噻吩或噻唑衍生物和其作为 PI3K 抑制剂的用途 背景技术 磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K) 是一个脂质激酶家族， 其在肌醇环的 3′位置处磷酸 化磷脂酰肌醇。PI3K 包含数个类别的基因， 包括 IA 类、 IB 类、 II 类和 III 类， 并且这些类 别中的一些类别含有数个同种型 ( 回顾于恩格尔曼 (Engelman) 等人， 自然综述 - 遗传学 (Nature Review Genetics)7 ： 606-619(2006) 中 )。PI3K 以杂二聚体 ( 包含催化域和调控 域 ) 形式起作用的事实增加了这一家族的复杂性。PI3K 家族在结构上与称为磷脂酰肌醇 3- 激酶样激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase like kinase， PIKK) 的脂质和丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶的较大基团有关， 所述家族还包括 DNA-PK、 ATM、 ATR、 mTOR、 TRRAP 和 SMG1。
PI3K 在经受体酪氨酸激酶介导的各种促有丝分裂信号的下游活化， 并且随后刺激 各种生物结果 ； 包括增加细胞存活率、 细胞周期进程、 细胞生长、 细胞代谢、 细胞迁移和血管 生成 ( 回顾于坎特利 (Cantley)， 科学 (Science)296 ： 1655-57(2002) ； 轩尼诗 (Hennessy) 等人， 自然综述 - 药物发现 (Nature Reviews Drug Discovery)4 ： 988-1004(2005) ； 恩格尔 曼 (Engelman) 等人， 自然综述 - 遗传学 (Nature Review Genetics)7 ： 606-619(2006) 中 )。 因此， PI3K 过度活化与许多过度增生性、 发炎性或心血管病症相关 ； 包括癌症、 炎症和心血 管疾病。
存 在 许 多 导 致 组 成 性 PI3K 信 号 传 导 的 遗 传 学 畸 变 ； 包 括 PI3K 自 身 ( 轩 尼 诗 (Hennessy) 等 人，自 然 综 述 - 药 物 发 现 (Nature Reviews Drug Discovery)4 ： 988-1004(2005) ； 回顾于巴德 (Bader) 等人， 自然综述 - 癌症 (Nature Reviews Cancer)5 ： 921-9(2005) 中 )、 RAS( 回顾于唐恩瓦德 (Downward) 自然综述 - 癌症 (Nature Reviews Cancer)3 ： 11-22(2003) 中 ) 和上游受体酪氨酸激酶 ( 回顾于兹威克 (Zwick) 等人， 分子 医学趋势 (Trends in Molecular Medicine)8 ： 17-23(2002) 中 ) 的活化突变， 以及肿瘤抑 制因子 PTEN 的失活突变 ( 回顾于库利 (Cully) 等人， 自然综述 - 癌症 (Nature Reviews Cancer)6 ： 184-92(2006) 中 )。这些基因类别中每一者的突变已证明是致癌的并且常见于 各种癌症中。
本发明中所定义的分子抑制 PI3K 的活性， 且因此可适用于治疗增生性、 发炎性或 心血管病症。PI3K 路径突变与增生性病症 ( 本发明中所定义的分子可具有治疗性益处 ) 有关的病例包括良性和恶性肿瘤以及来自不同系的癌症， 包括 ( 但不限于 ) 来源于以下 的癌症 ： 结肠 ( 萨缪尔斯 (Samuels) 等人， 科学 (Science)304 ： 554(2004) ； 回顾于凯拉克 斯 (Karakas) 等人， 英国癌症杂志 (British Journal of Cancer)94 ： 455-59(2006) 中 )、 肝 ( 回顾于凯拉克斯 (Karakas) 等人， 英国癌症杂志 (British Journal of Cancer)94 ： 455-59(2006) 中 )、 肠道 ( 回顾于轩尼诗 (Hennessy) 等人， 自然综述 - 药物发现 (Nature Reviews Drug Discovery)4 ： 988-1004(2005) 中 )、 胃 ( 萨 缪 尔 斯 (Samuels) 等 人， 科 学 (Science)304 ： 554(2004) ； 回顾于凯拉克斯 (Karakas) 等人， 英国癌症杂志 (British Journal of Cancer)94 ： 455-59(2006) 中 )、 食道 ( 菲利普斯 (Phillips) 等人， 国际癌症 杂志 (International Journal of Cancer)118 ： 2644-6(2006)) ； 胰脏 ( 回顾于唐恩瓦德 (Downward) 自然综述 - 癌症 (Nature Reviews Cancer)3 ： 11-22(2003) 中 ) ； 皮肤 ( 回顾
于轩尼诗 (Hennessy) 等人， 自然综述 - 药物发现 (Nature Reviews Drug Discovery)4 ： 988-1004(2005) 中 )、 前 列 腺 ( 回 顾 于 轩 尼 诗 (Hennessy) 等 人， 自然综述 - 药物发现 (Nature Reviews Drug Discovery)4 ： 988-1004(2005) 中 )、 肺 ( 萨 缪 尔 斯 (Samuels) 等人， 科学 (Science)304 ： 554(2004) ； 回顾于凯拉克斯 (Karakas) 等人， 英国癌症杂志 (British Journal of Cancer)94 ： 455-59(2006) 中 )、 乳 房 ( 萨 缪 尔 斯 (Samuels) 等 人， 科 学 (Science)304 ： 554(2004) ； 埃 萨 科 夫 (Isakoff) 等 人， 癌 症 研 究 (Can Res)65 ： 10992-1000(2005) ； 回顾于凯拉克斯 (Karakas) 等人， 英国癌症杂志 (British Journal of Cancer)94 ： 455-59(2006) 中 )、 子宫内膜 ( 欧达 (Oda) 等人， 癌症研究 (Can Res)65 ： 10669-73(2005) ； 回顾于轩尼诗 (Hennessy) 等人， 自然综述 - 药物发现 (Nature Reviews Drug Discovery)4 ： 988-1004(2005) 中 )、 子宫颈 ( 回顾于轩尼诗 (Hennessy) 等人， 自然综 述 - 药物发现 (Nature Reviews Drug Discovery)4 ： 988-1004(2005) 中 ) ； 卵巢 ( 沙耶斯 特 (Shayesteh) 等人， 自然遗传学 (Nature Genetics)21 ： 99-102(1999) ； 回顾于凯拉克斯 (Karakas) 等人， 英国癌症杂志 (British Journal of Cancer)94 ： 455-59(2006) 中 )、 睪丸 ( 莫尔 (Moul) 等人， 基因、 染色体和癌症 (Genes Chromosomes Cancer)5 ： 109-18(1992) ； 迪 维兹奥 (Di Vizio) 等人， 致癌基因 (Oncogene)24 ： 1882-94(2005))、 血液学细胞 ( 回顾于凯 拉克斯 (Karakas) 等人， 英国癌症杂志 (British Journal of Cancer)94 ： 455-59(2006) ； 轩 尼 诗 (Hennessy) 等 人， 自 然 综 述 - 药 物 发 现 (Nature Reviews Drug Discovery)4 ： 988-1004(2005) 中 )、 胰脏 ( 回顾于唐恩瓦德 (Downward) 自然综述 - 癌症 (Nature Reviews Cancer)3 ： 11-22(2003) 中 )、 甲状腺 ( 回顾于唐恩瓦德 (Downward) 自然综述 - 癌症 (Nature Reviews Cancer)3 ： 11-22(2003) 中 ； 回顾于轩尼诗 (Hennessy) 等人， 自然综述 - 药物发现 (Nature Reviews Drug Discovery)4 ： 988-1004(2005) 中 ) ； 脑 ( 萨缪尔斯 (Samuels) 等人， 科学 (Science)304 ： 554(2004) ； 回顾于凯拉克斯 (Karakas) 等人， 英国癌症杂志 (British Journal of Cancer)94 ： 455-59(2006) 中 )、 膀胱 ( 洛佩兹· 诺尔斯 (Lopez-Knowles) 等 人， 癌症研究 (Cancer Research)66 ： 7401-7404(2006) ； 轩尼诗 (Hennessy) 等人， 自然综 述 - 药物发现 (Nature Reviews Drug Discovery)4 ： 988-1004(2005)) ； 肾 ( 回顾于唐恩 瓦德 (Downward) 自然综述 - 癌症 (Nature Reviews Cancer)3 ： 11-22(2003) 中 ) 和头颈 部 ( 回顾于恩格尔曼 (Engelman) 等人， 自然综述 - 遗传学 (Nature Reviews Genetics)7 ： 606-619(2006) 中 )。
具有异常 PI3K 路径信号传导的其它类别的病症 ( 本发明中所定义的分子可具有 治疗性益处 ) 包括发炎性和心血管疾病， 包括 ( 但不限于 ) 过敏 / 过敏反应 (( 回顾于罗 密尔 (Rommel) 等人， 自然综述 - 免疫学 (Nature Reviews Immunology)7 ： 191-201(2007) 中 )、 急 性 和 慢 性 炎 症 ( 回 顾 于 吕 克 勒 (Ruckle) 等 人， 自 然 综 述 - 药 物 发 现 (Nature Reviews Drug Discovery)5 ： 903-12(2006) 中 ； 回顾于罗密尔 (Rommel) 等人， 自然综述 - 免 疫学 (Nature Reviews Immunology)7 ： 191-201(2007) 中 )、 类风湿性关节炎 ( 回顾于罗 密尔 (Rommel) 等人， 自然综述 - 免疫学 (Nature Reviews Immunology)7 ： 191-201(2007) 中)； 自体免疫病症 ( 回顾于吕克勒 (Ruckle) 等人， 自然综述 - 药物发现 (Nature Reviews Drug Discovery)5 ： 903-12(2006) 中 )、 血 栓 形 成 ( 杰 克 逊 (Jackson) 等 人， 自然医学 (Nature Medicine)11 ： 507-14(2005) ； 回 顾 于 吕 克 勒 (Ruckle) 等 人， 自然综述 - 药物 发现 (Nature Reviews Drug Discovery)5 ： 903-12(2006) 中 )、 高血压 ( 回顾于吕克勒(Ruckle) 等人， 自然综述 - 药物发现 (Nature Reviews Drug Discovery)5 ： 903-12(2006) 中 )、 心脏肥大 ( 回顾于普罗德 (Proud) 等人， 心血管研究 (Cardiovascular Research)63 ： 403-13(2004) 中 ) 和心脏衰竭 ( 回顾于莫卡努 (Mocanu) 等人， 英国药理学杂志 (British Journal of Pharmacology)150 ： 833-8(2007) 中 )。
显然， 提供具有良好治疗性质、 特别是用于治疗增生性、 发炎性或心血管病症的新 颖 PI3K 抑制剂将是有益的。 具体实施方式
1. 本发明化合物的概述 ：
本发明提供是 PI3K 的抑制剂且因此适用于治疗增生性、 发炎性或心血管病症的 化合物。本发明的化合物由式 I 表示 ：
或其医药学上可接受的盐， 其中 ： 1
当 Y2 为 C 时， R 为 H、 -CN、 卤素、 -Z-R3、 C1-6 脂肪族基或 3-10 元脂环族基， 其中 ： 1a
Z 选自任选经取代的 C1-3 亚烷基链、 -O-、 -N(R )-、 -S-、 -S(O)-、 -S(O)2-、 -C(O 1a 1a 1a 1a 1a )-、 -CO2-、 -C(O)NR -、 -N(R )C(O)-、 -N(R )CO2-、 -S(O)2NR -、 -N(R )S(O)2-、 -OC(O) 1a 1a 1a 1a 1a N(R )-、 -N(R )C(O)NR -、 -N(R )S(O)2N(R )- 或 -OC(O)- ； 1a
R 为氢或任选经取代的 C1-4 脂肪族基， 且 3
R 为选自以下的任选经取代的基团 ： C1-6 脂肪族基， 3-10 元脂环族基， 具有 1-5 个 独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具有 1-5 个独立地选自 氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基 ；
R2 为 H、 卤素、 -W-R5 或 -R5， 其中 ：
