抗病毒盐 发明领域 本发明涉及抗病毒剂， 具体地说， 涉及用于治疗微小核糖核酸病毒科， 如人鼻病毒 (HRV) 所致感染的盐和它们的制备方法。本发明也涉及这些盐在治疗微小核糖核酸病毒感 染中的应用。 本发明的盐特别适合用于治疗 HRV， 然而应理解本发明也可用于微小核糖核酸 病毒科的其它病毒。
发明背景
人鼻病毒 (HRV) 是特别的微小核糖核酸病毒， 是呼吸系统最常见的传染性病毒因 子。它们实际上是 “普通感冒” 的主要原因。该病毒颗粒由围绕一条短 RNA 链的蛋白质外 鞘模块 ( 衣壳 ) 组成。
一种功能为衣壳结合抑制剂的已获准进入近期人类临床试验的特定抗 - 微小核 糖核酸病毒的化合物是 4-[2-[1-(6- 甲基 -3- 哒嗪基 )-4- 哌啶基 ] 乙氧基苯甲酸酯， 也称 为 “吡罗达韦 (Pirodavir)” 。吡罗达韦为亲脂性， 显示水溶性差， 常用环糊精主体配制， 所 得复合物在水性介质中较易溶解而得以通过例如鼻喷雾方法递送该药物。然而， 已证明不 论选择何种赋形剂， 吡罗达韦的脂部分被温和的内切酶切割可导致该分子生物利用度差。 除成本高外， 用环糊精主体分子配制的药物显示还有其它缺点 (Int.J.Pharm.， 2002， 246， 25-35)。另一种有应用前景的抗微小核糖核酸病毒化合物 “普来可那立 (Pleconaril)” 也 显示与采用口服避孕药的患者有不良相互作用。
显然， 需要一种水溶性理想、 在生理条件下稳定和不良相互作用极少的抗微小核 糖核酸病毒化合物。此外， 需要配制较易、 以固体和液体形式贮藏时表现稳定的这种化合 物。
发明内容
WO2002/50045 公开了一类新型的显示具有特别优异抗微小核糖核酸病毒性能的 抗病毒化合物。近年来惊奇地发现 WO2002/50054 中表 3 所示 35 号化合物的二种特别的酸 加成盐， 即磷酸盐和硫酸盐， 具有优于目前所提出的治疗微小核糖核酸病毒的其它化合物 的特别优点。 化合物 35( 其 “游离碱” 用下面的结构式 I 表示 ) 经证明对 HRV2(IC500.001μg/ mL) 和 HRV14(IC500.005μg/mL) 具有强效活性。用二甲基亚砜作为载体溶剂进行这些测 试。式 I 化合物的化学名是 6-{2-[1-(6- 甲基 -3- 哒嗪基 )-4- 哌啶基 ] 乙氧基 }-3- 乙氧 基 -1， 2- 苯并异 唑。
本发明游离碱 ( 式 I) 的酸加成盐的特别优选的化学计量学形式是 ：a) 磷酸 (2 当量 ) 与该游离碱的酸加成盐， 和
b) 硫酸 (1 当量 ) 与该游离碱的酸加成盐。
因此， 本发明的一方面提供式 I 化合物游离碱的磷酸 (2 当量 ) 加成盐。
本发明另一方面提供式 I 化合物游离碱的硫酸 (1 当量 ) 加成盐。
这些盐宜具有以下特性 ：
a) 它们显示具有与游离碱相似的强效生物学活性 ( 例如对人鼻病毒式 I 化合物游 离碱的 EC50 为 14.4nM， 而式 I 化合物游离碱的磷酸 (2 当量 ) 加成盐为 17.7nM ；
b) 它们的水溶性大大高于该游离碱的其它盐以及该游离碱本身 ；
c) 它们易于制备和易于分离 ；
d) 它们易于结晶， 其结晶盐的母液和分离形式稳定。
认为这些特性对于生物学活性分子的游离碱盐是特别需要的， 有助于操作、 配制 等。
本发明另一方面提供包含所述一种盐或二种盐及一种或多种运载体的药物组合 物。
本发明另一方面提供所述磷酸加成盐的制备方法， 包括使所述游离碱与磷酸反应 的步骤， 优选使所述游离碱与大约 2 摩尔当量的磷酸， 更优选与 1.8-2.2 摩尔当量的磷酸接 触。
本发明另一方面提供制备所述硫酸加成盐的方法， 包括使所述游离碱与硫酸反应 的步骤， 优选使所述游离碱与大约 1 摩尔当量的硫酸， 更优选与 0.8-1.2 摩尔当量的硫酸接 触。
本发明另一方面提供一种在需要的对象中治疗微小核糖核酸病毒感染的方法， 包 括给予上述一种或二种盐。另一方面， 本发明提供一种在需要的对象中预防微小核糖核酸 病毒感染的方法， 包括给予上述一种或二种盐。 另一方面， 本发明提供上述一种或二种盐在 制造在需要治疗的对象中治疗微小核糖核酸病毒感染的药物中的应用。另一方面， 本发明 提供上述一种或二种盐在制造在需要预防的对象中预防微小核糖核酸病毒感染的药物中 的应用。
附图简要说明
图 1. 是用扫描电镜 (SEM) 获得的带标尺的图象， 显示本发明一优选实施方式的式 I 化合物的磷酸 (2 当量 ) 加成盐的晶体图。
图 2. 是本发明一优选实施方式的式 I 化合物的磷酸 (2 当量 ) 加成盐的 X 射线 粉末衍射图样。计算出的 2θ 峰值 (±0.2 ℃ ) 是 3.3 ℃、 6.7 ℃、 12.8 ℃、 13.3 ℃、 14.1°、 19.2°、 20.0°、 21.1°和 22.4°。
图 3. 是本发明一优选实施方式的式 I 化合物的硫酸 (1 当量 ) 加成盐的 X 射线 粉末衍射图样。计算出的 2θ 峰值 (±0.2° ) 是 3.3 ℃、 6.7°、 13.2°、 15.5 ℃、 15.9°、 18.9°和 22.9°。
