反应性的杂环取代的 7- 羟基香豆素类以及它们的结合物 发明背景发明领域
本发明涉及包括反应性染料和染料 - 结合物的荧光化学品 ； 以及涉及它们的用途。 相关技术的描述
被分析物特异性荧光探测剂是分析样品中的被分析物的有用试剂。被分析物通 过特异结合到探测剂上变成标记的， 并且标记使得被分析物的检测变得容易。用于分析 样品内被分析物的荧光探测剂的应用包括荧光免疫分析， 它包括通过流动细胞计数法、 荧光显微镜检查鉴别和 / 或分离细胞混合物中的细胞亚群， 和通过荧光染色使凝胶分离 的被分析物可视化。这些技术被 Herzenberg 等人，″ CELLULAR IMMUNOLOGY ″第 3 版， 第 22 章 ； Blackwell ScientificPublications(1978) ； 和 被 Goldman， ″ FLUORESCENCE ANTIBODY METHODS″ Academic Press， New York， (1968) ； 和被 Taylor 等人， APPLICATIONS OFFLUORESCENCE IN THE BIOMEDICAL SCIENCES， Alan Liss Inc.， (1986) 所描述， 它们各 自在此引入作为参考。
当为上述目的使用荧光染料时， 有许多需要考虑的因素影响荧光染料的选择。其 中一个需要考虑的是荧光染料的吸收和发射特性， 因为许多受试样品例如血液、 尿液、 脑脊 髓液中的配体、 受体和材料， 将发荧光并干扰精确测定荧光标记的荧光。 这一现象被称为自 发荧光或背景荧光。第二个需要考虑的因素是荧光染料与配体、 受体以及其它生物或非生 物材料结合的能力， 以及所述结合对荧光染料的影响。 在许多情况下， 同另一种分子的结合 可能导致荧光染料的荧光特性的本质变化， 并且在某些情况下， 本质上破坏或减少荧光染 料的量子效率。同荧光染料的结合也将有可能使被标记的分子的功能失活。第三个需要考 虑的因素是荧光染料的量子效率， 其优选是对检测高灵敏度的。第四个需要考虑的因素是 荧光染料的光吸收能力或吸光系数， 其优选尽可能大。进一步需要考虑的因素是荧光分子 在十分接近时是否将彼此相互作用， 从而导致自猝灭。另一个需要考虑的因素是是否存在 荧光染料与其它化合物或容器壁的非特异性结合， 该结合是通过它们自身进行的或同荧光 染料所结合的化合物共同进行的。
上述方法的适用范围和重要性与合适荧光化合物的可得性紧密相联系。具体地， 需要可以被商业上可行的活性激光源如紫激光 (405nm)、 氩激光 (488nm) 和 He-Ne 激光 (633nm) 所激活的荧光物质。有许多为氩激光 (488nm 激发 ) 和 He-Ne 激光 (633nm 激发 ) 所研发的荧光染料。例如， 能很好地被 488nm 氩激光所激发的荧光素在绿色区域中是有用 的发射极。然而， 很少有可用于 405nm 紫激光的荧光染料。
一些香豆素染料已经在多种生物检测应用中表现出其实用性。例如参见， 美国 专利 6,207,404， Miller 等人 ； 美国专利 5,830,912， Gee 等人 ； 和美国专利 4,956,480， Robinson。 同其它荧光染料如荧光素类、 若丹明类和青色素类相比， 许多香豆素染料具有一 定的优点。 更小尺寸的香豆素染料减少了染料对染料标记的抗原特异性试剂的亲和性和特
异性的影响。此外， 更小的香豆素比荧光素类、 若丹明类和青色素类具有更高标记效率。然 而， 已知许多香豆素染料均有一定的缺陷， 例如由于它们很强的疏水性和高 pKa， 同蛋白质 结合的羟基香豆素染料的荧光剧烈猝灭。香豆素的荧光猝灭起因于自猝灭 ( 香豆素标记间 的近距离 ) 和 / 或由富含电子的氨基酸残基 ( 如组氨酸、 色氨酸和酪氨酸等 ) 引起的猝灭。 此外， 香豆素类在 405nm 处的典型弱吸收严重限制了它们使用紫外激发激光来分析细胞的 应用， 例如在一些流式细胞计数法中的使用。
氯 化 的 香 豆 素 类 已 经 被 用 于 标 记 有 机 小 分 子 ( 例 如， Zlokarnik 等 人， 1998， Science 279 ： 84 和美国专利 5,955,604)。对于标记有机小分子， 自猝灭和由底物引起的 猝灭都不是严重的问题， 因为在每个结合物中仅存在单个香豆素分子。 相反地， 对于标记抗 体， 因为希望把多种染料分子结合到各自抗体上去所以自猝灭和由底物引起的猝灭都是重 点关注的。通常认为由于所谓 “重原子作用” 和增加的疏水性， 香豆素类或荧光素类的氯化 将导致抗体的较差标记 ( 美国专利 5,516,629， Park 等人 ； 美国专利 5830912， Gee 等人 ； 美 国专利 6,472,205， Tsien and Zlokarnik ； Haugland， Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals， Molecular Probes， 第 9 版， 7-74 页， 2002)。
于 2008 年 7 月 29 日递交的共同待决的美国专利申请系列 12/220,939 在此引入 作为参考， 其中描述了结合了多种单氯化的 7- 羟基香豆素染料的抗体以及它们在生物测 定中的应用。 这些单氯化的羟基香豆素染料在每个抗体多种染料情况下用作抗体标记时出 人意料地展现出减少的自猝灭。这些染料标记的抗体典型地表现出最大接近于 405nm 的吸 收并且在蓝色区域表现出最大发射。
发明概述
本发明提供一种水溶性、 杂环取代的 7- 羟基香豆素染料以及水溶性、 杂环取代的 7- 羟基香豆素染料的衍生物， 包括反应性染料和染料结合物。
本发明的水溶性、 杂环取代的 7- 羟基香豆素染料展现出新的性质组合， 这使得这 些荧光染料特别适于在生物测定中使用， 包括用作生物聚合物的标记。我们发现 7- 羟基香 豆素类中杂环的取代和水溶性基团的加入出人意料地产生荧光香豆素类新品种， 其用于生 物测定和制备在 405nm 有强吸收的生物结合物并且是高荧光的。此外， 杂环取代的 7- 羟基 香豆素类的卤化显著地降低香豆素染料的 pKa 从而使得到的香豆素结合物在生理学 pH 范 围中具有它们的荧光极大值。这些杂环取代的 7- 羟基香豆素染料是强荧光的， 并且本发明 的杂环取代的 7- 羟基香豆素染料结合物的增强了的荧光强度导致更高的检测灵敏度。
本发明的杂环取代的 7- 羟基香豆素染料典型地展现出接近于 405nm 的吸收最大 值， 并且可以选择本发明的染料去匹配紫激光的主要发射谱线， 像例如在许多流式细胞计 数法中存在的那样。 本发明的反应性染料和染料结合物的一个具体优点是这一种类的染料 在绿色区域 ( 约 500-540nm) 典型地展现出发射极大值。据我们所知， 本发明提供了在绿色 区域发射并且在一般的生物测定反应条件下用于标记生物分子的一类小分子荧光染料的 第一次描述。
在一个方面， 本发明提供了化学反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基香豆素 化合物用作荧光染料。本发明的反应性的、 水溶性、 杂环取代的 7- 羟基香豆素染料可以与 多种有机或无机物 (“底物” ) 反应， 所述底物含有或经修饰而含有合适反应性的官能团， 从 而使染料与所述物质的结合。在本发明的一个方面， 本发明的反应性染料被直接用于荧光染色或标记样品从而使该样品可以被检测、 鉴别或定量化。
在另一个方面， 本发明提供染料结合物， 其含有一种或多种结合到底物上的本发 明的水溶性、 杂环取代的 7- 羟基香豆素类。在优选的实施方案中， 该染料结合物被用作荧 光检测试剂以检测、 鉴别、 定位或定量化样品中的被分析物。
在本发明的一个优选实施方案中， 染料结合的底物为生物聚合物并且该生物聚合 物与本发明一种或多种或水溶性、 杂环取代的 7- 羟基香豆素类结合以获得荧光生物聚合 物。本发明的荧光生物聚合物染料 - 结合物作为或部分作为检测试剂是有用的， 包括作为 被分析物特异性检测试剂。有用的生物聚合物包括， 例如， 氨基酸聚合物、 核酸聚合物、 多 糖、 碳水化合物和脂类。在一个优选的实施方案中， 如本文广泛定义的那样， 染料 - 生物聚 合物结合物的生物聚合物组分是氨基酸聚合物。在一个优选的实施方案中， 所述生物聚合 物为单克隆的抗体。
在另一个方面， 本发明提供了含有本发明的反应性染料或染料结合物的试剂盒。 本发明的试剂盒可以含有用于实现预期应用的另外组分， 例如其它试剂或缓冲液。
本发明反应性的、 水溶性、 杂环取代的 7- 羟基香豆素染料具有式 1 的结构 ：
式1其中
HC 为杂环 ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R5 和 R6 独 立 地 是 H、 卤 素、 烷 基、 烷 氧 基、 芳 氧 基、 巯 基、 烷硫基 (alkylthiol)、 芳硫基 (arylthiol)、 叠氮基、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 硼酸 (boronic acid)、 L-RG、 WSG 或其本身被卤素、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 羰基、 硼酸、 L-RG 或 WSG 一 次或多次取代的烷基或烷氧基 ；
RG 是化学反应性基团 ；
L 是任选的连接体 ；
WSG 是水溶性基团 ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R5 和 R6 中的至少一个含有 L-RG ； 和
R1、 R2、 R3、 R4、 R5 和 R6 中的至少一个是 WSG。
优选地， 杂环部分 HC 选自下列 ：
优选地， 反应性基团 RG 是丙烯酰胺、 胺、 羧酸、 羧酸的活性酯、 酰叠氮、 酰基腈、 醛、 烷基卤、 酐、 芳基卤、 叠氮化物、 氮丙啶、 硼酸酯、 重氮烷、 卤代乙酰胺、 卤代三嗪、 肼、 羟胺、 亚 氨基酯、 异氰酸酯、 异硫氰酸酯、 马来酰亚胺、 反应性铂络合物、 磺酰卤或补骨脂素衍生物。
优选地， 任选的连接体 L 是没有、 烷基、 烷氧基、 硫代烷基、 氨基酸、 磺基氨基酸 (sulfo amino acid)、 多胺、 聚乙二醇、 芳基或杂芳基。
优 选 地， 水 溶 性 基 团 WSG 是 磺 酸 根、 硫 代 磺 酸 根、 膦 酸 根、 硼 酸 根、 铵、 吡啶鎓 (pyridium)、 喹啉鎓 (quinolium) 或吖啶鎓 (acridinium) 基团。
在优选的实施方案中， 本发明的反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基香豆素 染料具有式 2 的结构 ：
式2其中
X 是 O、 S、 NH 或 NR10 ；
