一种山羊超数排卵方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201110042747.X

申请日:

2011.02.22

公开号:

CN102068322A

公开日:

2011.05.25

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):A61D 19/00申请公布日:20110525|||实质审查的生效IPC(主分类):A61D 19/00申请日:20110222|||公开

IPC分类号:

A61D19/00

主分类号:

A61D19/00

申请人:

安徽农业大学

发明人:

李运生; 张运海; 韩春杨; 章美玲; 随刘才; 曹鸿国; 章孝荣; 刘亚; 陶勇; 张远亮; 焦明慧; 季索菲; 贾晴; 张宇; 桂涛; 周娜汝; 刘晓蕊; 杨盼; 张子军; 丁建平

地址:

230036 安徽省合肥市长江西路130号

优先权:

专利代理机构:

代理人:

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内容摘要

本发明公开了一种山羊超数排卵方法,其步骤是:选取可以用于超数排卵的雌性山羊,每天早晚试情,以观察到首次发情作为第0天,分别在第四、第五、第六、第七天早晚各注射一次促卵泡素,第七天早晚同时注射氯前列烯醇,第八天注射促黄体素,第九天进行腹腔镜输精,第十天通过手术法回收原核胚或第十六天收集桑椹胚。本发明取消了山羊常规超排方法中需放置孕酮栓的过程,缩短了生产时间,降低了生产费用,同时该方法可以获得与常规超排方法一样的超排效率,每个批次的实验结果为每只羊平均能获得胚胎8-30枚。

权利要求书

1: 一种山羊超数排卵方法, 步骤如下 : 以自然发情母羊为对象, 首次发情时计为第 0 天, 分别在第四天、 第五天、 第六天、 第七 天, 早晚各注射一次促卵泡素, 第七天早晚同时注射氯前列烯醇, 第八天注射促黄体素, 注 射时间为首次注射氯前列烯醇后 32-40 小时, 第九天进行腹腔镜输精输精时间为促黄体素 注射后 12-18 小时, 第十天回收原核胚或第十六天回收桑椹胚。
2: 根据权利要求 1 所述的山羊超数排卵方法, 第四天注射的促卵泡素购买于宁波市三 生药业有限公司, 规格 100IU/ 支, 每次注射剂量为 30-34IU。
3: 根据权利要求 2 所述的山羊超数排卵方法, 第五天注射的促卵泡素购买于宁波市三 生药业有限公司, 规格 100IU/ 支, 每次注射剂量为 26-30IU。
4: 根据权利要求 3 所述的山羊超数排卵方法, 第六天注射的促卵泡素购买于宁波市三 生药业有限公司, 规格 100IU/ 支, 每次注射剂量为 22-26IU。
5: 根据权利要求 4 所述的山羊超数排卵方法, 第七天注射的促卵泡素购买于宁波市三 生药业有限公司, 规格 100IU/ 支, 每次注射剂量为 18-22IU。
6: 根据权利要求 5 所述的山羊超数排卵方法, 第七天注射的氯前列烯醇购买于上海计 划生育研究所, 规格 0.2mg/2ml, 每次注射剂量为 0.08mg。
7: 根据权利要求 6 所述的山羊超数排卵方法, 第八天注射的促黄体素购买于宁波市三 生药业有限公司, 规格 200IU/ 支, 每次注射剂量为 100IU。