图 4. 显示表 3 和 4 所述测试 1 和测试 2 获得的本发明一优选实施方式的双磷酸 二氢盐的水含量结果。
图 5. 显示表 3 和 4 所述测试 1 和测试 2 获得的本发明一优选实施方式的双磷酸 二氢盐的无水试验结果。图 6. 显示表 3 和 4 所述测试 1 和测试 2 获得的本发明一优选实施方式的双磷酸 二氢盐的总相关物质的结果。
图 7. 是本发明一优选实施方式的单硫酸盐的 X 射线晶体结构， (a) 显示不对称单 元 (ORTEP 图， 显示 30％概率椭园体 )， 和 (b) 显示压缩 b- 轴。
图 8. 是本发明一优选实施方式的双磷酸二氢盐的 X 射线晶体结构， (a) 是显示无 序的 H2PO4 与 H2O 的不对称单元 (ORTEP 图， 显示 30％概率椭园体 )， 和 (b) 显示除去无序的 水分子和 H2PO4 后的不对称单元 (ORTEP 图， 显示 30％概率椭园体 )， (c) 显示压缩 b- 轴。
图 9. 是本发明一优选实施方式的双磷酸二氢盐的典型 HPLC 色谱图。推测在这些 条件下分析时该盐至少有一定程度的分解。
发明详述
不想受理论的束缚， 认为式 I 化合物的氮原子中， 只有哌啶的氮原子易于被酸质 子化。
该分子中另外二个碱性含氮部分 ( 即苯并异 唑基和哒嗪基 ) 是相对较弱的碱， 认为这二种基团只有与强酸反应才产生稳定的酸加成盐。另一方面， 也相信所述游离碱化 合物对强酸的作用敏感， 这对于提高该游离碱的水溶性而言是一种挑战 - 即该分子形成稳 定的盐与该分子降解之间达到平衡。
目前惊奇地发现， 所述游离碱 ( 式 I) 与大约 1 摩尔当量的硫酸反应可产生双质 子化的游离碱的单硫酸盐 ( 式 II)， 而未观察到该分子降解。如本文所用将此加成盐称为 6-{2-[1-(6- 甲基 -3- 哒嗪基 )-4- 哌啶基 ] 乙氧基 }-3- 乙氧基 -1， 2- 苯并异 唑硫酸盐 (1 ∶ 1)。术语 (1 ∶ 1) 指式 I 化合物游离碱的双质子化共轭酸与硫酸根二价阴离子的摩 尔比。
此外， 惊奇地发现， 所述游离碱 ( 式 I) 与大约 2 摩尔当量的磷酸反应可产生双质 子化游离碱的双磷酸二氢盐 ( 式 III)， 仍未观察到任何降解。如本文所用将此加成盐称为 6-{2-[1-(6- 甲基 -3- 吡嗪基 )-4- 哌啶基 ] 乙氧基 }-3- 乙氧基 -1， 2- 苯并异 唑磷酸二 氢盐 (1 ∶ 2)。术语 (1 ∶ 2) 指式 I 化合物游离碱的双质子化共轭酸与磷酸二氢根阴离子的摩尔比。
虽然可能是以下这种情况， 即某给定活性化合物的给定盐可能显示具有一种或多 种特性， 使之适合用作药物 ； 但特别使人惊奇的是发现这二种盐的特性大大优于式 I 化合 物的其它盐。
式 I 化合物的游离碱与乙酸、 柠檬酸、 苯甲酸、 延胡索酸、 D- 葡糖酸、 氢溴酸、 盐酸、 马来酸、 硝酸、 草酸、 磷酸、 硫酸、 L-(+)- 酒石酸、 甲苯磺酸和甲磺酸反应形成的反应产物中， 只有与硝酸、 磷酸、 硫酸、 盐酸、 草酸和 L-(+) 酒石酸形成的盐才能产生该游离碱的盐或共 结晶， 因而可能适合用作药物。
硝酸与式 I 游离碱反应形成的酸加成盐的水溶性不大理想。随后显示式 I 游离碱 与酒石酸接触形成的产物是显著共结晶的化合物， 而不是所需的酸加成盐。
可用以下技术特征分析所述酸加成盐并测定它们的溶解度和稳定性 ：
a) 肉眼观察 ；
b) 拉曼光谱 ( 测定盐 / 共结晶形成 ) ；
c)X 射线衍射光谱 ( 测定产物的结晶度 ) ；
d) 高效液相色谱 (HPLC) 分析 ( 反向 ； 测定副产物的形成 ) ；
e) 差示扫描量热法 ( 测定融点 / 分解温度 ) ；
f) 元素分析 ( 测定纯度 / 吸湿性 ) ；
g) 溶解度测定 ( 在用 HPLC 测定饱和液的浓度之前必须保留固体或可将其滤除的 条件下， 使 10mg 盐与有限量的水接触一定时间 ) ；
h) 在不同应激条件下贮藏 4 周 (25 ℃干燥， 25 ℃和 75 ％相对湿度 (rh)， 25 ℃和 90％ rh， 40℃干燥， 40℃和 75％ rh， 40℃和 90％ rh) ； 包括在测试期间用近红外光谱和拉曼 光谱作非侵入性特征分析以及测试完成时进行 HPLC 分析。
实施例 5 提供了这些特征分析方法的进一步细节和参数。表 1 显示式 I 游离碱的 酸加成盐所获得的比较结果。灰底单元格表示采用该盐作为药物时结果不理想。如该表所 见， 就水溶性和贮藏稳定性而言， 盐 2 和 4 显著优于其它盐。2 ∶ 1 的草酸∶游离碱盐的元 素分析结果与预计结果不一致， 因此 1873mg/ml 这一略高的溶解度不算有意义的结果。
表1
不想受理论的束缚， 在式 I 化合物中三个碱性含氮部分中两个相对较弱时， 看来 它们在形成盐时不一定需要强酸。与其它无机酸， 如硫酸、 盐酸和硝酸相比， 磷酸是弱酸。 然而令人十分惊奇的是， 已证明磷酸加成盐 ( 表 1 中的盐 4) 不仅能结晶而且在许多条件下 稳定。事实上， 从表 1 可见， 与盐酸形成的盐 ( 表 1 中的盐 1) 稳定性差于与磷酸形成的盐 ( 表 1 中的盐 4)。