Y 是 NH、 NR11、 CH 或 CR12 ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R10、 R11 和 R12 独立地是 H、 卤素、 烷基、 烷氧基、 芳氧基、 巯基、 烷 硫基、 芳硫基、 叠氮基、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 硼酸、 L-RG、 WSG 或其本身任选地被卤素、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 羰基、 硼酸、 L-RG 或 WSG 一次或多次取代的烷基或烷氧基 ；
RG 是化学反应性基团 ；
L 是任选的连接体 ；
WSG 是水溶性基团 ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R10、 R11 和 R12 中的至少一个含有 L-RG ； 和
R1、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R10、 R11 和 R12 中的至少一个是 WSG。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基 香豆素染料具有式 3 的结构 ：
式3其中
X是O或S；
R1、 R2、 R 3、 R4、 R10、 R11 和 R12 独立地是 H、 卤素、 烷基、 烷氧基、 芳氧基、 巯基、 烷硫基、 芳硫基、 叠氮基、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 硼酸、 L-RG、 WSG 或其本身任选地被卤素、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 羰基、 硼酸、 L-RG 或 WSG 一次或多次取代的烷基或烷氧基 ；
RG 是化学反应性基团 ；
L 是任选的连接体 ；
WSG 是水溶性基团 ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R10、 R11 和 R12 中的至少一个含有 L-RG ； 和
R1、 R2、 R3、 R4、 R10、 R11 和 R12 中的至少一个是 WSG。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基 香豆素染料具有式 4 的结构 ：
式4其中
X是O或S；
R1、 R 2、 R3、 R 4、 R10 和 R11 独立地是 H、 卤素、 烷基、 烷氧基、 芳氧基、 巯基、 烷硫基、 芳硫 基、 叠氮基、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 硼酸、 L-RG、 WSG 或其本身任选地被卤素、 氨基、 羟 基、 磺酰基、 膦酰基、 羰基、 硼酸、 L-RG 或 WSG 一次或多次取代的烷基或烷氧基 ；
RG 是化学反应性基团 ；
L 是任选的连接体 ；
WSG 是水溶性基团 ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R10 和 R11 中的至少一个含有 L-RG ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R10 和 R11 中的至少一个是 WSG ； 和
R10 和 R11 中的至少一个含有磺酸盐。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基 香豆素染料具有式 5 的结构 ：
式5其中
X是O或S；
R1、 R2、 R3、 R4、 R10 和 R11 独立地是氢、 氯、 氟、 氰基或磺酸盐 ；
RG 是化学反应性基团 ；
L 是任选的连接体 ； 和
其中 R10 和 R11 中的至少一个是磺酸盐。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基 香豆素染料具有式 6 的结构 ：
式6
其中 R1、 R2、 R3、 R4、 R10 和 R11 独立地是氢、 氯、 氟、 氰基或磺酸盐 ； RG 是化学反应性基团 ；L 是任选的连接体， 它是没有、 烷基、 烷氧基、 硫代烷基、 氨基酸、 磺基氨基酸、 多胺、 聚乙二醇、 芳基、 芳烷基或杂芳基， 和
其中 R10 和 R11 中的至少一个是磺酸盐。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基 香豆素染料具有式 7 的结构 ：
式7其中
R3、 R4、 R10 和 R11 独立地是氢、 氯、 氟、 氰基或磺酸盐 ；
n 为 1-10 的整数 ； 和
其中 R10 和 R11 中的至少一个是磺酸盐。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基 香豆素染料具有式 8 的结构 ：
式8其中
R3 和 R4 独立地是氢、 氯、 氟或磺酸盐 ； 和
R10 和 R11 中的至少一个是磺酸盐。
在下表 1 中给出本发明所选择的反应性染料的实施方案。表 1 中反应性染料的编 号对应于实施例中所描述的化合物的编号。
表1
本发明的反应性染料实例
本发明的染料结合物包括与本发明的一种或多种染料结合的底物。典型地， 染料 结合物通过本发明反应性染料和底物之间的反应制备， 该底物含有或已经经修饰从而含有 具有合适反应性的官能团， 导致染料化学连接到该底物上。作为反应性染料和底物上官能 团之间结合反应的结果， 染料反应性基团的一个或更多原子一般被结合入使染料连接到底 物上的新的键中。
一般而言， 本发明的染料结合物具有式 9 的结构 ：
式9其中
HC 为杂环 ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R5 和 R6 独立地是 H、 卤素、 烷基、 烷氧基、 芳氧基、 巯基、 烷硫基、 芳硫 基、 叠氮基、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 硼酸、 WSG 或其本身被卤素、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦 酰基、 羰基、 硼酸或 WSG 一次或多次取代的烷基或烷氧基 ；
WSG 是水溶性基团 ；
n 是 1-35 的整数 ；
SUB 是底物 ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R5 和 R6 中的至少一个通过任选的连接体 L 共价结合到 S 上 ； 和
R1、 R2、 R3、 R4、 R5 和 R6 中的至少一个是 WSG。
在一个优选的实施方案中， 本发明的染料结合物具有式 10 的结构 ：
式 10其中
X 是 O、 S、 NH 或 NR10 ；
Y 是 NH、 NR11、 CH 或 CR12 ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R10、 R11 和 R12 独立地是 H、 卤素、 烷基、 烷氧基、 芳氧基、 巯基、 烷 硫基、 芳硫基、 叠氮基、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 硼酸、 WSG 或其本身任选地被卤素、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 羰基、 硼酸或 WSG 一次或多次取代的烷基或烷氧基 ；
WSG 是水溶性基团 ；
n 是 1-35 的整数 ；
SUB 是底物 ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R10、 R11 和 R12 中的至少一个通过任选的连接体 L 共价结合到 S 上； 和
R1、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R10、 R11 和 R12 中的至少一个是 WSG。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的染料结合物具有式 11 的结构 ：
式 11其中
X是O或S；
R1、 R2、 R 3、 R4、 R10、 R11 和 R12 独立地是 H、 卤素、 烷基、 烷氧基、 芳氧基、 巯基、 烷硫基、 芳硫基、 叠氮基、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 硼酸、 WSG 或其本身任选地被卤素、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 羰基、 硼酸或 WSG 一次或多次取代的烷基或烷氧基 ；
WSG 是水溶性基团 ；
n 是 1-35 的整数 ；
SUB 是底物 ；
R1、 R2、 R 3、 R4、 R10、 R11 和 R12 中的至少一个通过任选的连接体 L 共价结合到 S 上 ； 和
R1、 R2、 R3、 R4、 R10、 R11 和 R12 中的至少一个是 WSG。 在另一个优选的实施方案中， 本发明的染料结合物具有式 12 的结构 ：
式 12其中
X是O或S；
R1、 R 2、 R3、 R 4、 R10 和 R11 独立地是 H、 卤素、 烷基、 烷氧基、 芳氧基、 巯基、 烷硫基、 芳硫 基、 叠氮基、 氨基、 羟基、 磺酰基、 膦酰基、 硼酸、 WSG 或其本身任选地被卤素、 氨基、 羟基、 磺酰 基、 膦酰基、 羰基、 硼酸或 WSG 一次或多次取代的烷基或烷氧基 ；
WSG 是水溶性基团 ；
n 是 1-35 的整数 ；
SUB 是底物 ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R10 和 R11 中的至少一个通过任选的连接体 L 共价结合到 S 上 ；
R1、 R2、 R3、 R4、 R10 和 R11 中的至少一个是 WSG ； 和
R10 和 R11 中的至少一个含有磺酸盐。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的染料结合物具有式 13 的结构 ：
式 13
其中X是O或S； R1、 R2、 R3、 R4、 R10 和 R11 独立地是氢、 氯、 氟、 氰基或磺酸盐 ； L 是任选的连接体 ； SUB 是底物 ； 和 其中 R10 和 R11 中的至少一个是磺酸盐。 杂环部分、 连接体和水溶性基团的优选实施方案如以上对反应性染料所描述的。附图说明 附图 1 表示通过 4- 羰基间苯二酚类与杂环乙酸酯化合物的碱催化缩合反应 ( 方 法 A) 或基于乙酸酐的缩合反应 ( 方法 B) 合成反应性香豆素的简图。
附图 2 表示在 pH ＝ 9.0 缓冲液中的化合物 7 的吸收和发射光谱。 化合物 7 在 414nm 附近有它的最大吸收， 这很好地与典型的流式细胞计数器的 405nm 紫激光激发相匹配。
