g( 相当于 8.32mmol) 的 6- 溴 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-9， 步骤 2)。
将 138mg( 相当于 0.476mmol) 的 6- 溴 -2-(4 ′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡 啶溶解于 20mL 的二噁烷中， 向其中添加 2mL 三乙胺。然后， 向其中添加 360μL( 相当于 0.713mmol) 的双 ( 三丁基锡 ) 和 20mg( 催化量 ) 的四 ( 三苯膦 ) 钯。在将反应混合物在 90℃下搅拌 22 小时后， 减压蒸馏除去溶剂。通过制备型 TLC( 洗脱液 ： 己烷 / 乙酸乙酯＝ 1/4) 精制残余物。进而， 通过再循环制备型 HPLC(HPLC 装置 ： LC-908( 商品名 ； 日本分析工 业公司制 ) ； 柱： 2 根 JAIGEL 2H( 商品名 ； 日本分析工业公司制 ) 串联 ； 流动相 ： 氯仿 ) 精制 所得粗产物， 得到 47mg( 相当于 94.9μmol) 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪 唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-9， 步骤 3)。
向 53μL 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-(4′ - 羟基苯基 ) 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的甲 醇溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中， 加入 75μL 的 1mol/L 盐酸， 40μL 的 136MBq 的 [125I] 碘化钠和 10μL 的 10％ (W/V) 过氧化氢。在将该混合液在 50℃下静置 10 分钟后， 将该溶液在与实施 125 例 I-2 相同的条件下进行 HPLC， 以得到 2-(4′ - 羟基苯基 )-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡 啶级分 ( 图 1-9， 步骤 4)。
向该级分中加入 10mL 水。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商标 ) Light C18 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附收集 125 2-(4′ - 羟基苯基 )-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然后让 1mL 乙 125 醇通过， 以洗脱 2-(4′ - 羟基苯基 )-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。在合成刚刚结束时， 所得化合物的放射性活度是 37.5MBq。此外， 在与实施例 I-2 相同的条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 96.5％。
参考例 I-9 ： 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
将 50mL 乙酸乙酯加入到 28.17g( 相当于 126mmol) 的溴化铜中获得混悬液， 向其 中添加 8.18g( 相当于 60.0mmol) 的 4′ - 羟基苯乙酮在 50mL 乙酸乙酯和 50mL 氯仿的混合 液中的溶液。然后加热回流所得混合物。5 小时后， 将反应混合物冷却至室温， 并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯， 通过加入活性炭进行脱色操作。然后， 过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱 ( 洗脱溶剂 ： 氯仿 / 甲醇＝ 20/1) 精制所得粗产物， 并 从乙酸乙酯 / 石油醚中重结晶， 得到 7.25g( 相当于 33.7mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮 ( 图 1-10， 步骤 1)。
将 441mg( 相当于 2.0mmol) 的 2- 溴 -4′ - 羟基苯乙酮和 449mg( 相当于 2.0mmol) 的 2- 氨基 -5- 溴吡啶溶解于 15mL 乙腈中。将所得溶液在油浴中在 110℃下加热回流 5 小 时。反应结束后， 将反应混合物冷却至室温， 过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。 将所得粗结晶混悬在 10mL 水和 10mL 甲醇的混合液中。然后， 向其中添加约 10mL 饱和碳酸 氢钠溶液， 用超声洗涤器将混合物超声处理 5 分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀， 用水充 分洗涤， 减压干燥， 得到 526mg( 相当于 1.56mmol) 的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-10， 步骤 2)。
所得 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的 NMR 测定结果 ( 内标物 ：二甲亚砜 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 亚 砜 -d6， 共振频率 ： 500MHz) ： δ8.86-8.84(m， 1H)， 8.14(s， 1H)， 7.78-7.74(m， 2H)， 7.40-7.35(m， 2H)， 6.86-6.82(m， 2H)。 13
C-NMR( 溶 剂 ： 二 甲 亚 砜 -d6， 共振频率 ： 125MHz) ： δ158.08， 145.87， 143.87， 132.48， 131.72， 127.67， 124.99， 118.14， 116.14， 108.02， 75.85。
