胍类衍生物及制备、 药物组合物及制备治疗代谢综合症药 物的用途 【技术领域】
本发明属于医药技术领域， 涉及一类从车前子和车前草中分离得到的胍类衍生 物， 及其制备方法， 和在制备治疗代谢综合症和糖尿病的药物方面的应用。背景技术
车前子和车前草为常用中药， 中国药典 (2005 版 ) 规定， 车前科植物车前 Plantago asiatica L. 及平车前 Plantago Depressa Willd. 的干燥成熟种子为车前子， 干燥全草为 车前草， 用于清热利尿， 渗湿通淋， 水肿胀满等症。目前文献报道中并未提及其抗糖尿病及 治疗代谢综合症活性。
车前子中的主要成分包括多糖类、 苯乙醇苷类、 环烯醚萜类、 黄酮类等， 这些成分 具有促进水、 氯化钠、 尿素与尿酸的排泄， 治疗水肿 ； 抗衰老 ； 缓泻 ； 止咳平喘 ； 改善心血管 状态等作用。目前没有车前子提取物及其治疗糖尿病、 高血压等活性成分的报道。 发明内容
本发明旨在提供一种新的胍类衍生物。 本发明还提供了上述胍类衍生物的制备方法。 本发明另一个目的在于将这种胍类衍生物应用于制备治疗代谢综合症的药物。 一种胍类衍生物， 具有通式 I 所示的结构 ：( 通式 I)
其中， R1 为氢、 羟基或 C1-C5 的烷氧基 ；
R2 为 C1 ～ C20 饱和或者不饱和烃基、 羟基取代的 C1 ～ C20 饱和或者不饱和烃基、 C1-C5 的烷氧基取代的 C1 ～ C20 饱和或者不饱和烃基基团 ； 以上烃基基团可以为直链或支 链的。
R1 优选为羟基。R2 优选为 2- 甲基 -2- 丁烯基、 2- 甲基 -2- 羟基 - 丁基或 2- 甲 基 -2- 甲氧基 - 丁基。
所述的胍类衍生物还包括上述所有化合物及其在药学上可接受的酸或碱所形成 的加成盐。
优选的胍类衍生物结构式如结构式 I、 II、 III 所示。
结构式 I
结构式 II结构式 III
本发明提供了从车前子或车前草中分离胍类衍生物的方法， 以车前属车前科植物 车前为植物来源， 经分离纯化得到。
所 述 的 植 物 来 源 包 括 车 前 科 (plantaginaceae) 车 前 属 (Plantago) 植 物 车 前 (Plantago asiatica L.) 或同属植物 (Genus Plantago) 的种子或全草。
其具体制备步骤为 ：
(1) 以中药车前子或车前草， 或者新鲜采集的车前子或车前草为原料， 采用溶剂提 取法， 得到提取液 ； 所用的溶剂优选为水、 醇或任意比水 - 醇混合物 ； 醇为 C1 ～ C5 的饱和 或不饱和一元醇 ； 提取方法优选为加热回流提取、 超声提取、 冷浸提取、 温浸提取、 渗漉提取 法；
(2) 用溶剂萃取法萃取后， 弃去有机相， 得到水相 ； 所用溶剂优选为石油醚 (30 ～ 90℃ )、 环己烷、 正己烷、 氯仿、 二氯甲烷、 乙酸乙酯 ；
再次溶剂萃取法萃取后， 将有机相减压浓缩 ； 所用溶剂优选为正丁醇 ；
将所得产物通过柱层析并用溶剂洗脱， 减压浓缩回收溶剂， 得到总胍类衍生物 ； 所 用溶剂选自 C1 ～ C10 的卤代烷、 C1 ～ C10 的饱和或不饱和醇、 C1 ～ C10 酮、 C1 ～ C10 酯或其 混合物， 其中卤代烷具有以下通式 ： CnH2n+1R、 CnH2nR2、 CnH2n-1R3(n ＜ 10 ； R ＝ Cl， Br， I)， 醇类溶 剂具有以下通式 ： CnH2n+1OH 或 CnH2n-1OH(n ＜ 10)， 酮类溶剂具有以下通式 ： CnH2nO 或 CnH2n-2O(n ＜ 10)， 酯类溶剂具有以下通式 ： CnH2nO2 或 CnH2n-2O2(n ＜ 10)， 及以上溶剂与水、 甲酸、 乙酸的 任意比例的混合溶剂。 柱层析溶剂洗脱方式包括单一或混合溶剂的正相、 反相或梯度洗脱 ； 柱层析填料为下列种的一种或多种 ： 硅胶、 硅藻土、 氧化铝、 吸附树脂、 葡聚糖凝胶或 ODS。
更优选的制备方法为 ：
