新的拟肽化合物 发明领域 本发明涉及式 (I)、 (II) 或 (III) 的新化合物及含有它们的药物组合物， 以及它们 在淀粉样蛋白病 ( 尤其是如在阿尔茨海默病中观察到的 Aβ 淀粉样蛋白病 )、 感染性疾病、 PAI-1 相关疾病的治疗中的用途， 以及在制备用于此类治疗的药物中的用途。
发明背景
拟肽化合物可用于干涉不同的蛋白质 - 蛋白质、 肽 - 蛋白质和 / 或肽 - 肽相互作 用。此类相互作用是在各种自然与疾病相关的生物过程中涉及的常见机制， 所述生物过程 包括淀粉样蛋白的形成、 伴侣蛋白辅助的蛋白质折叠和丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制 剂之间的相互作用。
阿尔茨海默病的特征在于 ： 作为细胞外淀粉样蛋白斑块和作为脑血管壁内淀粉样 蛋白存在的称为 β- 淀粉样蛋白或 Aβ 的 39-43 氨基酸肽以纤丝形式聚集。阿尔茨海默病 中的纤丝状 Aβ 淀粉样蛋白沉积被认为对患者有害， 并最终导致毒性和神经元细胞死亡， 这是阿尔茨海默病的特征标志。 越来越多的证据牵涉淀粉样蛋白， 更具体而言， 牵涉作为阿 尔茨海默病发病机理的主要病因因素的 Aβ 纤丝的形成、 沉积、 聚集和 / 或存留。此外， 除 阿尔茨海默病之外， 含有多种其它淀粉样蛋白病涉及 Aβ 纤丝的形成、 沉积、 聚集和存留， 包括唐氏综合征、 涉及嗜刚果红血管病的病症， 例如但不限于荷兰型遗传性脑出血、 包涵体 肌炎、 拳击手痴呆、 脑内 β- 淀粉样血管病、 与进行性核上性麻痹相关的痴呆、 与皮质基底 变性相关的痴呆和轻度认知功能损害。
帕金森病是特征在于表现出淀粉样蛋白的许多特征的异常纤丝蛋白沉积物的 形成、 沉积、 聚集和 / 或存留的另一种人类病症。在帕金森病中， 由 α- 突触核蛋白 / NAC( 非 -Aβ 成分 ) 的纤丝组成的细胞质路易体的聚集被认为在发病机制中是重要的， 并被 认作治疗靶标。能够抑制 α- 突触核蛋白和 / 或 NAC 形成、 沉积、 聚集和 / 或存留， 或瓦解 预先形成的 α- 突触核蛋白 /NAC 纤丝或其部分的新药剂或化合物被认为是治疗帕金森病 和相关突触核蛋白病的潜在疗法。NAC 是能够在体外或如在帕金森病患者脑内观察到的那 样形成淀粉样蛋白样纤丝的 α- 突触核蛋白 35 氨基酸片段。由于 α- 突触核蛋白的 NAC 片段被认为对如在所有帕金森病、 突触核蛋白病和相关病症的患者中观察到的路易体的形 成是至关重要的， 因此 α- 突触核蛋白的这部分是相对重要的治疗靶标。
多种其它人类疾病也表现出淀粉样蛋白沉积并通常涉及系统器官 ( 即位于中枢 神经系统之外的器官或组织 )， 具有导致器官功能障碍或衰竭的淀粉样蛋白聚集。 这些导致 在许多不同器官与组织中显著的淀粉样蛋白聚集的淀粉样蛋白病 ( 下文讨论 ) 称为系统性 淀粉样变。在其它淀粉样蛋白病中， 单个器官可受到侵袭， 如 90％的 2 型糖尿病患者的胰 腺。在这种类型的淀粉样蛋白病中， 据信在胰腺中的胰岛中的 β 细胞被纤丝状淀粉样蛋白 沉积物的聚集破坏， 该沉积物主要由称作胰岛淀粉样蛋白多肽 (IAPP) 的蛋白质组成。抑制 或减少此类 IAPP 淀粉样蛋白纤丝的形成、 沉积、 聚集和存留被认为产生了 2 型糖尿病的新 的有效治疗。在阿尔茨海默病、 帕金森病和 “系统形” 淀粉样蛋白病中， 目前没有治愈或有 效治疗， 患者通常在病发起 3 至 10 年内死亡。
淀粉样蛋白病根据存在的淀粉样蛋白质的类型以及潜在的疾病分类。淀粉样蛋 白病具有多种共有特征， 包括每种淀粉样蛋白由独特类型的淀粉样蛋白质组成。淀粉样蛋 白病包括但不限于 ： 与阿尔茨海默病、 唐氏综合征、 荷兰型遗传性脑出血伴淀粉样变、 拳击 手痴呆、 包涵体肌炎 (Askanas Ann.Neurol 43 ： 521-560， 1993) 和轻度认知功能损害相关 的淀粉样蛋白 ( 其中该特异性淀粉样蛋白称为 β- 淀粉样蛋白质或 Aβ)， 与慢性炎症、 各 种形式的恶性肿瘤和家族性地中海热相关的淀粉样蛋白 ( 其中该特异性淀粉样蛋白称为 AA 淀粉样蛋白或炎症相关的淀粉样变 )， 与多发性骨髓瘤和其它 B 细胞恶液质相关的淀粉 样蛋白 ( 其中该特异性淀粉样蛋白称为 AL 淀粉样蛋白 )， 与 2 型糖尿病相关的淀粉样蛋 白 ( 其中该特异性淀粉样蛋白质称为胰淀素或胰岛淀粉样蛋白多肽或 IAPP)， 与普利朊病 ( 包括克 - 雅病 (Creutzfeldt-Jakob disease)、 格 - 施综合征 (Gerstmann-Straussler syndrome)、 库鲁病和动物瘙痒病 ) 相关的淀粉样蛋白 ( 其中该特异性淀粉样蛋白称为 PrP 淀粉样蛋白 )， 与长期血液透析和腕管综合征相关的淀粉样蛋白 ( 其中该特异性淀粉样蛋 白称为 α2- 微球蛋白淀粉样蛋白 )， 与老年性心脏淀粉样变和家族性淀粉样多神经病相关 的淀粉样蛋白 ( 其中该特异性淀粉样蛋白称为转甲状腺素蛋白或前清蛋白 )， 以及与内分 泌肿瘤如甲状腺髓样癌相关的淀粉样蛋白 ( 其中该特异性淀粉样蛋白称为降钙素原的变 体 )。此外， 发现形成类淀粉样蛋白纤丝的 α- 突触核蛋白是帕金森病、 路易体疾病 (Lewy in Handbuch der Neurologie， M.Lewandowski， ed.， Springer， Berlin 第 920-933 页， 1912)、 多系统性萎缩 (Wakabayashi， Acta Neuropath.96 ： 445-452， 1998)、 路易体痴呆和阿 尔茨海默病的路易体变异的患者脑内路易体的一部分。对于这些公开内容而言， 由于纤丝 在患有帕金森病的患者脑内生长 ( 其含有占优势的 β- 折叠层二级结构 ) 这一事实， 因此 该疾病现在被认为是同样表现出类淀粉样蛋白病特征的疾病。
作为实例， 包括与慢性炎症、 各种形式的恶性肿瘤和家族性地中海热相关的淀粉 样蛋白 ( 即 AA 淀粉样蛋白或炎症相关淀粉样变 )(Benson and Cohen， Arth.Rheum.22 ： 36-42， 1979) 以及与多发性骨髓瘤和其它 B- 细胞恶液质相关的淀粉样蛋白 ( 即 AL 淀粉 样蛋白 )(Harada， J.Histochem.Cytochem.19 ： 1-15， 1971) 的系统淀粉样蛋白病已知涉及 在通常位于中枢神经系统之外的多种不同器官与组织中的淀粉样蛋白沉积。在这些疾病 中， 淀粉样蛋白沉积可以发生在例如肝脏、 心脏、 脾、 胃肠道、 肾、 皮肤和 / 或肺中 (Johnson， N.Engl.J.Med.321 ： 513-518， 1989)。对大多数此类淀粉样变疾病而言， 没有显著的治愈或 有效治疗， 并且淀粉样蛋白沉积的后果对患者可以是有害的。例如， 淀粉样蛋白在肾脏中 沉积可以导致肾衰竭， 而淀粉样蛋白在心脏中沉积可以导致心力衰竭。对这些患者来说， 淀粉样蛋白在系统器官中的聚集通常在 3-5 年内最终导致死亡。其它淀粉样蛋白病可侵 袭单个器官或组织， 如从阿尔茨海默病和唐氏综合征患者脑内发现的 Aβ 淀粉样蛋白沉积 物； 克 - 雅病、 格 - 施综合征和库鲁病患者脑内发现的 PrP 淀粉样蛋白沉积物 ； 在 90％的 2 型糖尿病患者胰腺中的胰岛中发现的胰岛淀粉样蛋白 (IAPP) 沉积物 (Johnson， N.Engl. J.Med.321 ： 513-518， 1989 ； Lab.Invest.66 ： 522 535， 1992) ； 在经受长期血液透析的患者 中观察到的导致腕管综合征的正中神经 (medial nerve) 中的 α2- 微球蛋白淀粉样蛋白 沉积物 (Geyjo， Biochem.Biophys.Res.Comm.129 ： 701-706， 1985) ； 老年性心脏淀粉蛋白病 患者的心脏中观察到的前清蛋白 / 转甲状腺素蛋白淀粉样蛋白 ； 以及家族性淀粉样多神经 病患者周围神经中现察到的前清蛋白 / 转甲状腺素蛋白淀粉样蛋白 (Skinner and Cohen，Biochem.Biophys.Res.Comm.99 ： 1326-1332， 1981) 所观察到的。
伴 侣 蛋 白 对 存 在 于 细 菌 表 面 上 称 为 纤 毛 或 菌 毛 的 粘 合 蛋 白 质 (adhesive protein) 细胞器的组装而言是必不可少的， 在这些细胞器不存在的情况下， 细菌变成非感 染性的 (Mulvey， Cellular Microbiology， 4： 257-271， 2002)。因此， 干扰纤毛 / 菌毛形成 的化合物 pilicide 代表一种新类型的直接针对细菌毒力的抗菌剂 (Lee， Current Opinion in Pharmacology， 3： 513-519， 2003)。本发明的化合物可以用作革兰氏阴性菌的纤毛和 / 或菌毛形成的抑制剂， 并可用于治疗、 防止和 / 或预防由革兰氏阴性菌引起的感染性疾 病。待治疗的疾病可以选自由革兰氏阴性菌引起的感染性疾病， 该革兰氏阴性菌选自大 肠埃希氏菌 (Escherichia coli)、 流感嗜血杆菌 (Heamophilus influenza)、 肠沙门氏菌 (Salmonella enteriditis)、 鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)、 百日咳博德特 氏菌 (Bordetellapertussis)、 鼠疫耶尔森氏菌 (Yersiniapestis)、 小肠结肠炎耶尔森氏 菌 (Yersinia enterocolitica)、 幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori) 和肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)。
丝氨酸蛋白酶 PAI-1(1 型纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂 ) 是纤维蛋白溶解系统的 主要抑制剂之一。 纤维蛋白溶解是一系列导致纤维蛋白被纤维蛋白溶酶降解的酶促反应的 结果。纤维蛋白溶酶原的激活是纤维蛋白溶解中的中心过程。由纤维蛋白溶酶原激活剂、 组织型纤维蛋白溶酶原激活剂 (t-PA) 或尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂 (u-PA) 实现纤维 蛋白溶酶原裂解以产生纤维蛋白溶酶。纤维蛋白溶解系统不仅负责从循环中除去纤维蛋 白， 而且还涉及几种其它生物学过程， 包括排卵、 胚胎发生、 内膜增生、 血管发生、 肿瘤发生、 动脉粥样硬化和阿尔茨海默病。
已发现由于产生增加或活性提高导致的提高的 PAI-1 水平与多种疾病和症状相 关， 所述疾病和症状包括与纤维蛋白溶解受损相关的那些。这些疾病和症状包括但不限于 血栓形成、 冠心病、 肾纤维化、 动脉粥样硬化斑块形成、 肺病、 心肌缺血、 心房纤颤、 凝血综合 征、 手术血栓栓塞性并发症、 外周动脉闭塞和肺纤维化。其它病症包括但不限于癌症、 多囊 卵巢综合征、 糖尿病和肥胖症。
例如， 提高的 PAI-1 水平已经涉及血栓性疾病， 例如特征在于分离并栓塞以阻 碍血液向下游流动的局部阻塞脉管血流的血栓形成的疾病 (Krishnamurti， Blood， 69， 798(1987) ； Reilly， Arteriosclerosis and Thrombosis， 11， 1276， (1991) ； Carmeliet， Journal of Clinical Investigation， 92， 2756(1993) ； Rocha， Fibrinolysis， 8， 294， 1994 ； Aznar， Haemostasis， 24， 243(1994))。PAI-1 抑制性抗体的 Fab 片段在给予了内毒 素的老鼠体内提高了被削弱的纤维蛋白溶解， 导致组织纤维蛋白沉积减少 (Abrahamsson， Thrombosis and Haemostasis， 75， 118(1996))。
提高的 PAI-1 水平还涉及诸如以下疾病 ： 多囊卵巢综合征 (Nordt， Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism， 85， 4， 1563(2000))、 缺乏雌激素导致的骨质流 失 (Daci， Journal of Bone and Mineral Research， 15， 8， 1510(2000))、 囊性纤维化、 特发 性肺纤维化、 糖尿病、 慢性牙周炎、 淋巴瘤、 与细胞外基质聚集相关的疾病、 恶性肿瘤、 与新 生血管生成相关的疾病、 炎性疾病、 与感染相关的血管损伤， 以及与提高的水平相关的疾病 ( 如乳癌和卵巢癌 )。