实施例 I-7 和比较例 I-1 ： 与淀粉样蛋白结合性的测定
通过下述的体外结合试验评价本发明化合物与淀粉样蛋白的亲和性。
(1) 将 Aβ1-40( 肽研究所制 ) 溶于磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)， 在 37℃下振荡 72 小时， 以获得 1mg/mL 的凝集 Aβ( 以下， 在本实施例中， 称作淀粉样蛋白 ) 的混悬液 ( 以下， 在本 实施例中， 称作淀粉样蛋白混悬液 )。
(2) 根 据 文 献 (Naiki ， H. 等 人， Laboratory Investigation ， 74 ， p.374-383(1996)) 所述的方法， 基于使用硫磺素 T( 由 Fluka 公司制 ) 的荧光分光光度法， 进行该淀粉样蛋白混悬液的定性实验， 以证实在 (1) 中获得的凝集 Aβ 是淀粉样蛋白 ( 测 定条件 ： 激发波长 446nm， 荧光波长 490nm)。
(3) 调 制 由 实 施 例 I-2 所 述 的 方 法 合 成 的 化 合 物 I-6 的 乙 醇 溶 液 ( 放 射 性 浓度 ： 37MBq/mL)， 用包含 0.1 ％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 稀释， 以制备 2-[4′ -(3″ - 氟丙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的总量相当于 2nmol/L 浓度的 溶液。
(4) 向 96 孔微量培养板的各孔中加入 50μL 的如上述 (3) 制备的溶液 ( 最终 浓度为 400pM) 和将淀粉样蛋白混悬液溶解于包含 0.1 ％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 而得到的溶液 ( 可以根据样品溶液中的淀粉样蛋白浓度来调节淀粉样蛋白的浓 度 )50μL， 然后加入 150μL 的相同缓冲液， 以制备最终浓度为 2.5， 12.5， 25， 62.5， 125， 250， 625 和 1000nmol/L 的淀粉样蛋白溶液。
(5) 将该微量培养板以指定速度 (400rpm) 在 22℃下振荡 3 小时。然后让各孔的 混合液通过玻璃纤维过滤器 ( 商品名 ； MulutiscreenTM-FC， 由 Millipore 制 ) 过滤， 以从游 离的化合物 I-6 中分离与淀粉样蛋白结合的化合物 I-6。
(6) 用包含 0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (0.5mL×5 次 ) 洗涤过滤该混合 液后的玻璃纤维过滤器， 然后用 Autowell Gamma 系统 ( 由 Aloka 公司制， 型号 ： ARC-301B) 测定该玻璃纤维过滤器的放射性。
(7) 由 (6) 的测定结果计算与淀粉样蛋白结合的化合物 I-6 的量和淀粉样蛋白 的添加量之间的关系。用添加上述 (4) 中的化合物 I-2( 非 RI 标记化合物 ) 至浓度为 100nM( 最终浓度 ) 的样品来确定非特异性结合 ( 实施例 I-7)。
(8) 使用在上述参考例 I-6 中合成的 [125I]-IMPY， 进行与上述 (2) ～ (6) 的相同 操作， 来获得对照数据 ( 比较例 I-1)。
图 1-11 中显示的是在样品溶液中淀粉样蛋白的浓度与在上述 (6) 中在玻璃纤维 过滤器上测定的放射性计数之间的关系。 玻璃纤维过滤器上的放射性随淀粉样蛋白的浓度 ( 添加量 ) 成比例地增加 ( 实施例 I-7)。在本实验的条件下， 淀粉样蛋白和与淀粉样蛋白 结合的化合物保持在玻璃纤维中。因此， 玻璃纤维上的放射性计数是反映与淀粉样蛋白结合的化合物量的值。 描绘相对于淀粉样蛋白浓度的放射性计数的图的斜率是一个可以表示 化合物与淀粉样蛋白结合的强度的指标的值。由于化合物 I-6 在玻璃纤维过滤器上的放射 性计数值随着淀粉样蛋白浓度的提高而增加， 启示化合物 I-6 是一种具有与淀粉样蛋白结 合的性质的化合物。化合物 I-6 的直线斜率大于相同图中 [125I]-IMPY 的斜率， 因此它启示 125 125 化合物 I-6 与淀粉样蛋白的亲和性大于 [ I]-IMPY， 已知 [ I]-IMPY 显示了与淀粉样蛋白 的强亲和性。
上述结果表明， 化合物 I-6 具有很强的与淀粉样蛋白结合的能力。
实施例 I-8 ～ I-12， 比较例 I-2 ～ I-6 ： 与淀粉样蛋白亲和性的测定
通过以下体外结合试验来检验本发明化合物对淀粉样蛋白的亲和性。
(1) 将 Aβ1-40( 肽研究所制 ) 溶解于磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)， 在 37℃振荡 62-72 小 时， 得到 1mg/mL 的凝集 Aβ( 以下， 在本实施例中， 称作淀粉样蛋白 ) 的混悬液 ( 以下， 在本 实施例中， 称作淀粉样蛋白混悬液 )。
(2) 根 据 文 献 (Naiki， H.， 等 人， Laboratory Investigation 74， p.374-383(1996)) 中所述的方法， 通过使用硫磺素 T( 由 Fluka 制 ) 的荧光分光光度法， 对 淀粉样蛋白混悬液进行定性实验， 以证实在 (1) 中得到的凝集的 Aβ 是淀粉样蛋白 ( 测定 条件 ： 激发波长为 446nm， 荧光波长为 490nm)。
(3) 根 据 文 献 (Wang， Y.，等 人， J.Labeled CompoundsRadiopharmaceut.44， S239(2001)) 中 所 述 的 方 法，从 标 记 前 体 2-(4 ′ - 氨 基 苯 基 ) 苯 并 噻 唑 制 备 [125I]2-(3′ - 碘 -4′ - 氨基苯基 ) 苯并噻唑 ( 以下称作 [125I]3′ -I-BTA-0)， 将其溶解于 乙醇中。将刚果红、 硫磺素 T 和 6- 甲基 -2-[4′ -(N， N- 二甲基氨基 ) 苯基 ] 苯并噻唑 ( 以 下称作 6-Me-BTA-2)， 直接以市售试剂的形式称重并使用。
(4) 分别根据文献 (Wang， Y. 等人， J.Labelled CompoundsRadiopharmaCeut.44， S239(2001)) 和文献 (Zhuang， Z.P. 等人， J.Med.Chem.46， 237(2003)) 中所述的方法来合成 2-(3′ - 碘 -4′ - 氨基苯基 ) 苯并噻唑 ( 以下称作 3′ -I-BTA-0) 和 IMPY。