W 选自任选经取代的 C1-3 亚烷基链、 -O-、 -NCR2a)-、 -S-、 -S(O)-、 -S(O)2-、 -C(O 2a 2a 2a 2a 2a )-、 -CO2-、 -C(O)NR -、 -N(R )C(O)-、 -N(R )CO2-、 -S(O)2NR -、 -N(R )S(O)2-、 -OC(O)
N(R2a)-、 -N(R2a)C(O)NR2a-、 -N(R2a)S(O)2N(R2a)- 或 -OC(O)-。
R2a 为氢或任选经取代的 C1-4 脂肪族基， 且 5
R 为选自以下的任选经取代的基团 ： C1-6 脂肪族基， 3-10 元脂环族基， 具有 1-5 个 独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具有 1-5 个独立地选自 氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基 ；
X1、 X2 和 X3 各独立地为 N 或 CR6， 其中每个出现的 R6 独立地为氢、 -CN、 卤素、 -V-R7、 C1-6 脂肪族基或 3-10 元脂环族基， 其中 ：
V 选自任选经取代的 C1-3 亚烷基链、 -O-、 -N(R6a)-、 -S-、 -S(O)-、 -S(O)2-、 -C(O 6a 6a 6a 6a 6a )-、 -CO2-、 -C(O)NR -、 -N(R )C(O)-、 -N(R )CO2-、 -S(O)2NR -、 -N(R )S(O)2-、 -OC(O)N(R6a)-、 -N(R6a)C(O)NR6a-、 -N(R6a)S(O)2N(R6a)- 或 -OC(O)-，
R6a 为氢或任选经取代的 C1-4 脂肪族基， 且 7
R 为选自以下的任选经取代的基团 ： C1-6 脂肪族基， 3-10 元脂环族基， 具有 1-5 个 独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具有 1-5 个独立地选自 氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基 ；
Y1 为 S、 O、 NR8， 其中 R8 为氢或任选经取代的 C1-4 脂肪族基 ；
Y2 为 C、 N，
CY 为其中每个出现的 R4 独立地为 -R4a 或 -T1-R4d， 其中 ： 4a
当价数和稳定性允许时， 每个出现的 R 独立地为氟、 ＝ O、 ＝ S、 -CN、 -NO2、 -R4c、 -N(R4b)2、 -OR4b、 -SR4c、 -S(O)2R4c、 -C(O)R4b、 -C(O)OR4b、 -C(O)N(R4b)2、 -S(O)2N(R4b)2、 -OC(O) 4b 4e 4b 4e 4c 4e 4b 4e 4b N(R )2、 -N(R )C(O)R 、 -N(R )SO2R 、 -N(R )C(O)OR 、 -N(R )C(O)N(R )2 或 -N(R4e) SO2N(R4b)2， 或两个出现的 R4b 连同其所键结的氮原子一起形成具有 0-1 个选自氮、 氧或硫的
额外杂原子的任选经取代的 4-7 元杂环基环 ；
每个出现的 R4b 独立地为氢或选自以下的任选经取代的基团 ： C1-C6 脂肪族基， 3-10 元脂环族基， 具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或 具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基 ； 4c
每个出现的 R 独立地为选自以下的任选经取代的基团 ： C1-C6 脂肪族基， 3-10 元 脂环族基， 具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具 有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基 ；
每个出现的 R4d 独立地为氢或选自以下的任选经取代的基团 ： 3-10 元脂环族基， 具 有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具有 1-5 个独立 地选自氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基 ；
每个出现的 R4e 独立地为氢或任选经取代的 C1-6 脂肪族基 ； 且
T1 为 任 选 经 取 代 的 C1-C6 亚 烷 基 链， 其 中 所 述 亚 烷 基 链 任 选 地 杂 有 -N(R4a) -、 -O-、 -S-、 -S(O)-、 -S(O)2-、 -C(O)-、 -C(O)O-、 -C(O)N(R4a)-、 -S(O)2N(R4a)-、 -OC(O) N(R 4a )- 、-N(R 4a )C(O)- 、-N(R 4a )SO 2 - 、-N(R 4a )C(O)O- 、-NR 4a C(O)N(R 4a )- 、-N(R 4a ) S(O)2N(R4a)-、 -OC(O)- 或 -C(O)N(R4a)-O- 或其中 T1 或其一部分任选地形成任选经取代的 3-7 元脂环族或杂环基环的一部分 ；
n 为 0-6 ；
m为1或2；
p 为 0、 1或2；
表示单键或双键 ； 且
条件是所述式 I 化合物不为 4-[5-(4， 5- 二苯基 -1H- 咪唑 -2- 基 )-2- 噻吩基 ]- 吗 啉。
2. 化合物和定义 ：本发明的化合物包括对于上式 I 一般描述的化合物， 且进一步通过本文所揭示的 类别、 亚类和种类来说明。除非另有指示， 否则如本文中所用， 将应用以下定义。
如本文所述， 本发明的化合物可任选经一个或一个以上取代基取代， 诸如上文一 般说明的， 或如通过本发明的特定类别、 亚类和种类所示范。应了解， 短语 “任选经取代” 可 与短语 “经取代或未经取代” 互换使用。一般来说， 术语 “经取代” 无论之前是否有术语 “任 选” 意思都是指定部分的氢基经指定取代基的基团置换， 条件是所述取代产生稳定或化学 上可行的化合物。术语 “可取代” 在提及指定原子使用时意思是氢基连接于此原子， 所述氢 原子可经合适取代基的基团置换。除非另有指示， 否则 “任选经取代” 的基团在基团的各可 取代位置可具有取代基， 且当任何特定结构中的一个以上位置可经一个以上选自指定基团 的取代基取代时， 所述取代基在各位置可为相同或不同。本发明所预见的取代基组合优选 为使得形成稳定或化学上可行的化合物的组合。
稳定化合物或化学上可行的化合物是当在约 -80℃到约 +40℃温度下、 在无水分 或其它化学反应条件存在下保持至少一周时， 化学结构实质上不改变的化合物， 或维持完 整性足够长的时间以适用于治疗性或预防性投与患者的化合物。
如本文中所使用， 短语 “一个或一个以上取代基” 是指等于根据可用键结位点数目 而可能的一个到最大数目的取代基的许多取代基， 条件是符合稳定性和化学可行性的上述 条件。 如本文中所使用， 术语 “独立地选择” 意思是单一化合物中给定变量的多个情形可 选择相同或不同值。
如本文中所使用， “具有 0-3 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 3-7 元饱和、 部分 不饱和或芳香族单环或具有 0-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 8-10 元部分不饱和或 芳香族双环系统” 包括脂环族、 杂环、 芳基和杂芳基环。
如本文中所使用， 术语 “芳香族” 包括如下文和本文一般描述的芳基和杂芳基。
如本文中所使用， 术语 “脂肪族” 或 “脂肪族基” 意思是任选经取代的直链或分支链 C1-12 烃或环状 C1-12 烃， 其为完全饱和或其含有一个或一个以上不饱和单元， 但其不为芳香族 ( 本文中也称为 “碳环” 、 “脂环族” 、 “环烷基” 或 “环烯基” )。举例来说， 合适的脂肪族基包 括任选经取代的直链、 分支链或环状烷基、 烯基、 炔基和其杂合物， 诸如 ( 环烷基 ) 烷基、 (环 烯基 ) 烷基或 ( 环烷基 ) 烯基。除非另外规定， 否则在各种实施例中， 脂肪族基具有 1-12、 1-10、 1-8、 1-6、 1-4、 1-3 或 1-2 个碳原子。
术语 “烷基” 在单独使用或作为较大部分的一部分使用时是指具有 1-12、 1-10、 1-8、 1-6、 1-4、 1-3 或 1-2 个碳原子的任选经取代的直链或分支链烃基。
术语 “烯基” 在单独使用或作为较大部分的一部分使用时是指具有至少一个双键 且具有 2-12、 2-10、 2-8、 2-6、 2-4 或 2-3 个碳原子的任选经取代的直链或分支链烃基。
术语 “炔基” 在单独使用或作为较大部分的一部分使用时是指具有至少一个三键 且具有 2-12、 2-10、 2-8、 2-6、 2-4 或 2-3 个碳原子的任选经取代的直链或分支链烃基。
术语 “脂 环 族” 、 “碳 环 (carbocycle/carbocyclic)” 、 “碳 环 基 (carbocyclyl/ carbocyclo)” 在单独使用或作为较大部分的一部分使用时是指具有 3 到约 14 个环碳原子 的任选经取代的饱和或部分不饱和环状脂肪族环系统。在一些实施例中， 脂环族基为具有 3-8 个或 3-6 个环碳原子的任选经取代的单环烃。脂环族基包括 ( 但不限于 ) 任选经取代
的环丙基、 环丁基、 环戊基、 环戊烯基、 环己基、 环己烯基、 环庚基、 环庚烯基、 环辛基、 环辛烯 基或环辛二烯基。术语 “脂环族” “碳环” 、 “碳环基” 、 还包括具有 6-12、 6-10 或 6-8 个环碳原 子的任选经取代的桥式或稠合双环， 其中双环系统中的任何个别环具有 3-8 个环碳原子。
术语 “环烷基” 是指具有约 3 到约 10 个环碳原子的任选经取代的饱和环系统。示 范性单环环烷基环包括环丙基、 环丁基、 环戊基、 环己基和环庚基。
术语 “环烯基” 是指含有至少一个碳 - 碳双键且具有约 3 到约 10 个碳原子的任选 经取代的非芳香族单环或多环环系统。示范性单环环烯基环包括环戊基、 环己烯基和环庚 烯基。
术语 “卤脂肪族” 、 “卤烷基” 、 “卤烯基” 和 “卤烷氧基” 是指视情况而定经一个或一 个以上卤素原子取代的脂肪族、 烷基、 烯基或烷氧基。如本文中所使用， 术语 “卤素” 或 “卤 基” 意思是 F、 Cl、 Br 或 I。术语 “氟脂肪族” 是指卤素为氟基的卤脂肪族， 包括全氟化脂肪 族基。氟脂肪族基的实例包括 ( 但不限于 ) 氟甲基、 二氟甲基、 三氟甲基、 2- 氟乙基、 2， 2， 2- 三氟乙基、 1， 1， 2- 三氟乙基、 1， 2， 2- 三氟乙基和五氟乙基。
术语 “杂原子” 是指氧、 硫、 氮、 磷或硅中的一个或一个以上 ( 包括氮、 硫、 磷或硅 的任何氧化形式 ； 任何碱性氮的季铵化形式， 或； 杂环的可取代氮， 例如 N( 如在 3， 4- 二 + 氢 -2H- 吡咯基中 )、 NH( 如在吡咯烷基中 ) 或 NR ( 如在 N 上经取代的吡咯烷基中 ))。
术语 “芳基” 和 “芳 (ar-)” 在单独使用或作为较大部分的一部分使用 ( 例如 “芳烷 基” 、 “芳烷氧基” 或 “芳氧基烷基” ) 时是指包含一个到三个芳香环的任选经取代的 C6-14 芳 香族烃部分。芳基优选为 C6-10 芳基。芳基包括 ( 但不限于 ) 任选经取代的苯基、 萘基或蒽 基。如本文中所使用， 术语 “芳基” 和 “芳 (ar-)” 还包括芳基环与一个或一个以上脂环族环 稠合形成任选经取代的环状结构 ( 诸如四氢萘基、 茚基或二氢茚基环 ) 的基团。术语 “芳基 (aryl)” 可与术语 “芳基 (aryl group)” 、 “芳基环” 和 “芳香环” 互换使用。
“芳烷基” 或 “芳基烷基” 包含共价连接于烷基的芳基， 两者都独立地任选经取代。 芳烷基优选为 C6-10 芳基 C1-6 烷基， 包括 ( 但不限于 ) 苯甲基、 苯乙基和萘基甲基。
术语 “杂芳基” 和 “杂芳 (heteroar-)” 在单独使用或作为较大部分的一部分使用 ( 例如 “杂芳烷基” 或 “杂芳烷氧基” ) 时是指如下基团 ： 具有 5 到 14 个环原子， 优选 5、 6、 9 或 10 个环原子 ； 具有 6、 10 或 14 个参与环状阵列的 π 电子 ； 且除碳原子外具有 1 到 5 个 杂原子。杂芳基可为单环、 双环、 三环或多环， 优选为单环、 双环或三环， 更优选为单环或双 环。术语 “杂原子” 是指氮、 氧或硫， 且包括氮或硫的任何氧化形式， 和碱性氮的任何季铵化 形式。举例来说， 杂芳基的氮原子可为碱性氮原子且也可任选地氧化为相应 N- 氧化物。当 杂芳基经羟基取代时， 其还包括其相应互变异构体。如本文中所使用， 术语 “杂芳基” 和 “杂 芳” 还包括杂芳香环与一个或一个以上芳基、 脂环族或杂脂环族环稠合的基团。杂芳基的 非限制性实例包括噻吩基、 呋喃基、 吡咯基、 咪唑基、 吡唑基、 三唑基、 四唑基、 噁唑基、 异噁 唑基、 噁二唑基、 噻唑基、 异噻唑基、 噻二唑基、 吡啶基、 哒嗪基、 嘧啶基、 吡嗪基、 吲嗪基、 嘌 呤基、 萘啶基、 喋啶基、 吲哚基、 异吲哚基、 苯并噻吩基、 苯并呋喃基、 二苯并呋喃基、 吲唑基、 苯并咪唑基、 苯并噻唑基、 喹啉基、 异喹啉基、 噌啉基、 酞嗪基、 喹唑啉基、 喹喏啉基、 4H- 喹嗪 基、 咔唑基、 吖啶基、 吩嗪基、 吩噻嗪基、 吩噁嗪基、 四氢喹啉基、 四氢异喹啉基和吡啶并 [2， 3-b]-1， 4- 噁嗪 -3(4H)- 酮。术语 “杂芳基 (heteroaryl)” 可与术语 “杂芳基环” 、 “杂芳基 (heteroaryl group)” 或 “杂芳香族” 互换使用， 所述术语中的任一者包括任选经取代的环。术语 “杂芳烷基” 是指经杂芳基取代的烷基， 其中所述烷基和杂芳基部分独立地任选经取 代。