本发明的化合物本身或在前药的情况下在施用后是 PAI-1 的抑制剂。因此， 预期本发明的化合物可用于 PAI-1 相关病症中， 如用于哺乳动物 ( 包括人 ) 的血液与组织中的 血栓形成和血凝过快的治疗或预防。
已知的是， 血凝过快导致血栓栓塞疾病。可以提及的与血凝过快和血栓栓塞疾病 相关的病症包括蛋白 C 抵抗和遗传性或获得性抗凝血酶 III、 蛋白 C、 蛋白 S 和肝素辅因子 II 不足。其它已知与血凝过快和血栓栓塞疾病相关的病症包括循环性和败血性休克、 循环 的抗磷脂抗体、 高同型半胱氨酸血症、 肝素引起的血小板减少和纤维蛋白溶解缺陷。因此， 本发明的化合物可用于本申请中提及的症状的治疗性和 / 或预防性治疗。
可以根据本发明治疗的特定病状包括静脉血栓形成和肺栓塞、 动脉血栓形成 ( 例 如， 在心肌梗塞、 不稳定心绞痛、 缺血性卒中和外周动脉血栓形成中 ) 和通常在心房纤颤过 程中来自心房或在透壁性心肌梗塞后来自左心室的全身性栓塞。
其它适应症包括由细菌导致的弥漫性血管内凝血、 多发伤、 中毒或任何其它机制 的治疗性和 / 或预防性治疗， 当血液与体内的外来表面如人造血管、 血管支架、 血管导管、 机械和生物人工瓣膜或任何其它医疗装置接触时纤维蛋白溶解治疗， 和当血液与体外的医 疗装置接触时如在使用心肺机的心血管外科手术的过程中或在血液透析中的纤维蛋白溶 解治疗。
本发明的化合物还可以与任何具有不同作用机理的抗血栓药联用和 / 或共同施 用， 所述抗血栓药例如抗血小板剂乙酰水杨酸、 噻氯匹定、 氯吡格雷、 血栓素受体和 / 或合 成酶抑制剂、 纤维蛋白原受体拮抗剂、 前列环素模拟物、 磷酸二酯酶抑制剂、 ADP- 受体 (P2T) 拮抗剂、 羧肽酶 U 抑制剂和凝血酶抑制剂。
本发明的化合物还可以在血栓性疾病， 特别是心肌梗塞与卒中的治疗中与溶血 栓药联用和 / 或共同施用， 所述溶血栓药例如组织纤维蛋白溶酶原激活剂 ( 天然的、 重组 体或改性的 )、 链激酶、 尿激酶、 尿激酶原、 茴香酰纤维蛋白溶酶原 - 链激酶激活剂复合物 (APSAC)、 动物唾液腺纤维蛋白溶酶原激活剂等。
华盛顿大学名下的 WO 01/36426 公开了吡啶酮用于治疗或预防革兰氏阴性菌感 染。
Almqvist 等人， J.Org.Chem.2007， 72， 4917-4924 公开了与噻唑环稠合的 2- 吡啶 酮的不同官能化。
JP2005320346、 WO 2005030716 和 WO 200174793 都公开了 PAI-1 抑制剂。
发明描述
本发明的一个目的是式 (I)、 (II) 或 (III) 的化合物及其可药用盐、 前药和对映异 构体 ：
其中 W 选自 S、 SO、 SO2、 O、 P、 PO、 PO2、 CH2、 NR1、 NC(O)R1 和 NSO2R1 ；
R1 包括 (CH2)mD， 其中 m 是 0、 1、 2、 3、 4 或 5 的自然数， D 包括氢、 未取代或取代的烷 基、 未取代或取代的烯基、 未取代或取代的炔基、 未取代或取代的环烷基、 未取代或取代的 芳基、 未取代或取代的杂芳基 ；
R2 包括 (CH2)nA， 其中 n 是 0、 1、 2、 3、 4 或 5 的自然数， A 包括氢、 未取代或取代的烷 基、 未取代或取代的烯基、 未取代或取代的炔基、 未取代或取代的环烷基、 未取代或取代的 芳基、 未取代或取代的芳氧基、 未取代或取代的杂芳基 ；
R3 包括 (CH2)nA， 其中 n 是 0、 1、 2、 3、 4 或 5 的自然数， A 包括氢、 未取代或取代的烷 基、 未取代或取代的烯基、 未取代或取代的炔基、 未取代或取代的环烷基、 未取代或取代的 芳基、 未取代或取代的杂芳基 ；
R4 包括 CO2Y、 B(OY)2、 CHO、 CH2OY、 CH(CO2Y)2、 PO(OY)2， 其中 Y 包括氢、 未取代或取代 的烷基、 未取代或取代的烯基、 未取代或取代的炔基、 未取代或取代的环烷基、 未取代或取 代的芳基、 未取代或取代的杂芳基 ； 或 4
R 包括四唑基 ； 或 4
R 包括 CONHZ， 其中 Z 包括氢、 羟基、 烷基、 烷基磺酰基、 芳基磺酰基或氰基烷基 ； 5
R 包括氢、 未取代或取代的烷基、 未取代或取代的烷氧基、 未取代或取代的芳基、 未取代或取代的杂芳基。
对式 (I) 和 (II) 而言， 应该指出， 在键合到 R4 上的碳原子和键合到 R5 上的碳原子 之间的键可以是单键或双键。
在另一个实施方案中， 提供式 (I) 或 (III) 的化合物， 其中 W 选自 S、 SO、 SO2、 O、 6 6 CH2、 NC(O)R 和 NSO2R ；
R1 是 (CH2)mD， 其中 m 是 0， D 选自未取代或取代的环烷基、 未取代或取代的芳基和 未取代或取代的杂芳基 ；
R2 包括 (CH2)nA， 其中 n 是 0、 1、 2、 3、 4 或 5 的自然数， A 包括氢、 未取代或取代的烷 基、 未取代或取代的环烷基、 未取代或取代的芳基、 未取代或取代的芳氧基、 未取代或取代 的杂芳基 ；
R3 包括 (CH2)nA， 其中 n 是 0、 1、 2、 3、 4 或 5 的自然数， A 包括氢、 未取代或取代的烷 基；
R4 选自 ： CO2Y， 其中 Y 选自氢或烷基 ； 四唑基 ； 和 CONHZ， 其中 Z 选自氢、 羟基、 烷基、 烷基磺酰基、 芳基磺酰基和氰基烷基 ；
R5 选自氢、 未取代或取代的烷基、 未取代或取代的烷氧基、 未取代或取代的芳基、 未取代或取代的杂芳基 ；
R6 选自氢、 烷基和芳基。
在另一个实施方案中， 提供式 (I) 或 (III) 的化合物， 其中
W 选自 S 和 SO2 ；
R1 是 (CH2)mD， 其中 m 是 0， D 选自未取代或取代的环烷基、 未取代或取代的芳基和 未取代或取代的杂芳基 ；
R2 包括 (CH2)nA， 其中 n 是 0、 1、 2、 3、 4 或 5 的自然数， A 包括氢、 未取代或取代的烷 基、 未取代或取代的芳基、 未取代或取代的芳氧基、 未取代或取代的杂芳基 ； 3
R 包括 (CH2)nA， 其中 n 是 0、 1、 2、 3、 4 或 5 的自然数， A 包括氢、 未取代或取代的烷 基；
R4 选自 ： CO2Y， 其中 Y 选自氢或烷基 ； 四唑基 ； 和 CONHZ， 其中 Z 选自氢、 羟基、 烷基、 烷基磺酰基、 芳基磺酰基和氰基烷基 ； 5
R 选自氢、 烷基、 烷氧基、 未取代或取代的芳基、 未取代或取代的杂芳基。
在另一个实施方案中， 提供式 (I) 或 (III) 的化合物， 其中
W是S； R1 是 (CH2)mD， 其中 m 是 0， D 选自未取代或取代的环烷基、 未取代或取代的芳基 ； 4 R 选自 ： CO2Y， 其中 Y 选自氢 ； 四唑基 ； 和 CONHZ， 其中 Z 选自烷基磺酰基和芳基磺酰基 ； R5 选自氢、 甲基、 甲氧基和苯基。
在另一个实施方案中， 芳基是 C6-15 芳基， 芳氧基是 C6-15 芳氧基， 烯基是 C1-15 烯基， 炔基是 C1-15 炔基， 环烷基是 C3-6 烷基， 杂芳基是 C5-15 杂芳基。
在另一个实施方案中， 取代的芳基是被一个或多个卤素， 尤其是氟取代的芳基。
在另一个实施方案中， 取代的芳基是被一个或多个卤代烷基， 尤其是三氟甲基取 代的芳基。
在另一个实施方案中， 取代的芳基是被一个或多个氟取代的芳基。
在另一个实施方案中， 取代的芳基是被一个或多个甲氧基取代的芳基。
在另一个实施方案中， 以共价键合到 R4 上的碳为中心的立体化学构型是 (R)。
在另一个实施方案中， 以共价键合到 R4 上的碳为中心的立体化学构型是 (S)。
在实施例 21-25 和 27-42 中示出了具体化合物。
本发明的另一目的是制备上述化合物的方法， 包括使式 (I) 的化合物与 Raney 镍
反应以获得式 (III) 的化合物。
定义
本文所用的烷基是指具有 1 至 10 个碳原子的直链或支链烷基。实例包括甲基、 乙 基、 丙基、 异丙基、 丁基、 己基、 庚基、 辛基、 壬基、 癸基等。该烷基可以是未取代或取代的。
本文所用的烷氧基是指具有 1 至 10 个碳原子的直链或支链烷氧基。实例包括甲 氧基、 乙氧基、 丙氧基、 异丙氧基、 丁氧基、 己氧基、 庚氧基、 辛氧基、 壬氧基、 癸氧基等。该烷 氧基可以是未取代或取代的。
本文所用的烯基是指具有 2 至 10 个碳原子的直链或支链烯基。实例包括乙烯基、丙烯基、 异丙烯基、 丁烯基、 己烯基、 庚基、 庚烯基、 辛烯基、 壬烯基、 癸烯基等。 该烯基可以是 未取代或取代的。
本文所用的炔基是指具有 2 至 10 个碳原子的直链或支链炔基。实例包括乙炔基、 丙炔基、 丁炔基、 己炔基、 庚炔基、 辛炔基、 壬炔基、 癸炔基等。该炔基可以是未取代或取代 的。
本文所用的环烷基是指具有 3 至 10 个碳原子的直链或支链环烷基。实例包括环 丙基、 环丁基、 环戊基、 环己基、 环庚基、 环辛基、 环壬基、 环癸基等。该环烷基可以是未取代 或取代的。
本文所用的酰基是指具有 1 至 10 个碳原子的直链或支链酰基。实例包括甲酰基、 乙酰基、 丙酰基、 异丙酰基、 丁酰基、 己酰基、 庚酰基、 辛酰基、 壬酰基、 癸酰基等。 该酰基可以 是未取代或取代的。
本文中所述芳基部分， 单独或具有各种取代基， 含有 6 至 15 个碳原子， 并包括苯 基、 1- 萘基和 2- 萘基。取代基包括烷氧基、 卤素、 羟基、 烷基、 芳基、 烯基、 酰基、 酰氧基、 硝 基、 氨基、 酰胺基、 三氟甲基等。
本文所述芳氧基部分， 单独或具有各种取代基， 含有 6 至 15 个碳原子， 并包括苯氧 基、 1- 萘氧基和 2- 萘氧基。 取代基包括烷氧基、 卤素、 羟基、 烷基、 芳基、 烯基、 酰基、 酰氧基、 硝基、 氨基、 酰胺基、 三氟甲基等。 本文所述杂芳基部分， 单独或具有各种取代基， 含有 3 至 15 个碳原子， 并包括呋 喃、 噻吩、 吲哚、 呋喃基、 吡啶基、 噻吩基、 色氨酸等。 取代基包括烷氧基、 卤素、 羟基、 烷基、 芳 基、 烯基、 酰基、 酰氧基、 硝基、 氨基、 酰胺基、 三氟甲基等。
本文中所述取代的烷基、 烷氧基、 烯基、 炔基、 环烷基、 酰基、 芳基、 芳氧基和杂芳基 基团与部分的取代基可以是羟基、 卤素、 烷基、 烯基、 炔基、 芳基、 杂芳基和 / 或可以含有氮、 氧、 硫、 卤素， 包括例如低级烷氧基如甲氧基、 乙氧基、 丁氧基， 卤素如氯或氟、 硝基、 氨基、 酮 和三氟甲基。
在另一个实施方案中， 本文中所述取代的烷基、 烷氧基、 烯基、 炔基、 环烷基、 酰基、 芳基、 芳氧基和杂芳基基团与部分的取代基可以是羟基、 卤素、 烷基、 烯基、 炔基、 芳基、 杂芳 基和三氟甲基。
本文所用的术语 “卤素” 表示氟、 氯、 溴或碘基团。术语 “全卤代” 表示基团具有键 合到其上的最大可能数目的卤素原子。
本文所用的术语 “卤代烷基” 表示被一个或多个卤素取代的烷基。卤代烷基的实 例是氯甲基、 三氯甲基和三氟甲基。
如本文中所用， 当两个或更多个基团彼此联用时， 其是指每个基团被紧靠在前面 的基团取代。例如， 三氟甲基苯基是指被三氟甲基取代的苯基。
本文所用的术语 “防止” 和 “预防” 具有它们通常的含义， 因此是指通过早期检查 避免或缓解疾病或副作用的严重后果。
本文所用的术语 “哺乳动物” 是指人或如猴、 灵长类、 狗、 猫、 马、 牛等的动物。
本文所用的术语 “PAI-1 相关病症或疾病” 指的是与提高或增加的 PAI-1 表达或活 性、 或提高或增加的编码 PAI-1 基因表达或活性相关的任何疾病或症状。术语 “PAI-1 相关 病症或疾病” 还指其中对 PAI-1 的抑制是有益的任何疾病或症状。
本文所用的单个对映异构体、 外消旋混合物和两种对映异构体的不等量混合物在 本发明的范围内， 其中存在所述异构体。应理解的是， 所有可能的非对映体形式 ( 纯对映异 构体、 外消旋混合物和两种或更多种非对映异构体的不等量混合物 )、 互变异构体和阻转异 构体在本发明的范围内。
本文所用的术语 “可药用盐” 包括酸加成盐和碱加成盐。可以通过常规方法， 例如 通过使游离酸或游离碱形式的本发明化合物与一当量或几当量合适的酸或碱任选在溶剂 中或在盐不可溶的介质中反应， 接着采用标准技术 ( 例如在真空中或通过冷冻干燥 ) 去除 所述溶剂或所述介质， 由此形成所述盐。也可利用合适的离子交换树脂使盐形式的本发明 化合物的反离子与另一种反离子交换来制备盐。