附图 3 表示使用 CD3 抗体结合化合物 7 的染料结合物在用于标记淋巴细胞的染料 与蛋白质之比范围内所获得的数据曲线。
附图 4 表示使用 CD4 抗体结合化合物 7 的染料结合物在用于标记淋巴细胞的染料 与蛋白质之比范围内所获得的数据曲线。
附图 5 表示表示使用 CD8 抗体结合化合物 7 的染料结合物在用于标记淋巴细胞的 染料与蛋白质之比范围内所获得的数据曲线。
附图 6 表示使用 CD45 抗体结合化合物 7 的染料结合物在用于标记淋巴细胞的染 料与蛋白质之比范围内所获得的数据曲线。
发明详述
为了使本文所述的本发明可以被完全地理解， 许多术语在下面被明确地定义。没 有被明确定义的术语意味它们具有在化学和生物领域中通常的意思。 本文所有在上面和下 面引用的参考资料， 在此引入作为参考。
术语 “7- 羟基香豆素” 或 “7- 羟基香豆素衍生物” ， 自身或作为另一个基团的一部 分在本文中使用， 表示含有一个或多个下列稠环结构或其衍生物的任意化合物或取代基 ：
7- 羟基香豆素可以理解的是本发明的香豆素染料可以以一个或另一个具体的电子共振结构画 出。本发明每一方面均等地适用于形式上绘制为其它允许的共振结构的染料， 因为在该染 料上的电荷遍及染料自身离域分布。
术语 “杂原子” ， 自身或作为另一个基团的一部分在本文中使用， 表示氧原子 (“O” )、 硫原子 (“S” ) 或氮原子 (“N” )。公认当杂原子是氮时， 它可以形成 NR1R2 部分， 其中 R1 和 R2 彼此独立地为氢或烷基， 或同它们连接的氮一起形成饱和或不饱和的 5-、 6- 或 7- 元环。
术语 “杂环” 或 “杂芳基” ， 自身或作为另一个基团的一部分在本文中使用， 是指 具有 5 至 14 个环原子并含有碳原子以及 1、 2、 3 或 4 个氧、 氮或硫杂原子的基团。杂环基 团的例子包括噻吩基、 苯并 [b] 噻吩基、 萘并 [2， 3-b] 噻吩基、 噻蒽基、 呋喃基、 吡喃基、 异 苯并呋喃基、 苯丙噁唑基、 色烯基、 呫吨基、 啡噁噻基 (phnoxathiinyl)、 2H- 吡咯基、 吡咯基、 咪唑基、 吡唑基、 吡啶基、 吡嗪基、 嘧啶基、 哒嗪基、 吲嗪基、 异吲哚基、 3H- 吲哚基、 吲哚 基、 吲唑基、 嘌呤基、 4H- 喹嗪基、 异喹啉基、 喹啉基、 酞嗪基、 萘啶基、 喹唑啉基、 噌啉基、 蝶 啶基、 咔唑基、 菲啶基、 吖啶基、 萘嵌间二氮苯基、 二氮杂菲基、 吩嗪基、 异噻唑基、 吩噻嗪基、 异噁唑基、 呋咱基 (furazanyl)、 吩噁嗪基和四唑基的基团。杂环基已经在文献中被广泛 地描述 ( 参见， 例如， Katritzky， Alan R.， Charles W.Rees， 和 Colin J.Drayton.1984. Comprehensive heterocyclicchemistry ： the structure， reactions， synthesis， and uses of heterocycliccompounds. 第 8 卷，第 6 部 分 . 索 引 .Oxford[Oxfordshire] ： PergamonPress.， 在此引入作为参考 )。
任意芳基和杂芳基环体系可以是未取代的或任选地和独立地被合成上易取得的 和化学上稳定结合的取代基所取代， 例如 H、 卤素、 氰基、 磺基、 磺基的碱金属或铵盐、 硝基、 羧基、 烷基、 全氟 ( 代 ) 烷基、 烷氧基、 烷硫基、 氨基、 单烷基氨基、 二烷基氨基或烷基酰胺基， 其烷基部分具有 18 个或更少的碳。
本文中使用的术语 “取代的” ， 是指用可选择的基团对化学结构部分或官能团上的 氢进行的形式取代。在化合物、 化学结构部分或官能团被描述为取代的时， 可选择的基团 取代基部分通常选自羟基、 氧代、 硝基、 三氟甲基、 卤素、 烷氧基、 烯基二氧基、 氨基烷基、 氨 基烷氧基、 氨基、 单烷基氨基、 二烷基氨基、 烷基羰基氨基、 烷氧基羰基氨基、 烷氧基羰基、 羧 基、 羟基烷氧基、 烷氧基烷氧基、 单烷基氨基烷氧基、 二烷基氨基烷氧基单 ( 羧基烷基 ) 氨 基、 双 ( 羧基烷基 ) 氨基、 烷氧基羰基、 炔基羰基、 烷基磺酰基、 烯基磺基酰基、 炔基磺酰基、 芳基磺酰基、 烷基磺酰基、 烷基亚磺酰基、 烷基磺酰胺基， 芳基磺酰胺基， 烷基磺酰胺基、 羧 基烷氧基、 羧基烷基， 羧基烷基氨基、 氰基、 三氟甲氧基、 全氟 ( 代 ) 乙氧基、 胍、 脒基、 氧胍 基、 烷基亚氨基、 甲酰基亚氨基、 酰基腈、 酰叠氮、 乙酰基叠氮化物、 二氯三氮烯、 异硫氰酸 酯、 磺酰卤、 磺基琥珀酰亚氨基酯、 异氰酸酯、 酰卤、 醛、 卤乙酰胺、 马来酰亚胺、 氮丙啶基、 烷 硫基 ( 二硫化物 )、 丙烯酰 (acrylo)、 卤烷基羰基、 硼酸酯、 酰肼、 氨基脲、 碳酰肼、 芳烷基、 杂 芳烷基、 环烷基烷基、 环烯基烷基、 环杂烷基烷基和环杂烯基烷基。
本文所用的 “反应性基团” ， 表示为 “RG” ， 系指化合物上能够与不同化合物上的官 能团发生化学反应形成共价键的结构部分。
本文所用的在两个结构部分之间的 “连接体” ， 表示为 “L” ， 如果这两个结构部分可 以直接彼此连接或通过该连接体作为中间物进行连接， 则称为是 “任选的” 。使用这一文字 以简化对区别仅在于存在或不存在连接体的很多备选结构的描述。在本发明中， 例如香豆 素染料分子可以直接结合于生物聚合物或可选择地通过连接体 (L) 间接结合于生物聚合 物。为了更简约的表示， 这两种选择在本文描述为具有任选的连接体的单一结构。具有任 选的连接体 (L) 的结构的一个实施方案， 其中连接体不存在时可以被描述为其中 L 是 “没 有” 的结构。
本文所用的术语 “水溶性基团” 或 “WSG” 是指提高其所连接的化合物的水溶性的任 意取代基。优选地， 水溶性基团 (WSG) 是磺酸根、 硫代磺酸根、 膦酸根、 硼酸根、 铵、 吡啶鎓、 喹啉鎓、 吖啶鎓或多羟基 ( 例如糖如葡萄糖 ) 基团。
术语 “磺酸盐” ， 自身或作为另一个基团的部分， 是指含有一个或多个具有下列结 构的结构部分的任意化合物或取代基 ：
其中 R 是氢或其他反离子， 例如金属离子或铵离子。
本文所用的术语 “染料结合物” 是指染料和 “底物” 或 “物质” 之间的结合物。
术语 “被分析物” 在本文广泛用于指将被分析、 检测、 测量或标记的任意物质。被 分析物的例子包括但不限于蛋白质、 肽类、 荷尔蒙、 半抗原、 抗原、 抗体、 受体、 酶类、 核酸、 多 糖、 化学品、 聚合物、 病原体、 毒素、 有机药物、 无机药物、 细胞、 组织、 微生物、 病毒、 细菌、 真 菌、 藻类、 寄生虫、 变应原、 污染物质及它们的组合。按惯例， 将要被测定的特定细胞类型的 细胞， 其细胞组分分子或细胞本身可以被描述为被分析物。
本文使用术语 “被分析物 - 特异性试剂” 或 “靶点 - 特异性试剂” 来广泛地指相对 于其它可能地存在于样品中的被分析物优先结合到感兴趣的被分析物或靶点的任意试剂。 靶点 ( 被分析物 ) 和靶点特异性 ( 被分析物特异性 ) 试剂是结合对的成员， 该结合对的任 一成员可以用作靶点特异性试剂以选择性结合于该结合对的另一个成员。 靶点和靶点特异 性试剂对的例子包括， 但不限于， 在下表 2 中提供的。优选的靶点特异性试剂为抗体， 其包 括特异性结合 ( 与之免疫应答 ) 抗原的抗原结合位点。
表2 代表性的特异结合对 抗体 抗生物素蛋白， 抗生蛋白质链菌素或抗 生物素抗体 蛋白质 A 或蛋白质 G 药物受体 毒素受体 外源凝集素或碳水化合物受体 肽受体 互补核苷酸 蛋白质受体 酶抗原 生物素IgG( 免疫球蛋白质 ) 药物 毒素 碳水化合物 肽 核苷酸 蛋白质 酶底物25CN 101914093 A说明书核酸 荷尔蒙受体 核酸 RNA 或 DNA 适体18/42 页核酸 荷尔蒙 补骨脂素 靶分子
本文所用的 “检测试剂” 是指用来使被分析物易于光学检测的任意化合物。检测 试剂一般包括结合于荧光标记的被分析物特异性试剂， 并且包括 ： 其中底物组分 ( 一般为 生物聚合物 ) 自身为被分析物 - 特异性试剂的染料 - 结合物， 以及结合到充当荧光标记的 染料结合物上的被分析物 - 特异性试剂。
本文所用的术语 “生物聚合物” 一般用于指氨基酸聚合物、 核酸聚合物、 碳水化合 物、 多糖类和脂类， 其各自在此广泛定义。
本文所用的术语 “氨基酸聚合物” 一般用于指氨基酸的任意聚合物， 包括肽类、 多 肽和蛋白质， 包括那些已经接受过共转译或转移后修饰的蛋白质， 例如糖蛋白类。 氨基酸聚 合物可以包括标准 ( 即， 由标准遗传密码也称为蛋白质原所编码的 20 种氨基酸中的一种 ) 保护或取代。术 和非标准氨基酸， 可以由例如磷酸盐、 碳水化合物或 C1 至 C25 羧酸所衍生、 语 “肽” 、 “多肽” 和 “蛋白质” 根据聚合物的长度在此处可无区别地交换使用， 虽然氨基酸的 短聚合物一般称为肽或多肽， 和氨基酸的更长聚合物尤其是那些天然存在和 / 或具有生物 学功能的称为蛋白质。
本文所用的术语 “抗体” 包括衍生或可衍生自抗体或抗体基因的所有产品， 其用作 靶点特异性结合试剂。 “抗体” 因此包括天然抗体、 抗体片段、 抗体衍生物和基因工程化的抗 体、 抗体片段和抗体衍生物等。
本文所用的术语 “核酸聚合物” 、 “核酸” 和 “低聚核苷酸” 是指聚脱氧核糖核酸类 ( 含有 2- 脱氧 -D- 核糖 )、 聚核糖核苷酸类 ( 含有 D- 核糖 )、 和为嘌呤或嘧啶碱或者经过修 饰的嘌呤或嘧啶碱的 N 糖苷的任意其它类型的多核苷酸。在术语 “核酸” 和 “低聚核苷酸” 之间在长度上未打算进行区分， 并且这些术语可以互换使用。这些术语仅仅是指分子的一 级结构。因此， 这些术语包括双链和单链 DNA， 以及双链和单链 RNA。核酸聚合物旨在包括 肽核酸， 例如 N-(2- 氨基乙基 ) 甘氨酸单元 ( 参见 Nielsen 等， 美国专利 5,539,082， 在此引 入作为参考 )。
反应性染料
本发明的反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基香豆素类具有在式 1-8 的任一 个中所示的通式结构。具体例子在表 1 中表示并且在实施例中进行描述。
所述反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基香豆素染料含有一个反应性基团 RG， 其通过任选的连接体 L 共价连接于染料。在某些实施方案中， 连接染料至 RG 的共价键 含有多个充当间隔物的插入原子。 本发明的反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基香豆素类染料可以与各种含有 或经修饰含有具有适合反应性的官能团的有机或无机物质反应， 导致染料化学连接于该物 质。一般地， 反应性染料和物质上官能团之间的结合反应导致反应性基团 RG 上的一个或更