(5) 配制将 [125I]3′ -I-BTA-0、 各评价化合物和淀粉样蛋白溶解于包含 0.1％牛 血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中、 并使它们的最终浓度如表 1-2 所示的样品。将所 得样品填充在 96 孔微量培养板的各孔中 ( 体积约 0.3mL)。
表 1-2 ： 在样品溶液中各化合物的最终浓度
(6) 将填充有样品溶液的微量培养板以指定速度 (400rpm) 在 22℃下振荡 3 小时。 然后让各样品溶液通过玻璃纤维过滤器 ( 商品名 ； MulutiscreenTM-FC， Millipore 公司制 ) 125 125 过滤， 以从游离的 [ I]3′ -I-BTA-0 中分离出与淀粉样蛋白结合的 [ I]3′ -I-BTA-0。
(7) 将用于过滤各样品溶液的玻璃纤维过滤器用含有 0.1％牛血清白蛋白的磷酸 盐缓冲液 (pH7.4) 洗涤 (0.5mL×5 次 )， 然后用 Autowell Gamma 系统 ( 由 Aloka 公司制， 型 号： ARC-301B) 测定该玻璃纤维过滤器的放射性， 将各样溶液的放射性水平用于计算抑制 率 ( 以下， A 表示各评价化合物的浓度为零 (0) 的样品的放射性水平， B 表示各评价化合物 的浓度为 0.001nmo l/L 以上的样品的放射性水平 )。
(8) 另外， 制备包含 15μmol/L 的 6-Me-BTA-2， 400pmol/L 的 [125I]3′ -I-BTA-0 和 1μmol/L 的 Aβ1-40 的溶液， 进行与上述 (6) 和 (7) 同样的操作， 来测定放射性水平。将所 测定的放射性水平定义为背景放射性水平， 用于计算抑制率 ( 以下称作 BG)。
(9) 使用在上述 (7) 和 (8) 中所测定的放射性水平， 通过下述式 (1-1) 来求出抑制 率。
绘制相对于所评价化合物浓度的对数的由所获得的抑制率通过概率单位变换的 值的图， 以通过最小二乘法获得近似的直线。 使用这条线， 评价当放射性水平是不含各评价 化合物样品的一半时的各评价化合物的浓度， 将其定义为各化合物的 50％抑制浓度 ( 以下 称作 IC50％值 )。使用该值作为指标， 评价各评价化合物与淀粉样蛋白 ( 凝集 Aβ1-40) 的亲 和性。
各评价化合物的 IC50 ％ 值如表 1-3 所示。化合物 I-1 ～ I-5 都显示了小于 100 的 IC50％ 值， 与刚果红和硫磺素 T 相比， 具有与淀粉样蛋白 ( 凝集 Aβ1-40) 更高的亲和性。 结果显示， 化合物 I-1 ～ I-5 具有良好的淀粉样蛋白 ( 凝集 Aβ1-40) 亲和性。特别地， 与 3′ -I-BTA-0 和 6-Me-BTA-2 相比， 化合物 I-1 ～ I-4 与淀粉样蛋白 ( 凝集 Aβ1-40) 具有更 高的、 与 IMPY 同等的亲和性。
表 1-3 ： 本发明化合物的 IC50％值
30101909657 A CN 101909663
说实验 比较例 I-2 比较例 I-3 比较例 I-4 比较例 I-5 比较例 I-6 实施例 I-8 实施例 I-9 实施例 I-10 实施例 I-11 实施例 I-12明书IC50％值 (nmol/L) 10.1 ＞ 1000 ＞ 1000 25.4 0.8 1.4 0.9 1.8 0.9 55.427/38 页评价化合物 3′ -I-BTA-0 刚果红 硫磺素 T 6-Me-BTA-2 IMPY 化合物 I-1 化合物 I-2 化合物 I-3 化合物 I-4 化合物 I-5实施例 I-13 ～ I-14， 比较例 I-7 ： 基于辛醇萃取法的分配系数的测定
测定采用一般已知作为化合物渗透通过血脑屏障 ( 以下称作 BBB) 的指标的基于 辛醇萃取法的分配系数 ( 以下称作 logP 辛醇 )。
向 2mL 的辛醇中， 加入 10μL 的包含化合物 I-7( 实施例 I-13) 和化合物 I-8( 实施 例 I-14) 的溶液和 2mL 的 10mmol/L 磷酸盐缓冲液 (pH7.4)， 并搅拌 30 秒。在用低速离心机 (2000rpm x 60 分钟 ) 离心分离该混合液后， 分别取样各 1mL 的辛醇层和水层， 用 Autowell Gamma 系统 ( 由 Aloka 公司制， 型号 ： ARC-301B) 测定各自的放射性计数。使用所测得的放 射性计数， 根据公式 (1-2) 计算 logP 辛醇。
结果如表 1-4 所示。化合物 I-7 和 I-8 显示的 logP 辛醇值都在 1 ～ 3 之间。已知 能渗透通过 BBB 的化合物的 logP 辛醇值在 1 ～ 3 之间 (Douglas D.Dischino 等人， J.Nucl. Med.， (1983)， 24， p.1030-1038)。因此， 这表明， 这两种化合物都具有与 IMPY 同样的 BBB 渗 透性。
表 1-4 ： 本发明化合物的 logP 辛醇值
31101909657 A CN 101909663说实验 比较例 I-7 实施例 I-13 实施例 I-14明书logP 辛醇值 2.1 2.1 2.028/38 页化合物 [123I]-IMPY 化合物 I-7 化合物 I-8实施例 I-15 ～ I-19， 比较例 I-8 ： 基于 HPLC 的分配系数的测定
通过下述方法测定基于 HPLC 的分配系数 ( 以下称作 logPHPLC)。已知 logPHPLC 在 pH7.2 ～ 7.4， 显示了与 logP 辛醇值相同的数值， 一般已知 logP 辛醇是化合物的 BBB 渗透性的 指标 (Franco Lombardo 等人， J.Med.Chem.， (2000)， 43， p.2922-2927)。
首先， 将如表 1-5 所示的评价化合物以 1mg/mL 的浓度溶解于包含 10％二甲亚砜的 甲醇中制备样品溶液。在下述条件下将 1μL 的样品溶液进行 HPLC 分析， 以求出溶剂的洗 脱时间 (t0) 和各化合物的洗脱时间 (tR)。
表 1-5 各实验中的评价化合物
实验 比较例 I-8 实施例 I-15 实施例 I-16 实施例 I-17 实施例 I-18 实施例 I-19
