一种检测细胞内锌离子的分子荧光开关及其应用 技术领域 本发明属于生物分析检测技术领域， 具体涉及高选择性检测锌离子， 尤其涉及一 种可用于活细胞中锌离子测定的分子荧光开关。
背景技术
分子荧光开关检测金属离子相对于其他检测手段优点有 ： 可以实现对于单个离 10 0 子的高检测灵敏性 ； 锌离子最外层 3d 4s 电子构型， 通常使用许多常规的分析手段如紫 谱、 核磁共振谱 (NMR)、 顺磁共振谱 (EPR) 等都得不到合适的光谱外 - 可见光谱、信号或者磁信号。 但使用荧光分子探针检测锌离子和铜离子具有快速响应、 高灵敏度、 低检 测阈值和易于操作等特点， 是非常行之有效的方法。
锌是人体必需的重要微量元素， 锌能提高人体免疫功能， 并能达到抗衰老的作用 ； 锌可加速创伤愈合， 刺激性机能 ； 微量锌可强化记忆力， 延缓脑的衰老 ； 锌能保护心肌免遭 异丙肾素导致的心肌损害 ； 锌与利尿剂合用能加强降压作用， 有利于控制高血压、 冠心病的 发生。对生长发育中的婴儿、 儿童和青少年具有更重要的营养价值。锌是人体内 200 多种 酶和蛋白质的重要组成成分， 也是许多酶的催化剂， 广泛参与了生命活动的各个方面。 其中 最重要的含锌的酶和蛋白质有 DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶、 蛋白转录因子、 碱性磷酸酶、 味觉蛋 白、 消化酶等。锌是这些重要生命大分子的活性结构成分。DNA 聚合酶是 DNA 复制的关键 物质之一， 缺乏锌元素时 DNA 聚合酶数量减少， 活性降低， 导致 DNA 复制速率减慢， 结果使细 胞的分裂速度降低甚至停滞。锌缺乏还使 RNA 聚合酶的数量与质量降低， 直接影响基因的 表达， 从而使上述含锌蛋白质和酶的合成受到阻碍。 所以说锌直接参与核酸蛋白质的合成、 细胞的分化和增殖以及许多代谢， 人体内还有一些酶需要锌的激活， 而发挥其活性作用。 因 此， 采用荧光分子探针的方法检测锌离子， 尤其是跟踪其化学反应及其在生命中的作用过 程就变成一件非常有意义的事情。
中国专利 01805747.0“锌荧光探针” 及中国专利 200410019339.2“稀土 - 过渡混 和金属配合物型锌离子荧光探针” 报道的锌离子荧光探针制备相对复杂。而且相应的荧光 探针分子在生物检测方面的应用未见报道。 为此， 在现有研究基础上发现性能更优、 合成更 易和生产成本更低的新型荧光分子探针则具有非常重要的使用价值。 发明内容 本发明目的之一提供一种具有良好的选择性、 能检测锌离子的荧光探针 ； 目的之 二是提供该荧光探针在生物检测锌离子中的应用。
本发明荧光探针分子具有以下结构通式 ：
通式中 R1 代表烷基， R2 代表烷基、 羟基。
在上述通式的荧光分子探针中， 烷基是具有 1-20 个碳原子的直链或异构烷基， 如 甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基等短链烷基。在上述通式中酰胺保护的萘啶希夫碱芳基衍生物 具有多个配位原子， 可以识别特定半径及电子结构的金属离子。荧光基团的光诱导电子转 移受控于识别基团。烷基和羟基的引入有助于改善探针分子在不同极性的溶剂中的溶解 性， 芳基的引入有助于调节荧光探针分子的共轭长度从而通过改变激发态电子云分布调节 探针发光在可见光区和发光颜色。
本发明荧光探针通过如下路径合成 ：
从附图说明中可以看出， 在多种的金属离子中， 该类荧光探针只对锌离子表现出 良好的选择性， 对其他金属具有抗干扰性。因此， 该类荧光探针可以应用于金属离子检测， 特别是在生物组织中锌离子的检测。
本发明设计、 合成的生物荧光分子探针具有结构相对简单、 易于合成等特点。 并且 在细胞中的识别效果良好， 可实现生物细胞或组织的实时荧光成像、 在有干扰离子存在的 情况下实现痕量锌离子荧光检测。在锌离子的浓度最小为 0.68％ g·L-1 时， 1 分钟以内荧 光强度可以增强到探针分子起始强度的九倍以上。
附图说明 图 1 为本发明荧光探针分子 ( 浓度为 5.0×10-5M) 乙醇溶液对于 Zn2+ 的荧光光谱 响应图。在图 1 中， 横坐标为荧光发射波长 (nm)， 纵坐标为荧光强度 ； 图中箭头表示锌离子 浓度增加， 直至探针分子浓度的 12 倍为止。