另一个令人惊奇的结果是， 所述游离碱双质子化形成的产物 ( 式 II 和式 III 二者 的盐 ) 显示的稳定性高于该游离碱被盐酸单质子化形成的产物。
此外， 式 III 的双磷酸二氢盐的溶解性高于根据单磷酸二氢盐 ( 表 1 中的盐 3) 溶 解性用外推法预测得到的溶解度。
采用以下试验参数测试了双磷酸二氢盐的稳定性 ：
i) 外观
ii) 水含量
iii) 试验 ( 以无水含量计算 )
iv) 相关化合物 ( 作为最大个体报告 )
v) 相关化合物 ( 总体 )
该双磷酸二氢盐的描述见表 2。其特征鉴定方法、 参数和示范性 HPLC 试验数据在 实施例 5 中提供。
表2： 双磷酸二氢盐的描述
将二批双磷酸二氢盐分别避光贮藏于 25℃ /60％相对湿度下 12 个月 ( 测试 1， 批 次 1) 和 36 个月 ( 测试 2， 批次 2)。同时在 40℃ /75％相对湿度的加速条件下避光贮藏这 二批样品。以适当时间间隔检测样品。在与全尺寸初期包装单位相当的棕色玻璃瓶中进行 试验。
结果显示该双磷酸二氢盐具有长期稳定性， 参见表 3( 测试 1) 和表 4( 测试 2) 及 图 4-6。
表 3. 双磷酸二氢盐贮藏 12 个月的稳定性数据 ( 测试 1， 批次 1)
1. 符合＝黄色可自由流动的粉末。整体包装。 表4： 双磷酸二氢盐贮藏 36 个月的稳定性数据 ( 测试 2， 批次 2)1. 符合＝黄色可自由流动的粉末。整体包装。
虽然根据阴离子与阳离子的似乎精确的摩尔比描述本发明酸加成盐， 但应理解本 发明的酸加成盐可能包含盐、 游离碱和适当过量酸的混合物， 这取决于形成盐所用的反应 条件。例如， 如果使不到 1 摩尔当量 ( 如 0.7 当量 ) 的硫酸与式 I 游离碱反应， 反应后的分 离产物很可能含有一定比例的式 II 的盐和与一定比例的式 I 游离碱。然而， 该混合物仍显 示出采用 1 摩尔当量的酸所形成的盐的许多有益性质。同样， 如果使大于 2 摩尔当量 ( 如 2.6 当量 ) 的磷酸与式 I 游离碱反应， 分离的产物很可能含有一定比例的式 III 的盐和一定 比例的过量磷酸。然而， 该混合物仍显示出采用 2 摩尔当量的酸所形成的盐的许多有益性 质。应理解所述的这类混合物属于本发明的范围。因此， 在本发明的一优选实施方式中， 提 供了含有 ( 更优选 ) 基本上均为式 I 化合物的酸加成盐的混合物。
本发明也提供形成式 II 的盐的方法， 包括使式 I 游离碱与硫酸接触。本发明提供 形成式 III 的盐的方法， 包括使式 I 游离碱与磷酸接触。应理解， 在所述盐形成中其最终产 物有可能被化学计量上与式 II 和 III 的盐不相同的盐污染。在某些实施方式中， 通过使游 离碱与 0.5-1.5 摩尔当量之间 ( 优选 0.9-1.1 摩尔当量之间 ) 的硫酸接触而形成式 II 的
盐。在某些实施方式中， 通过使游离碱与 1.5-2.5 摩尔当量之间 ( 优选 1.8-2.2 摩尔当量 之间 ) 的磷酸接触而形成式 III 的盐。在各例子中， 宜采用能完全溶解所述游离碱与硫酸 / 磷酸， 但对式 II/III 的盐而言是不良溶剂的一种或多种反应溶剂。优选用异丙醇来形成 该双磷酸二氢盐， 虽然乙醇和较少采用的甲醇是可替代的溶剂。应知道磷酸和硫酸二者常 常含有一定量的水。明智地选择反应溶剂有助于使所述盐与母液相分离， 这是本领域熟知 的技术。或者， 可通过采用纯硫酸或纯磷酸来避免采用溶剂。无论如何， 应知道， 熟练的化 学工作者不难及时修改反应期间和 / 或之后反应混合物的温度， 以优化所述盐的形成和 / 或优化盐形成后从反应混合物中回收所述盐。例如， 开始时加热所述游离碱和酸使之溶解 和 / 或通过搅拌促进溶解， 然后冷却反应混合物以减少溶液中残留的盐量。虽然本发明的 酸加成盐优选基本上以结晶形式存在， 但应理解这类化合物也可以是部分晶体的形式， 或 甚至为无定形形式， 这取决于 ( 例如 ) 形成固体产物的条件。本发明也考虑这些形式。进 一步应知道， 某些晶体化合物可能存在不同的晶形 - 即称为多晶形的现象。本发明也考虑 包括这些不同的个体晶形及其混合物。熟练的技术人员明白， 可改变许多不同的参数来影 响通过酸对式 I 游离碱的作用所产生的固体的性质。