评价化合物 IMPY 化合物 I-1 化合物 I-2 化合物 I-3 化合物 I-4 化合物 I-5HPLC 条件 ：
色谱柱 ： Prodigy ODS(3)( 制品名 ； 由 phenomenex 公司制 ； 规格 ： 4.6 x 250mm)
流动相 ： 50mM 三乙胺磷酸盐 (pH 7.2)/ 乙腈＝ 40/60 的混合液
流速 ： 0.7mL/ 分钟
检测器 ： 紫外可见吸光光度计 ( 检测波长 ： 282nm)
使用获得的 t0 和 tR， 根据下述计算式 (1-3) 求出各评价化合物的保留因子 ( 以下 称作 K′ HPLC 值 )。
K’ HPLC ＝ (tR-t0)/t0… (1-3)
另外， 分别将 10μL 的上述参考例 I-8 中合成的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6-[125I] 碘 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的溶液 ( 放射性浓度 37MBq/mL) 和 10μL 的化合物 I-6 的溶液 ( 放射性浓度 37MBq/mL) 加入到分别制备的 2mL 的辛醇中， 再向各自的溶液中加入 2mL 的 10mmol/ L 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)。将各自的溶液搅拌 30 秒后， 将溶液以 2000rpm 离心分离 60 分 钟。分别取样各 1mL 的辛醇相和水相， 通过 Autowell Gamma 系统 ( 由 Aloka 公司制， 型号 ： ARC-301B) 测定放射性。基于所获得的放射性， 根据上述公式 (1-2) 计算 logP 辛醇值。
此外， 将化合物 I-2 和上述参考例 I-9 中制备的 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的溶液分别按照与上述相同的方式进行 HPLC 分析， 以确定各化合物的 K′ HPLC 值。
制作图， 其中相对于化合物 I-2 和 2-(4′ - 羟基苯基 )-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 125 的 log10K′ HPLC 值绘出化合物 I-6 和 2-(4′ - 羟基苯基 )-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 的 logP 辛醇值， 以确定直线的斜率和 Y 轴上的截距。用这些值， 求出下述式 (1-4)， 条件是， 在 pH 7.2 ～ 7.4 下， logP 辛醇值等于 logPHPLC 值。
logPHPLC ＝ 0.96(log10K’ HPLC)+1.59… (1-4)
使用由各评价化合物获得的 K ′ HPLC， 根据上述算式 (1-4) 求出各评价化合物的 logPHPLC 值。
结果如表 1-6 所示。 如该表所示， 化合物 I-1 ～化合物 I-5 的 logPHPLC 值都在 1-3 之 间。 如上所述， 已知能渗透通过 BBB 的化合物的 logP 辛醇值在 1-3 之间 (Douglas D.Dischino 等人， J.Nucl.Med.， (1983)， 24， p.1030-1038)。此外， 如上所述， 已知在 pH7.2 ～ 7.4 下， logPHPLC 显示了与 logP 辛醇同等的数值 (Franco Lombardo 等人， J.Med.Chem.， (2000)， 43， p.2922-2927)。上述结果表明， 化合物 I-1 ～ I-5 具有渗透 BBB 的性质。
表 1-6 ： 本发明化合物的 logPHPLC 值
实验 比较例 I-8 实施例 I-15 实施例 I-16 实施例 I-17 实施例 I-18 实施例 I-19
化合物 IMPY 化合物 I-1 化合物 I-2 化合物 I-3 化合物 I-4 化合物 I-5logPHPLC 值 2.1 2.0 2.1 1.9 1.9 1.8实施例 I-20 ～ I-21， 比较例 I-9 ： 脑中转移性和清除性的测定 (1)
使用化合物 I-7( 实施例 I-20) 和化合物 I-8( 实施例 I-21)， 测定在雄性 Wistar 大鼠 (7 周龄 ) 的脑中放射性蓄积的经时变化。
在硫喷妥钠麻醉下， 将化合物 I-7( 实施例 I-20) 溶解于包含 10mg/mL 抗坏血酸的 生理盐水溶液的溶液、 化合物 I-8( 实施例 I-21) 溶解于包含 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液的溶液、 和上述参考例 I-7 制备的 [123I]-IMPY( 比较例 I-9) 分别溶解于包含 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液而成的溶液 ( 放射性浓度为 20-30MBq/mL) 各 0.05mL， 注射到大鼠 的尾静脉中。在注射后 2， 5， 30 和 60 分钟后， 通过从腹部大动脉放血来处死这些大鼠， 移取 脑， 用 Autowell Gamma 系统 ( 由 Aloka 公司制， 型号 ： ARC-301B) 测定脑的放射性 ( 以下， 在 本实施例中， 称作 A)， 再测定脑质量。同时， 按照与上述相同的方式测定所注射溶液的 1000 倍稀释溶液 0.05mL 的放射性 ( 以下， 在本实施例中， 称作 B)。 使用这些测定结果， 根据下述 式 (1-5) 计算在各个解剖时间点的每单位脑重量的放射性分布率 (％ ID/g)。
在各时间点， 3 只动物用于实施例 I-20 和比较例 I-9， 2 只动物用于实施例 I-21。
结果如表 1-7 所示。如表 1-7 所示， 在注射后 2 分钟的时间点， 化合物 I-7 和 I-8 123 显示的蓄积高于 [ I]-IMPY， 随后在 60 分钟内显示出迅速消除的趋势。这些结果启示， 化 123 合物 I-7 和 I-8 与 [ I]-IMPY 同样， 具有优良的脑转移性和从脑中的迅速清除性。
表 1-7 ： 本发明化合物在静脉注射后的脑中放射性分布率 ( 大鼠 )
实施例 I-22 ： 脑中淀粉样蛋白的图像确认
进行下述实验以检验通过本发明的化合物是否可以使脑中的淀粉样蛋白显像。