说明书


一种山羊超数排卵方法

    [ 技术领域 ]
     本发明涉及超数排卵技术领域, 尤其涉及一种山羊超数排卵的方法。 [ 背景技术 ]
     超数排卵技术是应用外源性促性腺激素诱发卵巢多个卵泡发育, 并排出具有受精 能力的卵子的方法, 简称 “超排” 。该技术结合胚胎移植技术, 能够大大提高优良种畜的生 产、 扩繁能力, 生产和科研中已经广泛应用。
     传统山羊超排始于上世纪 80 年代年 (Armstrong DT, Pfitzner AP, Warnes GM, Seamark RF.Superovulation treatments and embryo transfer in Angora goats.J Reprod Fertil 1983 ; 67 : 403-10. ; Tervit HR, Goold PG, McKenzie RD, Clarkson DJ, DrummondJ.Embryo transfers in Angora and Saanen goats.N Z Vet J 1985 ; 33 : 78-80), 该方法一直延续到现在, 具体方法是用孕酮栓在母畜体内放置 12 ~ 18 天, 在撤栓 前 48h 开始用 FSH 的超排处理, 通过这种处理, 可以获得 10 ~ 20 枚胚胎。国内外普遍使用 的超排方案, 取得了一定的经济效益。能够稳定获得一定数量的卵母细胞或胚胎。
     上世纪 90 年代, 哺乳动物卵巢卵泡动力学和生殖内分泌研究的发展, 为超数排卵 的方案提供了新的思路。哺乳动物发情周期中一般有多个卵母细胞同时发育, 但仅有 1 ~ 2 枚最终发育成熟并排卵, 在正常发情周期中, 由于有优势卵泡的存在使其抑制了其他卵母 细胞的发育, 造成单胎动物的形成 (Sirois J, Fortune JE.Ovarian follicular dynamics during the estrous cycle in heifers monitored by real-time ultrasonography. Biol Reprod 1988 ; 39 : 308-17. ; Savio JD, Keenan L, Boland MP, Roche JF.Pattern of growth of dominant follicles during the oestrous cycle of heifers.J Reprod Fertil 1988 ; 83 : 663-71.), 在传统超排方案中, 家畜处在不同的卵巢周期会获得不同超 排 的 结 果 (Guilbault LA, Grasso F, Lussier JG, Rouillier P, Matton P.Decreased superovulatory responses in heifers superovulated in the presence of a dominant follicle.J eprod Fertil 1991 ; 91 : 81-9. ; Huhtinen M, Rainio V, Aalto J, Bredbacka P, Ma¨ki-Tanila A.Increased ovarian responses in the absence of a dominant follicle in superovulated cows.Theriogenology 1992 ; 37 : 457-63. ; Nasser LF, Adams GP, Bo GA, Mapletoft RJ.Ovarian superstimulatory response relative to follicular wave emergence in heifers.Theriogenology 1993 ; 40 : 713-24.), 这主要是由于卵巢上 优势卵泡的存在, 在超排过程中抑制其他小卵泡的生长, 影响了卵泡募集和超排反应, 从而 造成超排效率的低下 (Menchaca A, Pinczak A, Rubianes E.Follicular recruitment and ovulatory response to FSHtreatment initiated on day 0 or day 3postovulation in goats.Theriogenology 2002 ; 58 : 1713-21.)。根据卵泡波的理论, 利用孕酮栓诱导 发情方法将优势卵泡排出, 在下一个卵泡波开始前进行超排可以获得更好的超排效果, 同 时超排卵母细胞或胚胎数量上及胚胎质量上均有所提高 (Menchaca, A., M.,Crispo, M., Pinczak, A., and Rubianes, E.Day 0 protocol : Superstimulatory treatmentinitiated in the absence of a large follicle improves ovarian response and embryo yield in goats.Theriogenology2007 : 68, 1111-1117)。这些方法的使用均需要 孕酮栓进行前期抑制发情或诱导发情处理, 处理时间为 5-14 天, 这使实验的随机性受到限 制, 同时由于孕酮栓为国外进口或国内生产, 国外进口阴道栓价格较为昂贵, 在生产中和实 验中使用提高了成本, 而国内的孕酮栓质量不够过关, 常常造成阴道粘连和阴道炎症。 我们 设想, 正常发情的母羊会排出优势卵泡, 排卵后在合适的卵泡发生时期进行超数排卵处理, 可以获得较好的效果。 [ 发明内容 ]
     本发明要解决的技术问题是提供一种能提高母羊超数排卵效率, 缩短超排处理时 间, 提高超排数量, 降低超排费用的山羊超数排卵方法。
     为了解决上述技术问题, 本发明采用的技术方案是, 以自然发情母羊为对象, 首次 发情时记为第 0 天, 分别在第四天、 第五天、 第六天、 第七天, 早晚各注射一次促卵泡素, 第 七天早晚同时注射氯前列烯醇, 第八天注射促黄体素, 注射时间为首次注射氯前列烯醇后 32-40 小时, 第九天进行腹腔镜输精输精时间为促黄体素注射后 12-18 小时, 第十天取原核 胚或第十六天取桑椹胚。 作为优选, 第四天注射的促卵泡素购买于宁波市三生药业有限公司, 规格 100IU/ 支, 每次注射剂量为 30-34IU。