本文所用的术语 “前药” 指的是在体内变得更具活性的化合物。本文中公开的某 些化合物也可以以前药形式存在， 如在 Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism ： Chemistry ， Biochemistry ， and Enzymology(Testa ， Bernard and Mayer ， Joachim M.Wiley-VH CA， Zurich， Switzerland 2003) 中所述的。本文中所述化合物的前药是经结 构修饰的形式的化合物， 其在生理状况下容易发生化学变化以提供该化合物。 此外， 前药可 以在体外环境下通过化学或生物化学方法转化为所述化合物。例如， 当放置在具有合适的 酶或化学试剂的透皮贴剂贮库 (reservoir) 中时， 前药可以缓慢地转化为化合物。由于在 某些情况下前药可以比化合物或母体药物更容易施用， 因此前药通常是有用的。例如它们 可以通过口服发挥生物有效性， 而母体药物不能。 与母体药物相比， 前药还可以在药物组合 物中具有提高的溶解度。多种前药衍生物在本领域是已知的， 如依赖前药的水解断开或氧 化活化的那些。前药的一个非限制性实例是以酯 (“前药” ) 形式施用， 但是随后代谢水解 为活性实体羧酸的化合物。另外的实例包括化合物的肽基衍生物。
合适的酸是无毒的， 包括例如但不限于盐酸、 氢溴酸、 氢碘酸、 硫酸、 硝酸、 乙酸、 柠 檬酸、 抗坏血酸、 乳酸、 苹果酸和酒石酸。合适的碱是无毒的， 包括例如但不限于氢氧化钠、 氢氧化钾、 氢氧化锂、 氨、 甲胺、 二甲胺、 三甲胺和三乙胺。
在本说明书的上下文中， 术语 “治疗” 也包括 “预防” ， 除非有相反的具体指示。本 发明上下文中的术语 “治疗” 还包括施用有效量的本发明化合物以减轻先前存在的急性或 慢性疾病状态， 或复发的病症。该定义还包括用于防止复发病症的预防性治疗和慢性病症 的持续治疗。
本发明的化合物可以通过任何途径以常规药物组合物的形式施用， 包括口服、 肌 内、 皮下、 局部、 鼻内、 腹膜内、 胸内、 静脉内、 硬膜外、 鞘内、 脑室内施用和通过注射到关节内 施用。
在本发明的一个实施方案中， 施用的途径可以是口服、 静脉内或肌内施用。
当确定最适于特定患者的个体治疗方案和剂量水平时， 剂量将取决于施用途径、 疾病的严重程度、 患者的年龄与体重和主治医师通常要考虑的其它因素。
为了由本发明的化合物制备药物组合物， 惰性可药用载体可以是固体或液体。固 体形式的制剂包括粉末剂、 片剂、 可分散颗粒、 胶囊、 扁囊剂和栓剂。
固体载体可以是一种或多种物质， 其也可以用作稀释剂、 调味剂、 增溶剂、 滑润剂、 助悬剂、 粘合剂或片剂崩解剂 ； 其还可以是包封材料。
在粉末剂中， 载体是微细固体， 其与微细的本发明的化合物或活性成分混合。 在片剂中， 活性成分与具有必要粘合性质的载体以合适比例混合并压成所需形状与尺寸。
为了制备栓剂组合物， 首先使低熔点的蜡 ( 如脂肪酸甘油酯与可可脂的混合物 ) 熔融， 并通过例如搅拌将活性成分分散在其中。随后将熔融的均匀混合物倾入合适尺寸的 模具中并使其冷却和凝固。
合适的载体是碳酸镁、 硬脂酸镁、 滑石、 乳糖、 糖、 果胶、 糊精、 淀粉、 甲基纤维素、 羧 甲基纤维素钠、 低熔点蜡、 可可脂等。
术语组合物还意在包括活性成分与包封材料的制剂， 该包封材料作为提供胶囊的 载体， 其中活性成分 ( 含有或不含其它载体 ) 被由此与之相关的载体包围。类似地， 包括扁 囊剂。
片剂、 粉末剂、 扁囊剂和胶囊可用作适于口服的固体剂型。
液体形式的组合物包括溶液、 混悬液和乳液。 例如， 活性化合物的无菌水或丙二醇 溶液可以是适于胃肠外施用的液体制剂。 液体组合物还可以配制成聚乙二醇水溶液形式的 溶液。
可以通过将活性成分溶解在水中并根据需要加入合适的着色剂、 调味剂、 稳定剂 和增稠剂来制备用于口服的水溶液。可以通过将微细的活性成分与粘性材料如天然合成 胶、 树脂、 甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠和药物配制领域已知的其它助悬剂一起分散在水中 以制备用于口服使用的水溶液。
根据施用方式， 药物组合物根据本发明的一个实施方案包含 0.05 重量％至 99 重 量％ ( 重量百分比 )、 根据一个替代实施方案包含 0.10 至 50 重量％的本发明化合物， 所有 重量百分数基于全部组合物。
本领域普通技术人员可利用已知标准 ( 包括个体患者的年龄、 体重和响应 ) 来确 定和在所治疗或预防的疾病的情况下解释用于实施本发明的治疗有效量。
上述包含本发明化合物的药物组合物的主题类似地适用于包含本发明组合的药 物组合物。
本发明的另一目的是如上公开的化合物， 其用于药物中。
本发明的另一目的是包含如上公开的化合物与可药用辅助剂 (adjuvant)、 稀释剂 和 / 或载体的药物制剂。
根据本发明的另一方面， 提供如上公开的化合物， 用于治疗、 防止和 / 或预防淀粉 样蛋白病。适于用本发明的化合物治疗的淀粉样蛋白病是与淀粉样蛋白纤丝， 尤其是选自 Aβ 淀粉样蛋白、 AA 淀粉样蛋白、 AL 淀粉样蛋白、 IAPP 淀粉样蛋白、 PrP 淀粉样蛋白、 α2- 微 球蛋白淀粉样蛋白、 转甲状腺素蛋白、 前清蛋白和降钙素原， 特别是选自 Aβ 淀粉样蛋白和 IAPP 淀粉样蛋白的淀粉样蛋白的纤丝的形成、 沉积、 聚集或存留相关的疾病。合适的此类 疾病包括阿尔茨海默病、 唐氏综合征、 拳击手痴呆、 多系统性萎缩、 包涵体肌炎、 荷兰型遗传 性脑出血伴淀粉样变、 C 型尼 - 皮病 (Nieman-Pick disease)、 脑 β- 淀粉样血管病、 与皮质 基底变性相关的痴呆、 2 型糖尿病的淀粉样变、 慢性炎症的淀粉样变、 恶性和家族性地中海 热的淀粉样变、 多发性骨髓瘤和 B 细胞恶液质的淀粉样变、 普利朊病的淀粉样变、 克 - 雅病、 格 - 施综合征、 库鲁病、 瘙痒病、 与腕管综合征相关的淀粉样变、 老年性心脏淀粉样变、 家族 性淀粉样多神经病和与内分泌肿瘤相关的淀粉样变， 尤其是阿尔茨海默病和 2 型糖尿病。
所述化合物还具有以下作用 ： 抑制或防止 α- 突触核蛋白 /NAC 纤丝形成， 抑制或防止 α- 突触核蛋白 /NAC 纤丝生长， 和 / 或导致预先形成的 α- 突触核蛋白 /NAC 纤丝和 α- 突触核蛋白 /NAC- 相关的蛋白质沉积物的分解、 破裂和 / 或解聚。
根据本发明的另一方面， 提供如上公开的化合物， 用于治疗、 防止和 / 或预防适于 用本发明的化合物治疗的 “突触核蛋白疾病” 或 “突触核蛋白病” ， 其是与突触核蛋白纤丝， 尤其是 α- 突触核蛋白纤丝的形成、 沉积、 聚集或存留相关的疾病。合适的此类疾病包括帕 金森病、 家族性帕金森病、 路易体病、 阿尔茨海默病路易体变体、 路易体痴呆、 多系统性萎缩 和关岛帕金森 - 痴呆复合征 (Parkinsonism-dementia complex of Guam)。
本发明的化合物还可通过抑制革兰氏阴性菌中的菌毛形成而用作抗菌剂。
根据本发明的另一方面， 提供如上公开的化合物， 用于治疗、 防止和 / 或预防由革 兰氏阴性菌引起的感染性疾病。待治疗的疾病可以选自由革兰氏阴性菌引起的感染性疾 病， 该革兰氏阴性菌选自大肠埃希氏菌、 流感嗜血杆菌、 肠沙门氏菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 百日 咳博德特氏菌、 鼠疫耶尔森氏菌、 小肠结肠炎耶尔森氏菌、 幽门螺杆菌和肺炎克雷伯氏菌。
根据本发明的另一方面， 提供如上公开的化合物用于治疗其中对 PAI-1 的抑制可 以是有益的病症， 该病症选自血栓形成、 冠心病、 肾脏纤维化、 动脉粥样硬化斑块形成、 肺部 疾病、 心肌缺血、 心房纤颤、 凝血综合征、 手术血栓栓塞性并发症、 外周动脉闭塞、 肺纤维化、 癌症、 多囊卵巢综合征、 糖尿病、 肥胖症和阿尔茨海默病。 本发明的另一目的是上述化合物在制备用于治疗其中对 PAI-1 的抑制可以是有 益的病症的药物中的用途， 该病症选自血栓形成、 冠心病、 肾脏纤维化、 动脉粥样硬化斑块 形成、 肺部疾病、 心肌缺血、 心房纤颤、 凝血综合征、 手术血栓栓塞性并发症、 外周动脉闭塞、 肺纤维化、 癌症、 多囊卵巢综合征、 糖尿病、 肥胖症和阿尔茨海默病。
在另一个实施方案中， 所述化合物与另一种抗血栓药联用和 / 或共同施用。
本发明的另一目的是通过向哺乳动物施用上述化合物来治疗其中对 PAI-1 的抑 制可以是有益的病症的方法， 该病症选自血栓形成、 冠心病、 肾脏纤维化、 动脉粥样硬化斑 块形成、 肺部疾病、 心肌缺血、 心房纤颤、 凝血综合征、 手术血栓栓塞性并发症、 外周动脉闭 塞、 肺纤维化、 癌症、 多囊卵巢综合征、 糖尿病、 肥胖症和阿尔茨海默病。
在另一个实施方案中， 所述化合物与另一种抗血栓药联用和 / 或共同施用。
在下文中， 通过下列非限制性实施例阐述本发明。
当使用时， 表述 “包含” 表示 “包括” 但不限于。因此， 可以存在其它成分、 载体和 添加剂。
附图说明 图 1. 淀粉样蛋白聚集试验
通过检测加入的硫黄素 T(ThT) 的荧光来测量受试物质对 Aβ1-40 聚集的作用。 将 在指示物质存在下聚集的 Aβ1-40 的 ThT- 荧光与在 5％的 DMSO 存在下聚集的 Aβ1-40 的 ThT- 荧光比较。
实施例
缩略语 DEAD ＝偶氮二甲酸二乙酯rt 或 RT- 室温 TFA ＝三氟乙酸 THF ＝四氢呋喃 t- 三重峰 s- 单峰 d- 双峰 q- 四重峰 quint- 五重峰 m- 多重峰 br- 宽峰 bs- 宽单峰 dm- 多重双峰 bt- 宽三重峰 dd- 双重双峰 一般合成 ：除非另行说明， 否则所有反应均在惰性气氛下使用干燥溶剂在无水条件下进行。 Zn( 粉 ) 通过在 10％的 HCl 中搅拌 2 分钟来活化。随后将其过滤， 用水和丙酮洗涤并在真 空下干燥。采用 UV 光检测在硅胶 60F254(Merck) 上进行 TLC。快速柱色谱使用正相硅胶 (Matrex， 60 35-70 微米， Grace Amicon)。用 Perkin-Elmer 343 旋光计在 20℃和 589 纳米下测量旋光度。在含有残余 CHCl3(δH 7.26ppm) 或 CDCl3(δc 77.16ppm) 作为内标的 CDCl3 中， 或在含有残余 CD2HOD(δH 3.31ppm) 或 CD3OD(δc49.0ppm) 作为内标的 MeOH-d4 中， 在 298K 下用 Bruker DRX-400 光谱仪记录 1H 和 13C NMR 谱图。
以类似于先前在 J Org.Chem.2001， 66(20)， 6756-6761 中公开的方法制备通式结 构 IV 的吡啶酮。
在下表中示出了实施例 1-5 和 30-31 的结构式——均源自式 IV。 实施例 R1 R216102066385 A CN 102066395说1 2 3 4 5 30 31明书异丁基 正丙基 正戊基 氢 正己基 氢 异丁基12/27 页3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 苯基 苯基硝化的一般步骤 (V)
向烧瓶中装入通式结构 IV 的吡啶酮和 NaNO2(1.05 当量 )。加入 CH2Cl2(30 毫升 / 毫摩尔 IV)。通过橡胶隔膜与填充有 O2( 气体 ) 的气球连接， 并在搅拌的同时逐滴加入
TFA(1.15 毫升 / 毫摩尔 IV)。将混合物在室温下搅拌过夜， 随后加入 NaHCO3( 饱和水溶液 ) 中和。分离有机相， 水相用 CH2Cl2 萃取。合并的有机相用 NaSO4( 固体 ) 干燥， 过滤， 随后在 减压下浓缩。 使用庚烷∶乙酸乙酯 (4 ∶ 1 → 1 ∶ 2) 作为洗脱剂利用硅胶色谱纯化粗产物， 得到 V。
在下表中示出了实施例 6-10 的结构式——均源自式 V。 实施例 6 7 R1 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基17R2 异丁基 正丙基102066385 A CN 102066395说8 9 10明书正戊基 氢 正己基13/27 页3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基还原的一般步骤 (VI) ：