(1) 将 Aβ1-40( 肽研究所制 ) 溶于磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)， 在 37℃下振荡 72 小时， 以获得 1mg/mL 的凝集 Aβ 混悬液 ( 以下， 在本实施例中， 称作淀粉样蛋白混悬液 )。
(2) 将 25μL( 相当于 25μg) 的淀粉样蛋白混悬液注射到雄性 Wistar 大鼠 (7 周 龄 ) 一侧的杏仁核中。作为对照， 将 25μL 的磷酸盐缓冲生理盐水溶液 (pH 7.4) 注射到该 大鼠另一侧的杏仁核中。在注射淀粉样蛋白混悬液和磷酸盐缓冲生理盐水溶液 (pH 7.4)1 天后检查该大鼠。
(3) 将化合物 I-7 溶解于包含 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液中， 得到样品溶液 ( 放射性浓度为 32MBq/mL)。将该溶液通过尾静脉注射到大鼠中 ( 剂量 ： 0.5mL， 给予的放射 性活度 ： 相当于 16MBq)。
(4) 在注射后 60 分钟移取脑， 用切片机 ( 型号 ： CM3050S， 由 LEICA 制 ) 制成厚度
10μm 的脑切片。 将该脑切片在成像板上曝光 20 小时， 然后， 通过使用生物图像分析仪 ( 型 号： BAS-2500 ； 由富士胶片株式会社制 ) 进行图像分析。
(5) 在用生物图像分析仪进行图像分析后， 用硫磺素 T 进行病理学染色， 使用荧光 显微镜 ( 由尼康公司制 ； 型号 ： TE2000-U 型 ； 激发波长 ： 400-440nm ； 检测波长 ： 470nm) 进行 显像。由此证明了淀粉样蛋白沉积于切片上 ( 图 1-12b)。
图 1-12 显示了通过脑内注射淀粉样蛋白的大鼠的脑切片的放射自显影图和硫磺 素 T 染色的图像。如该图所示， 在注射了淀粉样蛋白混悬液位点的杏仁核中观测到明显的 放射性蓄积。由放射性蓄积位点的硫磺素 T 染色的结果， 证明了在该蓄积位点存在着淀粉 样蛋白。 另一方面， 与其他位置相比， 在注射生理盐水溶液一侧的杏仁核中没有观察到明显 的放射性蓄积。
这些结果启示， 化合物 I-7 具有在脑内淀粉样蛋白上蓄积的性质和使脑内淀粉样 蛋白显像的能力。
实施例 I-23 ～ I-26 ： 回复突变试验
为 了 检 验 化 合 物 I-1， I-2， I-4 和 I-5 的 基 因 诱 变 性， 使用鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)TA98 和 TA100 进行回复突变试验 ( 以下称作 Ames 试验 )。
本试验在没有添加 S9mix 和添加 S9mix 的情况下进行。将二甲亚砜用作阴性对 照。阳性对照在不添加 S9mix 的情况下使用 2-(2- 呋喃基 )-3-(5- 硝基 -2- 呋喃基 ) 丙烯 酰胺、 在添加 S9mix 的情况下使用 2- 氨基蒽。
作为被加入到试验平板中的各样品溶液的添加量， 对于化合物 I-1 和 I-5 是 7 个 剂量 ( 几何比 ： 4)， 最大剂量是 1250μg/ 板， 对于化合物 I-2 和 I-4 是 7 个剂量 ( 几何比 ： 3)， 最大剂量是 5000μg/ 板。将各受试样品溶液和试验菌株 (TA98 或 TA100)、 或者将各受 试样品、 S9mix 和试验菌株混合在一起， 然后用软琼脂在试验平板的培养基上将混合物重叠 成多层， 然后在 37℃下培养 48 小时。 通过在培养后对平板上的回复突变菌落数计数来进行 判断， 当回复突变的菌落数是阴性对照的 2 倍以上、 且表现出浓度依赖性增加时， 判定诱变 性为阳性。
结果如表 1-8 所示。在用化合物 I-1， I-2， I-4 和 I-5 处理的组中各个菌株的回复 突变菌落数均小于用阴性对照物处理的组中的菌落数的 2 倍， 而不论是否加入了 S9mix 以 及受试样品的加入量是多少。从上述结果可以判定， 化合物 I-1， I-2， I-4 和 I-5 在 Ames 试 验中呈阴性， 没有诱变性。
表 1-8 ： Ames 试验的结果
实施例 I-27 ： 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的合成
将 88mg( 相当于 0.260mmol) 参考例 I-3 中得到的 6- 溴 -2-[4′ -(2″ - 氟乙氧 基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶溶解于 10.0mL 的二噁烷中， 向其中添加 2.0mL 三乙胺。然 后， 向其中添加 0.20mL( 相当于 0.39mmol) 的双 ( 三丁基锡 ) 和 20.1mg( 催化量 ) 的四 ( 三 苯膦 ) 钯。在将反应混合物在 90℃下搅拌 9 小时后， 减压蒸馏除去溶剂。通过快速硅胶柱 色谱 ( 洗脱液 ： 己烷 / 乙酸乙酯＝ 4/1) 精制残余物， 得到 71.6mg( 相当于 0.131mmol) 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 图 1-13， 步 骤 1)。
所得 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 的 NMR 测定结果 ( 内标物 ： 四甲基硅烷 ) 如下所示。
所使用的 NMR 装置 ： JNM-ECP-500( 日本电子株式会社 (JEOL) 制 ) 1
H-NMR( 溶剂 ： 氯仿 -d1 ； 共振频率 ： 500MHz) ： δ7.97(s， 1H)， 7.90(d， J ＝ 8.7Hz， 2H)， 7.58(d， J ＝ 8.7Hz， 1H)， 7.14(d， J ＝ 8.7Hz， 1H)， 6.99(d， J ＝ 8.7Hz， 2H)， 4.77， (dt， J ＝ 47.2， 4.1Hz， 2H)， 3.99(dt， J ＝ 28.0， 4.1Hz， 2H)， 1.59-1.53(m， 6H)， 1.39-1.32(m， 6H)， 1.13-1.10(m， 6H)， 0.92(t， J ＝ 7.3Hz， 9H)。
C-NMR( 溶 剂 ： 氯 仿 -d1，共 振 频 率 ： 500MHz) ： δ158.3， 145.6， 144.9， 131.2， 130.0， 127.4， 121.9， 116.9， 114.9， 106.4， 82.6， 81.3， 67.2， 29.0， 27.3， 13.6， 9.8。 123