多原子被包括到将染料连接至该物质的新键中。
一般地， 反应性基团是亲电基团或亲核基团， 它可以通过暴露于分别为亲核基团 或亲电基团的相应的官能团而形成共价键。所选择的亲电基团和亲核基团反应对、 以及由 它们反应产生的共价键的例子， 表示在下表 3 中。
表3
反应性的亲电基团和亲核基团， 以及产生的结合物
亲电基团 活性酯类 * 丙烯酰胺类 酰叠氮类 ** 酰卤类 酰卤类 酰腈类 酰腈类 醛类 醛类或酮类 醛类或酮类 烷基卤类 烷基卤类 烷基卤类 烷基卤类 磺酸烷基酯类 磺酸烷基酯类亲核基团 胺类 / 苯胺类 硫醇类 胺类 / 苯胺类 胺类 / 苯胺类 醇类 / 酚类 醇类 / 酚类 胺类 / 苯胺类 胺类 / 苯胺类 肼类 羟胺类 胺类 / 苯胺类 羧酸类 硫醇类 醇类 / 酚类 硫醇类 羧酸类产生的结合物 羧酰胺类 硫醚类 羧酰胺类 羧酰胺类 酯类 酯类 羧酰胺类 亚胺类 腙类 肟类 烷基胺类 酯类 硫醚类 醚类 硫醚类 酯类27CN 101914093 A说磺酸烷基酯类 酐类 酐类 芳基卤类 芳基卤类 氮丙啶类 硼酸酯类 碳化二亚胺类 重氮烷类 环氧化物 卤乙酰胺类 卤铂酸盐类 卤铂酸盐类 卤铂酸盐类 卤三嗪类 卤三嗪类 亚氨基酯类 异氰酸酯类 异氰酸酯类 异硫氰酸酯类 马来酰亚胺类明书酯类 酯类 羧酰胺类 苯硫酚类 芳胺类 硫醚类 硼酸酯类 N- 酰基脲或酐类 酯类 硫醚类 硫醚类 铂络合物 铂络合物 铂络合物 氨基三嗪类 三嗪醚类 脒类 脲类 氨基甲酸酯类 硫脲类 硫醚类20/42 页醇类 / 酚类 醇类 / 酚类 胺类 / 苯胺类 硫醇类 胺类 硫醇类 二醇类 羧酸类 羧酸类 硫醇类 硫醇类 氨基 杂环 硫醇 胺类 / 苯胺类 醇类 / 酚类 胺类 / 苯胺类 胺类 / 苯胺类 醇类 / 酚类 胺类 / 苯胺类 硫醇类28CN 101914093 A说亚磷酰胺类 甲硅烷基卤 磺酸酯类 磺酸酯类 磺酸酯类 磺酸酯类 磺酰基卤 磺酰基卤 醇类 醇类明书亚磷酸酯类 甲硅烷基醚类 烷基胺类 硫醚类 酯类 醚类 磺酰胺类 磺酸酯类21/42 页胺类 / 苯胺类 硫醇类 羧酸类 醇类 胺类 / 苯胺类 酚类 / 醇类
* 活 性 酯 类， 如 在 现 有 技 术 中 理 解 的 那 样， 通 常 具 有 式 -COW， 其中 W 为好的 离 去 基 团 ( 例 如 琥 珀 酰 亚 胺 氧 基 (succinimidyloxy)(-OC4H4O2) 磺 基 琥 珀 酰 亚 胺 氧 基 (-OC4H3O2-SO3H)， -1- 氧苯并三唑基 (-OC6H4N3) ； 或用于形成活性芳基酯的芳氧基或被吸电 子取代基如硝基、 氟、 氯、 氰基或三氟甲基或其组合一次或多次取代的芳氧基 ； 或被碳化二 亚胺活化以形成酸酐或混合酸酐 -OCOAlk 或 -OCN(Alk1)NH(Alk2) 的羧酸， 其中 Alk1 和 Alk2 可以相同或不同的且为 C1-C20 烷基、 C1-C20 全氟 ( 代 ) 烷基或 C1-C20 烷氧基 ； 或环己基， 3- 二 甲基氨基丙基或 N- 吗啉代乙基 )。
** 酰叠氮也可以重排为异氰酸酯类。
用于使染料连接到被结合的物质上的反应性基团的选择一般取决于被结合的物 质上的官能团以及所希望的共价键的类型和长度。 在有机或无机物质中一般存在的官能团 类型包括， 但不限于， 胺类、 酰胺类、 硫醇、 醇类、 酚类、 醛类、 酮类、 磷酸盐类、 咪唑类、 肼类、 羟胺类、 二取代的胺类、 卤化物、 环氧化物、 羧化物酯类、 磺酸酯类、 嘌呤类、 嘧啶类、 羧酸、 烯 键或这些基团的组合。 单个反应点类型在该物质上是可得的 ( 一般对于多糖来说 )， 或可以 产生多种位点 ( 例如胺类， 硫醇类、 醇类、 酚类 )， 这对于蛋白质来说是典型的。结合的物质 可以结合于不止一种染料， 染料可以是相同或不同的， 或者结合于额外地被半抗原修饰的 物质， 例如生物素。
虽然一些选择性可以通过反应条件的小心控制获得， 但是标记的选择性最好通过 适当的反应性染料的选择而获得。
一般地， 反应性基团 RG 将与胺、 硫醇类、 醇、 醛或酮反应。优选地， RG 与胺或巯基 官能团反应。在一个实施方案中， RG 为丙烯酰胺、 反应性胺 ( 包括尸胺或乙二胺 )、 羧酸的 活性酯 ( 一般为羧酸的琥珀酰亚胺基酯 )、 酰叠氮、 酰基腈、 醛、 烷基卤、 酐、 苯胺、 芳基卤、 叠 氮化物、 氮丙啶、 硼酸酯、 羧酸、 重氮烷、 卤代乙酰胺、 卤代三嗪、 肼 ( 包括酰肼 )、 亚氨基酯、 异氰酸酯、 异硫氰酸酯、 马来酰亚胺、 亚磷酰胺、 反应性铂络合物、 磺酰基卤或巯基基团。 “反
应性铂络合物” 尤其是指例如在美国专利 5,580,990、 5,714,327、 5,985,566 中所描述的化 学反应性铂络合物， 在此引入作为参考。
当 RG 为羧酸的活性酯时， 反应性染料具体地用于制备蛋白质、 核苷酸类、 低聚核 苷酸类或半抗原的染料结合物。当 RG 为马来酰亚胺或卤代乙酰胺时， 反应性染料具体地用 于结合含有巯基的物质。当 RG 为酰肼时， 反应性染料具体地用于结合高碘酸盐氧化的碳水 化合物和糖蛋白类， 而且此外是用于细胞显微注射的醛可固定的极性示踪剂。 优选地， RG 为 羧酸、 羧酸的琥珀酰亚胺基酯、 卤代乙酰胺、 肼、 异硫氰酸酯、 马来酰亚胺基团、 脂肪族胺、 全 氟 ( 代 ) 苯甲酰氨基、 叠氮基全氟 ( 代 ) 苯甲酰氨基或补骨脂素。更优选地， RG 为羧酸的 琥珀酰亚胺基酯、 马来酰亚胺、 碘乙酰胺或反应性的铂络合物。
可 选 择 地， 反 应 性 基 团 RG 为 可 光 活 化 的 基 团， 例 如 叠 氮 化 物、 双吖丙啶基 (diazirinyl)、 叠氮芳基或补骨脂素衍生物， 在这一例子中染料只有在用适当波长的光照 射后才能变成化学反应性的。
反应性染料的合成
本发明的水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基香豆素类是通过 4- 羰基间苯二酚类与杂 环乙酸的基于乙酸酐的缩合或 4- 羰基间苯二酚类与活性亚甲基化合物的碱催化缩合而制 备的。 这些基本结构在合成期间或之后， 被任选地进一步取代， 以给出相应的如上所定义的 香豆素染料取代基。公认的是其中有许多可以产生同等结果的可能变化。本发明的反应 性香豆素染料的典型合成在图 1 中被图解说明。文献中其它已知的香豆素合成方法可以 通过本领域技术人员公知的某些修改而适用于制备本发明的化学反应性的香豆素类 ( 参 见， 例如， Bentsen 等， 美国专利 6,566,508 ； Dittmer 等， 2005， J.Org.Chem.70 ： 4682 ； Shi 等， 2005， 分析化学 33 ： 1452 ； Sivakumar 等， 2004， Org.Lett 6 ： 4603 ； Zhao 等， 2004， J.Am. Chem.Soc.126 ： 4653 ； Huang 等， 1994， J.Chem.Soc.PerkinTrans.1 ： 102 ； 以 及 Kuznetsova 和 Kaliya， 1992， Russ.Chem.Rev.61 ： 1243 ； 它们各自在此引入作为参考 )。
合成含有反应性基团的染料的方法在现有技术中已经有很多文献了。 一般通过将 羟酸与相对酸性的 “离去基团” 相结合而合成胺 - 反应性染料， 例如羧酸的 “活性酯” 。其它 优选的胺 - 反应性基团包括磺酰基卤， 其使用卤化剂如 PCl5 或 POCl3 从磺酸来制备 ； 卤三嗪 类， 其通过氰尿酰卤 (cyanuric halide) 与胺类的反应而制备 ； 以及异氰酸酯类或异硫氰 酸酯类， 其分别通过胺类和光气或硫光气而制备。
具体地用于结合于羧酸、 醛类和酮类的含有胺类和酰肼类的染料， 最经常通过羧 酸的活性酯或磺酰基卤与二胺如尸胺， 或与肼反应来合成。 可选择地， 芳族胺类通常通过硝 基芳族化合物的化学还原而合成。胺类和肼类是通过标准方法合成硫醇类 - 反应性卤乙酰 胺或马来酰亚胺的特别有用的前体。
染料结合物
本发明的反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基香豆素染料可以与各种含有或 经修饰含有具有适合反应性的官能团的有机或无机物质 ( 本文称为 “底物” ) 反应， 导致染 料与该物质相结合。有用的染料结合物除此之外还包括底物为氨基酸、 核苷酸、 生物聚合 物 ( 例如氨基酸聚合物， 核酸聚合物， 多糖， 碳水化合物或脂类 )、 抗原、 类固醇、 维生素、 药 物、 半抗原、 代谢物、 毒素、 环境污染物质、 离子络合结构部分或玻璃、 塑料或者其它非生物 聚合物的结合物。在一些实施方案中， 底物为细胞、 细胞系统、 细胞碎片或组分或亚细胞颗粒 ( 例如， 病毒颗粒， 细菌颗粒或其组分 )。反应性染料一般地标记细胞表面上、 细胞膜、 细 胞器或细胞质中的官能团。
在生物测定中所使用的底物一般地为氨基酸、 核苷酸或生物聚合物， 例如氨基酸 聚合物、 核酸聚合物、 碳水化合物或多糖。染料 - 聚合物结合物可以被制备得引入多种结合 到底物的染料分子以增加来自染料结合物的荧光信号。
在一个实施方案中， 底物是氨基酸或氨基酸聚合物， 例如肽或蛋白质。 本发明可用 的氨基酸聚合物的例子包括， 但不限于， 抗体 ( 如上广泛定义 )、 IgG 结合蛋白质 ( 例如蛋 白质 A、 蛋白质 G、 蛋白质 A/G 等等 )、 酶类、 外源凝集素类、 糖蛋白类、 组蛋白质类、 白蛋白质 类、 脂蛋白质类、 抗生物素蛋白、 抗生物素蛋白、 蛋白质 A、 蛋白质 G、 藻胆蛋白质以及其它荧 光蛋白质、 荷尔蒙类、 毒素、 趋化激素、 生长因子、 神经肽类、 细胞因子类、 毒素、 蛋白质酶底 物以及蛋白质激酶底物。在一个优选的实施方案中， 生物聚合物底物为单克隆抗体。
在另一个实施方案中， 底物为核酸碱、 核苷、 核苷酸或核酸聚合物。核酸聚合物包 括经修饰含有用于与本发明的染料结合的额外的连接体或间隔物的那些， 例如炔基连接体 ( 美国专利 5,047,519)、 氨基烯丙基连接体 ( 美国专利 4,711,955)、 杂原子取代的连接体 ( 美国专利 5,684,142) 或其它连接体。在另一个实施方案中， 结合的物质为核苷或核苷酸 类物， 其通过非环形间隔物连接嘌呤或嘧啶碱至磷酸酯或聚磷酸酯结构部分。在另一个实 施方案中， 染料一般地通过羟基但是选择性地通过巯基或氨基结合于核苷酸或核苷的碳水 化合物部分 ( 例如， 如美国专利 5,659,025 ； 5,668,268 ； 5,679,785 中所描述 )。一般地， 结 合的核苷酸为三磷酸核苷或脱氧三磷酸核苷或双脱氧三磷酸核苷。 向磷酸酯或聚磷酸酯结 构部分中引入亚甲基结构部分或氮或硫杂原子也是有用的。非嘌呤和非嘧啶碱诸如 7- 去 氮杂嘌呤 ( 美国专利 6,150,510) 和含有这种碱的核酸也可以与本发明染料连接。通过脱 嘌呤核酸与胺、 酰肼或羟胺衍生物反应而制备的核酸加合物提供了额外的标记和检测核酸 的方法， 例如 “A methodfor detecting abasic sites in living cells ： age-dependent changes in baseexcision repair” Atamna 等， 2000， Proc Natl Acad Sci 97 ： 686-691。