将通式结构 V 的硝基产物溶解在乙酸 (7 毫升 / 毫摩尔 V) 中。分批加入 Zn( 粉 末 )(5 当量 )， 随后在室温下将混合物搅拌 4 小时。混合物通过 Celite 层过滤， 随后在减
并用 NaHCO3( 饱和水溶液 ) 洗涤。水层用 CH2Cl2 萃 压下浓缩。将残余物溶解在 CH2Cl2 中， 取， 合并的有机相随后用 NaSO4( 固体 ) 干燥， 过滤并在减压下浓缩。使用庚烷∶乙酸乙酯 (1 ∶ 2 → 1 ∶ 4) 作为洗脱剂利用硅胶色谱纯化粗产物， 得到 VI。
在下表中示出了实施例 11-15 和 32-33 的结构式——均源自式 VI。 实施例 11 12 13 14 15 32 R1 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 苯基 R2 异丁基 正丙基 正戊基 氢 正己基 氢18102066385 A CN 102066395说33 苯基明书异丁基14/27 页吡唑形成的一般步骤 (VII) ：
将通式结构 VI 的胺溶解在乙酸 (110 毫升 / 毫摩尔 VI) 中。在室温下搅拌的同时 用 20 分钟逐滴加入 0.2M 的 NaNO2( 水溶液 )(5.0 毫升 / 毫摩尔 VI)。再将混合物搅拌一小 时， 然后加入水 (200 毫升 / 毫摩尔 VI)， 随后冻干。残余物用 CH2Cl2 吸收中并用 NaHCO3( 饱 和水溶液 ) 洗涤。水相用 CH2Cl2 萃取， 合并的有机相用 NaSO4( 固体 ) 干燥， 过滤并在减压 下浓缩。使用庚烷∶乙酸乙酯∶甲醇 (100 ∶ 100 ∶ 1 → 50 ∶ 50 ∶ 1) 作为洗脱剂利用硅 胶色谱纯化粗产物。将产物溶解在甲醇中并加入 Amberlite IR-120(H+)( 大约 4 毫升 / 毫
摩尔 VI)。将混合物搅拌 5 分钟， 随后将树脂滤除并用甲醇洗涤。滤液在减压下浓缩， 获得 VII。
在下表中示出了实施例 16-20、 26 和 34-36 的结构式——均源自式 VII。 实施例 16 17 18 19 20 26 34 R1 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 苯基19R2 异丁基 正丙基 正戊基 氢 正己基 异丁基 氢R3 氢 氢 氢 氢 氢 乙基 氢102066385 A CN 102066395说苯基 苯基明书异丁基 溴 氢 氢15/27 页35 36
水解的一般步骤 (VIII) ：
将通式结构 VII 的吡唑溶解在 THF ∶甲醇 3 ∶ 7(20 毫升 / 毫摩尔 VII) 中。在 0℃下逐滴加入 0.1M 的 LiOH( 水溶液 )(1.0 毫升 / 毫摩尔 )。移去冰浴， 将混合物在室温 下搅拌过夜。如果必要的话， 再加入 0.1M 的 LiOH( 水溶液 )， 将混合物再搅拌 6 小时， 然后 + 在减压下浓缩。将残余物溶解在甲醇中并加入 Amberlite IR-120(H )( 大约 7 毫升 / 毫摩 尔 VII)。将混合物搅拌 5 分钟， 然后将树脂滤除并用甲醇洗涤。滤液在减压下浓缩， 获得 VIII。
在下表中示出了实施例 21-25、 27-28 和 37 的结构式——均源自式 VIII。 实施例 21 22 23 24 25 27 28 R1 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3- 三氟甲基苯基 3， 4- 二氟苯基20R2 异丁基 正丙基 正戊基 氢 正己基 异丁基 正己基R3 氢 氢 氢 氢 氢 乙基 氢102066385 A CN 102066395说苯基明书异丁基 氢16/27 页37
实施例 29 是实施例 28 的对应的苯基磺酰胺。
化合物 E 的 Suzuki 偶联以制备 IX 的一般步骤
将 3.6 毫升甲醇加入到 73 毫克 (0.18 毫摩尔 ) 化合物 E、 4.0 毫克 (0.018 毫摩 尔 )Pd(OAc)2、 11 毫克 (0.018 毫摩尔 )rαc-BINAP、 20 毫克 (0.34 毫摩尔 )KF 和 0.36 毫摩 尔 (2.0 当量 ) 待偶联的硼酸中。将混合物在密封管中用微波在 50℃下加热 3 分钟， 随后在 140℃下加热 20 分钟 ( 将化合物 10e 在 140℃下再加热 40 分钟 )。所得混合物在减压下浓 缩。将残余物吸收在少量吡啶中， 随后用甲苯∶ MeCN ∶吡啶 95 ∶ 5 ∶ 2 → 90 ∶ 10 ∶ 2 作为洗脱剂使之通过硅胶柱。 在减压下浓缩后， 将残余物溶解在 3.6 毫升甲醇∶吡啶 3 ∶ 1 中并加入 1.8 毫升 0.1M 的 LiOH( 水溶液 )。该溶液在室温下搅拌过夜。再加入 0.9 毫 升 0.1M 的 LiOH( 水溶液 )， 将反应再搅拌 6-7 小时， 然后在减压下浓缩。将粗产物溶解在 HCO2H ∶ DMSO 1 ∶ 1 中并用采用 C8 柱的制备性 HPLC 纯化。甲醇∶水 ( 含有加入的 1％的 甲酸 ) 用作流动相。 纯化后， 在减压下除去甲醇， 残余物从 5％乙酸水溶液中冻干， 获得粉末 状的 IX。
在下表中示出了实施例 38-42 的结构式——均源自式 IX。 实施例 38 39 40 41 42 R1 苯基 苯基 苯基 苯基 苯基 R2 苯基 4- 甲氧基苯基苯基 3- 硝基苯基 3- 呋喃基 2- 甲苯基实施例 1-5
如上所述， 类似于先前在 J Org.Chem.2001， 66(20)， 6756-6761 中公开的方法制备 这些实施例。
实施例 6
按 照 硝 化 的 一 般 步 骤， 将 751 毫 克 (1.77 毫 摩 尔 ) 实 施 例 1 转 化 为 536 毫 克 1 (64 ％ ) 实 施 例 6。[α]D-206(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)7.72-7.67(m， 1H)， 7.64-7.45(m， 3H)， 5.79-5.73(m， 1H)， 3.83(s( 分 裂 )， 3H)， 3.82-3.75(dd， J ＝ 11.9， 8.8Hz， 1H)， 3.54-3.48(m， 1H)， 2.36-2.15(m， 2H)， 1.31-1.09(m， 3H)， 0.59-0.51(m， 6H) ； 13 C NMR(100MHz， CDCl3)167.6( 分 裂 )， 153.5( 分 裂 )， 151.7( 分 裂 )， 148.7( 分 裂 )， 138.4( 分裂 )， 135.7( 分裂 )， 134.0( 分裂 )， 131.6(q( 分裂 )， J ＝ 32.4Hz)， 129.9( 分裂 )， 127.5-127.1(m)， 125.9(m)， 123.8(q， J ＝ 272.5Hz)， 112.7， 64.4( 分 裂 )， 53.7( 分 裂 )， 38.0( 分裂 )， 32.1( 分裂 )， 28.1， 27.7， 21.3， 21.5( 分裂 )。
实施例 7
按照硝化的一般步骤， 将 731 毫克 (1.78 毫摩尔 ) 实施例 2 转化为 586 毫克 (72％ ) 1 实施例 7。 [α]D-215(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)7.70(d， 1H)， 7.64-7.45(m， 3H)， 5.78-5.73(m， 1H)， 3.83(s( 分裂 )， 3H)， 3.78(dd， J ＝ 11.9， 8.8Hz， 1H)， 3.55-3.48(m， 1H)， 2.36-2.18(m， 2H)， 1.39-1.18(m， 2H)， 1.12-0.99(m， 2H)， 0.59(t( 分 裂 )， J ＝ 7.4Hz， 3H) ； C NMR(100MHz， CDCl3)167.7( 分 裂 )， 153.6， 151.8， 148.6， 138.5， 135.9( 分 裂 )， 134.1， 133.9， 131.7(q( 分裂 )， J ＝ 32.6Hz)， 130.0( 分裂 )， 127.6-127.1(m)， 126.1(m)， 123.8(q， J ＝ 272.4Hz)， 112.8， 64.5( 分裂 )， 53.8( 分裂 )， 32.2( 分裂 )， 31.2( 分裂 )， 29.4， 22.7， 13.2( 分裂 )。
实施例 8
按 照 硝 化 的 一 般 步 骤， 将 776 毫 克 (1.77 毫 摩 尔 ) 实 施 例 3 转 化 为 557 毫 克 1 (65 ％ ) 实 施 例 8。[α]D-203(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)7.72-7.68(m， 1H)， 7.64-7.45(m， 3H)， 5.78-5.74(m， 1H)， 3.83(s( 分裂 )， 3H)， 3.78(dd， J ＝ 8.8， 11.9Hz， 1H)， 3.54-3.48(m， 1H)， 2.36-2.16(m， 2H)， 1.39-1.20(m， 2H)， 1.10-0.98(m， 4H)， 0.98-0.88(m， 13 2H)， 0.72(t， J ＝ 7.1Hz， 3H) ；C NMR(100MHz， CDCl3)167.6( 分裂 )， 153.6， 151.8( 分裂 )， 148.5， 138.4( 分裂 )， 135.8( 分裂 )， 133.9(d， J ＝ 25.0Hz)， 131.6(dq， J ＝ 32.5， 8.5Hz)， 129.9( 分 裂 )， 127.3(dq， J ＝ 26.1， 3.5Hz)， 126.0( 宽， 分 裂 )， 123.7(q， J ＝ 272.5Hz)， 29.1， 29.0， 22.1， 13.8。 112.7， 64.4( 分裂 )， 53.7( 分裂 )， 32.1( 宽 )， 30.7， 29.6( 宽 )，
实施例 9
按 照 硝 化 的 一 般 步 骤， 将 2062 毫 克 (5.58 毫 摩 尔 ) 实 施 例 4 转 化 为 1320 毫 1 克 (57 ％ ) 实 施 例 9。[α]D-223(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)7.72-7.65(m， 1H)， 7.65-7.42(m， 3H)， 5.75(dd， J ＝ 8.8， 2.0Hz， 1H)， 3.82(s， 3H)， 3.80-3.74(m， 1H)， 13 3.56-3.49(m， 1H)， 1.98(s， 3H) ；C NMR(100MHz， CDCl3)167.5， 153.3， 151.6， 144.7， 138.7， 135.9( 分 裂 )， 133.7( 分 裂 )， 131.7(q， J ＝ 32.6Hz)， 130.0， 127.0(m)， 126.0( 分 裂 )， 123.8(q， J ＝ 272.7Hz)， 113.1， 64.4( 分裂 )， 53.7( 分裂 )， 32.1， 16.7。
实施例 10
按 照 硝 化 的 一 般 步 骤， 将 1178 毫 克 (2,60 毫 摩 尔 ) 实 施 例 5 转 化 为 796 毫13克 (61 ％ ) 实 施 例 10。1H NMR(400MHz， CDCl3)7.67-7.61(m， 1H)， 7.60-7.40(m， 3H)， 5.76-5.71(m， 1H)， 3.81-3.71(m， 1H)， 3.75(s， 3H)， 3.45(d， J ＝ 11.7Hz， 1H)， 2.29-2.10(m， 13 2H)， 1.34-1.13(m， 2H)， 1.11-1.00(m， 2H)， 1.00-0.83(m， 6H)， 0.69(t， J ＝ 7.1Hz， 3H) ； C NMR(100MHz， CDCl3)167.5( 分裂 )， 153.3( 分裂 )， 152.1( 宽 )， 148.2， 138.0， 135.7( 分裂 )， 133.8(d， J ＝ 14.5Hz)， 131.2(q( 分裂 )， J ＝ 32.6Hz)， 129.7( 分裂 )， 127.0(m)， 125.6(m)， 123.5(q， J ＝ 272.7Hz)， 112.4， 64.3( 分裂 )， 53.3( 分裂 )， 31.9( 分裂 )， 31.0， 29.3， 29.1， 28.8， 27.9， 22.2， 13.6。
实施例 11