如 本 文 中 所 使 用， 术语 “杂 环 (heterocycle/heterocyclic ring)” 、 “杂 环 基 (heterocyclyl/heterocyclic radical)” 可互换使用且是指饱和或部分不饱和且除碳原 子外具有一个或一个以上 ( 优选一个到四个 ) 如上文所定义的杂原子的稳定的 3 到 8 元单 环或 7-10 元双环杂环部分。当提及杂环的环原子使用时， 术语 “氮” 包括经取代的氮。举 例来说， 在具有 0-3 个选自氧、 硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中， 所述氮可为 N( 如 + 在 3， 4- 二氢 -2H- 吡咯基中 )、 NH( 如在吡咯烷基中 ) 或 NR ( 如在 N 上经取代的吡咯烷基 中 )。
杂环可以任何杂原子或碳原子连接于其侧基， 产生稳定结构， 并且任一环原子可 任选经取代。这些饱和或部分不饱和杂环基的实例包括 ( 但不限于 ) 四氢呋喃基、 四氢噻 吩基、 哌啶基、 十氢喹啉基、 噁唑烷基、 哌嗪基、 二氧杂环己烷基、 二氧戊环基、 二氮杂卓基、 氧氮杂卓基、 硫氮杂卓基、 吗啉基和硫吗啉基。杂环基可为单环、 双环、 三环或多环， 优选为 单环、 双环或三环， 更优选为单环或双环。术语 “杂环基烷基” 是指经杂环基取代的烷基， 其 中所述烷基和杂环基部分独立地任选经取代。另外， 杂环还包括杂环与一个或一个以上芳 基环稠合的基团。
如本文中所使用， 术语 “部分不饱和” 是指在环原子之间包括至少一个双键或三键 的环部分。术语 “部分不饱和” 打算涵盖具有多个不饱和位点的环， 但不打算包括如本文所 定义的芳香族 ( 例如芳基或杂芳基 ) 部分。
术语 “亚烷基” 是指二价烷基。 “亚烷基链” 是聚亚甲基， 即 -(CH2)n-， 其中 n 为正 整数， 优选为 1 到 6、 1 到 4、 1 到 3、 1 到 2 或 2 到 3。任选经取代的亚烷基链是一个或一个以 上亚甲基氢原子任选经取代基置换的聚亚甲基。 合适的取代基包括下文对于经取代的脂肪 族基所述的取代基并且还包括本文说明书中所述的取代基。 应了解亚烷基的两个取代基可 一起形成环系统。在某些实施例中， 两个取代基可一起形成 3-7 元环。所述取代基可位于 同一原子或不同原子上。
亚烷基链还可任选杂有官能团。当内部亚甲基单元杂有官能团时， 亚烷基链 “杂 有” 所述官能团。合适的 “杂有的官能团” 的实例描述于本文说明书和权利要求书中。
为了清楚起见， 本文所述的所有二价基团 ( 包括例如上述亚烷基链键联基团 ) 都 打算从左到右读， 存在变量的化学式或结构相应从左到右读。
芳基 ( 包括芳烷基、 芳烷氧基、 芳氧基烷基等 ) 或杂芳基 ( 包括杂芳烷基和杂芳 烷氧基等 ) 可含有一个或一个以上取代基且因此可 “任选经取代” 。除上文和本文所定 义的取代基外， 芳基或杂芳基的不饱和碳原子上的合适取代基还包括且一般选自以下基 团： - 卤基、 -NO2、 -CN、 -R+、 -C(R+) ＝ C(R+)2、 -C ≡ C-R+、 -OR+、 -SR°、 -S(O)R°、 -SO2R°、 + + + + + + + + + + + + SO3R 、 -SO2N(R )2、 -N(R )2、 -NR C(O)R 、 -NR C(S)R 、 -NR C(O)N(R )2、 -NR C(S)N(R )2、 -N(R ) + + + + + + + + + C( ＝ NR )-N(R )2、 -N(R )C( ＝ NR )-R °、 -NR CO2R 、 -NR SO2R °、 -NR SO2N(R )2、 -O-C(O) + + + + + + + R、 -O-CO2R 、 -OC(O)N(R )2、 -C(O)R 、 -C(S)R°、 -CO2R 、 -C(O)-C(O)R 、 -C(O)N(R )2、 -C(S) + + + + + + + + + + N(R )2、 -C(O)N(R )-OR 、 -C(O)N(R )C( ＝ NR )-N(R )2、 -N(R )C( ＝ NR )-N(R )-C(O)R 、 -C( ＝ + + + + + + + + + + NR )-N(R )2、 -C( ＝ NR )-OR 、 -N(R )-N(R )2、 -C( ＝ NR )-N(R )-OR 、 -C(R° ) ＝ N-OR 、 -P(O) + + + + + + (R )2、 -P(O)(OR )2、 -O-P(O)-OR 和 -P(O)(NR )-N(R )2， 其中 R 独立地为氢或任选经取代的脂肪族基、 芳基、 杂芳基、 脂环族基或杂环基， 或两个独立出现的 R+ 连同其插入的原子一起 形成任选经取代的 5-7 元芳基、 杂芳基、 脂环族或杂环基环。各 R°为任选经取代的脂肪族 基、 芳基、 杂芳基、 脂环族基或杂环基。
脂肪族或杂脂肪族基或非芳香族碳环或杂环可含有一个或一个以上取代基且因 此可 “任选经取代” 。除非上文和本文另有规定， 否则脂肪族或杂脂肪族基或非芳香族碳环 或杂环的饱和碳上的合适取代基选自上文对于芳基或杂芳基的不饱和碳所列的取代基且 另外包括以下 ： ＝ O、 ＝ S、 ＝ C(R*)2、 ＝ N-N(R*)2、 ＝ N-OR*、 ＝ N-NHC(O)R*、 ＝ N-NHCO2R°、 ＝ * * N-NHSO2R°或＝ N-R ， 其中 R°如上文所定义， 且各 R 独立地选自氢或任选经取代的 C1-6 脂 肪族基。
除 上 文 和 本 文 所 定 义 的 取 代 基 外， 非芳香族杂环的氮上的任选取代基 + + 还 包 括 且 一 般 选 自 -R 、 -N(R )2、 -C(O)R+、 -C(O)OR+、 -C(O)C(O)R+、 -C(O)CH2C(O) + + + + + + + R、 -S(O)2R 、 -S(O)2N(R )2、 -C(S)N(R )2、 -C( ＝ NH)-N(R )2 或 -N(R )S(O)2R ； 其中各 R+ 如上 文所定义。杂芳基或非芳香族杂环的环氮原子也可氧化形成相应 N- 羟基或 N- 氧化物化合 物。所述具有氧化环氮原子的杂芳基的非限制性实例是 N- 氧化吡啶基。
如上文所详述， 在一些实施例中， 两个独立出现的 R+( 或本文说明书和权利要求书 中类似定义的任何其它变量 ) 连同其插入的原子一起形成选自以下的单环或双环 ： 3-13 元 脂环族基， 具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 3-12 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具 有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基。
当两个独立出现的 R+( 或本文说明书和权利要求书中类似定义的任何其它变 量 ) 连同其插入的原子一起时所形成的示范性环包括 ( 但不限于 ) 以下 ： a) 两个独立出 + 现的 R ( 或本文说明书或权利要求书中类似定义的任何其它变量 ) 结合于同一原子且连 同此原子一起形成环， 例如 N(R+)2， 其中两个出现的 R+ 连同氮原子一起形成哌啶 -1- 基、 哌 + 嗪 -1- 基或吗啉 -4- 基 ； 和 b) 两个独立出现的 R ( 或本文说明书或权利要求书中类似定义 的任何其它变量 ) 结合于不同原子且连同这两个原子一起形成环， 例如其中苯基经两个出 现的 OR+ 取代， 这两个出现的 R+ 连同其所键结的氧原子一起形成稠合 6 元含氧环 ：应了解当两个独立出现的 R+( 或本文说明书和权利要求书中类似定义的任何其它变量 ) 连同其插入的原子一起时， 可形成各种其它环 ( 例如螺环和桥环 )， 且 上文所详述的实例不打算有所限制。 除非另有规定， 否则本文所述的结构还打算包括所述结构的所有异构 ( 例如对映 异构、 非对映异构和几何 ( 或构象 )) 形式 ； 举例来说， 各不对称中心的 R 和 S 构型、 (Z) 和 (E) 双键异构体以及 (Z) 和 (E) 构象异构体。 因此， 本发明化合物的单一立体化学异构体以 及对映异构、 非对映异构和几何 ( 或构象 ) 混合物在本发明的范围内。除非另有规定， 否则 本发明的化合物的所有互变异构形式都在本发明的范围内。 另外， 除非另有规定， 否则本文 所述的结构还打算包括不同之处仅为存在一个或一个以上同位素富集原子的化合物。 举例 13 14 来说， 具有本发明结构但由氘或氚置换氢或由 C 或 C 富集碳置换碳的化合物在本发明的
范围内。所述化合物适用作例如生物测定中的分析工具或探针。
应了解， 当所揭示的化合物具有至少一个手性中心时， 本发明涵盖不含相应光学 异构体的抑制剂的一种对映异构体， 抑制剂的外消旋混合物， 和相对于相应光学异构体富 集一种对映异构体的混合物。当混合物相对于光学异构体富集一种对映异构体时， 所述混 合物含有例如至少 50％、 75％、 90％、 95％ 99％或 99.5％的对映异构过量。
本发明的对映异构体可通过所属领域的技术人员已知的方法拆分， 例如通过形成 可例如通过结晶分离的非对映异构盐 ； 形成可例如通过结晶、 气相 - 液相或液相色谱法分 离的非对映异构衍生物或络合物 ； 使一种对映异构体与对映异构体特异性试剂选择性反 应， 例如酶促酯化 ； 或在手性环境下气相 - 液相或液相色谱法， 例如在手性载体 ( 例如结合 有手性配位体的二氧化硅 ) 上或在手性溶剂存在下。当所需对映异构体通过上述分离程序 之一而转化为另一化学实体时， 需要另一步骤来释放所需对映异构形式。 或者， 特定对映异 构体可通过使用光学活性剂、 底物、 催化剂或溶剂进行不对称合成， 或通过使用不对称转化 使一种对映异构体转化为另一种对映异构体来合成。
当所揭示的化合物具有至少两个手性中心时， 本发明涵盖不含其它非对映异构体 的非对映异构体、 不含其它非对映异构对的非对映异构体对、 非对映异构体混合物、 非对映 异构对混合物、 一种非对映异构体相对于其它非对映异构体富集的非对映异构体混合物、 和一种非对映异构对相对于其它非对映异构对富集的非对映异构对混合物。 当混合物相对 于其它非对映异构体或非对映异构对富集一种 ( 或多种 ) 非对映异构体或非对映异构对 时， 对于化合物来说， 所述混合物相对于其它非对映异构体或非对映异构对富含所述或所 提及的非对映异构体或非对映异构对， 例如至少 50％、 75％、 90％、 95％、 99％或 99.5％的 摩尔过量。
非对映异构对可通过所属领域的技术人员已知的方法 ( 例如色谱法或结晶 ) 来分 离且每一对中的个别对映异构体可如上文所述来分离。 本文实例提供用于以色谱法分离在 制备本文所揭示的化合物中所用的前体的非对映异构对的特定程序。
3. 示范性化合物的描述 ：
在某些实施例中， 对于通式 I 化合物， 一个或一个以上取代基选自 ：
(a)Y1 为 S ；
(b)Y2 为 C
(c)R1 为 CN 或 H ；
(d)R2 为任选经取代的 6-10 元芳基或具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子 的 5-10 元杂芳基 ；
(e)n 为 0-2 ； 或 4 4a
(f)R 为 -R 。
在一些实施例中， 式 I 化合物由以下表示 ：
而在其它实施例中， R2 为 3-10 元脂环族基， 具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂 原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 9 9 9a 元杂芳基， 其任选经 1-4 个独立出现的 R 取代， 其中 R 为 -R 、 -T2-R9d 或 -V2-T2-R9d， 且： 9a 9c 9b 9b 9c
每个出现的 R 独立地为卤素、 -CN、 -NO2、 -R 、 -N(R )2、 -OR 、 -SR 、 -S(O)2R9c、 9b 9b 9b 9b 9b 9e 9b 9e C(O)R 、 -C(O)OR 、 -C(O)N(R )2、 -S(O)2N(R )2、 -OC(O)N(R )2、 -N(R )C(O)R 、 -N(R ) 9c 9e 9b 9e 9b 9e 9b 9b SO2R 、 -N(R )C(O)OR 、 -N(R )C(O)N(R )2 或 -N(R )SO2N(R )2， 或两个出现的 R 连同其所 键结的氮原子一起形成具有 0-1 个选自氮、 氧或硫的额外杂原子的任选经取代的 4-7 元杂 环基环 ；
每个出现的 R9b 独立地为氢或选自以下的任选经取代的基团 ： C1-C6 脂肪族基， 3-10 元脂环族基， 具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或 具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基 ； 9c