优选的核酸聚合物结合物是标记的， 单链或多链的、 天然或合成的 DNA 或 RNA、 DNA 或 RNA 低聚核苷酸类、 或 DNA/RNA 混合物， 或引入罕见的连接体如吗啉衍生的磷酸酯类， 或 肽核酸类如 N-(2- 氨基乙基 ) 甘氨酸单元。当核酸为合成的低聚核苷酸时， 其一般地含有 少于 50 个核苷酸， 更为一般地少于 25 个核苷酸。肽核酸类 (PNA) 结合物 (Nielsen 等， 美 国专利 5,539,082) 由于它们通常更快的杂交速率对于一些应用可以是优选的。
在另一个实施方案中， 底物为碳水化合物， 其一般地为多糖如葡聚糖、 肝素、 糖原 质、 支链淀粉、 甘露聚糖、 菊糖、 淀粉、 琼脂糖和纤维素。可选择地， 碳水化合物为多糖， 其为 脂多糖。优选的多糖结合物为葡聚糖或脂多醣结合物。
在另一个实施方案中， 底物为脂质 ( 一般地具有 6-60 个碳 )， 包括糖脂类、 磷脂类、 鞘脂类和类固醇。可选择地， 结合的底物是脂质集合体， 如脂质体。可以使用亲脂性的结构 部分以在细胞中保留结合的物质， 如在美国专利 5,208,148 中描述的那样。本发明的某些 极性染料也可以被捕捉于脂质集合体中。
底物为离子络合结构部分的结合物用作钙、 钠、 镁、 锌、 钾或其它生物学上重 要的金属离子的指示剂。优选的离子络合结构部分为冠醚 ( 美国专利 5,405,975) ； 1， 2- 双 -(2- 氨基苯氧基乙烷 )-N， N， N′， N′ - 四乙酸的衍生物 (BAPTA 螯合剂 ； 美国专利5,453,517、 5,516,911 和 5,049,673) ； 2- 羧基甲氧基苯胺 -N， N- 二 - 乙酸的衍生物 (APTRA 螯合剂 ； Am.J.Physiol.256， C540(1989)) ； 或基于吡啶和二氮杂菲的金属离子螯合剂 ( 美 国专利 5,648,270) ； 或次氨基三乙酸的衍生物， 参见例如 “Single-step synthesis and characterization ofbiotinylated nitrilotriacetic acid， a unique reagent for the detectionof histidine-tagged proteins immobilized on nitrocellulose” ， McMahan 等， 1996， Anal Biochem 236 ： 101-106。优选地， 离子络合结构部分为冠醚螯合剂、 BAPTA 螯 合剂、 APTRA 螯合剂或次氨基三乙酸的衍生物。
其它非生物材料的结合物包括以下物质的染料结合物 ： 有机或无机聚合物、 聚合 薄膜、 聚合晶片 (polymeric wafers)、 高分子膜、 聚合颗粒或聚合微粒 ； 包括磁性或非磁性 微球 ； 铁、 金或银颗粒 ； 传导和非传导金属以及非金属 ； 以及玻璃和塑料表面及颗粒。通过 制备聚合物时含有合适官能团的染料的共聚作用， 或通过含有具有合适化学反应性的官能 团的聚合物的化学修饰， 来任选地制备结合物。用于制备聚合物的染料结合物的其它类型 的反应包括催化聚合作用或烯烃的共聚作用以及二烯与二烯亲合物的反应、 酯交换作用或 转氨基作用。
在一些实施方案中， 染料结合物进一步被至少一种第二发光染料 ( 其任选地为本 发明的额外染料 ) 所标记， 以形成能量传递对。在本发明的某些方面， 被标记的结合物起到 酶底物的作用， 并且酶水解作用使能量传递中断。 荧光染料 - 结合物， 尤其其中底物是生物聚合物时， 每一个底物分子可以引入多 个染料以增大荧光信号。 优选地， 至少 3 个染料分子被引入染料生物 - 聚合物结合物中。 在 生物聚合物为抗体的实施方案中， 至少三个或更优选至少 6 个染料分子被结合到抗体。在 一些实施方案中， 多达约 35 个染料分子可以结合到抗体而不会有显著的自猝灭， 但是更通 常是多达约 15-20 个。本领域技术人员可以理解的是， 每个结合物底物的染料各自所述的 范围旨在描述为在这一范围中的所有值。 因此， 例如， 通过说明本发明的荧光生物聚合物含 有 6-15 个染料分子， 含有 6、 7、 8、 ...、 或 15 个染料分子的生物聚合物也是本发明的一部分。
染料 - 结合物的制备
本发明的荧光染料 - 结合物一般地作为底物和反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基香豆素染料之间的反应产物而被合成。使用反应性染料制备染料结合物有很多 文献记载， 例如 Hermanson， 1996， Biocojugate Techniques(Academic Press， New York， NY) ； Haugland， 1995， Methods Mol.Biol.45 ： 205-21 ； 以及 Brinkley 1992， Bioconjugate Chemistry 3 ： 2， 各自在此引入作为参考。 结合物一般由将合适的反应性染料与待结合的物 质在二者都在其中可溶的合适的溶剂中混合而得到。 本文描述的反应性的、 水溶性的、 杂环 取代的 7- 羟基香豆素染料类的水溶液容易制造， 使与大部分生物材料的结合反应变得容 易。对于这些光活化的反应性染料， 结合作用需要照射反应混合物以活化反应性染料。
本发明的荧光生物聚合物一般作为生物聚合物和反应性的、 水溶性的、 杂环取代 的 7- 羟基香豆素染料之间的反应产物而被合成， 其中反应条件导致多种染料分子结合于 每个生物聚合物。 可选择地， 荧光生物聚合物可以通过亚单位分子的聚合反应而被合成， 其 中一种或多种亚单位分子已经先于生物聚合物的聚合作用被结合至反应性的、 水溶性的、 杂环取代的 7- 羟基香豆素中。后面一种方法的例子为使用标准的亚磷酰胺化学作用合成 低聚核苷酸， 其中至少一种亚磷酰胺是染料标记的。
应用以及使用方法
在发明的一个方面， 本发明的反应性染料被用于直接染色或标记样品或样品的组 分， 以便可以鉴定或定量化该样品。 如上所述， 化学反应性染料化合物将共价结合于在各种 各样材料上的相应的官能团， 形成染料结合物。
在优选的实施方式中， 本发明的反应性染料化合物被用于直接染色或标记有生物 组分的样品。样品可以包括非均匀的组分混合物 ( 包括完整的细胞、 细胞提取物、 细菌、 病 毒、 细胞器及它们的混合物 )、 或单一的组分或均匀的组分组 ( 例如天然或合成的氨基酸、 核酸或碳水化合物聚合物或类脂膜络合物 )。这些染料在一般使用的浓度内通常对活细胞 以及其它生物组分是没有毒性的。
为了直接染色， 染料化合物与样品以有利于染料化合物与感兴趣的样品组分之间 的接触的任意方式混合。一般地， 染料化合物或含有染料化合物的溶液被简单地加入至样 品。 本发明的某些染料， 尤其是被一个或多个磺酸结构部分取代的那些， 往往对生物细胞膜 是非渗透的， 且一旦处于活细胞内部就一般被很好地保留。 使质膜可渗透化的处理， 例如电 穿孔、 振动处理或者高细胞外 ATP 可以用于将所选择的染料化合物导入到细胞中。可选择 地， 所选的染料化合物可以物理上插入细胞中， 例如通过压力显微注射、 刮除负载、 修补钳 方法或吞噬作用。 引入脂族胺或肼残基的染料可以被显微注射入细胞中， 其中它们可以通过醛固定 剂例如甲醛或戊二醛固定于某位置。 这一固定能力使得所述染料对于细胞内应用例如神经 元追踪是有用的。
具有亲脂性取代基例如磷脂的染料化合物将非共价结合入脂质集合体中， 例如用 作膜结构的探针 ； 或用于在脂质体、 脂蛋白质、 薄膜、 塑料、 亲脂性微球体或类似材料中的引 入； 或用于追踪。亲脂性染料作为膜结构的荧光探针是有用的。
为了在生物应用中直接对被分析物进行染色， 本发明染料化合物一般在根据本领 域公知的方法制备的含水的、 大部分含水的或可与水混溶的溶液中使用。染料化合物的准 确浓度取决于试验条件以及所希望的结果， 但是一般地是从约 1 纳摩尔至 1 毫摩尔或更多 的范围。通过系统性变化直至实现有最小背景荧光的满意结果而测定最佳浓度。
在本发明的另一方面， 本发明的荧光染料 - 结合物作为检测试剂或作为检测试剂 的一部分用以促进被分析物的光学检测和分析， 所述检测试剂一般地为被分析物 - 特异性 检测试剂。在一个实施方案中， 染料 - 结合物底物自身是被分析物 - 特异性试剂， 并且荧光 染料结合物被用作检测试剂以标记感兴趣的被分析物。在一个可选择的实施方案中， 荧光 染料 - 结合物被结合于被分析物 - 特异性试剂， 并且该组合的实体被用作检测试剂以标记 感兴趣的被分析物。在这一可选择的实施方案中， 染料结合物作为结合于被分析物 - 特异 性试剂的荧光标记。
其中使用被分析物特异性检测试剂标记一种或多种感兴趣的被分析物并且随后 进行光学分析的分析方法是本领域公知的， 并且当前的荧光染料 - 结合物在所述测定中 通常用作检测试剂。例如， 样品中的蛋白质可以使用由可以特异性结合于被分析物蛋白 质的标记蛋白质 ( 一般为抗体 ) 组成的检测试剂来标记。所得的被标记的被分析物蛋白 质的检测可以使用许多公知的分析格式和仪器来实现， 包括使用流动细胞计数法、 扫描细 胞计数法、 图像和凝胶分析。流动细胞计数法在这一领域的大量文献中被详尽地描述， 包
括例如， Landy 等 (eds.)， Clinical Flow Cytometry， Annals of the New York Academy of Sciences 677 卷 (1993) ； Bauer 等 (eds)， Clinical Flow Cytometry ： Principles andApplications ， Williams & Wilkins(1993) ； Ormerod(ed.) ， Flow Cytometry ： A Practical Approach， Oxford Univ.Press(1997) ； Jaroszeski 等 (eds.)， Flow Cytometry Protocols， Methods in Molecular Biology 第 91 期， HumanaPress(1997) ； 以及 Practical Shapiro， FlowCytometry， 第 4 版， Wiley-Liss(2003) ； 所有在此引入作为参考。荧光显微 成像公开在， 例如， Pawley(ed)， Handbook of Biological Confocal Microscopy， 第 2 版， Plenum Press(1989) 中， 其在此引入作为参考。