本发明也涉及式 II 和 III 的酸加成盐的溶剂化物 ( 包括水合物 )。结晶所用的溶 剂可包括醇 ( 如甲醇、 乙醇、 i-PrOH)、 醛、 酮 ( 如丙酮 )、 酯 ( 如乙酸乙酯 ) 和水， 它们都会 不可避免地以某种程度包含在产生的盐中。产生的盐中溶剂分子的含量和位置取决于 ： 结 晶用的溶剂、 发生结晶的温度、 发生结晶时的压力、 结晶速度、 分子间和分子内作用力、 分离 后的贮藏和干燥条件等等。形成所述盐产品所用的溶剂优选是药学上可接受的溶剂。 本发明还提供包含本发明一种或二种盐 ( 优选为治疗有效量 ) 和一种或多种药学 上可接受的固体和 / 或液体运载体的固体或液体药物组合物。本文所用的术语 “药学上可 接受的运载体” 包括充填剂、 稀释剂、 赋形剂、 添加剂或包封剂这类术语， 用于表面、 局部或 全身给药时应安全。不难采用本领域熟知的药学上可接受的运载体， 如调味剂、 增溶剂、 润 滑剂、 悬浮剂、 粘合剂、 防腐剂、 药片崩解剂和包封材料来配制本发明的药学活性衍生物。 可 采用这类运载体将本发明的化合物配制成以下剂型， 如片剂、 粉剂、 扁囊剂、 锭剂、 丸剂、 胶 囊剂、 液体剂、 凝胶剂、 糖浆剂、 膏剂、 混悬剂等等。这些运载体是本领域熟知的， 可包括糖、 淀粉、 纤维素及其衍生物、 麦芽、 明胶、 碳酸镁、 硬脂酸镁、 滑石粉、 硫酸钙、 植物油、 合成油、 多元醇、 藻酸、 磷酸缓冲液、 乳化剂、 果胶、 黄蓍胶、 低融点蜡、 可可脂、 等渗盐水和无热原质 水。
本发明所述盐的令人惊奇特性使它们特别适合用于固体药物组合物中。例如， 由 于它们缺乏吸湿性而有利于减少操作 ( 称重， 运输等 )， 而它们的稳定性有利于在合成和分 离后延长贮存期。具体说， 可通过混合该活性化合物与固体辅料， 任选碾磨得到的混合物， 视需要加入合适辅料后将该混合物加工成颗粒来获得口服药物组合物， 从而获得药片或糖 锭芯。适合的赋形剂包括 ： 充填剂如糖 ( 包括乳糖、 葡萄糖、 蔗糖、 甘露醇或山梨醇 ) 和纤维 素制品如玉米淀粉、 小麦淀粉、 大米淀粉、 土豆淀粉、 明胶、 西黄蓍胶、 甲基纤维素、 羟丙基甲 基纤维素、 羧甲基纤维素钠以及聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。 如果需要， 可加入崩解剂， 如交联聚 乙烯吡咯烷酮、 琼脂或藻酸或其盐 ( 如藻酸钠 )。本发明还提供含合适包衣的糖锭芯。为此 目的， 可采用浓缩的糖液， 任选包含阿位伯胶、 滑石粉、 聚乙烯吡咯酮、 卡波姆凝胶、 聚乙二 醇和 / 或二氧化钛、 漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可在药片或糖锭包衣中加入
染料或色素以便于识别或鉴定活性化合物剂量的不同组合。
按照一个优选实施方式， 配制用于口服递送的包含本发明式 I 化合物的酸加成盐 的药物组合物。
可用于口服的药物包括 ： 明胶制成的压接 (push-fit) 胶囊， 以及用明胶和增塑剂 如甘油或山梨糖醇制成的密封软胶囊。 这种压接胶囊可包含所述活性成分及混合的充填剂 如乳糖、 粘合剂如淀粉、 和 / 或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁， 及任选的稳定剂。在软胶囊中， 所述活性化合物可溶解或悬浮在合适的液体， 如脂肪油、 液体石蜡或液体聚乙二醇中。此 外， 也可加入稳定剂。
本发明各所述盐的较高水溶性使它们适合用于含极性 ( 尤其是水性 ) 溶剂的药物 组合物中。 具体说， 本发明所提供的液体药物组合物可包含可接受的稀释剂和运载体， 本领 域技术人员熟悉的稀释剂和运载体包括但不限于 ： 盐水、 灭菌水、 乙氧化和非乙氧化的表面 活性剂、 聚 ( 乙二醇 )、 聚 ( 丙二醇 )、 脂肪醇、 脂肪酸、 烃油 ( 如棕榈油、 椰子油和矿物油 )、 可可脂蜡、 硅油、 pH 平衡剂、 纤维素衍生物、 乳化剂如非离子有机和无机碱、 合成的胶、 树脂、 防腐剂、 蜡酯、 类固醇、 甘油三酯、 磷脂如卵磷脂和脑磷脂、 多羟基醇酯、 脂肪醇酯、 亲水性羊 毛脂衍生物、 亲水性蜂蜡衍生物和主体分子如环糊精 ( 如 α-、 β- 和 / 或 γ- 环糊精 )， 可 修饰主体分子以使客体分子的某部分 ( 如本发明的盐 ) 暴露于溶剂。
本发明的组合物也可作为 ( 例如 ) 鼻或肺吸入气雾剂或喷雾器溶液， 或是单独或 与椭性载体如乳糖或其它药学上可接受的辅料混合的供吹入的微细粉末 ( 优选颗粒大小 为微米级或更小 ) 经呼吸道给药。气雾剂包括以加压包装提供的所述盐和合适的推进剂 如氯氟烃 (CFC)， 例如二氯二氟甲烷、 三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷、 二氧化碳或其它合适的气 体。 这种气雾剂还可方便地包含表面活性剂如卵磷脂。 可通过提供计量阀门控制给药剂量。 该盐也可通过在鼻腔中形成凝胶的药物制剂提供。可提供单位剂型的粉末组合物， 如在明 胶胶囊或药筒中提供， 或提供起泡包装的粉剂， 通过吸入器给药。
因此， 在另一优选实施方式中， 配制供鼻内递送的包含本发明式 I 化合物的酸加 成盐的药物组合物。
本发明的药物组合物可缓释所述活性化合物。
优选本发明的药物组合物以单位剂型提供。