     作为优选, 第五天注射的促卵泡素购买于宁波市三生药业有限公司, 规格 100IU/ 支, 每次注射剂量为 26-30IU。
     作为优选, 第六天注射的促卵泡素购买于宁波市三生药业有限公司, 规格 100IU/ 支, 每次注射剂量为 22-26IU。
     作为优选, 第七天注射的促卵泡素购买于宁波市三生药业有限公司, 规格 100IU/ 支, 每次注射剂量为 18-22IU。
     作 为 优 选, 第 七 天 注 射 的 氯 前 列 烯 醇 购 买 于 上 海 计 划 生 育 研 究 所, 规格 0.2mg/2ml, 每次注射剂量为 0.08mg。
     作为优选, 第八天注射的促黄体素购买于宁波市三生药业有限公司, 规格 200IU/ 支, 每次注射剂量为 100IU。
     对于供体母羊的选择, 其年龄、 发情周期和生殖系统有一定的标准。要选择年龄 在 10 个月以上, 体重在 45 斤以上, 但不宜过肥, 膘情达到中上即可 ; 有 1-2 次稳定的发情周 期; 供体母羊无生殖系统疾病、 无传染性疾病。
     本发明的有益效果是, 取消了常规超排方法羊放置孕酮栓的过程, 在羊自然发情 后 3-5 天进行超数排卵, 缩短了生产时间, 降低了生产费用, 同时该方法可以获得与常规超 排方法一样的超排效率, 每个批次的实验结果为每只羊平均能获得胚胎 8-30 枚, 胚胎发育 效率与常规超排方案相同。
     [ 具体实施方式 ]
     具体实施方式步骤如下 :
     所用材料 :促卵泡素 (FSH), 购买于宁波市三生药业有限公司, 规格为 100IU/ 支 ;
     氯前列烯醇 (PG), 购买于上海计划生育研究所, 规格为 0.2mg/2ml ;
     促黄体素 (LH), 购买于宁波市三生药业有限公司, 规格为 200IU/ 支。
     1、 发情羊的鉴定
     选取超排用羊, 在实验期间在早中晚分三次进行试情, 即选用输精管结扎后公羊, 放入母羊圈中, 其中接受跨爬的母羊视为发情, 并做记录。
     2、 发情羊的超排
     每只母羊发情时为第 0 天 ( 早、 中、 晚观察到发情均可 ), 分别在第四天、 第五天、 第 六天、 第七天, 早晚各注射一次促卵泡素注射, 第七天早晚同时注射氯前列烯醇, 第八天注 射促黄体素。
     在本实施方式中, 我们得出的最佳方案如表 1 : 母羊首次发情视为第 0 天 ( 发情被 观察为早中晚均可 ), 第四天上午 6 时开始首次注射促卵泡素, 注射剂量为 32IU, 第二、 三、 四、 五、 六、 七、 八次促卵泡素注射剂量分别为 30IU、 28IU、 26IU、 24IU、 22IU、 20IU、 18IU, 第七 天早 6:00 和晚 18:00 分别注射氯前列烯醇 0.8mg。第八天晚 20:00 注射促黄体素, 第九天 15:00 进行腹腔输精 ( 或第九天早 7:00 和晚 17:00 点进行人工授精或本交 )。第十天 8:00 取原核胚或第十六天取桑椹胚。
     表1:
     3、 腹腔镜输精
     注射促黄体素后 14-18 小时进行羊腹腔镜输精。输精方法为 : 将实验羊倒立 60 度 仰卧保定, 用 11mm 直径腹腔打孔器, 在腹中线乳房下方 8cm 处进行打孔, 用 5.5mm 直径打孔 器在其右侧 15cm 处打孔 ( 注意避开血管 )。用 10mm 直径腹腔镜观察子宫位置, 从另一打孔 器中插入子宫内输精枪, 找准子宫角中段, 用输精枪针头刺入子宫角内, 注射 0.2ml 冷冻或 新鲜精液。完成后缝合和消毒腹壁。
     4、 原核胚获取
     具体收集方法为 : 将实验羊倒立 60 度仰卧保定, 手术法取卵。手术前将待手术供 体羊饥饿 12 ~ 24h。手术前 0.5 ~ 1d 对手术羊进行术部剃毛, 剃毛区域以手术切口为中 心, 区域范围 20cm×20cm。手术前用速眠新注射液进行手术羊全麻, 0.05 ~ 0.08mL/kg。
     在腹中线乳房下 8cm 处开 2cm 左右手术口, 同腹腔镜观察找到子宫体后, 用子宫钳 夹住子宫角将子宫带出手术口, 轻拉子宫角大弯处将输卵管带出, 或固定一侧大弯, 轻捏输 卵管或系膜, 缓慢将输卵管伞部引出, 将外径与输卵管开口部内径相当的输卵管胚胎回收 管插入输卵管喇叭口内 2 ~ 2.5cm, 用阻血镊由输卵管外固定, 防止回收管滑脱。将含冲卵 液的注射器装上冲卵液进液针 ; 左手掌心向上, 以拇指和食指捏住子宫角前端 ; 右手持注 射器由子宫角前端向输卵管方向插入进液针 ; 用左手拇指和食指固定针头并捏住子宫角, 以防止冲卵液倒流入子宫腔 ; 缓缓推动注射器活塞, 使冲卵液经子宫角尖端、 宫管接合部冲
     入输卵管, 再经输卵管胚胎回收管流入集卵杯。一侧冲洗完毕后, 除去器械, 将该侧送回腹 腔, 再冲洗另一侧。每侧用液量为 10mL, 冲卵液为 DPBS。
     5、 子宫角胚胎回收采用子宫角胚胎回收针回收子宫角胚胎时, 先在子宫大弯上, 避开血管, 插入子宫角胚胎回收针并轻轻摆动针头, 确认针头进入子宫腔后, 用套有乳胶管 的肠钳夹住子宫角的进针部位。再用阻血镊夹住宫管接合部之前的输卵管, 以防冲卵液流 入输卵管。然后, 从宫管接合部后约 1 ~ 2cm 处向宫管接合部方向插入进液针头, 使针尖抵 达阻血镊所夹部位。 向输卵管方向注入冲卵液, 冲卵液倒流回子宫角后, 经回收针及后端的 硅胶管收集冲出液于集卵杯中。一侧子宫角冲洗完毕后, 除去器械, 检查针孔, 确认无出血 现象后, 可冲洗另一侧。羊子宫采胚的用液量为每侧 30 ~ 35mL。两侧均冲洗完毕后, 向子 宫内注入抗生素液, 将子宫送回腹腔。
     本实施方式经过多批次实验, 每批次实验用羊为 5-10 只, 各批次的实验结果为每 只羊平均能获得胚胎 8-30 枚。7