每个出现的 R 独立地为选自以下的任选经取代的基团 ： C1-C6 脂肪族基， 3-10 元 脂环族基， 具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具 有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基 ；
每个出现的 R9d 独立地为氢或选自以下的任选经取代的基团 ： 3-10 元脂环族基， 具 有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具有 1-5 个独立 地选自氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基 ；
每个出现的 R9e 独立地为氢或任选经取代的 C1-6 脂肪族基 ；
每 个 出 现 的 V2 独 立 地 为 -N(R9e)-、 -O-、 -S-、 -S(O)-、 -S(O)2-、 -C(O)-、 -C(O) 9e 9e 9e 9e 9e 9e -S(O)2N(R )-、 -OC(O)N(R )-、 -N(R )C(O)-、 -N(R )SO2-、 -N(R )C(O) O-、 -C(O)N(R )-、 9e 9e 9e 9e 9e O-、 -NR C(O)N(R )-、 -N(R )SO2N(R )-、 -OC(O)- 或 -C(O)N(R )-O- ； 且
T2 为 任 选 经 取 代 的 C1-C6 亚 烷 基 链， 其 中 所 述 亚 烷 基 链 任 选 杂 有 -N(R7a)
、 -O-、 -S-、 -S(O)-、 -S(O) 2-、 -C(O)-、 -C(O)O-、 -C(O)N(R 7a)-、 -S(O)2N(R7a)-、 -OC(O) 7a 7a 7a 7a 7a 7a N(R )- 、-N(R )C(O)- 、-N(R )SO 2 - 、-N(R )C(O)O- 、-NR C(O)N(R )- 、-N(R 7a ) S(O)2N(R7a)-、 -OC(O)- 或 -C(O)N(R7a)-O-， 或其中 T3 或其一部分任选地形成任选经取代的 3-7 元脂环族或杂环基环的一部分。
而在其它实施例中， Y1 为 S， Y2 为 C 且化合物由式 II 表示 ：
其中 R1 为 CN 或 H。
又在其它实施例中， R2 为任选经取代的 3-10 元脂环族基， 具有 1-5 个独立地选自 氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的 杂原子的 5-10 元杂芳基 ；
n 为 0-2 ； 且 4 4a
R 为 -R 。
在其它实施例中， 式 I 化合物由以下表示 ：
在其它实施例中， 对于上文刚刚所述的化合物， R2 为 3-10 元脂环族基， 具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具有 1-5 个独立地 选自氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基， 其任选经 1-4 个独立出现的 R9 取代， 其中 R9 为 -R9a、 -T2-R9d 或 -V2-T2-R9d， 且： 9a
每个出现的 R 独立地为卤素、 -CN、 -NO2、 -R9c、 -N(R9b)2、 -OR9b、 -SR9c、 -S(O)2R9c、 9b 9b 9b 9b 9b 9e 9b 9e C(O)R 、 -C(O)OR 、 -C(O)N(R )2、 -S(O)2N(R )2、 -OC(O)N(R )2、 -N(R )C(O)R 、 -N(R ) 9c 9e 9b 9e 9b 9e 9b 9b SO2R 、 -N(R )C(O)OR 、 -N(R )C(O)N(R )2 或 -N(R )SO2N(R )2， 或两个出现的 R 连同其所 键结的氮原子一起形成具有 0-1 个选自氮、 氧或硫的额外杂原子的任选经取代的 4-7 元杂 环基环 ；
每个出现的 R9b 独立地为氢或选自以下的任选经取代的基团 ： C1-C6 脂肪族基， 3-10 元脂环族基， 具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或 具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基 ； 9c
每个出现的 R 独立地为选自以下的任选经取代的基团 ： C1-C6 脂肪族基， 3-10 元 脂环族基， 具有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具 有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基 ； 9d
每个出现的 R 独立地为氢或选自以下的任选经取代的基团 ： 3-10 元脂环族基， 具 有 1-5 个独立地选自氮、 氧或硫的杂原子的 4-10 元杂环基， 6-10 元芳基， 或具有 1-5 个独立 地选自氮、 氧或硫的杂原子的 5-10 元杂芳基 ；
每个出现的 R9e 独立地为氢或任选经取代的 C1-6 脂肪族基 ；
每 个 出 现 的 V2 独 立 地 为 -N(R9e)-、 -O-、 -S-、 -S(O)-、 -S(O)2-、 -C(O)-、 -C(O) 9e 9e 9e 9e 9e 9e O-、 -C(O)N(R )-、 -S(O)2N(R )-、 -OC(O)N(R )-、 -N(R )C(O)-、 -N(R )SO2-、 -N(R )C(O) 9e 9e 9e 9e 9e O-、 -NR C(O)N(R )-、 -N(R )SO2N(R )-、 -OC(O)- 或 -C(O)N(R )-O- ； 且
T2 为 任 选 经 取 代 的 C1-C6 亚 烷 基 链， 其 中 所 述 亚 烷 基 链 任 选 杂 有 -N(R7a)、 -O- 、 -S- 、 -S(O)- 、 -S(O) 2- 、 -C(O)- 、 -C(O)O 、 -C(O)N(R 7a)- 、 -S(O) 2N(R 7a)- 、 -OC(O) 7a 7a 7a 7a 7a 7a N(R )- 、-N(R )C(O)- 、-N(R )SO 2 - 、-N(R )C(O)O- 、-NR C(O)N(R )- 、-N(R 7a ) S(O)2N(R7a)-、 -OC(O)- 或 -C(O)N(R7a)-O-， 或其中 T3 或其一部分任选地形成任选经取代的 3-7 元脂环族或杂环基环的一部分。
在其它实施例中， R2 为经 1-3 个独立出现的以下基团取代的苯基 ： 卤素、 -CN、 -NO2、 9c 9b 9b 9c 9c 9b 9b 9b 9b -R 、 -N(R )2、 -OR 、 -SR 、 -S(O)2R 、 -C(O)R 、 -C(O)OR 、 -C(O)N(R )2、 -S(O)2N(R )2、 -OC(O) 9b 9e 9b 9e 9c 9e 9b 9e 9b N(R )2、 -N(R )C(O)R 、 -N(R )SO2R 、 -N(R )C(O)OR 、 -N(R )C(O)N(R )2 或 -N(R9e) SO2N(R9b)2 ；
R3 为氢、 C1-4 烷基或 C1-4 氟烷基 ； 且
n 为 0。
在其它实施例中， R2 为经 1-3 个独立出现的卤基、 C1-3 烷基、 CN、 C1-3 卤烷基、 -OC1-3 烷基、 -OC1-3 卤烷基、 -NHC(O)C1-3 烷基、 -NHC(O)NHC1-3 烷基、 NHS(O)2C1-3 烷基或 -COH 取代的 苯基。
下表 1 描述某些示范性式 I 化合物 ：
表1： 示范性式 I 化合物 ：
4 通用合成方法和中间物 ：
本发明的化合物可通过所属领域的技术人员已知的方法和 / 或参考以下所示的 流程和以下合成实例来制备。示范性合成途径如以下流程 1-11 和实例中所陈述。
流程 1 ： 用于合成 3- 经取代的 4- 氰基 -5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 三唑的通用途径
以上流程 1 展示用于制备式 (vii) 化合物的通用途径。如流程 1 中所示， 酰胺 i 转化为硫代酰胺 ii 可使用合适的试剂 ( 诸如劳森试剂 (Lawesson′ s reagent))， 在 THF 中完成 ( 方法 A)。可在适当碱 ( 诸如 DIPEA) 存在下， 在 ACN 中使硫代酰胺 ii 与酰氯偶合 ( 方法 B)， 得到式 iii 化合物， 其随后可在使用微波辐射的一锅法 (one-pot process) 中与 合适的 α- 卤乙酸酯 ( 诸如乙酸碘乙酯或乙酸溴乙酯 ) 偶合， 得到经取代的噻吩 iv( 方法 C)。可在使用共溶剂 ( 诸如 THF 和 MeOH) 的水性条件下， 使用合适的碱 ( 诸如 NaOH) 水解 酯 iv， 得到羧酸 v( 方法 D)。可通过在 DCM 中使用合适的偶合剂 ( 诸如 EDCI 和 HOBT) 使化 合物 v 与氨偶合来获得酰胺 vi( 方法 E)。在微波辐射下用 DMFDMA 处理化合物 vi 产生中间 物烯胺， 在微波辐射下， 在乙酸中使用肼使其转化为三唑 vii。
流程 2 ： 3- 经取代的 4- 氰基 -5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 三唑的替代性合成
以上流程 2 展示用于制备式 (iv) 化合物的通用途径。 如流程 2 中所示， 在高温下， 在合适的碱 ( 诸如 TEA) 存在下， 在 MeOH 中用硫代乙酸乙酯处理 viii， 得到 ix( 方法 G)， 在 ACN 中使用适当试剂 ( 诸如碘代甲烷和亚硝酸戊酯 ) 使其经受山德迈尔反应 (Sandmeyer reaction)( 方法 H)。接着在 DCM 中使用适当氧化剂 ( 诸如 m-CPBA) 将产物 x 氧化为砜 xi( 方法 I)。在高温下， 在 THF 中使用吗啉置换砜 ( 方法 J)， 产生 xii。使用适当催化剂 ( 诸如 Pd(PPh3)4)， 在合适的碱 ( 诸如碳酸钠 ) 存在下， 在 DME- 水混合物中， 在微波条件下 使后一化合物与硼酸铃木偶合 (Suzuki coupling)， 得到式 iv 化合物 ( 方法 K)。如流程 1 中所述使酯 iv 转化为三唑 vii。
流程 3 ： 合成经取代的 4- 氰基 -3- 芳基 -5-( 吗啉 -4- 基 ) 噻吩 -2- 甲酰胺的替 代途径
以上流程 3 展示用于制备式 (xvii) 化合物的通用途径。如流程 3 中所示， 在水性 条件下使用合适的碱 ( 诸如氢氧化钠 ) 水解酯 x， 产生羧酸 xiii( 方法 D)。在 DCM 中使用 适当偶合剂 ( 诸如 EDCI 和 HOBT) 形成酰胺 xiv， 随后用氨水处理 ( 方法 E)。可在 DCM 中使 用合适的氧化剂 ( 诸如 mCPBA) 将硫醚 xiv 氧化为砜 xv( 方法 L)。在 DME/DMA 溶剂混合物 中， 在微波辐射下， 使用芳基硼酸、 Pd 源 ( 诸如 Pd(dba)2)、 配位体 ( 诸如 dpePhos) 和碱 ( 诸 如磷酸钾 ) 的适当组合使后一化合物经受铃木偶合条件， 得到高级式 xvi 中间物 ( 方法 M)。 在高温下用纯的经取代的吗啉处理砜 xvi， 得到式 xvii 的酰胺 ( 方法 N)。如流程 1 中所述 使酰胺 xvii 转化为三唑 vii。
流程 4 ： 用于合成 3- 经取代的 4- 氰基 -5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 咪唑的通用途径以上流程 4 展示用于制备式 (xx) 化合物的通用途径。 如流程 4 中所示， 在 DCM 中， 使用标准偶合条件 ( 诸如 EDCI 和 HOBt)， 用经 Boc 保护的乙二胺处理酸 v。在 DCM 中使用 适当酸 ( 例如 TFA) 去除保护基， 产生酰胺 xviii( 方法 O)。使用合适的条件 ( 例如 POCl3) 使 xviii 环化 ( 方法 P) 且使用合适的氧化方法 ( 诸如斯文氧化 (Swern oxidation)) 将所 形成的二氢咪唑 xix 氧化为咪唑 xx。
流程 5 ： 3- 经取代的 4- 氰基 -5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 咪唑的替代性合成
以上流程 5 展示用于制备式 (xx) 化合物的替代途径。如流程 5 中所示， 使用合 适的合成顺序， 例如通过与 N， O- 二甲基羟基胺偶合且随后用 DIBAL 还原所形成的韦瑞伯 (Weinreb) 酰胺， 使酸 v 转化为醛 ( 方法 R)。接着用二胺和碘处理醛 xxi( 方法 S)， 形成二 氢咪唑 xix， 使用合适的氧化方法 ( 诸如斯文氧化 ) 将其氧化为咪唑 xx( 方法 Q)。
流程 6 ： 用于合成 3- 经取代的 4- 氰基 -5- 吗啉 4- 基噻吩 -2- 咪唑的通用途径