本发明的药物组合物也可包含一种或多种其它治疗成分和 / 或预防成分。本发明 的盐可与已知的抗病毒或抗逆转录病毒药物或用于治疗病毒感染的其它药物联用。 其它药 物的代表性例子包括 ： 免疫调节剂、 免疫刺激剂、 抗生素和消炎药物。示范性的抗病毒药物 包括 ： 扎那米韦、 金刚乙胺、 金刚烷胺、 三氮唑核苷、 AZT、 3TC、 (-)FTC、 阿昔洛维、 泛西洛维、 喷西洛维、 ddI、 ddC、 甘西洛韦、 沙奎那韦、 洛韦胺 ； 其它非核苷酸逆转录酶 (RT) 抑制剂和蛋 白酶抑制剂 ； 抗病毒和抗受体抗体及受体类似物如 ICAM-1。示范性的免疫调节剂和免疫刺 激剂包括各种白介素、 细胞因子和抗体制品。 示范性的抗生素包括抗真菌药和抗细菌药。 示 范性的消炎药包括糖皮质激素和非类固醇消炎化合物。
本文所用的术语 “有效量” ， 指一种或多种药物以单次剂量或系列剂量的一部分， 能在需要治疗或预防的对象中有效产生所需结果的用量。例如， 可通过对象中特定病毒颗 粒数量的减少， 或症状的缓解来衡量这种效果。有效量可取决于所治疗个体的健康和生理 状况、 所治疗对象的分类学地位、 所述组合物的配方、 医学状态的评估和其它有关因素。所述活性药物化合物的给药量取决于所治疗的对象， 包括其年龄、 性别、 体重和全身健康状 况。预期此有效量的范围较宽， 可通过常规试验确定。在某些情况下， 给予 “有效量” 的活 性化合物可使对象的症状和 / 或有关的病毒颗粒数量降低 50％。给予对象的活性化合物 剂量应能使该对象随时间推移充分产生有益的应答， 如病毒感染症状减轻或缓解。就此点 而言， 所述活性药物的精确给药量取决于医生的判断。在确定给予的所述活性化合物的有 效量时， 医生可评价病毒感染相关症状的严重程度和 / 或判定病毒感染程度的其它一些指 标。每片含 100mg 活性成分或更广泛地说含 0.1-400mg 的制剂是合适的代表性单位剂型。 本文所用的术语 “对象” 、 “个体” 或 “患者” 可互换使用， 指需要治疗或预防的任何对象， 优 选脊椎动物， 甚至更优选哺乳动物。 所述对象最优选为需要治疗或预防受到病毒， 优选微小 核糖核酸病毒科， 特别是 HRV 感染的人对象。
因此， 本发明另一方面提供在需要的对象中治疗微小核糖核酸病毒感染的方法， 包括给予式 II 和 / 或式 III 的盐。
本发明另一方面提供在需要的对象中预防微小核糖核酸病毒感染的方法， 包括给 予式 II 和 / 或式 III 的盐。
另一方面， 本发明提供所述式 II 和 / 或式 III 的盐在制备在需要的对象中治疗微 小核糖核酸病毒感染的药物中的应用。
另一方面， 本发明提供所述式 II 和 / 或式 III 的盐在制备在需要的对象中预防微 小核糖核酸病毒感染的药物中的应用。
所述微小核糖核酸病毒感染系由微小核糖核酸病毒科的任何病毒所致。 其代表性 的成员包括 ： 人鼻病毒属 ； 脊髓灰质炎病毒属 ； 肠病毒属包括柯萨奇病毒和埃可病毒 ； 肝病 毒属、 心病毒属 ； 口蹄疫病毒属 ； 甲肝病毒和其它尚未确定具体属的微小核糖核酸病毒， 包 括这些病毒的一种或多种血清型。 优选用本发明来预防或治疗鼻病毒的一种或多种血清型 所致的感染。
本文所用术语 “治疗” 涵盖治疗对象， 优选哺乳动物 ( 非人哺乳动物或人 )， 更优选 人的病症或疾病， 其包括 ： (i) 抑制病毒感染， 即阻止其增殖 ； (ii) 缓解感染， 即减轻感染的 严重程度 ； 或 (iii) 缓解感染所致的病况， 即缓解感染症状。本文所用的术语 “预防” 涵盖 防止或预防对象， 优选哺乳动物 ( 非人哺乳动物或人 )， 更优选人的病症或疾病， 包括预防 易受感染但尚未诊断受到感染的对象发生病毒感染。
下面参照一些实施例对本发明进行描述。 应理解以下描述的具体内容不能代替本 发明先前描述的普遍性。
实施例 1 ：
6-{2-[1-(6- 甲基 -3- 哒嗪基 )-4- 哌啶基 ] 乙氧基 }-3- 乙氧基 -1， 2- 苯并异 唑磷酸盐 [ 式 III]
将式 I 游离碱 (1kg) 加入异丙醇 (24L) 中。加热回流该悬浮液溶解所述碱。将磷 酸 (81％ w/w， 0.63kg， 2.1 当量 ) 的异丙醇 (2.3L) 水溶液加热至 80℃， 然后迅速搅拌加入 到游离碱的回流溶液中。立即形成沉淀。将该浆液加热至 78℃ -82℃保持 5 分钟， 然后冷 却至室温。用异丙醇 (3x10L)、 再用丙酮 (3x10L) 洗涤固体产物， 然后 40℃抽真空干燥至恒 定质量， 得到的标题化合物为亮黄色结晶固体 (1.5kg， 97％ )。
实施例 2 ：
6-{2-[1-(6- 甲基 -3- 哒嗪基 )-4- 哌啶基 ] 乙氧基 }-3- 乙氧基 -1， 2- 苯并异 唑硫酸盐 [ 式 II]
将式 I 游离碱 (1g) 的四氢呋喃溶液 (52ml) 加入到硫酸水溶液 (0.05M， 52ml， 1当 量 ) 中， 混合液立即变成混浊。按照以下减压程序室温缓慢去除溶剂分离得到盐 ： 时间 (h) 00:00:00 00:30:00 01:30:00 02:30:00 05:30:00 08:30:00 11:30:00 14:30:00 18:00:00 压力 600mbar 600mbar 500mbar 400mbar 300mbar 200mbar 100mbar 1mbar 1mbar实施例 3 ：