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1、10申请公布号CN102068322A43申请公布日20110525CN102068322ACN102068322A21申请号201110042747X22申请日20110222A61D19/0020060171申请人安徽农业大学地址230036安徽省合肥市长江西路130号72发明人李运生张运海韩春杨章美玲随刘才曹鸿国章孝荣刘亚陶勇张远亮焦明慧季索菲贾晴张宇桂涛周娜汝刘晓蕊杨盼张子军丁建平54发明名称一种山羊超数排卵方法57摘要本发明公开了一种山羊超数排卵方法,其步骤是选取可以用于超数排卵的雌性山羊,每天早晚试情,以观察到首次发情作为第0天,分别在第四、第五、第六、第七天早晚各注射一次促卵泡素。

2、,第七天早晚同时注射氯前列烯醇,第八天注射促黄体素,第九天进行腹腔镜输精,第十天通过手术法回收原核胚或第十六天收集桑椹胚。本发明取消了山羊常规超排方法中需放置孕酮栓的过程,缩短了生产时间,降低了生产费用,同时该方法可以获得与常规超排方法一样的超排效率,每个批次的实验结果为每只羊平均能获得胚胎830枚。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页CN102068323A1/1页21一种山羊超数排卵方法,步骤如下以自然发情母羊为对象,首次发情时计为第0天,分别在第四天、第五天、第六天、第七天,早晚各注射一次促卵泡素,第七天早晚同时注射氯前列烯醇,第八天注射。