(1) 提取 ： 以车前科植物车前子或车前草为原料， 粉碎后， 用 50-95％乙醇 (4-5 升 /kg) 加热回流提取 4 小时， 重复提取 2 ～ 6 次， 过滤并合并提取液， 减压回收乙醇， 将得到的 浸膏混悬于水中。
(2) 富集 ： 用石油醚 (30 ～ 90℃ ) 萃取， 至石油醚层近无色， 弃去石油醚层 ； 水层 再用水饱和的正丁醇萃取， 至正丁醇层近无色 ； 将正丁醇层减压回收， 得正丁醇部位。通过 硅胶柱层析， 依次用体积比为 (7 ～ 12) ∶ 1 ∶ (0 ～ 0.1) 和 (4 ～ 6) ∶ 1 ∶ (0 ～ 0.1) 二 氯甲烷 - 甲醇 - 水洗脱， 收集 (4 ～ 6) ∶ 1 ∶ (0 ～ 0.1) 洗脱液， 减压回收溶剂， 得到浸膏， 用水混悬。通过 ODS 反相柱层析， 分别用 5％～ 25％甲醇和 30％～ 90％甲醇， 收集 5％～ 25％甲醇洗脱液， 减压回收溶剂， 得到总胍类衍生物。 (3) 纯化 ： 上述总胍类衍生物， 通过凝胶柱层析进行分离， 用甲醇洗脱， 薄层色谱 法检视胍类衍生物 ( 香草醛硫酸试液显蓝色 )， 分段收集 ； 再将凝胶分离部位， ODS 反向柱层 析， 并洗脱， 分段收集， 薄层色谱法检视， 直至得到纯品。
所得到的胍类衍生物可用于制备治疗代谢综合症 ( 例如糖尿病、 胰岛素抗性、 葡 萄糖耐量异常、 高血压、 高甘油三脂、 脂质代谢异常、 肥胖症、 动脉粥样硬化等 ) 的药物， 药 物剂型可以是口服给药的内用剂型及非口服给药的注射剂和外用剂型。
本发明在分离得到胍类衍生物的基础上， 证实了这类化合物的治疗糖尿病、 胰岛 素抗性、 葡萄糖耐量异常、 高血压、 高甘油三脂、 脂质异常、 肥胖、 动脉粥样硬化等代谢综合 症药物。
本发明为开发治疗糖尿病和代谢综合症的药物提供了先导化合物， 为开发天然产 物和植物药的新用途具有重要意义。
附图说明 图 1 为车前素 A(Plantagoamidinic acid A) 的主要 2D NMR 相关结构示意图， 其 中粗线为 COSY ； 实线相关 ： HMBC ； 虚线相关 ： NOE
图 2 为车前素 (Plantagoamidinic acid)A、 B、 C 的化学结构式
具体实施方式
实施例 1
取车前子 ( 干燥成熟种子 )1kg， 粉碎后加入 4L 80％乙醇加热回流提取 4 小时， 重 复 4 次， 过滤并合并提取液， 减压回收乙醇后将浸膏混悬于水中。
用石油醚 (60 ～ 90℃ ) 多次萃取混悬液， 至石油醚层近无色， 弃去石油醚层 ； 水层再用水饱和的正丁醇萃取， 至正丁醇层近无色。将正丁醇层合并减压回收， 得正丁醇部位。
通过硅胶柱层析， 依次用二氯甲烷 - 甲醇 - 水 10 ∶ 1 ∶ 0.05、 5 ∶ 1 ∶ 0.05 和 3 ∶ 1 ∶ 0.05 洗脱， 收集 3 ∶ 1 ∶ 0.05 洗脱液， 减压回收溶剂， 得到浸膏， 用水混悬 ； 通过 ODS 反相柱层析， 分别用 20％甲醇、 40％甲醇和 85％甲醇洗脱， 收集 20％甲醇洗脱液， 减压 回收溶剂， 得到总胍类衍生物 ；
上述总胍类衍生物， 通过凝胶柱层析进行分离， 用甲醇洗脱， 薄层色谱法检视胍类 衍生物 ( 香草醛硫酸试液显蓝色 )， 分段收集 ；
再将凝胶分离部位， 用 ODS 反向柱层析 5％ -25％甲醇洗脱， 分段收集， 薄层色谱法 检视 ( 香草醛硫酸试液显蓝色 )， 直至得到车前素 A、 B、 C 纯品。
实施例 2
取车前草 ( 干燥成熟全草 )1kg， 粉碎后加入 4L 80％乙醇在加热回流提取 4 小时， 重复 4 次， 过滤并合并提取液， 减压回收乙醇后将浸膏混悬于水中。
用乙酸乙酯多次萃取混悬液， 至乙酸乙酯层近无色， 弃去乙酸乙酯层 ； 水层再用水 饱和的正丁醇萃取， 至正丁醇层近无色。将正丁醇层合并减压回收， 得正丁醇部位。