按 照 还 原 的 一 般 步 骤， 将 408 毫 克 (0.867 毫 摩 尔 ) 实 施 例 6 转 化 为 323 毫 1 克 (86 ％ ) 实 施 例 11。[α]D-105(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)7.58(d， J＝ 7.8Hz ， 1H) ， 7.53-7.45(m ， 2H) ， 7.43-7.38(m ， 1H) ， 5.61(d ， J ＝ 7.9Hz ， 1H) ， 4.05(bs ， 2H)， 3.77(s， 3H)， 3.64-3.56(m， 1H)， 3.42-3.36(m， 1H)， 2.17-2.05(m， 2H)， 1.37-1.25(m， 13 1H)， 1.25-1.12(m， 2H)， 0.64(d， J ＝ 6.3Hz， 6H) ；C NMR(100MHz， CDCl3)168.5， 156.7， 138.3， 133.8， 133.4， 131.2(d， J ＝ 12.3Hz)， 130.9(q( 分裂 )， J ＝ 32.5)， 129.1( 分裂 )， 128.3( 宽 )， 124.7(m)， 123.8(q( 分裂 )， J ＝ 272.3)， 115.4( 分裂 )， 63.8( 分裂 )， 53.2( 分 裂 )， 36.0， 31.9( 分裂 )， 28.2， 26.3( 分裂 )， 21.9(2C)。
实施例 12
按照还原的一般步骤， 将 429 毫克 (0.940 毫摩尔 ) 实施例 7 转化为 359 毫克 1 (90％ ) 实施例 12。[α]D-112(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)7.57(d， J ＝ 7.8Hz， 1H)， 7.51-7.43(m， 2H)， 7.42-7.36(m， 1H)， 5.60(dd， J ＝ 8.3， 2.0Hz， 1H)， 4.00(bs， 2H)， 3.75(s， 3H)， 3.63-3.54(m， 1H)， 3.41-3.34(m， 1H)， 2.13(t， J ＝ 8.2Hz， 2H)， 1.37-1.20(m， 13 2H)， 1.16-1.04(m， 2H)， 0.65(t， J ＝ 7.3Hz， 3H) ；C NMR(100MHz， CDCl3)167.3， 155.5， 137.2( 分裂 )， 132.5， 132.2， 130.2， 129.9， 129.6(q( 分裂 )， J ＝ 32.5Hz)， 127.9( 分裂 )， 126.0-125.4(m)， 123.4(m)， 122.7(q( 分裂 )， J ＝ 272.4Hz)， 114.2， 62.6， 52.0， 30.7， 28.0， 26.8， 21.4。
实施例 13
按照还原的一般步骤， 将 405 毫克 (0.836 毫摩尔 ) 实施例 8 转化为 351 毫克 1 (92 ％ ) 实施例 13。[α]D-107(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)7.56-7.51(m， 1H)， 7.48-7.40(m， 2H)， 7.39-7.32(m， 1H)， 5.57(d， J ＝ 7.7Hz， 1H)， 4.04(bs， 2H)， 3.71(s， 3H)， 3.59-3.51(m， 1H)， 3.36-3.30(m， 1H)， 2.14-2.05(m， 2H)， 1.35-1.19(m， 2H)， 1.11-0.92(m， 13 6H)， 0.72-0.64(t， J ＝ 7.0Hz， 3H) ；C NMR(100MHz， CDCl3)168.4， 156.5， 138.3( 分 裂 )， 133.5(d， J ＝ 33.8Hz)， 131.3， 130.8， 130.7(dq， J ＝ 31.9， 8.8Hz)， 128.9( 分裂 )， 127.8， 126.9( 宽， 分裂 )， 124.4( 宽， 分裂 )， 123.8(dq， J ＝ 272.2， 3.2Hz)， 115.2， 63.7( 分裂 )， 52.9( 分裂 )， 31.7( 宽 )， 30.9， 29.0， 28.1， 26.8， 22.1， 13.6。
实施例 14
按照还原的一般步骤， 将 1165 毫克 (2.81 毫摩尔 ) 实施例 9 转化为 891 毫克 1 (82％ ) 实施例 14。[α]D-125(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)7.61(d， J ＝ 7.8Hz， 1H)， 7.56-7.49(m， 2H)， 7.42(d， J ＝ 7.4Hz， 1H)， 5.67(dd， J ＝ 8.2， 2.2Hz， 1H)， 3.98(bs， 2H)， 3.82(s， 3H)， 3.63(dd， J ＝ 11.6， 2.2Hz， 1H)， 3.45(dd， J ＝ 11.6， 8.2Hz， 1H)， 1.84(s，13 3H) ； C NMR(100MHz， CDCl3)167.7( 分 裂 )， 153.6， 151.8， 148.6， 138.5， 135.9( 分 裂 )， 134.1， 133.9， 131.7(q( 分 裂 )， J ＝ 32.6Hz)， 130.0( 分 裂 )， 127.6-127.1(m)， 126.1(m)， 123.8(q， J ＝ 272.4Hz)， 112.8， 64.5( 分 裂 )， 53.8( 分 裂 )， 32.2( 分 裂 )， 31.2( 分 裂 )， 29.4， 22.7， 13.2( 分裂 )。
实施例 15
按照还原的一般步骤， 将 758 毫克 (1.52 毫摩尔 ) 实施例 10 转化为 634 毫克 1 (89 ％ ) 实 施 例 15。 H NMR(400MHz， CDCl3)7.54-7.49(m， 1H)， 7.47-7.30(m， 3H)， 5.55(d， J ＝ 7.8Hz， 1H)， 4.05(bs， 2H)， 3.68(s， 3H)， 3.58-3.49(m， 1H)， 3.31(d， J ＝ 11.6Hz， 1H)， 13 2.13-2.03(m ， 2H) ， 1.33-1.17(m ， 2H) ， 1.12-0.93(m ， 8H) ， 0.69(t ， J ＝ 7.0Hz ， 3H) ； C NMR(100MHz， CDCl3)168.3， 156.4， 138.2( 分 裂 )， 133.4(d， J ＝ 32.2Hz)， 131.3， 130.7， 130.6(q( 分裂 )， J ＝ 32.3Hz)， 128.9( 分裂 )， 127.6， 126.7(m)， 124.3， 123.6(q( 分裂 )， J ＝ 272.6Hz)， 115.12， 63.6( 分裂 )， 52.8( 分裂 )， 31.6， 31.2， 29.2， 28.3， 28.1， 26， 22.2， 13.6。
实施例 16
按照吡唑形成的一般步骤， 将 200 毫克 (0.454 毫摩尔 ) 实施例 11 转化为 180 1 毫 克 (88 ％ ) 实 施 例 16。[α]D-145(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)12.87(bs， 1H)， 7.71-7.62(m， 2H)， 7.62-7.53(m， 2H)， 5.86(d， J ＝ 7.8Hz， 1H)， 3.81(s， 3H)， 3.73(dd， J ＝ 11.7， 7.8Hz， 1H)， 3.56(d， J ＝ 11.7Hz， 1H)， 2.28-2.16(m， 2H)， 1.37-1.23(m， 1H)， 13 0.63-0.47(m， 6H) ；C NMR(100MHz， CDCl3)168.5， 153.5， 145.0， 136.9， 135.3， 133.5( 分 裂 )， 132.0( 宽 )， 131.0(q( 分裂 )， J ＝ 32.5Hz)， 129.2( 分裂 )， 127.3-126.8(m)， 125.0(m)， 123.9(m)， 124.0(q， J ＝ 272.1Hz)， 108.6( 分 裂 )， 62.5， 53.4， 36.2， 32.6， 29.0( 分 裂 )， 22.1( 分裂 )， 21.9( 分裂 )。
实施例 17
按照吡唑形成的一般步骤， 将 249 毫克 (0.584 毫摩尔 ) 实施例 12 转化为 218 1 毫 克 (85 ％ ) 实 施 例 17。[α]D-163(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)13.04(bs， 1H)， 7.69-7.63(m， 2H)， 7.61-7.53(m， 2H)， 5.85(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 3.80(s， 3H)， 3.72(dd， J ＝ 11.6， 7.6Hz， 1H)， 3.55(d， br， J ＝ 11.6Hz， 1H)， 2.36-2.19(m， 2H)， 1.33-1.17(m， 13 2H)， 0.58(t， J ＝ 7.3Hz， 3H) ；CNMR(100MHz， CDCl3)168.5， 153.5， 145.6， 136.9， 135.3， 133.3( 分裂 )， 132.0( 宽 )， 131.0(q( 分裂 )， 32.3Hz)， 129.2( 分裂 )， 126.8(m)， 125.0(m)， 124.0(q， J ＝ 272.6Hz)， 123.7(m)， 108.5( 分裂 )， 62.5( 分裂 )， 53.4， 32.6， 29.3( 分裂 )， 22.9， 13.6。
实施例 18
按照吡唑形成的一般步骤， 将 209 毫克 (0.460 毫摩尔 ) 实施例 13 转化为 159 1 毫 克 (74 ％ ) 实 施 例 18。[α]D-154(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)12.27(bs， 1H)， 7.71-7.64(m， 2H)， 7.62-7.54(m， 2H)， 5.86(d， J ＝ 7.7Hz， 1H)， 3.82(s， 3H)， 3.73(dd， J ＝ 11.6， 7.7Hz， 1H)， 3.56(d， J ＝ 11.6Hz， 1H)， 2.41-2.22(m， 2H)， 1.30-1.12(m， 2H)， 13 1.09-0.97(m， 2H)， 0.97-0.85(m， 2H)， 0.75-0.66(t， J ＝ 7.2Hz， 3H) ；C NMR(100MHz， CDCl3)168.5， 153.5， 146.1， 137.0( 分裂 )， 135.3， 133.3( 分裂 )， 131.9( 宽 )， 131.1(q( 分 裂 )， J ＝ 32.5Hz)， 129.2( 分 裂 )， 126.8(m)， 125.1(m)， 124.0(q， J ＝ 272.5Hz)， 123.7，108.6( 分裂 )， 62.5( 分裂 )， 53.5( 分裂 )， 32.7， 31.5， 29.4( 分裂 )， 27.6， 22.2， 13.8。
实施例 19
按照吡唑形成的一般步骤， 将 297 毫克 (0.773 毫摩尔 ) 实施例 14 转化为 83 1 毫 克 (27 ％ ) 实 施 例 19。[α]D-237(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)13.27(bs， 1H)， 7.83-7.75(m， 2H)， 7.71(d， J ＝ 7.3Hz， 1H)， 7.67-7.56(m， 2H)， 5.90(d， J ＝ 7.6Hz， 13 1H)， 3.83(s， 3H)， 3.78(dd， J ＝ 11.7， 7.6Hz， 1H)， 3.66-3.61(m， 1H) ； C NMR(100MHz， CDCl3)168.5， 153.3， 136.9， 135.6， 132.2( 宽 )， 132.0， 131.4(q， J ＝ 32.5Hz)， 131.2( 宽 )， 129.6， 127.1( 宽 )， 125.5(m)， 124.8(m)， 124.0(q， J ＝ 272.5Hz)， 108.1， 62.4， 53.6， 32.3。
实施例 20