通过用所述盐和无水葡萄糖充填大小为 0 号的棕色硬明胶胶囊制备含式 III 盐的 药物组合物。该胶囊中的组分小结见表 5。
表5QS ＝含量足够符合预定的充填重量
实施例 4 ： X- 射线晶体分析
获得甲醇重结晶后的所述单硫酸盐和双磷酸二氢盐的 X 射线晶体结构。
(i) 单硫酸盐 ( 分子式 [C21H28N4O3](SO4))
评价了重结晶该单硫酸盐所用的六种溶剂 ( 乙醇、 甲醇、 丙酮、 四氢呋喃、 乙腈和 2- 丙醇 )。选择甲醇是因为它显示能使所述盐在升高温度下溶解度最佳。将 20mg 单硫酸 盐溶于 40℃温热甲醇中， 然后缓慢冷却至室温形成黄色结晶。将黄色结晶固定在配备了石 墨单色镜的 Stoe Mark II 型成像平板衍射仪系统 (Stoe & Cie， 2002) 上。
用 Mo-Kα 辐射光在 -100℃收集数据。在 135mm 的成像板距离、和 ) ＜ ω ＜ 180°及通过 1°的 ω 晶体振荡的条件下获得 180 次暴光， 每次暴光 10 分钟。分辨率为 使单硫酸盐在中心对称的单晶室中结晶， 空间群为 P21/c。采用 SHELXS-97 程序 (Sheldrick， G.M.， Acta Cryst.(2008)A64， 112-122) 以直接方法解析此化合物的结构， 并用 SHELXH-97 对 F 作全基质最小二乘法进行精辨 (Spek， A.L.J.Appl.Cryst.(2003)36， 7-13)。得到傅里叶 (Fourier) 差别图的 N-H 氢原子然后作为搭乘原子， 同时将剩余的氢原 子直接包括在计算的位置中作为采用 SHELXS-97 缺省参数的搭乘原子。各向异性地精辨所 有非氢原子。不采用吸收校正。该晶体只有弱衍射， 这归因其尺寸 (0.50x0.45x0.03mm)。 获得的晶体为极薄板片。用可接受的标准精辨该结构在键长和角度上不确定。
单硫酸盐的 X- 射线晶体数据
晶体数据
晶体形状 ： 板片状 ； 晶体颜色 ： 黄色 ； 晶体尺寸 ： 0.50x0.45x0.03mm ； 经验公式 ： C21H28N4O7S ； 化学式重量 ： 480.53 ； 晶体系统 ： 单斜晶 ； 空间群 ： P 21/c ； 晶胞尺度 ： a＝ 22.578(4)A α ＝ 90 度 ； b ＝ 13.175(2)A β ＝ 94.746(15) 度 ； c ＝ 7.4843(13)Aγ ＝ 90 3 度； 体积 ： 2218.7(7)A ； 晶胞精辨参数 ： 屈光率 1873 ； 角度范围 2.38 ＜ θ ＜ 21.30 ； Z是4； 3 密度 ( 计算的 )1.439g/cm ； 所用辐射 MoK\a ； 波长 0.71073A ； 线性吸收系数 0.198mm-1 ； 温 度 173(2)° K。
数据收集细节
衍射仪 STOE IPDS 2 ； 扫描方法 ： 旋转法 ； 检测的反射次数 12038 ； 独立的反射次 数 2889 ； 观察到的反射次数 1060 ； 识别标准＞ 2σ(I) ； R(int) ＝ 0.2485 ； 数据收集的 θ 范围 1.79-22.50 度角 ； 指数范围 24 ＜＝ h ＜＝ 24， -14 ＜＝ k ＜＝ 14， -8 ＜＝ l ＜＝ 8 ； F(000)1016。
精辨细节
精辨方法 ： 对 F2 作全基质最小二乘法 ； 最后的 R 指数为 [I ＞ 2σ(I)]R1 ＝ 0.1022，
wR2 ＝ 0.2222 ； R 指数 ( 所有数据 )R1 ＝ 0.2264， wR2 ＝ 0.2816 ； R1[ ＝ SUM(||Fo|-|Fc||)/ 2 2 2 2 4 1/2 SUM|Fo|] ； wR { ＝ [SUM(w(Fo -Fc ) )/SUM(wFo )] } ； H- 定位和精辨方法 ： 强迫法 ； 所用 2 的反射次数 2889 ； L.S 数 ： 约束 4 ； 精辨参数的数目 298 ； 对 F 的吻合度 0.892 ； S{ ＝ [SUM 2 2 2 1/2 2 2 w(Fo -Fc ) ]/(n-p) }n ＝反射次数 ； p ＝所用参数 ； 计算的 w ＝ 1/[\s (Fo )+(0.1225P)2] ； 此处 P ＝ (Fo2+2Fc2)/3 ； 最高 δ/σ0.000 ； 最大 e- 密度 0.374e.A-3 ； 最小 e- 密度 -0.538e. -3 A 。
所用的计算机程序
数据收集程序： STOE X-AREA ； 晶胞精辨程序： STOE X-AREA ； 数据归约程 序： STOE X-RED ； 结 构 解 析 程 序： SHELXS-97(Sheldrick， 1990) ； 结 构 精 辨 程 序： SHELXL-97(Sheldrick， 1997)。
(ii) 双磷酸二氢盐一水合物 ( 分子式 {[C21H28N4O3](H2PO4)2(H2O)}).