通过硅胶柱层析， 依次用二氯甲烷 - 甲醇 - 水 10 ∶ 1 ∶ 0.05、 5 ∶ 1 ∶ 0.05 和 3 ∶ 1 ∶ 0.05 洗脱， 收集 3 ∶ 1 ∶ 0.05 洗脱液， 减压回收溶剂， 得到浸膏， 用水混悬 ； 通过 ODS 反相柱层析， 分别用 20％甲醇、 40％甲醇和 85％甲醇洗脱， 收集 20％甲醇洗脱液， 减压 回收溶剂， 得到总胍类衍生物 ； 上述总胍类衍生物， 通过凝胶柱层析进行分离， 用甲醇洗脱， 薄层色谱法检视胍类 衍生物 ( 香草醛硫酸试液显蓝色 )， 分段收集 ；
再将凝胶分离部位， 用 ODS 反向柱层析 5％ -25％甲醇洗脱， 分段收集， 薄层色谱法 检视 ( 香草醛硫酸试液显蓝色 )， 直至分别得到车前素 A、 B、 C 纯品。
通过实施例 1 和 2， 从车前子 ( 草 ) 中分离得到车前素 (Plantagoamidinic acid 类化合物 )A、 B 和 C 结构如附图 2 所示， 其中 1 为车前素 A(Plantagoamidinic acid A)， 2 为车前素 B(Plantagoamidinic acid B)， 3 为车前素 C(Plantagoamidinic acidC)， 其光谱 数据为 ：
车前素 A(Plantagoamidinic acid A) 为淡黄色油状物， [α]D ＝ +64.5(MeOH)， 高分辨质谱得该化合物的精确质量数为 226.1537， 推算其分子式为 C11H19N3O2。红外光谱 -1 -1 -1 (KBr) ： 1776cm ， 1690cm and1639cm 。图 1 为车前素 A 的 2D NMR 相关结构示意图， 其中粗 线为 COSY ； 实线相关 ： HMBC ； 虚线相关 ： NOE。
车前素 B(Plantagoamidinic acid B) 为淡黄色油状物， [α]D ＝ +75.1(MeOH)， 高 分辨质谱得该化合物的精确质量数为 224.1643， 推算其分子式为 C11H22N3O3。 红外光谱 (KBr) -1 -1 显示了 1690cm 和 3300cm 的特征信号。
车前素 C(Plantagoamidinic acid C) 为淡黄色油状物， [α]D ＝ +78.2(MeOH)， 高 分辨质谱得该化合物的精确质量数为 258.1801， 推算其分子式为 C12H24N3O3。 红外光谱 (KBr) -1 显示了 1690cm 的特征信号。
以上三个化合物的 1H NMR 和 13C NMR 数据见表 1。
表 1. 车前素 A(1)、 B(2)、 C(3) 的 1H NMR(500HZ) 及 13C NMR(125MHZ) 数据
实施例 3
检测实施例 1 和 2 所得三个胍类成分对 3T3-L1 细胞和 Hep G2 细胞株的影响， 结 果显示 Plantagoamidinic acid 系列衍生物能够对 3T3-L1 细胞和 Hep G2 细胞增殖影响不 大， 但能增加 3T3-L1 细胞和 Hep G2 细胞葡萄糖消耗量， 同时对于 3T3-L1 和 Hep G2 没有细 胞毒作用。说明该类化合物具有增加葡萄糖消耗量的作用和较好安全性。
实验采用的是 MTT 法。 在消耗实验即将结束时， 将培养液移出， 换上含 0.5g/L MTT 的培养液继续孵育 4h， 然后将培养液倒尽， 吸干， 每孔再加入 200μl 二甲亚砜， 混匀后置酶 标仪上于 570nm 处测吸光度。结果见表 2 和表 3。
表 2 车前素 A(1)， B(2) 和 C(3) 对 3T3-L1 细胞糖代谢的影响 (x±s， n ＝ 6)
表 3 车前素 A(1)， B(2) 和 C(3) 对 Hep G2 细胞糖代谢的影响 (x±s， n ＝ 6)实施例 3 ：
本发明以 Plantagoamidinic acid A 为代表， 考察了胍类化合物对四氧嘧啶导致 的糖尿病小鼠空腹血糖的影响。四氧嘧啶造模后， 小鼠血糖值明显增加。给药 2 周后， 给药 组显示了与阳性对照药相同的显著降糖作用。 证明了车前子及胍类化合物在治疗糖尿病方 面的作用。结果见表 4。
表 4. 车前素 A 对四氧嘧啶导致糖尿病小鼠血糖的影响
本发明为开发治疗糖尿病和代谢综合症的药物提供了先导化合物， 为开发天然产 物和植物药的新用途具有重要意义。