3、促黄体素,注射时间为首次注射氯前列烯醇后3240小时,第九天进行腹腔镜输精输精时间为促黄体素注射后1218小时,第十天回收原核胚或第十六天回收桑椹胚。2根据权利要求1所述的山羊超数排卵方法,第四天注射的促卵泡素购买于宁波市三生药业有限公司,规格100IU/支,每次注射剂量为3034IU。3根据权利要求2所述的山羊超数排卵方法,第五天注射的促卵泡素购买于宁波市三生药业有限公司,规格100IU/支,每次注射剂量为2630IU。4根据权利要求3所述的山羊超数排卵方法,第六天注射的促卵泡素购买于宁波市三生药业有限公司,规格100IU/支,每次注射剂量为2226IU。5根据权利要求4所述的山羊超数排卵方。

4、法,第七天注射的促卵泡素购买于宁波市三生药业有限公司,规格100IU/支,每次注射剂量为1822IU。6根据权利要求5所述的山羊超数排卵方法,第七天注射的氯前列烯醇购买于上海计划生育研究所,规格02MG/2ML,每次注射剂量为008MG。7根据权利要求6所述的山羊超数排卵方法,第八天注射的促黄体素购买于宁波市三生药业有限公司,规格200IU/支,每次注射剂量为100IU。权利要求书CN102068322ACN102068323A1/5页3一种山羊超数排卵方法技术领域0001本发明涉及超数排卵技术领域,尤其涉及一种山羊超数排卵的方法。背景技术0002超数排卵技术是应用外源性促性腺激素诱发卵巢多个。

5、卵泡发育,并排出具有受精能力的卵子的方法,简称“超排”。该技术结合胚胎移植技术,能够大大提高优良种畜的生产、扩繁能力,生产和科研中已经广泛应用。0003传统山羊超排始于上世纪80年代年ARMSTRONGDT,PFITZNERAP,WARNESGM,SEAMARKRFSUPEROVULATIONTREATMENTSANDEMBRYOTRANSFERINANGORAGOATSJREPRODFERTIL1983;6740310;TERVITHR,GOOLDPG,MCKENZIERD,CLARKSONDJ,DRUMMONDJEMBRYOTRANSFERSINANGORAANDSAANENGOATSNZ。

6、VETJ1985;337880,该方法一直延续到现在,具体方法是用孕酮栓在母畜体内放置1218天,在撤栓前48H开始用FSH的超排处理,通过这种处理,可以获得1020枚胚胎。国内外普遍使用的超排方案,取得了一定的经济效益。能够稳定获得一定数量的卵母细胞或胚胎。0004上世纪90年代,哺乳动物卵巢卵泡动力学和生殖内分泌研究的发展,为超数排卵的方案提供了新的思路。哺乳动物发情周期中一般有多个卵母细胞同时发育,但仅有12枚最终发育成熟并排卵,在正常发情周期中,由于有优势卵泡的存在使其抑制了其他卵母细胞的发育,造成单胎动物的形成SIROISJ,FORTUNEJEOVARIANFOLLICULARDYN。

7、AMICSDURINGTHEESTROUSCYCLEINHEIFERSMONITOREDBYREALTIMEULTRASONOGRAPHYBIOLREPROD1988;3930817;SAVIOJD,KEENANL,BOLANDMP,ROCHEJFPATTERNOFGROWTHOFDOMINANTFOLLICLESDURINGTHEOESTROUSCYCLEOFHEIFERSJREPRODFERTIL1988;8366371,在传统超排方案中,家畜处在不同的卵巢周期会获得不同超排的结果GUILBAULTLA,GRASSOF,LUSSIERJG,ROUILLIERP,MATTONPDECREAS。

8、EDSUPEROVULATORYRESPONSESINHEIFERSSUPEROVULATEDINTHEPRESENCEOFADOMINANTFOLLICLEJEPRODFERTIL1991;91819;HUHTINENM,RAINIOV,AALTOJ,BREDBACKAP,MAKITANILAAINCREASEDOVARIANRESPONSESINTHEABSENCEOFADOMINANTFOLLICLEINSUPEROVULATEDCOWSTHERIOGENOLOGY1992;3745763;NASSERLF,ADAMSGP,BOGA,MAPLETOFTRJOVARIANSUPERSTIM。