评价了重结晶该双磷酸二氢盐所用的六种溶剂 ( 乙醇、 甲醇、 丙酮、 四氢呋喃、 乙 腈和 2- 丙醇 )。选择甲醇是因为它显示能使所述盐在升高温度下溶解度最佳。将 20mg 双 磷酸二氢盐溶于 40℃温热甲醇中， 然后缓慢冷却至室温形成黄色结晶。将黄色结晶固定在 配备了石墨单色镜的 Stoe Mark II 型成像平板衍射仪系统 (Stoe & Cie， 2002) 上。
用 Mo-Kα 辐射光在 -100℃收集数据。在 135mm 的成像板距离、和＜ ω ＜ 180°及通过 1°的 ω 晶体振荡的条件下获得 180 次暴光， 每次暴光 10 分 钟。分辨率为 使双磷酸二氢盐在中心对称的单晶室中结晶， 空间群为 C2/c。此结晶化合物为与 二个 H2PO4 阴离子和一个无序的水分子形成的双阳离子。发现这二个阴离子中一个无序， 导致原子 O9、 O10、 O11、 O9a、 O10a 和 O11a 部分占据 ( 占据率 0.5)。发现 H2PO4- 阴离子无氢 原子但计算时包括了氢原子。各向同性地精辨无序和部分占据的水分子。发现该水分子无 氢原子但计算时包括了氢原子。
采用 SHELXS-97 程序 (Sheldrick， G.M.， Acta Cryst.(2008)A64， 112-122) 以直 接方法解析此化合物的结构， 并用 SHELXH-97 对 F 作全基质最小二乘法进行精辨 (Spek， A.L.J.Appl.Cryst.(2003)36， 7-13)。得到傅里叶 (Fourier) 差别图的 N-H 氢原子然后作 为搭乘原子， 同时将剩余的氢原子直接包括在计算的位置中作为采用 SHELXS-97 缺省参数 的搭乘原子。各向异性地精辨所有非氢原子。不采用吸收校正。该晶体只有弱衍射， 这归 因其尺寸 (0.45x0.40x0.05mm)。 获得的晶体为极薄板片。 用可接受的标准精辨该结构在键 长和角度上不确定。
双磷酸二氢盐的 X- 射线晶体数据
晶体数据
晶体形状 ： 板状 ； 晶体颜色 ： 黄色 ； 晶体尺寸 ： 0.45x0.40x0.05mm ； 经验公式 ： C21H34N4O12P ； 化学式重量 ： 596.46 ； 晶体系统 ： 单斜晶 ； 空间群 ： C 2/c ； 晶胞尺度 ： a＝ 54.964(14)A α ＝ 90 度 ； b ＝ 12.692(2)A β ＝ 91.931(18) 度 ； c ＝ 7.8918(15)A γ ＝ 3 90 度 ； 体积 ： 5502(2)A ； 晶胞精辨参数 ： 屈光率 1873 ； 角度范围 1.48 ＜ θ ＜ 21.98 ； Z是8 ； 3 密度 ( 计算的 )1.440g/cm ； 所用辐射 MoK\a ； 波长 0.71073A ； 线性吸收系数 0.226mm-1 ； 温 度 173(2)° K。
数据收集细节
衍射仪 STOE IPDS 2 ； 扫描方法 ： 旋转法 ； 检测的反射次数 12038 ； 独立的反射次数 2889 ； 观察到的反射次数 1060 ； 识别标准＞ 2σ(I) ； R(int) ＝ 0.2505 ； 数据收集的 θ 范 围 1.48-22.50 度角 ； 指数范围 -58 ＜＝ h ＜＝ 58， -13 ＜＝ k ＜＝ 13， -8 ＜＝ l ＜＝ 8 ； F(000)2512。
精辨细节
精辨方法： 对 F2 作 全 基 质 最 小 二 乘 法 ； 最 后 的 R 指 数 为 [I ＞ 2σ(I)]R1 ＝ 0.0995， wR2 ＝ 0.2330 ； R 指 数 ( 所 有 数 据 )R1 ＝ 0.2114， wR2 ＝ 0.2823 ； R1[ ＝ 2 2 2 2 4 1/2 SUM(||Fo|-|Fc||)/SUM|Fo|] ； wR { ＝ [SUM(w(Fo -Fc ) )/SUM(wFo )] } ； H- 定 位 和 精 辨 方法 ： 强迫法 ； 所用的反射次数 3608 ； L.S 数 ： 约束 7 ； 精辨参数的数目 342 ； 对 F2 的吻合 度 0.928 ； S{ ＝ [SUM w(Fo2-Fc2)2]/(n-p)1/2} ； n ＝反射次数 ； p ＝所用参数 ； 计算的 w ＝ 1/ 2 2 2 2 2 [\s (Fo )+(0.1225P) ] ； 此处 P ＝ (Fo +2Fc )/3 ； 最高 δ/σ0.000 ； 最大 e- 密度 0.610e. -3 -3 A ； 最小 e- 密度 -0.417e.A 。
所用的计算机程序
数据收集程序： STOE X-AREA ； 晶胞精辨程序： STOE X-AREA ； 数据归约程 序： STOE X-RED ； 结 构 解 析 程 序： SHELXS-97(Sheldrick， 1990) ； 结 构 精 辨 程 序： SHELXL-97(Sheldrick， 1997)。
实施例 5 ： 鉴定盐的方法和参数
采用以下方法和参数鉴定本发明的盐。
拉曼光谱测定的参数
光谱仪 ： Bruker RFS 100/S 拉曼光谱仪
激光激发光功率 ： 400mW -1
分辨率 ： 2cm
扫描次数 ： 128
采集范围 ： 3300-0cm-1
孔径 ： 5.0mm
小瓶类型 ： 带 FEP 内衬的 RPD 96 孔板形式的玻璃小瓶或 RPD 96 孔板形式的玻璃 小瓶
样品位置 ： 优化至最佳信号强度
谱图预处理 ： 线性基线校正， 标准化
NIR 测定的参数
光谱仪 ： Bruker Vector 22NIR 光谱仪
分辨率 ： 2cm-1
扫描次数 ： 64
采集范围 ： 833-2500nm
孔径 ： 5.0mm
小瓶类型 ： RPD 96 孔板形式的玻璃小瓶
光谱预处理 ： 线性基线校正。
CCD- 图像采集
照相机 ： 索尼 XCD-C710CR目镜 ： Navitar 精密眼 ( 镜筒产品号 1-61449， 附件 1.33X( 产品号 1-41448) 和 0.5X( 产品号 1-60110).