按照吡唑形成的一般步骤， 将 470 毫克 (1.00 毫摩尔 ) 实施例 15 转化为 388 毫克 1 (81％ ) 实施例 20。 H NMR(400MHz， CDCl3)13.60(bs， 1H)， 7.68-7.62(m， 2H)， 7.60-7.52(m， 2H)， 5.84(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 3.78(s， 3H)， 3.76-3.68(m， 1H)， 3.53(d， J ＝ 11.5Hz， 1H)， 2.39-2.22(m， 2H)， 1.25-1.12(m， 2H)， 1.12-1.20(m， 2H)， 1.00-0.87(m， 4H)， 0.74(t， J ＝ 13 7.2Hz， 3H) ；CNMR(100MHz， CDCl3)168.6， 153.5， 146.3( 宽 )， 137.1( 分 裂 )， 135.3( 分 裂 )， 133.4( 分裂 )， 131.8( 宽 )， 131.0(q( 分裂 )， J ＝ 32.6Hz)， 129.2( 分裂 )， 126.9(m)， 125.1(m)， 123.7( 宽 )， 124.0(q， J ＝ 272.5Hz)， 108.6( 分 裂 )， 62.6( 分 裂 )， 53.4， 32.7， 31.4， 29.8( 分裂 )， 29.1， 27.7( 宽 )， 22.5， 14.0。
实施例 21-(7R)-3- 异丁基 -9- 氧代 -4-[3-( 三氟甲基 ) 苯基 ]-1， 6， 7， 9- 四氢吡 唑并 [4， 3-d][1， 3] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -7- 羧酸
按照水解的一般步骤， 使用总计 1.6 当量的 LiOH， 将 63 毫克 (0.140 毫摩尔 ) 实 1 施 例 16 转 化 为 61 毫 克 ( 定 量 ) 实 施 例 21。[α]D-110(c 0.5， MeOH) ； H NMR(400MHz， MeOD-d4)7.78-7.73(m， 1H)， 7.73-7.62(m， 3H)， 5.74(d， J ＝ 8.1Hz， 1H)， 3.86(dd， J ＝ 11.7， 8.1Hz， 1H)， 3.60(d， J ＝ 11.7Hz， 1H)， 2.25-2.19(m， 2H)， 1.30-1.18(m， 1H)， 0.59-0.49(m， 13 6H) ；C NMR(100MHz， MeOD-d4)171.3( 分裂 )， 156.1， 143.0， 138.7， 137.5， 136.3， 135.2( 分 裂 )， 132.1(dq， J ＝ 32.4， 7.2 ＝ Hz)， 130.8( 分 裂 )， 128.1(m)， 126.0(m)， 125.4(q， J＝ 271.6Hz)， 123.9( 分 裂 )， 108.8， 63.6， 36.3( 分 裂 )， 33.3， 30.3( 分 裂 )， 22.4( 分 裂 )， 22.2( 分裂 )。
实施例 22-(7R)-9- 氧代 -3- 丙基 -4-[3-( 三氟甲基 ) 苯基 ]-1， 6， 7， 9- 四氢吡唑 并 [4， 3-d][1， 3] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -7- 羧酸
按照水解的一般步骤， 使用总计 1.6 当量的 LiOH， 将 61 毫克 (0.139 毫摩尔 ) 实 1 施 例 17 转 化 为 59 毫 克 ( 定 量 ) 实 施 例 22。[α]D-119(c 0.5， MeOH) ； H NMR(400MHz， MeOD-d4)7.78-7.62(m， 4H)， 5.77-5.72(m， 1H)， 3.86(dd， J ＝ 11.8， 8.2Hz， 1H)， 3.60(d， 13 J ＝ 11.8Hz ， 1H) ， 2.34-2.19(m ， 2H) ， 1.26-1.15(m ， 2H) ， 0.58(t ， J ＝ 7.3Hz ， 3H) ； C NMR(100MHz， MeOD-Cl 4)171.3， 156.0， 143.9， 138.7， 137.4， 135.9， 135.0， 132.0， 130.7， 127.9， 126.1， 125.4， 123.8， 108.8， 63.8， 33.3， 29.4， 24.1， 13.9。
实施例 23-(7R)-9- 氧代 -3- 戊基 -4-[3-( 三氟甲基 ) 苯基 ]-1， 6， 7， 9- 四氢吡唑 并 [4， 3-d][1， 3] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -7- 羧酸
按照水解的一般步骤， 使用总计 1.7 当量的 LiOH， 将 65 毫克 (0.140 毫摩尔 ) 实 1 施 例 18 转 化 为 63 毫 克 ( 定 量 ) 实 施 例 23。[α]D-113(c 0.5， MeOH) ； H NMR(400MHz，MeOD-d4)7.77-7.63(m， 4H)， 5.74.5-71(m， 1H)， 3.86(dd， J ＝ 11.7， 8.2Hz， 1H)， 3.59(d， J ＝ 11.7Hz， 1H)， 2.39-2.23(m， 2H)， 1.21-1.10(m， 2H)， 1.10-0.98(m， 2H)， 0.97-0.84(m， 2H)， 13 0.73(t， J ＝ 7.3Hz， 3H) ；C NMR(100MHz， MeOD-d4)171.3( 分 裂 )， 156.0， 144.1， 138.8， 137.5， 135.9， 135.1( 分 裂 )， 132.1(q( 分 裂 )， J ＝ 32.6Hz)， 130.7( 分 裂 )， 127.9(m)， 127.1(m)， 125.4(q， J ＝ 271.7Hz)， 123.8， 108.8， 68.8， 63.8， 33.3， 32.6， 30.7， 27.6， 23.1。
实施例 24-(7R)-9- 氧代 -4-[3-( 三氟甲基 ) 苯基 ]-1， 6， 7， 9- 四氢吡唑并 [4， 3-d] [1， 3] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -7- 羧酸
按照水解的一般步骤， 使用总计 1.8 当量的 LiOH， 将 55 毫克 (0.139 毫摩尔 ) 实 1 施 例 19 转 化 为 53 毫 克 ( 定 量 ) 实 施 例 24。[α]D-214(c 0.5， DMSO) ； H NMR(400MHz， DMSO-d6)14.25(bs， 1H)， 7.86-7.72(m， 5H)， 5.64(d， J ＝ 8.2Hz， 1H)， 3.87(dd， J ＝ 11.7， 8.2Hz， 1H)， 3.62(d， J ＝ 11.7Hz， 1H)。
实施例 25-(7R)-3- 己基 -9- 氧代 -4-[3-( 三氟甲基 ) 苯基 ]-1， 6， 7， 9- 四氢吡唑 并 [4， 3-d][1， 3] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -7- 羧酸
按照水解的一般步骤， 使用总计 2.0 当量的 LiOH， 在使用 CH2Cl2 ∶ MeOH ∶ AcOH(1 00 ∶ 1 ∶ 1 → 100 ∶ 2 ∶ 1) 作为洗脱剂利用硅胶色谱纯化后， 将 336 毫克 (0.701 毫摩尔 ) 实 1 施 例 20 转 化 为 251 毫 克 (77 ％ ) 实 施 例 25。[α]D-117(c 0.5， MeOH) ； H NMR(400MHz， MeOD-d4)7.74-7.60(m， 4H)， 5.74(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 3.84(dd， J ＝ 11.6， 8.0Hz， 1H)， 3.57(d， J ＝ 11.6Hz， 1H)， 2.39-2.21(m， 2H)， 1.19-1.04(m， 4H)， 1.01-0.86(m， 4H)， 0.77(t， 13 J ＝ 7.3Hz， 3H) ；C NMR(100MHz， MeOD-d4)171.3( 分 裂 )， 155.8， 144.2， 138.6， 137.4， 135.7( 分 裂 )， 134.8( 分 裂 )， 132.0(q( 分 裂 )， J ＝ 32.3Hz)， 130.7( 分 裂 )， 127.8(m)， 126.0(m)， 125.2(q( 分 裂 )， J ＝ 272.1Hz)， 123.7( 分 裂 )， 108.7， 63.8， 33.3， 32.3， 30.9， 30.0， 27.7， 23.4， 14.3。
实施例 26
将 82 毫克 PPh3 溶解在 0.15 毫升 THF 和 0.15 毫升 CH2Cl2 中并冷却至 0℃。加入 27 微升 DEAD， 将溶液搅拌一小时。随后在室温下将其转移到 55 毫克 (0.122 毫摩尔 ) 实 施例 16 与 9 微升乙醇在 0.15 毫升 THF 与 0.15 毫升 CH2Cl2 中的溶液中。随后将该溶液搅 拌 4 小时， 然后在减压下浓缩。使用庚烷∶乙酸乙酯 2 ∶ 1 → 1 ∶ 1 作为洗脱剂使粗产物 通过硅胶柱。为了除去 DEAD-H2， 将该产物溶解在二乙醚中并用 10％的 NaOH( 水溶液 ) 洗 涤五次。合并的水相用二乙醚萃取一次， 合并的有机相通过硅胶栓 (silica plug) 并在 1 减压下浓缩为 23 毫克 (39 ％ ) 的实施例 26。[α]D-102(c 0.5， CHCl3) ； H NMR(400MHz， CDCl3)7.71-7.54(m， 4H)， 5.72-5.66(m， 1H)， 4.82-4.61(m， 2H)， 3.58(s， 3H)， 3.71(dd， br， J ＝ 11.7， 8.0Hz， 1H)， 3.56-3.49(m， 1H)， 2.16-2.08(m， 2H)， 1.52-1.42(t， J ＝ 7.2Hz， 3H)， 1.33-1.21(m， 1H)， 0.61-0.48(m， 6H)。
实施例 27-(7R)-1- 乙基 -3- 异丁基 -9- 氧代 -4-[3-( 三氟甲基 ) 苯基 ]-1， 6， 7， 9- 四氢吡唑并 [4， 3-d][1， 3] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -7- 羧酸
按照水解的一般步骤， 使用总计 1.0 当量的 LiOH 和附加的 0.25 毫升 THF， 将 15 毫 克 (0.031 毫 摩 尔 ) 实 施 例 26 转 化 为 14 毫 克 ( 定 量 ) 实 施 例 27。[α]D-84(c 0.5， 1 MeOH) ； H NMR(400MHz， MeOD-d4)7.79-7.72(m， 1H)， 7.72-7.62(m， 3H)， 5.63(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 4.75-4.62(m， 2H)， 3.86-3.77(m， 1H)， 3.60(d， J ＝ 11.4Hz， 1H)， 2.19-2.09(m， 2H)，1.91-1.82(m， 1H)， 1.48-1.38(m， 3H)， 1.35-1.17(m， 3H)， 0.60-0.45(m， 6H)。
实施例 28-(7R)-4-(3， 4- 二氟苯基 )-3- 己基 -9- 氧代 -1， 6， 7， 9- 四氢吡唑并 [4， 3-d][1， 3] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -7- 羧酸
类似于实施例 25 合成实施例 28， 不同之处在于 ： 如下进行吡唑形成步骤 ： 将 72 毫 1 2 克 (0.165 毫摩尔 )VI(R ＝ 3， 4- 二氟苯基、 R ＝ 1- 己基 ) 和 12.5 毫克 NaNO2(0.18 毫摩尔 ) 溶解在 1.5 毫升甲醇和 0.5 毫升乙酸中， 并在室温下搅拌 1 小时。在减压下除去溶剂， 使用 庚烷∶乙酸乙酯 (1 ∶ 1) 作为洗脱剂利用硅胶色谱纯化粗产物， 获得 39 毫克 (53％ )VII(R1 ＝ 3， 4- 二氟苯基、 R2 ＝ 1- 己基 )。按照一般步骤 (VIII) 使用总计 1.7 当量的 LiOH 水解 1 后， 获得实施例 28。 H NMR(400MHz， MeOH-d4)7.49-7.30(m， 2H)， 7.30-7.15(m， 1H)， 5.72(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 3.84(dd， J ＝ 11.7， 8.0Hz， 1H)， 3.60(d， J ＝ 11.7Hz， 1H)， 2.49-2.28(m， 2H)， 1.31-1.12(m， 4H)， 1.12-0.97(m， 4H)， 0.84(t， J ＝ 7.3Hz， 3H)。