实施例 I-28 ： 2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 的合成
13向 35μL 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4 ′ -(2 ″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的甲醇溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中， 加入 100μL 的 1mol/L 盐酸， 614MBq 的 [123I] 碘化钠 ( 体积为 100μL)， 10μL 的 1mol/L 碘化钠溶液和 20μL 的 10 ％ (W/V) 过氧化氢。 在将该混合物在 50℃下加热 10 分钟后， 在与实施例 I-2 相同的条件下进行 HPLC， 以获得 123 2-a] 吡啶级分。 2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6-[ I] 碘咪唑并 [1，
向该级分中加入 10mL 水。让所得溶液通过反相柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注册商 Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 145mg)， 以使得该柱吸附收集 标 )Light C8 Cartridges， 123 2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗该柱， 然 123 后让 1mL 乙醇通过， 以洗脱 2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6-[ I] 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡
啶。在合成刚刚结束时， 所得化合物的放射性活度是 64MBq。此外， 在下述条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 97.0％。
TLC 分析条件 ：
TLC 板 ： 硅胶 60F254( 商品名 ； 由默克公司制 )
流动相 ： 氯仿 / 甲醇 / 三乙胺＝ 100/1/2
检测器 ： Rita Star( 商品名 ； 由 Raytest 公司制 )
实施例 I-29， 比较例 I-10 ： 基于辛醇萃取法的分配系数的测定
用包含 10mg/mL 的抗坏血酸的生理盐水溶液分别稀释实施例 I-28 制备的化合物 I-9 的乙醚溶液 ( 实施例 I-29) 和 [123I]-IMPY 的乙醚溶液 ( 比较例 I-10)， 调节放射性浓 度至 20-30MBq/ml。分别向 2mL 的辛醇中加入各 10μL 所制备的样品溶液， 再加入 2mL 的 10mmol/L 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)， 然后搅拌 30 秒。在用低速离心机离心分离 (2000rpmx 60 分钟 ) 该混合物后， 分别取样各 1mL 的辛醇层和水层， 用 AutowellGamma 系统 ( 型号 ： ARC-301B， 由 Aloka 制 ) 进行各自放射性计数的测定。使用所测得的放射性计数， 根据公式 (1-6) 计算 logP 辛醇值。
结果如表 1-9 所示。化合物 I-9 显示的 logP 辛醇值也在 1 ～ 3 之间。已知能渗透 通过 BBB 的化合物的 logP 辛醇值在 1 ～ 3 之间 (Douglas D.Dischino 等人， J.Nucl.Med.， (1983)， 24， p.1030-1038)。因此， 上述结果表明， 化合物 I-9 具有与 IMPY 同样的 BBB 渗透 性。
表 1-9 ： 本发明化合物的 logP 辛醇值
实验 比较例 I-10 实施例 I-29
化合物 [123I]-IMPY 化合物 I-9logP 辛醇值 2.1 2.1实施例 I-30， 比较例 I-11 ： 脑中转移性和清除性的测定 (2) 使用化合物 I-9， 测定在雄性 Wistar 大鼠 (7 周龄 ) 的脑中放射性蓄积的经时变化。
制备将化合物 I-9( 实施例 I-30) 和上述参考例中制备的 [123I]-IMPY( 比较例 I-11) 分别溶解于包含 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液而形成的溶液 ( 放射性浓度为 20-31MBq/mL)。在硫喷要钠麻醉下， 将分别为 0.05mL 的这些溶液注射到各 Wistar 大鼠 (7 周龄 ) 的尾静脉中。注射 2， 5， 30 和 60 分钟后， 通过从腹部大动脉放血来处死这些大鼠， 移 取脑， 测定脑质量， 再用单通道分析仪 ( 检测器型号 ： SP-20， 应用光研株式会社制 ) 测定脑 的放射性 ( 以下， 在本实施例中， 称作 A)。 按照与上述相同的方式测定全身其余部分的放射 性 ( 以下， 在本实施例中， 称作 B)。使用这些测定结果， 根据下述式 (1-7) 计算在各个解剖时间点的每单位脑重量的放射性分布 (％ ID/g)。
在各时间点使用 3 只动物进行实验。
结果如表 1-10 所示。如表 1-10 所示， 在注射后 2 分钟的时间点， 化合物 I-9 显示 出了与 [ I]-IMPY 同样的显著的放射性蓄积， 随后在 60 分钟内显示出迅速消除的趋势。 这 123 些结果启示， 化合物 I-9 与 [ I]-IMPY 同样， 具有优良的脑内转移性以及从脑中的迅速清 除性。
表 1-10 ： 本发明化合物在静脉注射后的脑中放射性分布率 ( 大鼠 )
123
实施例 I-31 ： 脑中淀粉样蛋白的图像的确认
(1) 将 Aβ1-42( 和光纯药工业公司制 ) 溶于磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)， 在 37℃下振 荡 72 小时， 以获得 1mg/mL 的凝集 Aβ 混悬液 ( 以下， 在本实施例中， 称作淀粉样蛋白混悬 液 )。