9、ULATORYRESPONSERELATIVETOFOLLICULARWAVEEMERGENCEINHEIFERSTHERIOGENOLOGY1993;4071324,这主要是由于卵巢上优势卵泡的存在,在超排过程中抑制其他小卵泡的生长,影响了卵泡募集和超排反应,从而造成超排效率的低下MENCHACAA,PINCZAKA,RUBIANESEFOLLICULARRECRUITMENTANDOVULATORYRESPONSETOFSHTREATMENTINITIATEDONDAY0ORDAY3POSTOVULATIONINGOATSTHERIOGENOLOGY2002;58171321。根据卵泡波的。

10、理论,利用孕酮栓诱导发情方法将优势卵泡排出,在下一个卵泡波开始前进行超排可以获得更好的超排效果,同时超排卵母细胞或胚胎数量上及胚胎质量上均有所提高MENCHACA,A,M,CRISPO,M,PINCZAK,A,ANDRUBIANES,EDAY0PROTOCOLSUPERSTIMULATORYTREATMENT说明书CN102068322ACN102068323A2/5页4INITIATEDINTHEABSENCEOFALARGEFOLLICLEIMPROVESOVARIANRESPONSEANDEMBRYOYIELDINGOATSTHERIOGENOLOGY200768,11111117。这些。

11、方法的使用均需要孕酮栓进行前期抑制发情或诱导发情处理,处理时间为514天,这使实验的随机性受到限制,同时由于孕酮栓为国外进口或国内生产,国外进口阴道栓价格较为昂贵,在生产中和实验中使用提高了成本,而国内的孕酮栓质量不够过关,常常造成阴道粘连和阴道炎症。我们设想,正常发情的母羊会排出优势卵泡,排卵后在合适的卵泡发生时期进行超数排卵处理,可以获得较好的效果。发明内容0005本发明要解决的技术问题是提供一种能提高母羊超数排卵效率,缩短超排处理时间,提高超排数量,降低超排费用的山羊超数排卵方法。0006为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是,以自然发情母羊为对象,首次发情时记为第0天,分别在第四。

12、天、第五天、第六天、第七天,早晚各注射一次促卵泡素,第七天早晚同时注射氯前列烯醇,第八天注射促黄体素,注射时间为首次注射氯前列烯醇后3240小时,第九天进行腹腔镜输精输精时间为促黄体素注射后1218小时,第十天取原核胚或第十六天取桑椹胚。0007作为优选,第四天注射的促卵泡素购买于宁波市三生药业有限公司,规格100IU/支,每次注射剂量为3034IU。0008作为优选,第五天注射的促卵泡素购买于宁波市三生药业有限公司,规格100IU/支,每次注射剂量为2630IU。0009作为优选,第六天注射的促卵泡素购买于宁波市三生药业有限公司,规格100IU/支,每次注射剂量为2226IU。0010作为优。

13、选,第七天注射的促卵泡素购买于宁波市三生药业有限公司,规格100IU/支,每次注射剂量为1822IU。0011作为优选,第七天注射的氯前列烯醇购买于上海计划生育研究所,规格02MG/2ML,每次注射剂量为008MG。0012作为优选,第八天注射的促黄体素购买于宁波市三生药业有限公司,规格200IU/支,每次注射剂量为100IU。0013对于供体母羊的选择,其年龄、发情周期和生殖系统有一定的标准。要选择年龄在10个月以上,体重在45斤以上,但不宜过肥,膘情达到中上即可;有12次稳定的发情周期;供体母羊无生殖系统疾病、无传染性疾病。0014本发明的有益效果是,取消了常规超排方法羊放置孕酮栓的过程,。

14、在羊自然发情后35天进行超数排卵,缩短了生产时间,降低了生产费用,同时该方法可以获得与常规超排方法一样的超排效率,每个批次的实验结果为每只羊平均能获得胚胎830枚,胚胎发育效率与常规超排方案相同。具体实施方式0015具体实施方式步骤如下0016所用材料说明书CN102068322ACN102068323A3/5页50017促卵泡素FSH,购买于宁波市三生药业有限公司,规格为100IU/支;0018氯前列烯醇PG,购买于上海计划生育研究所,规格为02MG/2ML;0019促黄体素LH,购买于宁波市三生药业有限公司,规格为200IU/支。00201、发情羊的鉴定0021选取超排用羊,在实验期间在早。