用于激发本发明的荧光聚合物的照明光源包括， 但不限于， 手提式紫外灯、 汞弧光 灯、 氙气灯、 激光和激光二极管。 这些照明光源任选地整合入激光扫描仪、 荧光微板读数仪、 标准或小型荧光计或者色谱检测器中。本发明优选的荧光聚合物在或接近于 405nm 处是可 激发的， 并且可以使用相对廉价的紫激光激发源来激发。
试剂盒
本发明的一个方面为使得使用如上所述的本发明的任一种染料的各种分析实践 容易进行的试剂盒形式。本发明的试剂盒一般包括本发明的有色的或荧光染料， 其或者以 用于制备染料 - 结合物的化学反应性标记物的形式存在， 或者以染料结合物的形式存在， 其中结合的物质为特异性结合对成员或者核苷、 核苷酸、 低聚核苷酸、 核酸聚合物、 肽或者 蛋白质。该试剂盒任选地进一步包括一种或多种缓冲试剂， 其一般地以水溶液存在。本发 明的试剂盒任选地进一步包括额外的检测试剂、 用于纯化所得标记的物质的纯化介质、 标 准光源 (luminescence standards)、 酶、 酶抑制剂、 有机溶剂或者用于进行本发明分析的说 明书。 实施例 下列实施例中提供所选染料的合成策略、 所选荧光生物聚合物的合成、 它们的特 征描述以及使用方法的例子。进一步的修改以及变化对本领域技术人员来说是显而易见 的。 给出下列实施例以举例说明本发明的实践， 并且不打算限制或限定本发明的整个范围。
实施例 1
化合物 1 的制备
化合物 1将 4- 氯间苯二酚 (50g) 溶于无水乙醚中 (200ml)。 在搅拌下往溶液中加入精细粉 末化的氰化锌 (60g) 以及氯化钾 (12g)。该悬浮液被冷却至 0℃。一股强烈的氯化氢气体 流在剧烈搅拌下被吹入溶液中。在大约 30-60 分钟后反应物得到溶解。氯化氢气体的加入 持续到它在乙醚溶液中的吸收停止为止。悬浮液在冰上继续搅拌一个小时。该乙醚溶液从 被冰处理过的固体中倾倒而出并且水浴加热至 100℃。 冷却后， 产品以有光泽的片的形式从 溶液中结晶出来， 通过过滤移出产品并且风干以给出所希望的醛。
实施例 2
化合物 2 的制备
化合物 22- 噻吩乙酸乙酯 (10g) 与 6- 溴己酸乙酯 (12g) 溶解于二氯甲烷 (200ml) 中。在 干燥氮气保护下伴随着剧烈搅拌于 0℃下往溶液中加入无水 AlCl3(24g)。在干燥氮气保护 下于 0℃下搅拌反应混合物， 并且当通过 TLC 表明反应已经完成时加热至室温。 反应混合物 被倒入冰水中， 并且用氯仿 (3×200ml) 进行萃取。合并氯仿层， 用无水 Na2SO4 干燥， 并且在 真空下除去溶剂以给出粗固体。粗固体进一步用一定梯度的氯仿 / 乙酸乙酯作为洗脱液在 硅胶柱上纯化以生成所希望的化合物 2。
实施例 3
化合物 3 的制备
化合物 3化合物 2(10g) 溶于乙醇中 (100ml)。往溶液中加入 5M NaOH(65ml)。在室温下搅 拌反应混合物， 并且当通过 TLC 表明反应已经完成时用浓 HCl 中和。所得到的反应混合物 用乙酸乙酯 (3×200ml) 进行萃取。合并乙酸乙酯层， 用无水 Na2SO4 干燥， 并且在真空下除 去溶剂以给出所希望的化合物 3。
实施例 4
化合物 4 的制备
化合物 4将化合物 1(6g) 和化合物 3(5.8g) 悬浮于乙酸酐 (100ml) 中。在室温下往悬浮液 中加入三乙胺 (6ml)。 于 120-140℃下加热反应混合物直至通过 TLC 表明反应已经完成。 冷 却至室温后， 将混合物倾倒入冰水中， 并且抽滤生成的沉淀物从而收集固体， 风干该固体。 重结晶粗产物以获得所希望的化合物 4。
实施例 5
化合物 5 的制备
化合物 5将化合物 4(5g) 悬浮于 20 ％ HCl(300ml) 中。于 60-70 ℃下加热反应混合物直 至通过 TLC 表明反应已经完全。用水 (200ml) 对反应混合物进行稀释， 并且用乙酸乙酯 (3×300ml) 进行萃取。合并乙酸乙酯层， 用无水 Na2SO4 干燥， 并且在真空下除去溶剂以给 出粗化合物 5。粗物质进一步用一定梯度的氯仿 / 甲醇作为洗脱液在硅胶柱上纯化以生成 所希望的化合物 5。
实施例 6
化合物 6 的制备
化合物 6将化合物 5(1g) 悬浮于浓 H2SO4(5ml) 中。往悬浮液中加入 20％发烟 H2SO4(5ml)。 反应混合物于 0℃下搅拌直至通过 TLC 表明反应已经完成。 往冷乙醚 (200ml) 中滴加反应混 合物并伴随着剧烈搅拌以获得作为黄色沉淀物的粗化合物 6。粗物质进一步通过制备 HPLC 使用在水中的 0.1％ TFA- 在 MeCN 缓冲系统中的 0.1％ TFA 进行纯化以产生所希望的化合 物 6。
实施例 7
化合物 7 的制备
化合物 7化合物 6(100mg) 和 N， N′ - 二琥珀酰亚胺基碳酸酯 (85mg) 溶于 DMF(5ml) 中。在 干燥氮气保护下伴随着剧烈搅拌于室温下往溶液中加入 4- 二甲基氨基吡啶 (5mg) 以及无 水三乙胺 (0.1ml)。在干燥氮气保护下在室温下搅拌反应混合物直至通过 TLC 表明反应已 经完成。反应混合物被倒入乙醚中， 并且通过过滤收集所得沉淀物。该固体用乙醚洗涤以 生成所希望的化合物 7。
实施例 8
化合物 8 的制备
化合物 8往 在 DMF(0.5ml) 中 的 无 水 肼 (100μl) 中 加 入 在 DMF(0.5ml) 中 的 化 合 物 7(100mg)。混合物于环境温度下搅拌 15 分钟。将反应溶液倾倒入水中， 并且离心分离所得 沉淀物以收集固体， 该固体用水洗涤并且风干。粗产物进一步用 HPLC 纯化。
实施例 9
化合物 9 的制备
化合物 9在室温下向在 DMF(0.2ml) 中的化合物 7(10mg) 中加入 4 当量的三乙胺和 1.2 当 量的 N-(2- 氨基乙基 ) 马来酰亚胺、 三氟乙酸盐 (Sigma-Aldrich)。 混合物于环境温度下搅 拌 60 分钟。将 DMF 溶液倾倒入水中， 并且离心分离所得悬浮物以收集固体， 该固体被风干。 粗产物进一步用硅胶色谱纯化以产生所希望的化合物 9。
实施例 10
化合物 10 的制备
化合物 10化合物 10 从 4- 氯 -2- 氟间苯二酚 (Fanbo Biochemicals 公司， 中国， 北京 ) 制备 得到， 类似于制备化合物 1 的步骤。
实施例 11
化合物 11 的制备
化合物 11
化合物 11 从化合物 10 与化合物 3 的缩合制备得到， 类似于制备化合物 4 的步骤。 实施例 12 化合物 12 的制备
化合物 12化合物 12 从用 20％ HCl 进行的化合物 11 的酸性水解来制备， 类似于制备化合物 5 的步骤。
实施例 13
化合物 13 的制备
化合物 13
化合物 13 从化合物 12 的磺化作用制备得到， 类似于制备化合物 6 的步骤。 实施例 14 化合物 14 的制备
化合物 14化合物 14 从化合物 13 与 N， N′ - 二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到， 类似 于制备化合物 7 的步骤。
实施例 15
化合物 15 的制备
化合物 15化合物 15 从 2， 4- 二氯间苯二酚 (Fanbo Biochemicals 公司 ) 制备得到， 类似于 制备化合物 1 的步骤。
实施例 16
化合物 16 的制备
化合物 16
化合物 16 从化合物 15 与化合物 3 的缩合制备得到， 类似于制备化合物 4 的步骤。 实施例 17 化合物 17 的制备
化合物 17化合物 17 从用 20％ HCl 进行的化合物 16 的酸性水解来制备， 类似于制备化合物 5 的步骤。
实施例 18
化合物 18 的制备
化合物 18
化合物 18 从化合物 17 的磺化作用制备得到， 类似于制备化合物 6 的步骤。 实施例 19 化合物 19 的制备
化合物 19化合物 19 从化合物 18 与 N， N′ - 二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到， 类似 于制备化合物 7 的步骤。
实施例 20
化合物 20 的制备
化合物 20将 2- 噻吩乙酸乙酯 (5g) 与 4- 溴甲基苯甲酸甲酯 (6.2g) 溶解于二氯甲烷 (200ml) 中。在干燥氮气保护下伴随着剧烈搅拌于 0℃下往溶液中加入无水 AlCl3(12g)。在干燥氮 气保护下于 0℃下搅拌反应混合物， 并且当通过 TLC 表明反应已经完成时加热至室温。反 应混合物被倒入冰水中， 并且用氯仿 (3×200ml) 进行萃取。合并氯仿层， 用无水 Na2SO4 干 燥， 并且在真空下除去溶剂以给出粗固体。粗固体进一步用一定梯度的氯仿 / 乙酸乙酯作 为洗脱液在硅胶柱上纯化以生成所希望的化合物 20。
实施例 21
化合物 21 的制备
化合物 21将化合物 20(5g) 溶于乙醇 (50ml) 中。往溶液中加入 5M NaOH(65ml)。在室温下 搅拌反应混合物， 并且当通过 TLC 表明反应已经完成时用浓 HCl 中和。反应混合物用乙酸 并且在真空下除去溶剂 乙酯 (3×200ml) 进行萃取。合并乙酸乙酯层， 用无水 Na2SO4 干燥， 以给出所希望的化合物 21。
实施例 22
化合物 22 的制备
化合物 22
化合物 22 从化合物 21 与化合物 1 的缩合制备得到， 类似于制备化合物 4 的步骤。 实施例 23 化合物 23 的制备
化合物 23化合物 23 从用 20％ HCl 进行的化合物 22 的酸性水解来制备， 类似于制备化合物 5 的步骤。
实施例 24
化合物 24 的制备
化合物 24
化合物 24 从化合物 23 的磺化作用制备得到， 类似于制备化合物 6 的步骤。 实施例 25 化合物 25 的制备
化合物 25化合物 25 从化合物 24 与 N， N′ - 二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到， 类似 于制备化合物 7 的步骤。
实施例 26
化合物 26 的制备
化合物 26将 化 合 物 1(1g) 和 2， 5- 二 羧 甲 基 噻 吩 (6g， Sigma-Aldrich) 悬 浮 于 乙 酸 酐 (100ml) 中。在室温下往悬浮液中加入三乙胺 (6ml)。于 120-140℃下加热所得到的反应混 合物直至通过 TLC 表明反应已经完成。冷却至室温后， 将混合物倾倒入冰水中， 并且抽滤得 到的沉淀物从而收集固体， 风干该固体。粗固体进一步用一定梯度的氯仿 / 甲醇作为洗脱 液在硅胶柱上纯化以生成所希望的化合物 26。
实施例 27
化合物 27 的制备
化合物 27化合物 27 从用 20％ HCl 进行的化合物 26 的酸性水解来制备， 类似于制备化合物 5 的步骤。
实施例 28
化合物 28 的制备
化合物 28