以上流程 6 展示用于制备式 (xxv) 化合物的替代途径。如流程 6 中所示， 使用合 适的合成顺序， 例如通过与 N， O- 二甲基羟基胺偶合且随后用烷基锂试剂处理所形成的韦 瑞伯酰胺， 使酸 v 转化为酮 ( 方法 T)。接着在乙酸中在微波辐射下用溴处理酮 xxii( 方法 U)， 形成二溴酮 xxiii， 使用合适的方法 ( 诸如磷酸二乙酯 ) 和碱 ( 诸如 TEA) 使其还原为溴 酮 xxiv( 方法 V)。在微波辐射下用甲酰胺处理 xxiv， 得到最终咪唑 xxv( 方法 W)。
流程 7 ： 用于合成 3- 经取代的 4- 氰基 -5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 吡唑的通用途径以上流程 7 展示用于制备式 (xxvi) 化合物的通用途径。如流程 7 中所示， 用 DMFDMA 处理酮 xxii， 得到中间物烯胺， 随后在合适的溶剂 ( 例如乙酸 ) 中与水合肼反应， 产 生吡唑 xxvi( 方法 X)。
流程 8 ： 用于合成 3- 经取代的 4- 氰基 -5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 四唑的通用途径
以上流程 8 展示用于制备式 (xxvii) 化合物的通用途径。如流程 8 中所示， 在适 当溶剂 ( 诸如乙腈 ) 中， 用叠氮化物来源 ( 例如叠氮化钠 )， 使用合适的路易斯酸 (Lewis acid)( 例如四氯化硅 ) 处理酰胺 vi， 产生四唑 xxvii( 方法 Y)。
流程 9 ： 用于合成 3- 经取代的 4- 氰基 -5- 二氢吡喃 -4- 基噻吩 -2- 三唑的通用 途径
以上流程 9 展示用于制备式 (xxxiv) 化合物的通用途径。如流程 9 中所示， 在高温下， 在 THF 中， 使用合适的条件 ( 例如 TEA)， 用二甲氧基苯甲基胺处理砜 xi。使用适当催 化剂 ( 诸如 Pd(PPh3)4)， 在合适的碱 ( 诸如碳酸钠 ) 存在下， 在 DME- 水混合物中， 在微波条 件下使后一化合物与硼酸铃木偶合， 得到式 xxix 化合物 ( 方法 K)。在 DCM 中用合适的酸 ( 诸如 TFA) 脱除二甲氧基苯甲基的保护基 ( 方法 AA)。接着在 ACN 中使用适当试剂 ( 诸如 碘代甲烷和亚硝酸戊酯 ) 使胺 xxx 经受山德迈尔反应 ( 方法 H)。可在使用共溶剂 ( 诸如 THF 和 MeOH) 的水性条件下， 使用合适的碱 ( 诸如 NaOH) 水解酯 xxxi， 得到羧酸 ( 方法 D)， 随后在 DCM 中使用合适的偶合剂 ( 诸如 EDCI 和 HOBT) 与氨偶合， 产生酰胺 xxxii( 方法 E)。 在微波辐射下用 DMFDMA 处理酰胺 xxxii， 产生中间物烯胺， 在乙酸中， 在微波辐射下使用肼 使其转化为三唑 xxxiii( 方法 F)。接着可在高温下， 在合适的条件 ( 例如 Pd(PPh3)4、 CuI、 LiCl) 下， 在二噁烷中使化合物 xxxiii 与乙烯基锡烷偶合， 产生二氢吡喃 xxxiv( 方法 AB)。 氢化后一化合物 ( 方法 AC) 可得到四氢吡喃 xxxv。
流程 10 ： 用于合成 4- 经取代 -5-(4H-1， 2， 4- 三唑 -3- 基 )-1， 3- 噻唑 -2- 基 ] 吗 啉的通用途径
以上流程 10 展示用于制备式 (xl) 化合物的通用途径。如流程 10 中所示， 通过用 吗啉处理， 使 2， 4- 二氯噻唑 -5- 甲腈转化为 xxxvii( 方法 AD)， 转而又在微波条件下使用标 准试剂 ( 例如 Pd(PPh3)2Cl2、 碳酸钠 ) 在 DME- 乙醇 - 水混合物中使其经受铃木偶合 ( 方法 K)， 得到式 xxxviii 化合物。使用强酸 ( 诸如硫酸 ) 水解氰基 ( 方法 AE)， 产生酰胺 xxxix， 使用包含在微波辐射下用 DMFDMA、 随后在乙酸中在微波辐射下用肼处理的两步程序使其转 化为三唑 xl( 方法 F)。
流程 11 ： 用于合成经取代的呋喃和吡咯的通用途径X ＝ O 或 X ＝ N(R) 的式 (I) 化合物可由化合物 xliii 制备。式 xliii 化合物的 合成报导于文献中 (M.-C. 费尔南德斯 (Fernandez， M.-C.) ； A. 卡斯塔诺 (Castano， A.) ； 杜蒙库尔兹 (Dominguez， E.) ； A. 埃斯克里巴诺 (Escribano， A.) ； D. 江 (Jiang， D.) ； A. 吉 梅内斯 (Jimenez， A.) ； E. 洪 (Hong， E.) ； W.J. 赫姆巴克 (Homback， W.J.) ； E.S. 尼森巴姆 (Nisenbaum， E.S.) ； N. 阮克尔 (Rankl， N.) ； E. 托米兹克 (Tromiczak， E.) ； G. 渥特 (Vaught， G.) ； H. 扎里马耶 (Zarrinmayeh， H.) ； D.M. 齐默尔曼 (Zimmerman， D.M.) 生物有机化学与医 药化学通讯 (Bioorg.Med.Chem.Lett.)， 2006， 66， 5057-5061)， 且概述于流程 11 中。 脱除丙 腈 xli 的质子， 随后与二硫化碳缩合并随后用碘代甲烷淬灭， 产生式 xlii 化合物。这些化 合物可进一步通过与乙酸溴乙酯环化缩合而转化为呋喃甲酸乙酯 xliii。 类似地， 用甘氨酸 N- 烷基酯处理 xlii， 得到烷基化吡咯甲酸乙酯 xliv。式 xliii 和 xliv 的化合物可进一步 如以上流程 1-9 中所述来精心制成。
5. 用途、 调配物和投药
如上文所论述， 本发明提供适用作 PI3K 酶的抑制剂的化合物， 且因此本发明化合 物适用于治疗增生性、 发炎性或心血管病症， 诸如由 PI3K 介导的肿瘤和 / 或癌细胞生长。 具 体来说， 所述化合物适用于治疗个体的癌症， 包括 ( 但不限于 ) 肺癌和支气管癌、 前列腺癌、 乳癌、 胰脏癌、 结肠直肠癌、 甲状腺癌、 肝癌和肝内胆管癌、 肝细胞癌、 胃癌、 神经胶质瘤 / 胶 质母细胞瘤、 子宫内膜癌、 黑色素瘤、 肾癌和肾盂癌、 膀胱癌、 宫体癌、 子宫颈癌、 卵巢癌、 多 发性骨髓瘤、 食道癌、 急性骨髓性白血病、 慢性骨髓性白血病、 淋巴细胞性白血病、 骨髓白血 病、 脑癌、 口腔癌和咽癌、 小肠癌、 非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin lymphoma) 和绒毛状结肠 腺瘤。
在一些实施例中， 本发明的化合物适合于治疗乳癌、 膀胱癌、 结肠癌、 神经胶质瘤、 胶质母细胞瘤、 肺癌、 肝细胞癌、 胃癌、 黑色素瘤、 甲状腺癌、 子宫内膜癌、 肾癌、 子宫颈癌、 胰 脏癌、 食道癌、 前列腺癌、 脑癌或卵巢癌。
在其它实施例中， 本发明的化合物适合于治疗发炎性和心血管病症， 包括 ( 但不 限于 ) 过敏 / 过敏反应、 急性和慢性炎症、 类风湿性关节炎 ； 自体免疫病症、 血栓形成、 高血 压、 心脏肥大和心脏衰竭。
因此， 在本发明的另一方面中， 提供医药组合物， 其中这些组合物包含任一如本文 所述的化合物， 并且任选地包含医药学上可接受的载剂、 佐剂或媒剂。在某些实施例中， 这
些组合物任选地进一步包含一种或一种以上其它治疗剂。
还应了解本发明的某些化合物可以游离形式存在以用于治疗， 或适当时， 以其医 药学上可接受的衍生物形式存在。 根据本发明， 医药学上可接受的衍生物包括 ( 但不限于 ) 医药学上可接受的前药、 盐、 酯、 所述酯的盐或任何其它加合物或衍生物， 其在投与有需要 的患者后能够直接或间接提供如本文另外所述的化合物或其代谢物或残余物。
如本文中所使用， 术语 “医药学上可接受的盐” 是指在可靠的医学判断范围内适用 于与人类和低等动物的组织接触而无不当毒性、 刺激、 过敏反应等并且与合理的效益 / 风 险比相称的盐。 “医药学上可接受的盐” 意思是本发明的化合物的任何无毒盐或酯的盐， 其 在投与接受者后能够直接或间接提供本发明的化合物或其有抑制活性的代谢物或残余物。 如本文中所使用， 术语 “其有抑制活性的代谢物或残余物” 意思是其代谢物或残余物也是 PI3K 的抑制剂。
医药学上可接受的盐为所属领域所熟知。举例来说， S.M. 伯格 (S.M.Berge) 等人 在医药学杂志 (J.Pharmaceutical Sciences)， 1977， 66， 1-19 中详细描述了医药学上可接 受的盐， 所述文献以引用的方式并入本文中。本发明化合物的医药学上可接受的盐包括衍 生自合适的无机酸和碱以及有机酸和碱的盐。 医药学上可接受的无毒酸加成盐的实例为用 诸如盐酸、 氢溴酸、 磷酸、 硫酸和高氯酸等无机酸或用诸如乙酸、 草酸、 马来酸、 酒石酸、 柠檬 酸、 琥珀酸或丙二酸等有机酸或通过使用所属领域中所用的其它方法 ( 诸如离子交换 ) 所 形成的氨基盐。其它医药学上可接受的盐包括己二酸盐、 海藻酸盐、 抗坏血酸盐、 天冬氨酸 盐、 苯磺酸盐、 苯甲酸盐、 硫酸氢盐、 硼酸盐、 丁酸盐、 樟脑酸盐、 樟脑磺酸盐、 柠檬酸盐、 环戊 烷丙酸盐、 二葡糖酸盐、 十二烷基硫酸盐、 乙烷磺酸盐、 甲酸盐、 富马酸盐、 葡糖庚酸盐、 甘油 磷酸盐、 葡糖酸盐、 半硫酸盐、 庚酸盐、 己酸盐、 氢碘酸盐、 2- 羟基 - 乙烷磺酸盐、 乳糖酸盐、 乳酸盐、 月桂酸盐、 月桂基硫酸盐、 苹果酸盐、 马来酸盐、 丙二酸盐、 甲烷磺酸盐、 2- 萘磺酸 盐、 烟碱酸盐、 硝酸盐、 油酸盐、 草酸盐、 棕榈酸盐、 双羟萘酸盐、 果胶酸盐、 过硫酸盐、 3- 苯基 丙酸盐、 磷酸盐、 苦味酸盐、 特戊酸盐、 丙酸盐、 硬酯酸盐、 琥珀酸盐、 硫酸盐、 酒石酸盐、 硫氰 酸盐、 对甲苯磺酸盐、 十一烷酸盐、 戊酸盐等。衍生自适当碱的盐包括碱金属盐、 碱土金属 + 盐、 铵盐和 N (C1-4 烷基 )4 盐。本发明还预见本文所揭示的化合物的任何含氮碱性基团的季 铵化作用。水溶性或油溶性或可分散性产物可通过所述季铵化作用来获得。代表性碱金属 盐或碱土金属盐包括钠盐、 锂盐、 钾盐、 钙盐、 镁盐等。其它医药学上可接受的盐包括 ( 适当 时 ) 无毒铵盐、 季铵盐和使用诸如卤离子、 氢氧根、 羧酸根、 硫酸根、 磷酸根、 硝酸根、 低碳烷 基磺酸根和芳基磺酸根等平衡离子所形成的胺阳离子盐。
如上文所述， 本发明的医药学上可接受的组合物另外包含医药学上可接受的载 剂、 佐剂或媒剂， 如本文中所用， 所述载剂、 佐剂或媒剂包括适用于所需特定剂型的任何和 所有溶剂、 稀释剂或其它液体媒剂、 分散或悬浮助剂、 表面活性剂、 等渗剂、 增稠剂或乳化 剂、 防腐剂、 固体粘合剂、 润滑剂等。雷明顿医药科学 (Remington ′ s Pharmaceutical Sciences)， 第 16 版， E.W. 马丁 (E.W.Martin)( 宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司 (Mack Publishing Co.， Easton， Pa.)， 1980) 揭示用于调配医药学上可接受的组合物的各种载剂 和制备它们的已知技术。除非任何常规载剂介质与本发明的化合物不相容， 诸如通过产生 任何不合需要的生物作用或另外以有害方式与医药学上可接受的组合物的任何其它组分 相互作用， 否则其使用涵盖在本发明的范围内。可充当医药学上可接受的载剂的物质的一些实例包括 ( 但不限于 ) 离子交换剂 ； 铝； 硬脂酸铝 ； 卵磷脂 ； 血清蛋白， 诸如人血清白蛋 白； 缓冲物质， 诸如磷酸盐、 甘氨酸、 山梨酸或山梨酸钾 ； 饱和植物脂肪酸、 水、 盐或电解质 的偏甘油酯混合物， 诸如硫酸鱼精蛋白 ； 磷酸氢二钠 ； 磷酸氢钾 ； 氯化钠 ； 锌盐 ； 胶状二氧 化硅 ； 三硅酸镁 ； 聚乙烯吡咯烷酮 ； 聚丙烯酸酯 ； 蜡； 聚乙烯 - 聚氧丙烯 - 嵌段聚合物 ； 羊 毛脂 ； 糖， 诸如乳糖、 葡萄糖和蔗糖 ； 淀粉， 诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉 ； 纤维素和其衍生 物， 诸如羧甲基纤维素钠、 乙基纤维素和纤维素乙酸酯 ； 粉末状黄芪胶 ； 麦芽 ； 明胶 ； 滑石 ； 赋形剂， 诸如可可脂和栓剂蜡 ； 油类， 诸如花生油、 棉籽油、 红花油、 芝麻油、 橄榄油、 玉米油 和大豆油 ； 二醇， 诸如丙二醇或聚乙二醇 ； 酯， 诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯 ； 琼脂 ； 缓冲剂， 诸如氢氧化镁和氢氧化铝 ； 海藻酸 ； 无热原质水 ； 等渗生理盐水 ； 林格氏溶液 (Ringer′ s solution) ； 乙醇 ； 和磷酸盐缓冲溶液 ； 以及根据调配者的判断， 其它无毒相容性润滑剂 ( 诸 如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁 )， 以及着色剂、 释放剂、 涂布剂、 甜味剂、 调味剂和芳香剂、 防腐 剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。
在另一方面中， 提供一种治疗增生性、 发炎性或心血管病症的方法， 其包含向有需 要的个体投与有效量的化合物或医药组合物。在本发明的某些实施例中， 化合物或医药组 合物的 “有效量” 是有效治疗增生性、 发炎性或心血管病症的量， 或是有效治疗癌症的量。 在 其它实施例中， 化合物的 “有效量” 是抑制 PI3K 的结合且由此阻断所产生的信号传导级联 的量， 所述信号传导级联会导致生长因子、 受体酪氨酸激酶、 蛋白质丝氨酸 / 苏氨酸激酶、 G 蛋白偶合受体和磷脂激酶与磷酸酶的异常活性。