图 2 为本发明荧光探针分子 ( 浓度为 5.0×10-5M) 乙醇溶液对 Zn2+ 紫外 - 可见吸 收光谱图。在图 2 中， 横坐标为吸收波长 (nm)， 纵坐标为吸收强度 ； 图中箭头表示锌离子浓 度增加， 直至探针分子浓度的 12 倍为止。
图 3 为本发明荧光探针分子 ( 浓度为 5.0×10-5M) 乙醇溶液对于不同的金属离子 的荧光响应图。图中横坐标为荧光发射波长 (nm)， 纵坐标为荧光强度， 激发波长为 370nm。
1 为 Zn2+ 的荧光光谱响应曲线 ； 2 为其它金属离子 Cu2+、 Ca2+、 Co2+、 Cr3+、 Fe2+、 Hg2+、 K+、 Mg2+、 Mn2+、 Na+、 Ni2+ 荧光光谱响应曲线。
图 4 为本发明荧光探针分子 ( 浓度为 5.0×10-5M) 乙醇溶液对于不同的金属离子 ( 数字 1 到 13 分别对应于无金属离子、 Zn2+、 Cu2+、 Ca2+、 Co2+、 Cr3+、 Fe2+、 Hg2+、 K+、 Mg2+、 Mn2+、 Na+、 Ni2+) 及荧光探针分子与锌离子识别后加入高浓度干扰离子 ( 加入量为锌离子的 10 倍， 数字从 14 到 23 干扰离子分别是 Na+、 Mg2+、 K+、 Ca2+、 Cu2+、 Fe2+、 Mn2+、 Co2+、 Cr3+ 和 Ni2+) 的最大 荧光强度变化。纵坐标为 I/I0。I 表示加入金属离子在 505nm 处的荧光强度， I0 表示未加 入金属离子在 505nm 处的荧光强度， 激发波长为 370nm。
图 5、 图 6 和图 7 为 37℃时使用激光共聚焦显微镜拍摄的在人体 MCF-7 活细胞内 探针分子对锌离子识别的情况。图 5 是加入 10μM 探针分子细胞照片， 图 6 是加入探针分 子后的细胞再引入锌离子后的荧光照片， 图 7 是拍摄荧光照片时的明场像。 具体实施方式
为对本发明进行更好的说明， 举实施例如下 ：
实施例 1 本发明荧光探针的制备
在配有球形冷凝管的 100ml 的单口圆底烧瓶中， 加入等当量的对羟基苯胺和 4- 甲 基 -7- 乙酰氨基 -1， 8- 萘啶醛， 使之充分溶解在甲醇中。密封体系， 氩气做为保护气， 除气。 回流 5h， 反应结束。旋蒸， 粗产物用硅胶层析 (200 ～ 300 目 ) 分离纯化， 二氯甲烷作洗脱 剂， 得产物， 黄色固体。然后在甲醇中重结晶。
荧光探针的基本数据 ： 1
H-NMR ： δH(400MHz ； DMSO ； Me4Si)11.06(s， 1H， -OH)， 9.75(s， 1H， NH)， 8.64(m， 1H， naph)， 8.52(m， 1H， naph)， 8.37(m， 1H， naph)， 8.02(s， 1H， CH ＝ N)， 7.36(d， 2H， phenyl)， 13 7.06(d， 2H， phenyl)， 2.70(s， 3H， CH 3)， 2.18(s， 3H， COCH3). C-NMR ： δC(100MHz， DMSO) ： 170.65， 157.49， 154.95， 146.94， 141.65， 136.52， 123.72， 120.92， 117.90， 116.35， 115.29， 24.66， 18.36.
4- 甲基 -7- 乙酰氨基 -1， 8- 萘啶醛的合成参见文献 Z.X.Li， W.F.Fu， M.M.Yu， X.J.Zhao， Y.Chen Dyes and Pigments 2007， 75， 516-520.。
实施例 2 本发明荧光探针的应用
配制 5.0×10-5M 的荧光探针乙醇溶液， 和各种金属离子 1.0×10-2M 的乙醇溶液， 取 两毫升上述配制的探针溶液于比色皿中， 逐渐往比色皿中加入锌离子溶液， 用荧光光谱仪 检测锌离子的加入对探针的荧光光谱性质的影响。 其它金属离子对探针的荧光光谱的影响 测试和锌离子的类似。其它金属离子对锌离子荧光探针的干扰性研究和锌离子的类似。
结合附图， 光谱分析表明， 本发明荧光探针分子对于锌离子具有很高的选择性， 荧 光探针分子的低浓度溶液加入锌离子后荧光显著增强， 强度可以达到原来荧光强度的 15 倍， 颜色发生改变， 该选择性不受钾、 钙、 钠、 镁离子的影响。该荧光探针可以在活细胞内完 成对锌离子的荧光检测。在锌离子的浓度最小为 0.68％ g·L-1 时， 1 分钟以内荧光强度可 以增强到探针分子起始强度的九倍以上。
该类荧光探针结构简单， 合成方法简单且效率高， 具有实际应用价值。