化合物 28 从化合物 27 的磺化作用制备得到， 类似于制备化合物 6 的步骤。 实施例 29 化合物 29 的制备
化合物 29化合物 29 从化合物 24 与 N， N′ - 二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到， 类似 于制备化合物 7 的步骤。
实施例 30
化合物 30 的制备
化合物 30化合物 30 从 2， 4- 二羟基 -5- 甲酰基苯甲酸 (Fanbo Biochemicals 公司 ) 与 2- 噻 吩乙酸的缩合制备得到， 类似于制备化合物 4 的步骤。
实施例 31
化合物 31 的制备
化合物 31化合物 31 从用 20％ HCl 进行的化合物 30 的酸性水解来制备， 类似于制备化合物 5 的步骤。
实施例 32化合物 32 的制备
化合物 32
化合物 32 从化合物 31 的磺化作用制备得到， 类似于制备化合物 6 的步骤。 实施例 33 化合物 33 的制备
化合物 33化合物 33 从化合物 32 与 N， N′ - 二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到， 类似 于制备化合物 7 的步骤。
实施例 34 化合物 34 的制备
化合物 34将 2- 苯并噻唑乙酸乙酯 (5g， Sigma-Aldrich)、 2， 4- 二羟基 -5- 甲酰基苯甲酸 (2g， Fanbo Biochemicals 公司 )， 0.5ml 哌啶与 0.3ml 乙酸在 100ml 甲醇中在回流下加热 至通过 TLC 表明反应已经完成。冷却至室温后， 过滤该混合物并且浓缩滤液。把浓缩的滤 液倾倒入水中， 并且抽滤所得到的沉淀物从而收集固体， 风干该固体。 粗产品进一步用硅胶 色谱纯化以生成所希望的化合物 34。
实施例 35
化合物 35 的制备
化合物 35
化合物 35 从化合物 34 的磺化作用制备得到， 类似于制备化合物 6 的步骤。 实施例 36 化合物 36 的制备
化合物 36化合物 36 从化合物 35 与 N， N′ - 二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到， 类似 于制备化合物 7 的步骤。
实施例 37
化合物 37 的制备
化合物 37将甲基 4- 羧甲基吡啶 (Methyl 4-carboxymethylpyridine)(5g) 和 6- 溴己酸甲 酯 (8g) 在 1， 2- 二氯苯 (50ml) 中加热至通过 TLC 表明反应已经完成。冷却至室温后， 过滤 该混合物以收集固体， 该固体用乙醚洗涤并且风干。粗产物无需进一步纯化被直接用于下 一步反应中。
实施例 38
化合物 38 的制备
化合物 38化合物 38 从化合物 37 与间苯二酚的哌啶催化的缩合制备得到， 类似于制备化合 物 34 的步骤。
实施例 39
化合物 39 的制备
化合物 39
化合物 39 从化合物 38 的水解作用制备得到， 类似于制备化合物 5 的步骤。 实施例 40 化合物 40 的制备
化合物 40化合物 40 从化合物 39 与 N， N′ - 二琥珀酰亚胺基碳酸酯的缩合制备得到， 类似 于制备化合物 7 的步骤。
实施例 41
蛋白质 - 染料结合物的制备
蛋白质 - 染料结合物可以通过标准方法制备得到， 如那些在例如 Haugland 等， 1995 ， Meth.Mol.Biol.45 ： 205 ； Haugland ， 1995 ， Meth.Mol.Biol.45 ： 223 ； Haugland ， 1995， Meth.Mol.Biol.45 ： 235 ； Haugland， 2000， CurrentProtocols In Cell Biology 16.5.1-16.5.22 中描述的， 其各自在此引入作为参考。 例如， 蛋白质 - 染料结合物可以使用 本发明的琥珀酰亚胺基酯制备得到， 如下所述。
制备约 10mg/mL 的蛋白质在 0.1M 碳酸氢钠中的溶液。将标记试剂以约 10mg/mL 的浓度溶于适合的溶剂例如水或 DMF 或 DMSO 中。在搅拌下将预定量的标记试剂加入蛋白 质溶液中。反应混合物于室温下培养一个小时或于冰上培养几个小时。染料 - 蛋白质结合 物一般地通过尺寸排阻色谱例如用磷酸缓冲盐水 (PBS) 平衡的 Amersham PD-10 树脂 (GE Healthcare Bio-Sciences 公司， Piscataway， NJ) 与游离未反应的试剂分离开。收集最初 的、 含有蛋白质的染色带并且使用游离荧光团的吸光系数由各荧光团的吸光度极大值处的 吸光度测定取代的程度。由此获得的染料 - 蛋白质结合物可以再分级以产生有更高、 更低 或更均匀 DOS 的结合物。
对于许多应用， 例如用于生产染料标记的抗体， 使用 10 至 50 当量染料比 1 当量 蛋白质的摩尔比。可以理解的是， 最佳的反应条件和反应物浓度一般根据经验来决定。染 料 - 蛋白质结合的优化方法在本领域是公知的， 并且例如在此处引用的参考文献中所描 述。
实施例 42
抗体 - 染料结合物的制备
下面描述制备 IgG 单克隆抗体的染料结合物的优选方案。如下所注解的， 基本上 使用该样品方案制备化合物 7、 13、 14、 19、 25 和 60 的染料 - 结合物， 并有微小变动。
步骤 1. 制备抗体溶液 ： 以约 2-20mg/ml 的浓度制备抗体在标记缓冲液 (0.05M NaPi， pH 8.0+0.15M NaCl+20％甘油 ) 中的溶液。
溶液中抗体的浓度可以利用比尔 - 兰伯特定律 (A280 ＝ εp·C·L) 计算出来， 其中 A280 是在 280nm( 其为蛋白质的最大吸收波长 ) 处测量的吸光度， εp 是抗体蛋白质的摩尔 吸光系数， C 是浓度， 以及 L 是通过溶液的光程长度。典型的 IgG 抗体有 224,000cm-1M-1 的 εp 值。
步骤 2. 制备染料溶液 ： 通过将染料溶解在 DMSO 中制备染料溶液。如下所述测定 染料溶液的浓度。染料浓度测量的精确性可以通过先在 pH 9.6 的 1M 甘氨酸中以 1/100 稀
释染料而得以提高。
溶液中染料的浓度可以利用比尔 - 兰伯特定律 ： Amax ＝ ε 染料·C·L 计算出来， 其 中 Amax 是在染料的最大吸收波长处测量的吸光度， ε 染料是染料的摩尔吸光系数， C 是浓度， 以及 L 是通过溶液的光程长度。作为一个例子， 化合物 7 酰胺的最大吸收波长约为 415nm。 对于其它染料化合物， 反应性染料的最大吸收波长应该在结合前测量。
步骤 3. 进行结合反应 ： 计算抗体和染料溶液的量以在反应中获得预期的摩尔过 量的染料。为了优化研究， 使用一定范围摩尔过量的染料进行反应， 一般介于 2× 和 60× 之间的摩尔过量的染料。 伴随着有效的搅拌或振荡， 将抗体溶液加入到染料溶液中， 并且保 持反应混合物搅拌或振荡 1-2 小时以获得抗体 - 染料结合物。
步骤 4. 纯化结合物 ： 抗体 - 染料结合物可以使用 Bio-Spin 柱进行纯化。装载 50μl 的抗体 - 染料结合物溶液以及 50μl 的追踪 (chase) 缓冲液 (PBS+20％甘油 +0.1％ NaN3) 于 Bio-Spin 柱上， 将 1ml chase 缓冲液放入旋转 (spin) 柱的接收管中， 并且分离。 分 离后涡旋。
可选择地， 按照制造者的方案， 抗体 - 染料结合物可以使用 PD-10 柱 (Amersham Biosciences， Piscataway， NJ) 进行纯化。
步骤 5. 测定抗体 - 染料结合物的取代度 ： 取代度 (DOS) 使用下列等式进行计算 ：
DOS ＝ [ 染料 ]/[ 抗体 ] ＝ Amax·εp/ε 染料·(A280-0.55·Amax))，
其中 [ 染料 ] 是染料浓度， [ 抗体 ] 是抗体浓度， Amax 是在染料的最大吸收波长处 测量的吸光度， A280 是在 280nm 处测量的吸光度， εp 是抗体蛋白质的摩尔吸光系数， ε 染料 是染料的摩尔吸光系数。应当注意到的是， 为获得准确的 DOS， 结合物不应该有未结合的染 料。
为了有效地标记， 取代度一般应落入 3-20 摩尔染料比一摩尔抗体的范围之间。作 为本领域公知的， 提供最佳标记的 DOS 将取决于抗体， 以及在某些情况下， 更高的 DOS 可能 提供提高的标记。通过制备一定范围 DOS 的染料结合物并比较测得的荧光强度来经验性地 决定最佳标记。例子公开在图中。
实施例 43
高碘酸盐氧化的糖蛋白类的染料结合物的制备
在 pH 5.5 的 1mL 0.1M 乙酸盐、 0.135M NaCl 中的 5mg 山羊 IgG 抗体样品 ( 其具 有连接于蛋白质的多糖链 ) 用 2.1mg 偏高碘酸钠在冰上处理根据经验判断的足以使糖蛋白 上有所希望量的醛基的一段时间， 其随后与化合物 5 反应。通过加入 30μL 乙二醇停止反 应。在填充于 pH 7.2 的 PBS 中的 Sephadex G25 柱上纯化抗体。加入十分之一体积的 1M 碳 酸氢钠以提高 pH 并且以 50 ∶ 1 的染料与蛋白质的摩尔比加入化合物 5。反应物在室温下 搅拌根据经验判断的足以产生所希望染料 / 蛋白质比例的一段时间。加入氰基硼氢化钠至 10mM 的最终浓度并且在室温下搅拌反应物 4 个小时。通过透析并在如上所述的 Sephadex G25 柱上纯化抗体结合物。 凝胶中和污渍上的高碘酸盐氧化的糖蛋白也能被标记， 基本上如 Estep 和 Miller， 1986， Anal.Biochem.157 ： 100-105 中所述， 在此引入作为参考。
实施例 44
使用巯基 - 反应性染料制备蛋白质 - 染料结合物
制备 β- 半乳糖苷酶 ( 一种富含游离巯基基团的蛋白质 ) 在 PBS 中的溶液 (2.0mg在 400μL 中 )。随后用在 DMF 中的马来酰亚胺衍生物化合物 9 的 10mg/L 溶液处理该蛋白 质溶液。在旋转柱上移除未反应的染料。如实施例 42 中所描述的那样， 使用游离染料的吸 光系数估计被染料取代的程度。校正化合物 9 在 280nm 波长处的吸光度， 由 280nm 处的吸 光度估算蛋白质浓度。
实施例 45
氨基葡聚糖 - 染料结合物的制备
如下所述制备氨基葡聚糖一染料结合物， 使用用平均 13 个氨基衍生的 70,000MW 氨基葡聚糖 (50mg) 作为例子进行描述。将氨基葡聚糖 (50mg) 以 10mg/mL 溶解于 0.1M NaHCO3 中。加入化合物 7、 13、 14、 19、 25 或 60 以给出约 10-15 的染料 / 葡聚糖比例。6-12 个小时后， 所得结合物在 SEPHADEX G-50 上纯化并且用水洗脱。一般 6-10 摩尔染料被结合 至 70,000MW 葡聚糖上。
实施例 46
染料标记的微球体的制备
可以使用许多公知方案的任意一种用本发明的染料来标记微球体。 例子在下面被 描述。