(2) 将 2.5μL( 相当于 25μg) 的淀粉样蛋白混悬液注射到雄性 Wistar 大鼠 (7 周 龄 ) 一侧的杏仁核中。 作为对照， 将 2.5μL 的磷酸盐缓冲生理盐水溶液 (pH 7.4) 注射到该 大鼠另一侧的杏仁核中。在注射淀粉样蛋白混悬液和磷酸盐缓冲生理盐水溶液 (pH 7.4)1 天后检查该大鼠。
(3) 将化合物 I-9 溶解于包含 10mg/mL 的抗坏血酸的生理盐水溶液中， 得到样品溶 液 ( 该样品溶液中的放射性浓度为 21MBq/mL， 实施例 I-31)。在硫喷妥钠麻醉下， 将该溶液 通过尾静脉注射到大鼠中 ( 剂量 ： 0.5mL， 给予的放射性活度 ： 相当于 11-15MBq)。
(4) 在注射后 60 分钟移取脑， 用切片机 ( 型号 ： CM3050S， 由 LEICA 制 ) 制成厚度 10μm 的脑切片。 将该脑切片在成像板上曝光 20 小时， 然后， 通过使用生物图像分析仪 ( 型 号： BAS-2500 ； 由富士胶片株式会社制 ) 进行图像分析。
(5) 在用生物图像分析仪进行图像分析后， 用硫磺素 T 进行病理学染色， 通过使用 荧光显微镜 ( 由尼康公司制 ； 型号 ： TE2000-U 型 ； 激发波长 ： 400-440nm ； 检测波长 ： 470nm) 进行显像。从而证明了淀粉样蛋白沉积在该切片上 ( 图 1-14)。
图 1-14 显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠的脑切片的放射自显影图和硫磺素 T 染色的图像。如该图所示， 注射了化合物 I-9 的检体中， 在注射了淀粉样蛋白混悬液一侧的 杏仁核中也观测到明显的放射性蓄积。 另一方面， 与其他位置相比， 在注射生理盐水溶液一 侧的杏仁核中没有观察到明显的放射性蓄积。在放射自显影图上， 在淀粉样蛋白注射位点 以外的位置几乎观察不到放射性的蓄积。由硫磺素 T 染色的结果， 证明了在放射性蓄积的
位点存在着淀粉样蛋白 ( 图 1-14)。 这些结果启示， 化合物 I-9 具有在脑内淀粉样蛋白上蓄 积的性质和使脑内淀粉样蛋白显像的能力。
实施例 I-32 ： 染色体畸变试验
为了检验化合物 I-4 能否诱发染色体畸变， 使用中国仓鼠成纤维细胞株 (CHL/IU 细胞 )， 采用通过短期处理法的添加或不添加 S9 的培养系统， 以及通过连续处理法的 24 小 时培养系统， 进行染色体畸变试验。 对于所有的培养系统， 将受试样品的添加量设定为 1.2， 0.6， 0.3 和 0.15mg/mL。
与阴性对照组相比， 染色体畸变的细胞的出现频率显著增加并观察到剂量依赖性 时， 或者当出现频率在单次剂量下显著增加并观察到重现性时， 判定为阳性， 除此以外判定 为阴性。
作为该试验的结果， 在用化合物 I-4 处理的所有培养系统中， 具有结构畸变或数 目畸变 ( 倍数体 ) 的细胞的出现频率与阴性对照组相当。另一方面， 各个培养系统的阳性 对照组显示出了具有结构畸变的细胞的出现频率显著增加。从上述结果可以判断， 在本试 验条件下， 化合物 I-4 诱发染色体畸变的能力是阴性的。
实施例 I-33 ： 微核试验
为了研究化合物 I-4 的诱变性 ( 体内 )， 使用 Crlj:CD1(ICR) 系雄性小鼠的骨髓细 胞检验具有微核的多染性红细胞 ( 以下称作 MNPCE) 的诱发性。
设定试验剂量为 0mg/kg( 阴性对照组 )， 250， 500， 1000 和 2000mg/kg( 试验样品 组 )。在单次经口给药 24 和 48 小时后， 将小鼠处死， 制作骨髓涂片并进行观察。另外， 在阳 性对照组中腹腔给予 2mg/kg 的单剂量 MMC， 在给药后 24 小时处死小鼠， 然后制作骨髓涂片 并进行观察。
当确认在各给药组中 MNPCE 的出现频率显示出剂量依赖性增加或与阴性对照组 相比显示出统计学显著性增加时， 判定为阳性， 除此以外判定为阴性。作为统计学分析， 通 过 Wilcoxon 秩和检验， 对于各给药组中 MNPCE 的出现频率、 以及多染性红细胞 ( 以下称作 PCE) 与总红细胞 ( 以下称作 RBC) 的比例， 在受试样品组和阳性对照组相对于阴性对照组之 间或者各个组之间， 进行显著性检验， 将显著性水平分别设定为小于 5％和小于 1％。
从试验结果没有观察到受试样品组的 MNPCE 出现频率、 以及 PCE 与 RBC 的比例， 与 阴性对照组相比， 有统计学显著性差异。另一方面， 观察到阳性对照组的 MNPCE 出现频率与 阴性对照组相比显著性增加。从以上结果判定， 受试样品的诱变性 ( 体内 ) 是阴性的， 因为 在上述试验条件下， 使用化合物 I-4 没有观测到在小鼠骨髓细胞中有微核的诱发。
( 实施例 II-1 ～实施例 II-2) 与淀粉样蛋白结合性的确认
为了研究本发明化合物的结合机制， 使用以糊精作为前体化合物产生的淀粉样蛋 白进行抑制与硫磺素 T 结合的实验。糊精是在 II 型糖尿病中蓄积在胰脏中的淀粉样蛋白。
方法
(1) 将糊精 ( 人 )( 由和光纯药工业公司制 ) 溶解于磷酸盐缓冲液 (pH7.4)， 在 37℃ 振荡 72 小时， 以获得 1mg/mL 的凝集糊精的混悬液 ( 以下， 在各实施例中， 称作淀粉样蛋白 混悬液 )。
(2) 根 据 文 献 (Naiki ， H. 等 人， Laboratory Investigation ， 74 ， p.374-383(1996)) 所述的方法， 基于使用硫磺素 T( 由 Fluka 公司制 ) 的荧光分光光度法，进行该淀粉样蛋白混悬液的定性实验， 以证实在 (1) 中获得的凝集的糊精是淀粉样蛋白 ( 测定条件 ： 激发波长 446nm， 荧光波长 490nm)。
(3) 将该淀粉样蛋白混悬液以糊精浓度为 15μM 溶解于 50mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中。同时， 将硫磺素 T 以 15μM 的浓度溶解于 50mM 甘氨酸 -NaOH 缓冲液 (pH 8.5) 中。
(4) 配制将各评价化合物和淀粉样蛋白溶解于 50mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中、 且 最终浓度分别如表 2-1 所示的样品。将 (3) 中制备的各 50μL 的淀粉样蛋白溶液和硫磺素 T 溶液、 以及 50μL 的样品溶液填充在 96 孔微量培养板的各孔中 ( 体积约 0.3mL)。