15、中晚分三次进行试情,即选用输精管结扎后公羊,放入母羊圈中,其中接受跨爬的母羊视为发情,并做记录。00222、发情羊的超排0023每只母羊发情时为第0天早、中、晚观察到发情均可,分别在第四天、第五天、第六天、第七天,早晚各注射一次促卵泡素注射,第七天早晚同时注射氯前列烯醇,第八天注射促黄体素。0024在本实施方式中,我们得出的最佳方案如表1母羊首次发情视为第0天发情被观察为早中晚均可,第四天上午6时开始首次注射促卵泡素,注射剂量为32IU,第二、三、四、五、六、七、八次促卵泡素注射剂量分别为30IU、28IU、26IU、24IU、22IU、20IU、18IU,第七天早600和晚1800分别注射氯。

16、前列烯醇08MG。第八天晚2000注射促黄体素,第九天1500进行腹腔输精或第九天早700和晚1700点进行人工授精或本交。第十天800取原核胚或第十六天取桑椹胚。0025表10026说明书CN102068322ACN102068323A4/5页600273、腹腔镜输精0028注射促黄体素后1418小时进行羊腹腔镜输精。输精方法为将实验羊倒立60度仰卧保定,用11MM直径腹腔打孔器,在腹中线乳房下方8CM处进行打孔,用55MM直径打孔器在其右侧15CM处打孔注意避开血管。用10MM直径腹腔镜观察子宫位置,从另一打孔器中插入子宫内输精枪,找准子宫角中段,用输精枪针头刺入子宫角内,注射02ML冷冻。

17、或新鲜精液。完成后缝合和消毒腹壁。00294、原核胚获取0030具体收集方法为将实验羊倒立60度仰卧保定,手术法取卵。手术前将待手术供体羊饥饿1224H。手术前051D对手术羊进行术部剃毛,剃毛区域以手术切口为中心,区域范围20CM20CM。手术前用速眠新注射液进行手术羊全麻,005008ML/KG。0031在腹中线乳房下8CM处开2CM左右手术口,同腹腔镜观察找到子宫体后,用子宫钳夹住子宫角将子宫带出手术口,轻拉子宫角大弯处将输卵管带出,或固定一侧大弯,轻捏输卵管或系膜,缓慢将输卵管伞部引出,将外径与输卵管开口部内径相当的输卵管胚胎回收管插入输卵管喇叭口内225CM,用阻血镊由输卵管外固定,。

18、防止回收管滑脱。将含冲卵液的注射器装上冲卵液进液针;左手掌心向上,以拇指和食指捏住子宫角前端;右手持注射器由子宫角前端向输卵管方向插入进液针;用左手拇指和食指固定针头并捏住子宫角,以防止冲卵液倒流入子宫腔;缓缓推动注射器活塞,使冲卵液经子宫角尖端、宫管接合部冲说明书CN102068322ACN102068323A5/5页7入输卵管,再经输卵管胚胎回收管流入集卵杯。一侧冲洗完毕后,除去器械,将该侧送回腹腔,再冲洗另一侧。每侧用液量为10ML,冲卵液为DPBS。00325、子宫角胚胎回收采用子宫角胚胎回收针回收子宫角胚胎时,先在子宫大弯上,避开血管,插入子宫角胚胎回收针并轻轻摆动针头,确认针头进入子宫腔后,用套有乳胶管的肠钳夹住子宫角的进针部位。再用阻血镊夹住宫管接合部之前的输卵管,以防冲卵液流入输卵管。然后,从宫管接合部后约12CM处向宫管接合部方向插入进液针头,使针尖抵达阻血镊所夹部位。向输卵管方向注入冲卵液,冲卵液倒流回子宫角后,经回收针及后端的硅胶管收集冲出液于集卵杯中。一侧子宫角冲洗完毕后,除去器械,检查针孔,确认无出血现象后,可冲洗另一侧。羊子宫采胚的用液量为每侧3035ML。两侧均冲洗完毕后,向子宫内注入抗生素液,将子宫送回腹腔。0033本实施方式经过多批次实验,每批次实验用羊为510只,各批次的实验结果为每只羊平均能获得胚胎830枚。说明书CN102068322A。

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