进行化学修饰使表面上有官能团例如氨基、 羧基或醛的微球体可以通过表面基团 共价结合相应的如表 1 中所列的反应性染料而被表面标记。例如， 胺修饰的微球体可以容 易地通过琥珀酰亚胺基酯例如化合物 7、 13、 14、 19、 25 或 60 而结合本发明的染料。
如上所述制备的染料标记的蛋白质， 可以通过它的胺残基使用乙基 3-( 二甲氨基 丙基 ) 碳化二亚胺 (EDAC) 被共价偶联至微球体上的羧化物基团。可选择地， 染料标记的蛋 白质可以被动地吸附在微球体上。例如， 羧化物修饰的微球体被悬浮于溶液染料标记的蛋 白质中， 该蛋白质允许被动地吸附于微球体上， 并且过量的蛋白质通过离心分离作用以及 洗涤除去。不能被离心分离的这一尺寸的微粒利用经过有高 MW 截断的半透膜的透析或凝 胶过滤层析与过量蛋白质中分离开。
如上所述， 生物素化的微球体可以用结合至本发明的染料的链霉抗生物素蛋白、 抗生物素蛋白或抗生物素进行处理。
实施例 47
核苷酸 - 染料结合物的制备
与本发明的染料结合的核苷酸可以通过本领域技术人员根据公知或出版的步骤 例 如 那 些 公 开 在 M.Nimmakayalu 等， 2000， Biotechniques 28， 518-522 ； Muhlegger 等， 1990， Biol Chem Hoppe Seyler 371， 953-965 ； 和 Giaid 等， 1989， Histochemistry 93， 191-196 中的步骤轻易地制备得到， 其各自在此引入作为参考。 在下面描述了具体的结合的 例子。
向在 100μl 水中的 2mg 5-(3- 氨基烯丙基 )-2 ′ - 脱氧尿苷 5 ′ - 三磷酸酯 (Sigma-Aldrich) 中， 加入在 100μL DMF 中的化合物 7、 13、 14、 19、 25 或 60 和 5μL 三乙胺。 在 3 个小时后， 蒸发溶液并且通过 HPLC 纯化残留物。对产物部分进行冻干以给出荧光核苷 酸结合物。
可选择地， 脱氧尿苷 5′ - 三磷酸酯的荧光染料 - 结合物从 5-(3- 氨基 -1- 丙炔 基 )-2′ - 脱氧尿苷 5′ - 三磷酸盐来制备， 或者通过用本发明的巯基 - 反应性的染料 ( 例如马来酰亚胺化合物 9) 处理巯基化的核苷酸或硫代磷酸酯核苷酸来制备。
可选择地， 2′ -( 或 3′ )-2- 氨乙基氨基羰基腺苷 5′ - 三磷酸酯与稍微过量的 化合物 7、 13、 14、 19、 25 或 60 进行反应， 接着用乙醇沉淀， 利用制备 HPLC 纯化核糖修饰的产 物。
实施例 48
低聚核苷酸 - 染料结合物的制备
将 5′ - 胺修饰的、 18- 碱 M13 引物序列 ( 约 100μg) 溶解于 4μl 水中。往其中 加入在 pH 8.5 的 100μl 0.1M 硼酸钠中的 250μg 化合物 7、 13、 14、 19、 25 或 60。在 16 个 小时后， 加入 10μl 5M NaCl 和 3 体积的冷乙醇。 将混合物冷却至 -20℃、 离心分离， 将上清 液倾倒出， 用乙醇洗涤颗粒， 并且随后将颗粒溶解于 100μL 水中。被标记的低聚核苷酸通 过 HPLC 被纯化。收集所希望的峰并且蒸发给出发荧光的低聚核苷酸 - 染料结合物。
实施例 49
使用染料 - 抗体结合物通过流式细胞计数法进行细胞分析
结合了本发明的染料化合物的被分析物 - 特异性抗体 ( 即标记的抗体 ) 用于通过 流式细胞计数法进行血细胞 ( 例如， 在全血样品中 ) 分析。所标记的抗体用于标记 ( 染色 ) 细胞的蛋白质， 并且使用流式细胞计数仪测定所标记的蛋白质。
全血的样品 (100μL)( 优选收集在 EDTA 中 ) 一般在黑暗中以每 0.1ml 血液 1μg 或更少的染料结合物浓度用抗体 - 染料结合物染色 30-60 分钟。 染色后， 将 2mL 的 1×FACSTM 溶解溶液 (Lysing Solution)(BD Bioscience， San Jose， CA) 加入到样品中， 样品在旋涡搅 拌器中以中等速度混合并且随后室温培养 10 分钟。以 2-500g( 优选 2-300) 离心样品 5 分 钟并且倾倒出上清液。 洗涤样品 ( 在 2mL 0.5％ BSA/PBS 洗涤缓冲液中再悬浮、 混合并且离 心 ) 两次， 在 0.5mL 洗涤缓冲液或 150μl 定色稳定缓冲液中再悬浮， 并且保持在 4℃直至进 行流式细胞计数分析。
染色细胞的分析优选使用配备有蓝色 (488nm)、 红色 (-633nm) 和紫色 (405nm) 激 光的 BD LSR II 流式细胞计数仪 (BD Biosciences， San Jose， CA) 来实现。检测光学包括 在 525/50nm 荧光检测通道中进行检测。结合了染料化合物例如化合物 7、 13 和 25 的荧光 生物聚合物显示出密切匹配紫激光的 405nm 发射的激发极大值， 并且来自生物聚合物的发 射在 525/50nm 检测通道中进行测量。根据制造者的指令设定流式细胞计数仪。染色细胞 样品的流式细胞计数分析根据制造者的方案进行， 并且使用本领域公知的标准技术分析数 据以获得感兴趣的细胞群的中值荧光强度。
将被理解的是， 使用的具体的抗体结合物和所用的具体反应组分和具体反应条件 会对获得的结果有影响。应当操作常规试验方法以测定优选的反应组分， 例如缓冲液或溶 解溶液， 以及反应条件， 包括染色时间和温度。 所述分析条件的常规优化法是基于免疫染色 分析领域中的标准实践。
实施例 50
抗 CD4、 CD8 和 CD45 抗体的染料结合物
使用对 CD4 和 CD45( 分别为克隆 SK3 和 2D1， 来自 BD Biosciences， San Jose， CA) 特异性的抗体制备染料 - 结合物， 其各自在单独的制剂中以一定范围的染料与蛋白质之比 结合至化合物 7、 13 和 25。抗体 - 染料结合物基本上如在上面实施例 42 中所描述的那样进行制备。CD4 和 CD45 抗体的抗体 - 结合物基本上如在上面实施例 49 中所描述的那样被用 于分析全血样品中的淋巴细胞。
数据表明了对于各抗体 - 染料对来说优选的染料与蛋白质之比。对于各抗体， 最 佳的染料与蛋白质之比对三种染料中的每一种出现在类似的比值处。 比较与相同染料结合 的不同的抗体， 最佳的染料与蛋白质之比有显著不同， 其中对于 CD4 在更高比例处观察到 最佳的荧光。在这些实验中， 对于染料与蛋白质之比高于最佳比值的 ( 超出测试范围 )CD4 染料结合物， 没有观察到可察觉得到的自猝灭， 荧光仍然保持着最佳水平。相比之下， 对于 染料与蛋白质之比高于最佳比值的 CD45 染料结合物， 观察到显著的自猝灭。比较使用各染 料化合物获得的最大荧光染色， 化合物 7 产生比化合物 13 更好的荧光染色， 化合物 13 产生 比化合物 25 更好的荧光染色。
该结果表明所有三种染料结合物能用于制备用于通过流式细胞计数仪进行分析 的免疫荧光分析的抗原特异性检测试剂。 一般而言， 对于将被标记的各特异性抗体， 各最佳 的染料与蛋白质之比要经验性地来加以确定 ( 通过常规优化法 )。
实施例 51
抗 CD3、 CD4、 CD8 和 CD45 抗体的染料结合物
使用四种不同的抗体 CD3、 CD4、 CD8 和 CD45 抗体 ( 分别为克隆 SK7、 SK3、 SK1 和 2D1， 来自 BD Biosciences， San Jose， CA) 制备染料结合物， 抗体各自在单独的制剂中以一 定的染料 / 蛋白质比值范围结合至化合物 7。抗体 - 染料结合物基本上如在上面实施例 42 中所描述的那样进行制备。CD3、 CD4、 CD8 和 CD45 抗体的染料结合物基本上如在上面实施 例 49 中所描述的那样被用于分析全血样品中的淋巴细胞。
分析结果概述在附图 3-6 中， 其表示为对于各染料结合物的染料与蛋白质之比所 绘制的染料结合物标记的淋巴细胞群的荧光强度的曲线。在附图 3-5 中， 荧光强度被记 录为 “染色指数” ， 该染色指数提供了一种在测自未被染色、 “负数” 细胞群的信号 ( 即， 背 景 ) 上的被染色细胞群的荧光强度高于相对于由未染色细胞群测量的荧光分布宽度的量 度 ( 参见 Maecker 等， 2004， Cytometry PartA 62A ： 169-173， 在此引入作为参考 )。染色指 数如下定义 ：
染色指数＝ (S-U)/(2*SD_ 负数 )，
其中 S 是测量自染色细胞群的中值荧光强度 (MFI)， U 是未染色细胞群的 MFI， 以 及 SD_ 负数是未染色细胞群的荧光强度的标准偏差。在附图 6 中， 荧光强度被记录为中值 荧光强度 (MFI)。因为 CD45 抗体结合至所有的淋巴细胞， 所以其中没有被用作这些实验中 背景的量度的未染色淋巴细胞群， 且不能计算染色指数。
在下表 4 中提供了对于各染料结合的抗体的最佳染料与蛋白质之比。
表4
最佳的染料与蛋白质之比
抗体特异性 CD3优选的染料与蛋白质之比 549CN 101914093 A说CD4 CD8 CD45明书25 28 942/42 页附图 3 表示使用结合于化合物 7 的 CD3 抗体的染料结合物在一定范围的染料与蛋 白质之比内所获得的数据曲线。所获得的最大染色指数说明化合物 7 所标记的这一 CD3 抗 体的染料结合物使得在流式细胞计数免疫荧光分析中有可能辨别出超出背景荧光的染色 的淋巴细胞群。对于这一抗体和染料组合， 在高于最佳值的染料与蛋白质之比处观察到自 猝灭。
附图 4 表示使用结合于化合物 7 的 CD4 抗体的染料结合物在一定范围的染料与蛋 白质之比内所获得的数据曲线。所获得的最大染色指数说明化合物 7 所标记的这一 CD4 抗 体的染料结合物使得在流式细胞计数免疫荧光分析中有可能辨别出超出背景荧光的染色 的淋巴细胞群。对于这一抗体和染料组合， 在高于最佳值的染料与蛋白质之比处观察到极 少的自猝灭， 从而提供了宽范围的可用比值。
附图 5 表示使用结合于化合物 7 的 CD8 抗体的染料结合物在一定范围的染料与蛋 白质之比内所获得的数据曲线。所获得的最大染色指数说明化合物 7 所标记的这一 CD8 抗 体的染料结合物使得在流式细胞计数免疫荧光分析中有可能辨别出超出背景荧光的染色 的淋巴细胞群。对于这一抗体和染料组合， 在高于最佳值的染料与蛋白质之比处观察到极 少的自猝灭， 从而提供了宽范围的可用比值。
附图 6 表示使用结合于化合物 7 的 CD45 抗体的染料结合物在一定范围的染料与 蛋白质之比内所获得的数据曲线。由于 MFI 取决于， 例如， 光感测器的增益， 所获得的最大 值 MFI 并不直接表明染料结合物对于区别细胞群的用处。然而， 观察到用化合物 7 标记的 这一 CD45 抗体的染料结合物提供了在流式细胞计数免疫荧光分析中使用的淋巴细胞群的 足够标记。 对于这一抗体和染料组合， 在高于最佳值的染料与蛋白质之比处观察到自猝灭， 这表明可用比值的范围较窄。