X- 射线粉末衍射检测
光谱仪 ： Stoe Stadip 光谱仪
检测器 / 几何方法 ： 位置灵敏探测器 / 德拜 - 谢勒 (Debye-Scherrer) 几何学法
X- 射线源 ： Cu Kα ； 测量模式 ： 在 0.5mm 毛细管中传送
元素分析
采用以下方法测定元素组成 ：
C， H， N： 高温分解和定量检测烟气流 ( 仪器 Leco-900)
Cl ：消化后进行离子色谱测定S： 高温分解和用 IR 检测器定量检测烟气流 ( 仪器 LECO-CHN-932)
P： 微波消化后光度计检测。
DSC 分析
在 MT(Mettler Toledo) 差示扫描量热器上进行 DSC 分析， 加热速度每分钟 5℃。
溶解度测定
在 25℃用去离子水平衡约 10mg 所述酸加成盐 24 小时。过滤该悬浮液， 用 HPLC 检 测游离碱含量和检测饱和溶液的 pH。
HPLC 分析
将 10.0mg 所述盐溶于乙腈∶乙醇＝ 1 ∶ 1 的溶液中稀释至 1.0mg/mL 浓度， 以制 备所述酸加成盐的测试液。
色谱仪 ： TSP
检测器 SP877XR( 谱图物理公司 (Spectra-Physics))
层厚 ： 8mm.
检测波长 ： 230nm(UV 检测 )
输出电压 ： 1V
柱体 ： Nucleosil C18
粒度 ： 5μm
柱长 ： 250mm
柱内径 ： 4.0mm
柱温 ： 室温 样品大小 ： 10μl 参比液 / 测试液 流速 ： 1.0 毫升 / 分 梯度程序 1 ：时间 [ 分钟 ] 0.1％磷酸水溶液 [％ ] 0 70 35 1 36 70 41 70 评价 ： 计算面积％ 双磷酸二氢盐的示范性 HPLC 试验数据19乙腈 [％ ] 30 99 30 色谱条件 仪器 配有 UV 检测器的 HPLC 系统 柱体 ： WS(Waters Symmetry)， C8， 5μm， 150mm x 3.9mm 柱温 ： 25℃ 检测波长 ： 265nm 流速 ： 1.0mL/ 分 注入体积 ： 10μL 流动相 ： 0.1M KH2PO4(pH 3.0) ∶甲醇 (45 ∶ 55) 运行时间 ： 30 分钟 稀释液 ： 流动相 针头洗涤液 ： 甲醇 (100％ ) 在这些条件下该双磷酸二氢盐的保留时间约为 9-11 分钟。 图 9 所示的示范性 HPLC 色谱具有以下峰结果 ：名称 Int 类型 BB BB 双磷酸二氢盐 BB bb RT 2.623 5.489 10.641 15.555 高度 180 135 366923 113 面积 1311 1697 7581975 2575 面积％ 0.02 0.02 99.93 0.03稳定性
在以下条件下， 将约 30mg 的所述盐贮藏在 96 孔玻璃小瓶中 4 周 ：
·25℃ / 干燥
·25℃ /75％相对稳定
·40℃ / 干燥
·40℃ /75％相对稳定
在测试样品贮藏期间的预先选定时间上测定样品的 NIR 和拉曼光谱 ( 非侵入法 )。 分析样品的 NIR 和拉曼光谱， 以获得测试物的吸湿性 (NIR)、 形态学 (NIR 和拉曼 ) 和化学变 化的信息。在该贮藏期结束时对测试物进行 HPLC 分析。
除非文中另有要求， 本说明书和权利要求书中的词语 “包括” 及其变体如 “包含” 和 “含有” 应理解为暗示包括所述的整数或步骤， 或一组整数或一组步骤， 但不排除任何其它 整数或步骤， 或另外一组整数或一组步骤。本说明书中提到在先出版物 ( 或从其产生的信 息 ) 或任何已知的信息时， 不是也不应理解成本发明人承认、 认可或以任何方式暗示该在 先出版物 ( 或从其产生的信息 ) 或已知的信息构成本发明所属领域公知常识的一部分。