根据本发明的方法， 化合物和组合物可使用有效治疗疾病的任何量和任何投药途 径来投与。所需的精确量将在个体之间变化， 其视个体的物种、 年龄和总体状况、 感染的严 重程度、 特定药剂、 其投药模式等而定。 本发明的化合物优选调配成单位剂型以便于投药和 剂量均匀性。如本文中所使用， 表述 “单位剂型” 是指适合于待治疗患者的药剂的物理不连 续单位。 然而， 应了解， 本发明的化合物和组合物的总日用量将在可靠医学判断范围内由主 治医生决定。任何特定患者或生物体的特定有效剂量水平将视各种因素而定， 包括所治疗 的病症和病症严重程度 ； 所用特定化合物的活性 ； 所用特定组合物 ； 患者的年龄、 体重、 总 体健康状况、 性别和膳食 ； 投药时间、 投药途径和所用特定化合物的排泄速率 ； 治疗持续时 间； 与所用特定化合物组合或同时使用的药物， 和医学技术中熟知的类似因素。 如本文中所 使用， 术语 “患者” 意指动物， 优选为哺乳动物， 且最优选为人类。
本发明的医药学上可接受的组合物可视所治疗感染的严重程度而定， 经口、 经直 肠、 肠外、 脑池内、 阴道内、 腹膜内、 局部 ( 如以粉剂、 软膏或滴剂形式 )、 经颊、 以口腔或鼻用 喷雾形式等投与人类和其它动物。在某些实施例中， 本发明的化合物可以每日每千克个体 体重约 0.01mg 到约 50mg 且优选从约 1mg 到约 25mg 的剂量经口或肠外投与， 每日一次或一 次以上， 以获得所需治疗作用。
用于经口投与的液体剂型包括 ( 但不限于 ) 医药学上可接受的乳液、 微乳液、 溶 液、 悬浮液、 糖浆和酏剂。除活性化合物外， 液体剂型还可包含所属领域中常用的惰性稀释 剂， 例如水或其它溶剂 ； 增溶剂和乳化剂， 诸如乙醇、 异丙醇、 碳酸乙酯、 乙酸乙酯、 苯甲醇、 苯甲酸苯甲酯、 丙二醇、 1， 3- 丁二醇、 二甲基甲酰胺、 油类 ( 尤其棉籽油、 花生油、 玉米油、 胚 芽油、 橄榄油、 蓖麻油和芝麻油 )、 甘油、 四氢糠醇、 聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯和其 混合物。除惰性稀释剂外， 口服组合物还可包括佐剂， 诸如湿润剂、 乳化剂和悬浮剂、 甜味剂、 调味剂和芳香剂。
可注射制剂 ( 例如无菌可注射水性或油性悬浮液 ) 可根据已知技术， 使用合适的 分散剂或湿润剂和悬浮剂来调配。 无菌可注射制剂也可为在无毒肠外可接受的稀释剂或溶 剂中的无菌可注射溶液、 悬浮液或乳液， 例如呈在 1， 3- 丁二醇中的溶液。可采用的可接受 媒剂和溶剂包括水、 林格氏溶液、 U.S.P. 和等渗氯化钠溶液。另外， 无菌不挥发性油通常用 作溶剂或悬浮介质。 出于这一目的， 可使用任何温和的不挥发性油， 包括合成的单甘油酯或 二甘油酯。此外， 诸如油酸等脂肪酸可用于制备可注射剂。
可注射调配物可例如通过经由截留细菌的过滤器过滤或通过并有杀菌剂来杀菌， 所述杀菌剂呈在使用之前可溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组 合物形式。
为延长本发明化合物的作用， 通常需要减慢化合物从皮下或肌肉内注射的吸收。 这可通过使用具有弱水溶性的结晶或非晶形物质的液体悬浮液来实现。 随后化合物的吸收 速率视其溶解速率而定， 而溶解速度又可视晶体尺寸和结晶形态而定。 或者， 通过使化合物 溶解或悬浮于油性媒剂中来实现肠外投与的化合物形式的延迟吸收。通过在诸如聚丙交 酯 - 聚乙交酯等生物可降解聚合物中形成化合物的微胶囊基质来制备可注射积存形式。视 化合物与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质而定， 可控制释放速率。其它生物可 降解聚合物的实例包括聚 ( 原酸酯 ) 和聚 ( 酸酐 )。还可通过将化合物截留在与身体组织 相容的脂质体或微乳液中来制备积存式可注射调配物。 用于经直肠或经阴道投与的组合物优选为栓剂， 其可通过将本发明的化合物与合 适的无刺激性赋形剂或载剂 ( 诸如可可脂、 聚乙二醇或栓剂蜡 ) 混合来制备， 所述赋形剂或 载剂在环境温度下为固体但在体温下为液体且因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性化 合物。
用于经口投与的固体剂型包括胶囊、 片剂、 药丸、 粉剂和颗粒剂。在所述固体剂型 中， 活性化合物与以下混合 ： 至少一种惰性、 医药学上可接受的赋形剂或载剂， 诸如柠檬酸 钠或磷酸二钙 ； 和 / 或 a) 填充剂或增量剂， 诸如淀粉、 乳糖、 蔗糖、 葡萄糖、 甘露糖醇和硅酸 ； b) 粘合剂， 诸如羧甲基纤维素、 海藻酸盐、 明胶、 聚乙烯吡咯烷酮、 蔗糖和阿拉伯胶 ； c) 保湿 剂， 诸如甘油 ； d) 崩解剂， 诸如琼脂、 碳酸钙、 马铃薯或木薯淀粉、 海藻酸、 某些硅酸盐和碳 酸钠 ； e) 溶解延迟剂， 诸如石蜡 ； f) 吸收促进剂， 诸如季铵化合物 ； g) 湿润剂， 例如鲸蜡醇 和单硬脂酸甘油酯 ； h) 吸附剂， 诸如高岭土和膨润土 ； 和 i) 润滑剂， 诸如滑石、 硬脂酸钙、 硬 脂酸镁、 固体聚乙二醇、 月桂基硫酸钠和其混合物。 在胶囊、 片剂和药丸的情况下， 剂型还可 包含缓冲剂。
类似类型的固体组合物也可用作使用诸如乳糖 (lactose/milk sugar) 以及高分 子量聚乙二醇等赋形剂的经填充的软和硬明胶胶囊中的填充剂。片剂、 糖衣药丸、 胶囊、 药 丸和颗粒剂的固体剂型可制备为具有涂层和外壳， 诸如肠溶衣和医药调配技术中熟知的其 它涂层。 其可任选地含有乳浊剂并且还可具有任选地以延迟方式仅在或优先在肠道的某一 部分中释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。类似类型的 固体组合物也可用作使用诸如乳糖 (lactose/milk sugar) 以及高分子量聚乙二醇等赋形 剂的经填充的软和硬明胶胶囊中的填充剂。
活性化合物还可呈具有一种或一种以上如上文所述的赋形剂的微囊封形式。片剂、 糖衣药丸、 胶囊、 药丸和颗粒剂的固体剂型可制备为具有涂层和外壳， 诸如肠溶衣、 释放 控制涂层和医药调配技术中熟知的其它涂层。在所述固体剂型中， 活性化合物可与至少一 种诸如蔗糖、 乳糖或淀粉等惰性稀释剂混合。所述剂型还可包含 ( 如正常生产时 ) 除惰性 稀释剂外的额外物质， 例如压片润滑剂和其它压片助剂， 诸如硬脂酸镁和微晶纤维素。 在胶 囊、 片剂和药丸的情况下， 剂型还可包含缓冲剂。 其可任选地含有遮光剂且还可具有任选地 以延迟方式仅在或优先在肠道的某一部分中释放活性成分的组合物。 可使用的包埋组合物 的实例包括聚合物和蜡。
用于局部或经皮投与本发明的化合物的剂型包括软膏、 糊剂、 乳膏、 洗剂、 凝胶、 粉 剂、 溶液、 喷雾、 吸入剂或贴片。在无菌条件下将活性组分与医药学上可接受的载剂和任何 所需防腐剂或缓冲液 ( 如可能需要时 ) 混合。眼用调配物、 滴耳剂和滴眼剂也涵盖在本发 明的范围内。 另外， 本发明涵盖使用经皮贴片， 其具有使化合物受控制地传递到身体的额外 优点。所述剂型可通过使化合物溶解或分配于适当介质中来制备。也可使用吸收增强剂来 提高化合物穿过皮肤的通量。 可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或 凝胶中来控制速率。
虽然一种或一种以上本发明化合物可用于单一疗法应用中来治疗病症、 疾病或症 状， 但其也可用于组合疗法中， 其中本发明化合物或组合物 ( 治疗剂 ) 的使用与一种或一种 以上治疗相同和 / 或其它类型的病症、 症状和疾病的其它治疗剂的使用相组合。组合疗法 包括同时或依序投与治疗剂。或者， 治疗剂可组合成被投与患者的一种组合物。
在一个实施例中， 本发明的化合物与其它治疗剂 ( 诸如 PI3K 的其它抑制剂 ) 组合 使用。 在一些实施例中， 本发明的化合物是与选自由细胞毒性剂、 放射疗法和免疫疗法组成 的群组的治疗剂结合投与。应了解可进行其它组合， 而仍在本发明的范围内。
本发明的另一方面涉及抑制生物样品或患者的 PI3K 活性， 所述方法包含向所述 患者投与式 I 化合物或包含所述化合物的组合物， 或使所述生物样品与其接触。如本文中 所使用， 术语 “生物样品” 一般包括体内、 体外和离体物质， 还包括 ( 但不限于 ) 细胞培养物 或其提取物 ； 由哺乳动物或其提取物获得的活检物质 ； 和血液、 唾液、 尿液、 粪便、 精液、 眼 泪或其它体液或其提取物。
本发明的又一方面是提供一种试剂盒， 其包含处于单个包装中的单独容器， 其中 本发明的医药化合物、 组合物和 / 或其盐与医药学上可接受的载剂组合使用以治疗 PI3K 激 酶起作用的病症、 症状和疾病。
实验程序
I. 制备示范性化合物 ：
定义
AcOH 乙酸
ACN 乙腈
ATP 三磷酸腺苷
BCA 二辛可宁酸
BSA 牛血清白蛋白
BOC 叔丁氧羰基
m-CPBA 间氯过苯甲酸DCE DCM DDQ DIPEA DMEM DMF DMFDMA DMSO DPPA DTT dppf EDCI EDTA EtOAc EtOH FA FBS h HATU HBTU HEPES HOBT HRMS LAH LCMS m/z Me MeOH min MS MTT MWI PBS PKA rt TEA TFFA THF TMB二氯乙烷 二氯甲烷 2， 3- 二氯 -5， 6- 二氰基 -1， 4- 苯醌 二异丙基乙胺 杜氏改良伊格尔培养基 (Dulbecco′ s Modified Eagle′ s Medium) N， N- 二甲基甲酰胺 N， N- 二甲基甲酰胺二甲缩醛 二甲亚砜 二苯基磷酰基叠氮化物 二硫苏糖醇 二苯基膦基二茂铁 N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N′ - 乙基碳化二亚胺盐酸盐 乙二胺四乙酸 乙酸乙酯 乙醇 甲酸 胎牛血清 小时 六氟磷酸 N， N， N′， N′ - 四甲基 -o-(7- 氮杂苯并三唑 -1- 基 ) 脲 六氟磷酸 o- 苯并三唑 -1- 基 -N， N， N′， N′ - 四甲基脲 N-(2- 羟基乙基 ) 哌嗪 -N′ -(2- 乙烷磺酸 ) 1- 羟基苯并三唑水合物 高分辨率质谱 氢化锂铝 液相色谱质谱 质荷比 甲基 甲醇 分钟 质谱 甲基噻唑四唑盐 微波辐射 磷酸盐缓冲生理盐水 cAMP 依赖性蛋白激酶 室温 三乙胺 三氟乙酸酐 四氢呋喃 3， 3′， 5， 5′ - 四甲基联苯胺WST(4-[3-(4- 碘苯基 )-2-(4- 硝基苯基 )-2H-5- 四唑基 ]-1， 3- 苯二磺酸钠盐 ) LC-MS 分析方法
LCMS 条件
在惠普 (Hewlett-Packard)HP1100 的 Phenominex Luna 5μm C18 50×4.6mm 管 柱上， 使用以下梯度进行光谱分析 ：
- 甲酸法 (FA) ： 含有 0 到 100％的 0.1％甲酸水溶液的乙腈 ( 以 2.5ml/min 过柱 3 分钟 )。
- 乙酸铵法 (AA) ： 含有 0 到 100％的 10mM 乙酸铵水溶液的乙腈 ( 以 2.5ml/min 过 柱 3 分钟 )。
实例 1 ： 合成 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2- 吗啉 -4- 基 -5-(4H-1， 2， 4- 三唑 -3- 基 ) 噻 吩 -3- 甲腈 ( 化合物 I-25)
步骤 1 ： 3- 吗啉 -4- 基 -3- 硫代丙腈
向 3- 吗啉 -4- 基 -3- 氧代丙腈 (3.0g， 19.5mmol) 的无水 THF(45mL) 溶液中添加劳 森试剂 (4.2g， 10.3mmol)。 使反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 接着浓缩成小体积。 固体沉 淀并过滤。 用乙醚洗涤所述固体， 产生 3- 吗啉 -4- 基 -3- 硫代丙腈 (2.3g， 70％ )。 LCMS ： (AA) 1 ES+171.2。 H NMR(400MHz， d1- 氯仿 )δ ： 4.29-4.27(m， 2H)， 4.00(s， 2H) 和 3.83-3.81(m， 6H)。
步骤 2 和 3 ： 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 甲酸乙酯
使 3- 吗 啉 -4- 基 -3- 硫 代 丙 腈 (0.150g， 0.88mmol) 的 无 水 ACN(1.2mL) 溶 液冷却到 0 ℃。向这一冷却的溶液中添加 2， 4- 二氯苯甲酰氯 (0.149mL， 1.06mmol) 和 DIPEA(0.161mL， 0.93mmol)。使混合物在室温、 氮气下搅拌 15 分钟， 随后添加碘乙酸乙酯
(0.110mL， 0.93mmol) 和 DIPEA(0.161mL， 0.93mmol)。 使反应混合物经受 140℃下的 MWI 历时 10 分钟。冷却混合物并浓缩。通过柱色谱法来纯化残余物， 产生 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯 1 基 )-5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 甲酸乙酯 (0.1g， 28％ )。LCMS ： (AA)ES+411。 H NMR(400MHz， d1- 氯仿 )δ ： 7.49(d， 1H)， 7.33(dd， 1H)， 7.20(d， 1H)， 4.16-4.08(m， 2H)， 3.89-3.85(m， 4H)， 3.66-3.63(m， 4H) 和 1.12(t， 3H)。