实施例 29-(7R)-4-(3， 4- 二氟苯基 )-3- 己基 -9- 氧代 -N-( 苯基磺酰基 )-1， 6， 7， 9- 四氢吡唑并 [4， 3-d][1， 3] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -7- 羧酰胺
在室温下将 34 毫克 (0.21 毫摩尔 )N， N′ - 羰基二咪唑加入到 30 毫克 (0.069 毫 摩尔 ) 实施例 28 溶解在 1.5 毫升 CH2Cl2 中的溶液中。 搅拌一小时后， 加入 44 毫克 (0.28 毫 摩尔 ) 苯磺酰胺， 混合物用微波加热在密封管中在 80℃下搅拌 7 小时。混合物用 CH2Cl2 稀 释并用 5％乙酸水溶液洗涤， 用 CH2Cl2 萃取， 随后浓缩。使用乙酸乙酯∶甲醇 (9 ∶ 1) 作为 1 洗脱剂利用硅胶色谱纯化粗产物， 获得 16 毫克 (40％ ) 实施例 29。 H NMR(400MHz， DMSO-d6， 323K)13.53(bs， 1H)， 7.79-7.31(m， 8H)， 5.32(d， J ＝ 8.2Hz， 1H)， 7.70(dd， J ＝ 11.1， 8.2Hz， 1H)， 3.53(d， J ＝ 11.1Hz， 1H)， 2.32-2.20(m， 2H)， 1.24-1.06(m， 4H)， 1.06-0.91(m， 4H)， 0.79(t， J ＝ 7.2Hz， 3H)。
实 施 例 32-(3R)-6- 氨 基 -2， 3- 二 氢 -7- 甲 基 -8- 苯 基 - 噻 唑 并 [3， 2-a] 吡 啶 -5- 酮 -3- 羧酸甲酯
首先按照硝化的一般步骤， 但是随后按照还原的一般步骤直接还原而不经过两个 步骤之间的柱纯化， 由此制备实施例 32。从 3.01 克 (9.99 毫摩尔 ) 实施例 30 开始， 获得 2.26 克 (71％ ) 白色泡沫状的实施例 32。[α]D-169(c 0.5， CHCl3) ； IRλ1745， 1637， 1577， -1 1 1311， 1209， 1176， 707cm ； HNMR(400MHz， CDCl3)δ7.43-7.30(m， 3H)， 7.24-7.17(m， 2H)， 5.67-5.62(m， 1H)， 3.89(bs， 2H)， 3.82-3.78(m， 3H)， 3.63-3.55(m， 1H)， 3.44-3.48(m， 1H)， 13 1.85-1.83(m， 3H) ；C NMR(100MHz， CDCl3)δ168.8， 156.4， 137.6， 131.7， 130.9， 130.1， + 129.8， 128.7， 128.6， 127.9， 124.6， 117.3， 63.8， 53.3， 32.0， 14.9 ； )； HRMS(FAB ) 计 算 值 + + [M+H] C16H17N2O3S 317.0954， 实测值 317.0961。
实施例 33-(3R)-6- 氨基 -2， 3- 二氢 -7-(3- 甲基 - 丁基 )-8- 苯基 - 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -5- 酮 -3- 羧酸甲酯
首先按照硝化的一般步骤， 但是随后按照还原的一般步骤直接还原而不经过两个 步骤之间的柱纯化， 由此制备实施例 33。从 158 毫克 (0.442 毫摩尔 ) 实施例 31 开始， 获 得 110 毫克 (67％ ) 浅灰色泡沫状的实施例 33。[α]D-149(c 0.5， CHCl3) ； IRλ1745， 1635， -1 1 1571， 1309， 1207， 1168， 701cm ； H NMR(400MHz， CDCl3)δ7.41-7.30(m， 3H)， 7.24-7.18(m， 2H)， 5.61(dd， J ＝ 8.3， 2.3Hz， 1H)， 3.91(bs， 2H)， 3.80(s， 3H)， 3.58(dd， J ＝ 11.7， 8.3Hz， 1H)， 3.39(dd， J ＝ 11.7， 2.3Hz， 1H)， 2.19(dd， J ＝ 9.7， 7.1Hz， 2H)， 1.41-1.29(m， 1H)，13 1.28-1.16(m， 2H)， 0.68(d， J ＝ 6.5Hz， 6H) ； C NMR(100MHz， CDCl3)δ168.7， 156.8， 137.5， 131.1， 131.0， 130.3， 129.8， 129.5， 128.6， 128.5， 128.0， 117.0， 63.9， 53.2， 36.1， 31.9， + + + 28.3， 26.4， 22.1(2C) ； HRMS(FAB ) 计算值 [M+H] C20H25N2O3S 373.1580， 实测值 373.1587。
实 施 例 34-(7R)-6， 7- 二 氢 -4- 苯 基 - 吡 唑 并 [4， 5-d] 噻 唑 并 [3， 2-a] 吡 啶 -9- 酮 -7- 羧酸甲酯
按照吡唑形成的一般步骤制备实施例 34， 但是在柱纯化中不将甲醇作为添加剂。 不需要使用离子交换树脂 amberlite 来清除未反应的原料。将 598 毫克 (1.89 毫摩尔 ) 实 施例 32 转化为 190 毫克 (31％ ) 的实施例 34。[α]D(c 0.5， CHCl3) ； IRλ1743， 1654， 1211， -1 1 1180， 698cm ； H NMR(400MHz， CDCl3)δ7.83-7.79(s， 1H)， 7.55-7.43(m， 4H)， 7.42-7.35(m， 1H)， 5.87(dd， J ＝ 7.7， 1.3Hz， 1H)， 3.83(s， 3H)， 3.72(dd， J ＝ 11.6， 7.7Hz， 1H)， 3.60(dd， 13 J ＝ 11.6， 1.3Hz， 1H) ；C NMR(100MHz， CDCl3)δ168.6， 153.3， 136.0， 134.6， 132.9( 宽 )， 130.9( 宽 )， 128.9(2C)， 128.6(2C)， 128.1， 127.6， 109.7， 62.3， 53.5， 32.6 ； HRMS(FAB+) 计 算值 [M+H]+ C16H14N3O3S+ 328.0750， 实测值 328.0757。
实施例 35-(7R)-6， 7- 二氢 -3- 异丁基 -4- 苯基 - 吡唑并 [4， 5-d] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -9- 酮 -7- 羧酸甲酯
按照吡唑形成的一般步骤制备实施例 35， 但是在柱纯化中不将甲醇作为添加剂。 不需要使用离子交换树脂 amberlite 来清除未反应的原料。将 150 毫克 (0.403 毫摩尔 ) 实施例 33 转化为 84 毫克 (54％ )D。[α]D-224(c0.5， CHCl3) ； IRλ1747， 1654， 1565， 1205， -1 1 1170， 700cm ； H NMR(400MHz， CDCl3)δ7.48-7.40(m， 3H)， 7.40-7.33(m， 2H)， 5.84(dd， J＝ 7.8， 1.5Hz， 1H)， 3.83(s， 3H)， 3.70(dd， J ＝ 11.6， 7.8Hz， 1H)， 3.54(dd， J ＝ 11.6， 1.5Hz， 1H)， 2.31-2.21(m， 2H)， 1.42-1.31(m， 1H)， 0.59(d， J ＝ 6.6Hz， 3H)， 0.55(d， J ＝ 6.6Hz， 13 3H) ；C NMR(100MHz， CDCl3)δ168.8， 153.5， 145.9( 宽 )， 136.1， 134.7， 131.8( 宽 )， 130.2， 129.9， 128.7， 128.6， 128.4， 124.5， 110.3， 62.5， 53.5， 36.3， 32.7， 29.0， 22.3， 22.1 ； + + + HRMS(FAB ) 计算值 [M+H] C20H22N3O3S 384.1376， 实测值 384.1378。
实施例 34 的溴化
实施例 36-(7R)-3- 溴 -6， 7- 二氢 -4- 苯基 - 吡唑并 [4， 5-d] 噻唑并 [3， 2-a] 吡 啶 -9- 酮 -7- 羧酸甲酯
将 9.2 毫升 THF 加入到 602 毫克 (1.84 毫摩尔 ) 实施例 34 和 199 毫克 (2.03 毫 摩尔 )KOAc 的混合物中。当实施例 34 已经溶解时， 在室温下搅拌的同时逐滴加入 99 微升 (1.93 毫摩尔 )Br2。将混合物搅拌 1 小时， 随后通过加入 10％的 Na2S2O5( 水溶液 ) 结束该 反应。加入乙酸乙酯， 将有机相分离。水相用乙酸乙酯萃取， 合并的有机相用 Na2SO4( 固 体 ) 干燥， 过滤并在减压下浓缩。残余物溶解在少量 THF 中 ( 有时， 产物必须由更大量的 THF 浓缩以避免柱色谱过程中沉淀 )， 然后使用庚烷∶乙酸乙酯 (2 ∶ 1 → 1 ∶ 2) 作为洗 脱剂利用硅胶色谱纯化。获得 622 毫克 (83％ ) 浅黄色泡沫状的实施例 36。[α]D-183(c 1 0.5， DMSO) ； IRλ1745， 1652， 1562， 1149， 698cm -1 ； H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ14.60(bs， 1H)， 7.49-7.40(m， 3H)， 7.40-7.27(m， 2H)， 5.79-5.75(m， 1H)， 3.85(dd， J ＝ 11.9， 8.5Hz， 13 1H)， 3.76(s， 3H)， 3.57(dd， J ＝ 11.9， 1.2Hz， 1H) ；C NMR(100MHz， DMSO-d6)δ168.7， 151.2， 137.7， 133.7， 131.2， 130.6( 宽 )， 130.1( 宽 )， 128.3(2C)， 128.2， 123.7， 118.5， 106.2， + + + 62.1， 53.1， 31.7 ； HRMS(FAB ) 计算值 [M+H] C16H13BrN3O3S 405.9855， 实测值 405.9857。实施例 37-(7R)-6， 7- 二氢 -3- 异丁基 -4- 苯基 - 吡唑并 [4， 5-d] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -9- 酮 -7- 羧酸
按照水解的一般步骤， 使用总计 1.5 毫升 0.1M 的 LiOH( 水溶液 )， 将 38 毫克 (0.10 毫摩尔 ) 实施例 35 转化为 36 毫克 (97％ ) 实施例 37。 [α]D-179(c 0.25， HCO2H) ； IRλ1648， -1 1 1565， 1365， 1166， 700cm ； H NMR(400MHz， MeOH-d4)δ7.49-7.40(m， 3H)， 7.40-7.32(m， 2H)， 5.64(d， J ＝ 7.9Hz， 1H)， 3.75(dd， J ＝ 11.5， 7.9Hz， 1H)， 3.55(d， J ＝ 11.5Hz， 1H)， 2.32-2.17(m， 2H)， 1.33-1.21(m， 1H)， 0.54(d， J ＝ 6.6Hz， 3H)， 0.51(d， J ＝ 6.6Hz， 3H) ； 13 CNMR(100MHz， MeOH-d4)δ172.6， 156.0， 143.6( 宽 )， 137.8， 137.1， 136.0( 宽 )， 131.4， 131.2 ， 129.7 ， 129.5 ， 129.2 ， 124.5( 宽 ) ， 110.3 ， 64.9 ， 36.4 ， 33.6 ， 30.2 ， 22.6 ， 22.2 ； + + + HRMS(FAB ) 计算值 [M+H] C19H20N3O3S 370.1220， 实测值 370.1229。
实 施 例 38-(7R)-6， 7- 二 氢 -3， 4- 二 苯 基 - 吡 唑 并 [4， 5-d] 噻 唑 并 [3， 2-a] 吡 啶 -9- 酮 -7- 羧酸酯 / 盐