表 2-1 ： 样品溶液中各化合物的最终浓度
(5) 制备混合了 100μL 的 50mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 和 50μL 的 50mM 甘氨 酸 -NaOH 缓冲液的样品作为空白， 进行与 (4) 同样的操作， 用于计算抑制率 ( 以下称作 BG)。
(6) 将填充有样品溶液的微量培养板在室温下静置 30 小时。然后， 用微量培养板 读板器 ( 型号 ： SPECTRA MAX GEMINI XS， 由 MolecularDevices 公司制 ) 测定各样品溶液的 荧光强度 ( 测定条件 ： 激发波长 446nm， 荧光波长 490nm)( 以下， A 表示各评价化合物的浓度 为零 (0) 的样品的荧光强度， B 表示各评价化合物的浓度为 1.5μmol/L 以上的样品的荧光 强度 )。
(7) 使用在上述 (6) 中测定的荧光强度， 通过下式 (2-1) 求出抑制率。
各评价化合物的抑制率如表 2-2 所示。任意浓度的化合物 I-1 和 I-2 都抑制了硫 磺素 T 的结合。该结果表明， 化合物 I-1 和 I-2 竞争性地抑制硫磺素 T 的结合。一般已知， 硫磺素 T 通过识别淀粉样蛋白的 β- 折叠结构而与之结合。因此启示， 化合物 I-1 和 I-2 具有与硫磺素 T 同样的结合淀粉样蛋白的机制， 即， 通过识别 β- 折叠结构而与之结合。
表 2-2 ： 本发明化合物对硫磺素 T 与淀粉样蛋白 ( 糊精 ) 结合的抑制率 (％ )
( 实施例 III) 各器官中放射性分布率的测定为了证明本发明化合物能分布于靶器官中并具有良好的清除到体外的性质， 使用 化合物 I-9 在 SD 大鼠 (8 周龄 ) 中测定各器官的放射性蓄积的经时变化。
向 100μL 的 6- 三丁基甲锡烷基 -2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ] 咪唑并 [1， 2-a] 吡啶的乙腈溶液 ( 浓度 ： 1mg/mL) 中， 加入 100μL 的 1mol/L 硫酸、 10μL 的 1mmol/L 123 碘化钠、 60μL 的 981MBq 的 [ I] 碘化钠和 10μL 的 30％ (W/V) 过氧化氢。将该混合液在 40℃下静置 10 分钟后， 在下述条件下进行 HPLC， 以获得 [123I]-2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶级分。
HPLC 条件 ：
柱： YMC-Pack Pro C8( 商品名 ； YMC 公司制 ； 规格 ： 4.6 x 150mm)
流动相 ： 10mM 甲酸 (pH 3.0)/ 乙腈＝ 80/20 → 10/90(0 分钟→ 30 分钟 )
流速 ： 1.0mL/ 分钟
检测器 ： 紫外可见吸光光度计 ( 检测波长 ： 254nm) 和放射性计数器 (Raytest 公司 制； 型号 ： STEFFI)
向该级分中加入 10mL 水。 让所得溶液通过 Sep-Pak C18 柱 ( 商品名 ； Sep-Pak( 注 册商标 )Light C8 Cartridges， Waters 公司制 ； 填充剂的填充量 ： 130mg)， 以使得该柱吸附 123 收集 [ I]-2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶。用 1mL 水冲洗 123 该柱， 然后让 1mL 乙醚通过， 以洗脱 [ I]-2-[4′ -(2″ - 氟乙氧基 ) 苯基 ]-6- 碘咪唑并 [1， 2-a] 吡啶 ( 化合物 I-9)。在合成刚刚结束时， 所得化合物的放射性活度是 473MBq。此 外， 在下述条件下进行 TLC 分析， 结果， 该化合物的放射化学纯度是 98％。
TLC 分析条件 ：
TLC 板 ： 硅胶 60F254( 商品名 ； 由默克公司制 )
流动相 ： 乙酸乙酯 / 甲醇 / 二乙胺＝ 100/4/1
检测器 ： Rita Star( 商品名 ； raytest 公司制 )
用包含 10mg/mL 抗坏血酸的生理盐水溶液稀释化合物 I-9 的乙醚溶液， 调节放射 性浓度至 8-12MBq/mL。在无麻醉下， 将 0.2mL 所制备的各样品溶液给药到上述大鼠的尾静 脉中。在给药后的 5、 30、 60 和 180 分钟通过从腹部大动脉放血将这些大鼠处死， 摘取表 3 中所示的各器官。用与实施例 I-30 相同的方法， 测定各移取器官的质量和放射性。同时， 测定移取器官后大鼠全身 ( 以下称作全身其余部分 ) 的放射性。使用这些测量结果， 根据 下式 (3) 计算各时间点的各器官每单位重量的放射性分布率 (％ ID/g)
在各时间点使用 3 只动物进行实验。
RT ： 靶器官的放射性 (cpm) S
R ： 全部器官的放射性总和 (cpm) R
R ： 全身其余部分的放射性 (cpm) T
M ： 靶器官的质量 (g)
结果如表 3 所示。 如表 3 所示， 化合物 I-9 在给予后 5 分钟的时间点分布于各器官 中， 随后大部分放射性分布于小肠和大肠。此外， 其放射性分布从小肠转移至大肠。因此， 发现化合物 I-9 在给予后迅速随胆汁排泄并且具有良好的体外清除性。
此外， 对认为淀粉样蛋白会蓄积的脑、 心脏、 肺、 胰脏和骨等进行观察， 发现在给药 后 5 分钟的时间点， 在所有这些器官中出现了显著的放射性蓄积， 由此证实了化合物 I-9 的 分布。此外， 给药后 5 分钟的时间点与给药后 180 分钟的时间点之比 (( 给药后 5 分钟的时 间点的％ ID/g)/( 给药后 180 分钟的时间点的％ ID/g)) 显示出了高值， 例如， 脑为 94， 心脏 为 18， 肺为 9， 胰脏为 9， 骨为 6。由此显示， 在被认为淀粉样蛋白会蓄积的器官中发生了迅 速的放射性分布和迅速的清除。
由上述可见， 实现了对生物组织中的淀粉样蛋白检测试剂来说所需要的给药后早 期的放射性分布以及迅速的体外清除性。
表3
产业实用性
本发明的用于检测生物组织中的淀粉样蛋白的试剂可用作淀粉样变性病例如全 身性淀粉样变性病中的淀粉样蛋白的体外和体内诊断剂。