步骤 4 ： 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 甲酸
向 4- 氰 基 -3-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-5- 吗 啉 -4- 基 噻 吩 -2- 甲 酸 乙 酯 (0.060g， 0.15mmol) 的 THF/MeOH/ 水 (2 ∶ 1 ∶ 2)(5mL) 溶液中添加氢氧化钠 (0.061g， 1.5mmol)。 使 反应混合物在室温下搅拌 20 小时并浓缩。用 1N HCl 酸化残余物且用 EtOAc 萃取。合并有 机溶液， 用盐水洗涤， 经 MgSO4 干燥， 过滤并浓缩， 产生 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 吗 1 啉 -4- 基噻吩 -2- 甲酸 (0.034g， 62％ )。LCMS ： (FA)ES+382.9。 H NMR(400MHz， d6-DMSO) δ： 7.75(d， 1H)， 7.50(dd， 1H)， 7.39(d， 1H)， 3.79-3.74(m， 4H) 和 3.61-3.55(m， 4H)。
步骤 5 ： 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 甲酰胺
使 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 甲酸 (0.050g， 0.13mmol)、 HOBT(0.037g， 0.274mmol) 和 EDCI(50mg， 0.261mmol) 悬浮于 DCM(6.5mL) 中。30 分钟后， 试 剂溶解。向所得溶液中添加浓氨水 (0.26mL， 6.5mmol) 且使溶液在室温下有力地搅拌过夜。 浓缩反应混合物且用 1N HCl 稀释残余物并用 EtOAc 萃取。合并有机溶液， 用饱和 NaHCO3 和盐水洗涤， 经 MgSO4 干燥， 过滤并浓缩， 产生棕色固体。用己烷和冷 EtOAc 湿磨固体， 产 生 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 甲酰胺 (0.024g， 49 ％ )。LCMS ： 1 (AA)ES+382， ES-380。 H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 7.78(s， 1H)， 7.54(d， 2H)， 7.43(d， 2H)， 3.79-3.77(m， 4H) 和 3.55-3.52(m， 4H)。
步骤 6 ： 合成 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2- 吗啉 -4- 基 -5-(4H-1， 2， 4- 三唑 -3- 基 ) 噻 吩 -3- 甲腈
用氩气冲洗 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 甲酰胺 (31.6mg， 0.0000827mol) 于 1， 1- 二甲氧基 -N， N- 二甲基甲胺中的混合物 (1.0mL， 0.0075mol)， 接着 在 160℃下微波照射 60 分钟。 浓缩反应混合物， 产生作为中间物的 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯 基 )-N-(( 二甲基氨基 ) 亚甲基 )-5-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -2- 甲酰胺 (31mg， 86％ )。 LCMS ： (FA) 1 ES+437.13。 H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 8.34(s， 1H)， 7.69(d， 1H)， 7.47(d， 1H)， 7.33(d， 1H)， 3.79-3.74(m， 4H)， 3.59-3.54(m， 4H)， 3.07(s， 3H)， 2.72(s， 3H)。向上述中间物的 AcOH 溶液 (1.8mL， 0.032mol) 中添加水合肼 (50mg， 0.001mol)。 用氩气冲洗混合物， 接着在 120℃ 下微波照射 20 分钟。浓缩混合物， 去除大部分溶剂。将水添加到残余物中且收集沉淀物， 用水洗涤， 干燥， 得到 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 )-5-(4H-1， 2， 4- 三唑 -3- 基 ) 噻 1 吩 -3- 甲腈 (12.8mg， 55％ )。LCMS ： (FA)ES+406.11， ES-404.21，H NMR(400MHz， d6-DMSO) δ： 14.00(s， 1H)， 8.43(s， 1H)， 7.74(d， 1H)， 7.49(d， 1H)， 7.41(d， 1H)， 3.82-3.76(m， 4H)， 3.56-3.51(m， 4H)。
以类似于实例 1 的方法由适当起始物质制备下表中的化合物 ：
4LCMS ： (FA)ES+449.95。42102066365 A CN 102066375说8 10 12 18 26明书32/48 页LCMS ： (FA)ES+387.99。 LCMS ： (FA)ES+402。 LCMS ： (FA)ES+434。 LCMS ： (FA)ES+440.14。 LCMS ： (FA)ES+434。
实例 2 ： 4-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-2-(2-( 氟 甲 基 )(N- 吗 啉 基 ))-5-(4H-1， 2， 4- 三 唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈 ( 化合物 I-11)步骤 1 ： 3- 氨基 -4- 氰基 -5-( 甲基硫基 ) 噻吩 -2- 甲酸乙酯
使 [ 双 ( 甲 基 硫 基 ) 亚 甲 基 ] 丙 二 腈 (40g， 230mmol)、 硫 乙 醇 酸 乙 酯 (29g， 230mmol) 和 TEA(24mL， 173mmol) 于 MeOH(600mL) 中的混合物在回流下搅拌 2 小时。冷却反 应混合物过夜且滤出沉淀物， 用冷 MeOH(3×50mL) 洗涤， 产生 3- 氨基 -4- 氰基 -5-( 甲基硫 基 ) 噻吩 -2- 甲酸乙酯 (52.4g， 99％ )。LCMS ： (FA)ES+275。
步骤 2 ： 4- 氰基 -3- 碘 -5-( 甲基硫基 ) 噻吩 -2- 甲酸乙酯
在 氩 气 氛 围 下 将 3- 氨 基 -4- 氰 基 -5-( 甲 基 硫 基 ) 噻 吩 -2- 甲 酸 乙 酯 (10g， 41.3mmol) 溶解于乙腈 (50mL) 中。添加二碘甲烷 (11.6mL， 0.144mol) 且在 40℃下加热混 合物。添加亚硝酸异戊酯 (12.1g， 0.103mol) 且使反应物冷却到室温并搅拌 2 小时。在 0℃ 下冷却混合物， 用己烷 (50mL) 稀释并滤出沉淀物， 用 10 ∶ 1 己烷 - 乙腈混合物 (10mL)、 3 ∶ 1 己烷 - 乙醚 (10mL) 和己烷 (10mL) 洗涤。干燥沉淀物， 得到 4- 氰基 -3- 碘 -5-( 甲基 硫基 ) 噻吩 -2- 甲酸乙酯 (6.90g， 45％ )。LCMS ： (FA)ES+354。1H NMR(400MHz， d1- 氯仿 ) δ： 4.38(q， 2H)， 2.70(s， 3H)， 1.40(t， 3H)。
步骤 3 ： 4- 氰基 -3- 碘 -5-( 甲基磺酰基 ) 噻吩 -2- 甲酸乙酯
将 4- 氰基 -3- 碘 -5-( 甲基硫基 ) 噻吩 -2- 甲酸乙酯 (7.2g， 20.4mmol) 溶解于 DCM(200mL) 和 THF(100mL) 中且添加 m-CPBA(9.14g， 40.8mmol)。在室温下搅拌反应混合物 过夜。添加亚硫酸钠 (5.14g， 40.8mmol)， 搅拌 10 分钟， 随后添加碳酸钾 (8.45， 61.2mmol)。 在室温下搅拌悬浮液 1 小时且经由硅藻土过滤， 用 DCM 洗涤并蒸发溶剂， 得到 3- 碘 -4- 氰 1 基 -5-( 甲基磺酰基 ) 噻吩 -2- 甲酸乙酯 (6.80g， 78％ )。 LCMS ： (FA)ES+386。 H NMR(400MHz， d1- 氯仿 )δ ： 4.45(q， 2H)， 3.38(s， 3H)， 1.43(t， 3H)。
步骤 4 ： 4- 氰基 -5-(2-( 氟甲基 )(N- 吗啉基 ))-3- 碘噻吩 -2- 甲酸乙酯
用 氩 气 冲 洗 4- 氰 基 -3- 碘 -5-( 甲 基 磺 酰 基 ) 噻 吩 -2- 甲 酸 乙 酯 (718mg， 0.00186mol)、 2-( 氟 甲 基 ) 吗 啉 盐 酸 盐 (348mg， 0.00224mol) 和 TEA(1.0mL， 0.0072mol) 于 THF(7.1mL， 0.088mol) 中的混合物， 接着在 90 ℃下加热过夜。浓缩反应混合物且通过 柱色谱法来纯化， 产生 4- 氰基 -5-(2-( 氟甲基 )(N- 吗啉基 ))-3- 碘噻吩 -2- 甲酸乙酯 1 (288mg， 36.4 ％ )。LCMS ： (FA)ES+425， H NMR(400MHz， d1- 氯仿 )δ ： 4.57(d， 1H)， 4.46(d， 1H)， 4.34(q， 2H)， 4.12-4.05(m， 1H)， 4.02-3.77(m， 4H)， 3.34-3.25(m， 1H)， 3.22-3.14(m， 1H)， 1.37(t， 3H)。
步骤 5 ： 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(2-( 氟甲基 )(N- 吗啉基 )) 噻吩 -2- 甲 酸乙酯
用 氩 气 冲 洗 4- 氰 基 -5-(2-( 氟 甲 基 )(N- 吗 啉 基 ))-3- 碘 噻 吩 -2- 甲 酸 乙 酯 (288mg， 0.000679mol)、 2， 4- 二氯苯基硼酸 (262mg， 0.00137mol)、 四 ( 三苯基膦 ) 钯 (0) (51mg， 0.000044mol) 和碳酸钠 (220mg， 0.0021mol) 于水 (3mL， 0.1mol) 和 1， 2- 二甲氧基乙 烷 (10mL， 0.1mol) 中的混合物， 接着在 140℃下微波照射 12 分钟。过滤反应混合物并在真 空中浓缩， 得到 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(2-( 氟甲基 )(N- 吗啉基 )) 噻吩 -2- 甲酸 乙酯 (300mg， 99％ )。LCMS ： (FA)ES+443.15。
步骤 6 ： 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(2-( 氟甲基 )(N- 吗啉基 )) 噻吩 -2- 甲 酸
在室温下搅拌 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(2-( 氟甲基 )(N- 吗啉基 )) 噻 吩 -2- 甲 酸 乙 酯 (300mg， 0.00054mol)、 氢 氧 化 钠 (0.12g， 0.0030mol) 于 EtOH(10.0mL， 0.171mol) 和水 (3.0mL， 0.17mol) 中的混合物直到通过 LCMS 显示完成。浓缩混合物且 由 1N HCl 酸化残余物。收集沉淀物并在空气和真空中干燥， 得到 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯 苯基 )-5-(2-( 氟甲基 )(N- 吗啉基 )) 噻吩 -2- 甲酸 (225mg， 99 ％ )。LCMS ： (FA)ES+415， ES-413。步骤 7 ： 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(2-( 氟甲基 )(N- 吗啉基 )) 噻吩 -2- 甲酰胺 在 室 温 下 搅 拌 4- 氰 基 -3-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-5-(2-( 氟 甲 基 )(N- 吗 啉 基 )) 噻 吩 -2- 甲 酸 (68.0mg， 0.000164mol)、 33 ％ 氢 氧 化 铵 (33 ∶ 67 氨 ∶ 水， 0.1416mL)、 EDCI(94.2mg， 0.000491mol) 和 1-HOBT(66.4mg， 0.000491mol) 于 DCM 中 (7mL， 0.1mol) 的 混合物过夜。用 DCM 稀释反应混合物且用水洗涤， 干燥有机层并通过柱色谱法来纯化， 得 到 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(2-( 氟甲基 )(N- 吗啉基 )) 噻吩 -2- 甲酰胺 (38mg， 1 56 ％ )。LCMS ： (FA)ES+414， ES-412 ； H NMR(400MHz， d1- 氯 仿 )δ ： 7.59(d， 1H)， 7.42(dd， 1H) ， 7.31(d ， 1H) ， 6.00(s ， 1H) ， 4.50(dd ， 2H) ， 4.12-4.08(m ， 2H) ， 4.00-3.78(m ， 4H) ， 3.36-3.25(m， 1H)， 3.22-3.15(m， 1H)