按照实施例 36 的一般 Suzuki 偶联步骤， 使用 44 毫克 (0.36 毫摩尔 ) 苯基硼酸作 为偶联剂， 在 HPLC 纯化后获得 43 毫克 (61％ ) 实施例 38。经 20 分钟将 50 至 90％梯度的 甲醇 ( 相对于水和作为添加剂的 1％的甲酸 ) 用作制备 HPLC 纯化过程中的流动相。[α] 1 HCO2H) ； IRλ1656， 1565， 1488， 1440， 1367， 698cm-1 ； H NMR(400MHz， AcOH-d4) D-142(c 0.25， δ7.29-7.08(m， 4H)， 7.08-7.89(m， 6H)， 5.96(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 3.85(dd， J ＝ 11.7， 8.0Hz， 13 1H)， 3.66(d， J ＝ 11.7Hz， 1H) ；C NMR(100MHz， AcOH-d4)δ172.5， 154.9， 146.0， 137.8， 136.4， 133.5， 132.1， 130.7( 宽 )， 130.5( 宽 )， 130.1(2C)， 129.0(2C，宽 )， 128.8， 128.6， + + + 128.4(2C)， 124.6， 111.3， 63.8， 32.9 ； HRMS(FAB ) 计算值 [M+H] C21H16N3O3S 390.0907， 实 测值 390.0912。
实施例 39-(7R)-6， 7- 二氢 -3-(4- 甲氧基苯基 )-4- 苯基 - 吡唑并 [4， 5-d] 噻唑 并 [3， 2-α] 吡啶 -9- 酮 -7- 羧酸
按照实施例 36 的一般 Suzuki 偶联步骤， 使用 55 毫克 (0.36 毫摩尔 )4- 甲氧基 苯基硼酸作为偶联剂， 在 HPLC 纯化后获得 40 毫克 (55％ ) 实施例 39。经 20 分钟将 50 至 90％梯度的甲醇 ( 相对于水和作为添加剂的 1％的甲酸 ) 用作制备 HPLC 纯化过程中的流动 相。[α]D-87(c 0.25， HCO2H) ； IR λ1656， 1558， 1468， 1247， 1172， 1031， 829， 781， 698cm-1 ； 1 H NMR(400MHz， AcOH-d4)δ7.31-7.14(m， 3H)， 7.14-6.96(m， 2H)， 6.94(d， J ＝ 8.7Hz， 2H)， 6.57(d， J ＝ 8.7Hz， 2H)， 5.96(d， J ＝ 8.1Hz， 1H)， 3.86(dd， J ＝ 11.9， 8.1Hz， 1H)， 13 3.71(s， 3H)， 3.66(d， J ＝ 11.9Hz， 1H) ；C NMR(100MHz， AcOH-d4)δ172.7， 160.4， 155.1， 145.8， 137.6， 136.5， 133.6， 131.4(2C)， 130.9( 宽 )， 130.5( 宽 )， 129.1(2C，宽 )， 128.7， + + 124.5， 124.5， 114.0(2C)， 111.4， 63.8， 55.6， 32.9 ； HRMS(FAB ) 计 算 值 [M+H] C22H18N3O4S+ 420.1013， 实测值 420.1008。
实施例 40-(7R)-6， 7- 二氢 -3-(3- 硝基苯基 )-4- 苯基 - 吡唑并 [4， 5-d] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -9- 酮 -7- 羧酸
按照实施例 36 的一般 Suzuki 偶联步骤， 使用 60 毫克 (0.36 毫摩尔 )3- 硝基苯 基硼酸作为偶联剂， 在 HPLC 纯化后获得 29 毫克 (37 ％ ) 实施例 40。经 30 分钟将 50 至 90 ％梯度的甲醇 ( 相对于水和作为添加剂的 1 ％的甲酸 ) 用作制备 HPLC 纯化过程中的 1 流 动 相。[α]D-157(c 0.25， HCO2H) ； IRλ1658， 1529， 1348， 698， 686cm-1 ； H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ7.99-7.94(m， 1H)， 7.70-7.66(m， 1H)， 7.48-7.43(m， 1H)， 7.32-7.25(m， 1H)， 7.21-7.05(m， 3H)， 7.02-6.86(m， 2H)， 5.79(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 3.85(dd， J ＝ 11.5， 8.0Hz， 13 1H)， 3.61(d， J ＝ 11.5Hz， 1H) ；C NMR(100MHZ， MeOH-d4)δ171.3( 宽 )， 154.7( 宽 )， 148.7， 143.6( 宽 )， 138.7， 136.9， 135.9， 134.9( 宽 )， 134.3( 宽 )， 130.8(2C， 宽 )， 129.8， 129.6( 宽 )， 129.2( 宽 )， 128.7， 125.1， 124.8， 123.1， 109.5， 64.0( 宽 )， 33.3 ； HRMS(FAB+) 计算值 [M+H]+ C21H15N4O5S+ 435.0758， 实测值 435.0757。
实施例 41-(7R)-3-(3- 呋喃基 )-6， 7- 二氢 -4- 苯基 - 吡唑并 [4， 5-d] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -9- 酮 -7- 羧酸
按照实施例 36 的一般 Suzuki 偶联步骤， 使用 40 毫克 (0.36 毫摩尔 )3- 呋喃 基硼酸作为偶联剂， 在 HPLC 纯化后获得 36 毫克 (53 ％ ) 实施例 41。经 20 分钟将 50 至 75 ％梯度的甲醇 ( 相对于水和作为添加剂的 1 ％的甲酸 ) 用作制备 HPLC 纯化过程中的 1 流 动 相。[α]D-144(c 0.25， HCO2H) ； IRλ1658， 1554， 1164， 796， 698cm-1 ； H NMR(400MHz， AcOH-d4)δ7.50-7.31(m， 4H)， 7.31-7.22(m， 2H)， 6.56(s， 1H)， 6.29-6.27(m， 1H)， 5.99(d， J 13 ＝ 8.1Hz， 1H)， 3.91(dd， J ＝ 11.9， 8.1Hz， 1H)， 3.70(d， J ＝ 11.9Hz， 1H) ；C NMR(100MHz， AcOH-d 4 ) δ 172.6 ， 154.8 ， 143.3 ， 124.6 ， 138.3 ， 138.0 ， 136.8 ， 133.4 ， 131.3( 宽 ) ， 131.0( 宽 )， 129.5(3C，宽 )， 124.7， 117.8， 111.3， 111.1， 63.9， 33.0 ； HRMS(FAB+) 计 算 值 [M+H]+ C19H14N3O4S+ 380.0700， 实测值 380.0697。
实施例 42-(7R)-6， 7- 二氢 -4- 苯基 -3-(2- 甲苯基 )- 吡唑并 [4， 5-d] 噻唑并 [3， 2-a] 吡啶 -9- 酮 -7- 羧酸
按照实施例 36 的一般 Suzuki 偶联步骤， 使用 49 毫克 (0.36 毫摩尔 )2- 甲苯基 硼酸作为偶联剂并在 140℃下延长加热时间 ( 总计 60 分钟 )， 在 HPLC 纯化后获得 23 毫克 (32％ ) 实施例 42。经 20 分钟将 50 至 90％梯度的甲醇 ( 相对于水和作为添加剂的 1％的 甲酸 ) 用作制备 HPLC 纯化过程中的流动相。[α]D-40(c 0.25， HCO2H) ； IRλ1654， 1560， -1 1 759， 725， 698cm ； H NMR(400MHz， AcOH-d4)δ7.13-6.86(m， 9H)， 5.96(d， J ＝ 8.1Hz， 1H)， 13 3.86(dd， J ＝ 12.0， 8.1Hz， 1H)， 3.66(d， J ＝ 12.0Hz， 1H)， 1.93(s， 3H) ；CNMR(100MHz， AcOH-d4)δ172.6， 155.1， 145.2， 138.3， 137.5， 135.3， 133.2， 132.1， 131.6， 130.4(3C， 宽 )， + 129.4， 128.5(3C，宽 )， 126.0， 125.7， 111.6， 63.8， 32.9， 20.2 ； HRMS(FAB ) 计 算 值 [M+H]+ C22H18N3O3S+404.1063， 实测值 404.1075。
用于测试对淀粉样蛋白纤丝形成之抑制作用的 Aβ 聚集试验
将 冻 干 的 Aβ1-40 在 4mM 的 NaOH 中 溶 解 至 500μM 并 分 为 两 部 分。 一 部 分 在 PBS(50mM 磷酸盐缓冲液， pH 7.4， 含有 100mM 的 NaCl) 中稀释至 20μM 并在室温下涂布到 ELISA 96- 孔板 (Costar) 上 1 小时。将该板在 PBS 中洗涤以除去未结合的 Aβ1-40。在涂 有 Aβ1-40 的 ELISA 板中用 PBS 将物质 (DMSO 中 ) 稀释至不同浓度。随后将第二部分 NaOH 增溶的 Aβ1-40 加入到每个孔中以获得 100μM Aβ1-40 和 5％ DMSO 的最终浓度。将该板 在搅拌 (600rpm) 下在 37℃下培养 24 小时以使 Aβ1-40 聚集。
将 Aβ- 物质混合物在聚集后用在 PBS 中 25μM 硫黄素 T(ThT) 稀释 10 倍。通过 在 450nm 下激发和在 482nm 下发射立即检测 ThT 荧光。将与物质聚集的 Aβ1-40 的 ThT 荧 光与在 5％ DMSO 存在下聚集的 Aβ1-40 的 ThT 荧光比较。
图 1 中示出了用化合物实施例 21、 37 和 39 进行的 Aβ 聚集试验的结果。可以看出所述化合物阻碍淀粉样蛋白纤丝的形成。
用于测试 PAI-1 抑制剂的血浆凝块溶解试验
材料
双链 tPA
CaCl2， p.a. 储备溶液， 在水中 0.1M
柠檬酸盐， 0.13M
重组人 PAI-1
溶解在 100％ DMSO 中的 PAI-1 抑制剂
试验步骤
贫血小板血浆中的凝块溶解
将来自健康的肥胖空腹志愿者的血液收集到 0.13M 的柠檬酸三钠中， 9 份血液对 1 份抗凝剂。在室温下在 2000x g 下将试管离心 20 分钟。将上清液即贫血小板血浆汇集、 等分并在 -85℃下冷冻直到使用。在试验当天， 将血浆在水浴中解冻并升温至 37℃。将除 t-PA 外的所有其它成分预热至 37℃。 向微量滴定板上的每个孔内加入 25 微升 CaCl2、 25 微 升 PAI-1 或 25 微升 PAI-1 载体、 20 微升生理盐水和 5 微升药物或 5 微升载体 (100％ DMSO)。 将血浆与冷的 t-PA 溶液以 4 份血浆对 1 份 t-PA 的比例混合， 随后将 125 微升该混合物加 入到每个孔中。最终浓度为 CaCl2 为 12.5mM， PAI-1 为 10-13 纳克 / 毫升， t-PA 为 34 纳克 / 毫升， 在 0.1nM 至 0.25mM 的最终浓度下测试所述化合物。作为不同添加剂的结果， 最终 血浆浓度为 50％。将用塑料盖覆盖的该板放置在酶标仪 (Molecular Devices， US) 中并轻 轻摇振。以 37℃下 405nm 处的吸光度变化即时监控浊度的变化。在 10 小时期间， 以2分 钟间隔收集数据点。结束读数后， 将吸光度数据转化为含有针对每个孔的时间和吸光度值 的文件。以凝块形成 ( 即正 Vmax) 和凝块溶解 ( 即负 Vmax) 之间的时间测定凝块寿命 ( 即凝 块存在的时间 )。药物的效果即凝块寿命的缩短表示为达到凝块溶解时间一半时的浓度， IC50(pIC50 ＝ -log IC50)。在 PAI-1 的存在下测量设定至 100％的对照凝块溶解时间， 且最 大效果 ( 即在不存在 PAI-1 的情况下在确定条件下在该体系中可以达到的最短溶解时间 ) 设定为 0％。
具有高于 4 的 pIC50 的化合物被认为是有活性的。给出了下列 pIC50 值 ：
实施例 21 22 23 24 25pIC50 4.6 4.7 4.8 4.6 4.931102066385 A CN 102066395说27 28 29明书27/27 页4.1 4.3 5.2