步骤 8 ： 4-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-2-(2-( 氟 甲 基 )(N- 吗 啉 基 ))-5-(4H-1， 2， 4- 三 唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈
在 160℃下微波照射 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5-[2-( 氟甲基 ) 吗啉 -4- 基 ] 噻 吩 -2- 甲酰胺 (38mg， 0.000092mol) 的 1， 1- 二甲氧基 -N， N- 二甲基甲胺 (2.0mL， 0.015mol) 溶液 40 分钟。去除溶剂且将残余物溶解于 AcOH(1.6mL， 0.028mol) 中。添加单水合肼 (0.3mL， 0.006mol) 且在 120℃下微波照射混合物 10 分钟。浓缩反应混合物且用水处理残 余物， 收集固体， 干燥， 得到 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(2-( 氟甲基 )(N- 吗啉基 ))-5-(4H-1， 2， 1 4- 三唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈 (23.5mg， 60％ )。 LCMS ： (FA)ES+438， ES-436 ； H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 8.01(s， 1H)， 7.57(d， 1H)， 7.39(dd， 1H)， 7.32d， 1H)， 4.59(t， 1H)， 4.47(t， 1H)， 4.08-4.01(m， 1H)， 4.00-3.81(m， 5H)， 3.32-3.20(m， 1H)， 3.18-3.09(m， 1H)。
以类似于实例 2 的方法由适当起始物质制备下表中的化合物 ：
3 7 9 14 15 17 32 33 35
LCMS ： (FA)ES+434。 LCMS ： (FA)ES+438。 LCMS ： (FA)ES+434。 LCMS ： (FA)ES+434。 LCMS ： (FA)ES+420。 LCMS ： (FA)ES+368。 LCMS ： (FA)ES+438。 LCMS ： (FA)ES+388。 LCMS ： (FA)ES+434。实例 3 ： 合成 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-[2-( 羟基甲基 ) 吗啉 -4- 基 ]-5-(4H-1， 2， 4- 三唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈 ( 化合物 I-27)
步骤 1 ： 4- 氰基 -3- 碘 -5-( 甲基硫基 ) 噻吩 -2- 甲酸
向 4- 氰基 -3- 碘 -5-( 甲基硫基 ) 噻吩 -2- 甲酸乙酯 (3.40g， 10mmol) 于四氢呋喃 (80mL) 和水 (16mL) 中的溶液中添加 1.00M 氢氧化钠水溶液 (30mL)。使溶液搅拌过夜。用 1N 氯化氢水溶液 (50mL) 中止反应且用水 (400mL) 稀释。 过滤所得沉淀物， 用水 (2×100mL) 洗涤并在真空烘箱中干燥， 产生呈白色固体状的 4- 氰基 -3- 碘 -5-( 甲基硫基 ) 噻吩 -2- 甲 酸 (2.6g， 79 ％ )。LCMS ： (FA)ES+326。1H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 14.1-13.8(bs， 1H)， 2.75(s， 3H)。
步骤 2 ： 4- 氰基 -3- 碘 -5-( 甲基硫基 ) 噻吩 -2- 甲酰胺
向 4- 氰 基 -3- 碘 -5-( 甲 基 硫 基 ) 噻 吩 -2- 甲 酸 (2.85g， 7.93mmol) 的 二 氯 甲 烷 (30mL) 悬浮液中添加 N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N ′ - 乙基碳化二亚胺盐酸盐 (3.28g， 17.1mmol) 和 1- 羟基苯并三唑 (2.27g， 16.8mmol)。在室温下搅拌反应混合物 2 小时且添 加氢氧化铵 (15.4mL) 并在室温下搅拌两相混合物 2 小时。添加水 (100mL)、 甲醇 (50mL)、 二氯甲烷 (200mL)。去除有机层。用 20％甲醇的二氯甲烷溶液 (100mL) 萃取水层五次。经 无水硫酸镁干燥合并的有机萃取物， 过滤并浓缩为呈深红色油状物的标题化合物 (1.47g， 57％ )。LCMS ： (FA)ES+325。
步骤 3 ： 4- 氰基 -3- 碘 -5-( 甲基磺酰基 ) 噻吩 -2- 甲酰胺
向 4- 氰 基 -3- 碘 -5-( 甲 基 硫 基 ) 噻 吩 -2- 甲 酰 胺 (1.46g， 4.50mmol) 于 二 氯 甲烷 (60mL)、 四氢呋喃 (20mL)、 N， N- 二甲基甲酰胺 (20mL) 中的溶液中添加间氯过苯甲 酸 (5.05g， 22.5mmol) 且在室温下搅拌混合物过夜。在真空中去除二氯甲烷。用乙酸乙酯 (200mL) 稀释剩余残余物且用 1.00M 氢氧化钠水溶液 (50mL) 洗涤三次。 去除有机相且用乙
酸乙酯 (100mL) 萃取水相五次。用 1.00M 氢氧化钠水溶液 (50mL) 洗涤合并的有机萃取物 两次。在真空中浓缩有机萃取物。将残余物悬浮于水 (100mL) 中且形成沉淀物。过滤沉淀 物， 用水 (40mL)、 己烷 (100mL) 洗涤， 并在真空烘箱中干燥， 产生呈白色固体状的标题化合 1 物 (1.00g， 62％ )。LCMS ： (FA)ES+357。 H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 8.16(s， 2H)， 3.56(s， 3H)。
步骤 4 ： 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5-( 甲基磺酰基 ) 噻吩 -2- 甲酰胺
将 4- 氰基 -3- 碘 -5-( 甲基磺酰基 ) 噻吩 -2- 甲酰胺 (0.500g， 1.40mmol)、 双(二 苯亚甲基丙酮 ) 钯 (0.040g， 0.0700mmol)、 双 (2- 二苯基膦基苯基 ) 醚 (0.057g， 0.100mmol) 和磷酸钾 (0.596g， 2.81mmol) 悬浮于 1， 2- 二甲氧基乙烷 (10.0mL) 和 N， N- 二甲基乙酰胺 (5mL) 中。 用氩气冲洗悬浮液且在 150℃ (300 瓦特 ) 下微波照射反应混合物三个小时。 在真 1 空中浓缩反应混合物且进行柱色谱法， 得到呈米色泡沫状的标题化合物 (0.080g， 14％ )。 H NMR(400MHz， d4- 甲醇 )δ ： 7.71-7.69(m， 1H)， 7.52-7.50(m， 2H)， 3.46(s， 3H)。
步骤 5 ： 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5-[2-( 羟基甲基 ) 吗啉 -4- 基 ] 噻吩 -2- 甲 酰胺
将 4- 氰 基 -3-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-5-( 甲 基 磺 酰 基 ) 噻 吩 -2- 甲 酰 胺 (0.026g， 0.069mmol) 溶解于 2- 羟基甲基吗啉 (0.300g， 2.56mmol) 中且在 60 ℃下加热溶液过夜。 在真空中浓缩残余物且进行柱色谱法， 产生呈白色固体状的 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯 基 )-5-[2-( 羟基甲基 ) 吗啉 -4- 基 ] 噻吩 -2- 甲酰胺 (0.020g， 66％ )。 LCMS ： (FA)ES+412。 1 H NMR(400MHz， d4- 甲 醇 )δ ： 7.76(s， 1H)， 7.49(d， 1H)， 7.40(d， 1H)， 4.08-3.92(m， 3H)， 3.84-3.72(m， 2H)， 3.69-3.59(m， 2H)， 3.15-3.08(m， 2H)。
步骤 6 ： 合成 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-[2-( 羟基甲基 ) 吗啉 -4- 基 ]-5-(4H-1， 2， 4- 三唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈
用氩气冲洗 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5-[2-( 羟基甲基 ) 吗啉 -4- 基 ] 噻 吩 -2- 甲酰胺 (115mg， 0.279mmol) 于 1， 1- 二甲氧基 -N， N- 二甲基甲胺 (3.44mL， 0.025mol) 中的混合物， 接着在 160℃下微波照射 60 分钟。浓缩反应混合物， 产生 4- 氰基 -3-(2， 4- 二 氯苯基 )-N-[(1E)-( 二甲基氨基 ) 亚甲基 ]-5-[2-( 羟基甲基 ) 吗啉 -4- 基 ] 噻吩 -2- 甲 酰胺 (130mg， 99％ )。LCMS ： (FA)ES+467。向上述中间物的 AcOH 溶液 (4.3mL， 0.076mol) 中 添加水合肼 (100mg， 0.003mol)。用氩气冲洗混合物， 接着在 120℃下微波照射 20 分钟。浓 缩混合物， 去除溶剂。使用 ISCO 硅胶色谱法， 用 1 ∶ 1 己烷 - 乙酸乙酯到乙酸乙酯洗脱来 纯化残余物， 得到 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-[2-( 羟基甲基 ) 吗啉 -4- 基 ]-5-(4H-1， 2， 4- 三 1 唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈 (90mg， 70％ )。LCMS ： (FA)ES+436， H NMR(400MHz， d4- 甲醇 )δ ： 8.28(s， 1H)， 7.55(d， 1H)， 7.41(dd， 1H)， 7.34(d， 1H)， 4.12-3.72(m， 5H)， 3.68-3.61(m， 2H)， 3.30-3.20(m， 1H)， 3.12-3.02(m， 1H)。
以类似于实例 3 的方法由适当起始物质制备下表中的化合物 ：
20 24LCMS ： (FA)ES+436。 LCMS ： (FA)ES+492。47102066365 A CN 102066375说28 31 36明书37/48 页LCMS ： (FA)ES+436。 LCMS ： (FA)ES+478。 LCMS ： (FA)ES+450。
实例 4 ： 合成 4-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(1H- 咪唑 -2- 基 )-2- 吗啉 -3- 甲腈 ( 化合物 I-22)
步骤 1 ： N-(2- 氨基乙基 )-4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 甲酰胺 在室温下向 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 甲酸 (3.10g， 8.2mmol) 和 N-(2- 氨基乙基 )( 叔丁氧基 ) 甲酰胺 (1.98gr， 12.3mmol) 的二氯甲烷 (60mL) 溶液中添加 N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N′ - 乙基碳化二亚胺盐酸盐 (3.15gr， 16.4mmol) 和 1- 羟基苯并三唑 (2.22gr， 16.4mmol)。使溶液搅拌过夜。用二氯甲烷和水稀释反应物。分 离各层且经无水硫酸钠干燥有机层， 过滤并在真空中浓缩。 通过柱色谱法来纯化残余物， 产 生呈黄色固体状的中间物经 boc 保护的产物。 将所述物质溶解于二噁烷 (4mL) 中且添加 4N HCl 的二噁烷溶液 (9mL)。在室温下搅拌溶液 30 分钟。蒸发溶剂且在真空下干燥残余物过 随后添加碳酸钠溶液来使产物转化为游离碱。分离各层且用 夜。通过悬浮于二氯甲烷中， 二氯甲烷萃取水层两次。 经无水硫酸钠干燥合并的有机萃取物， 过滤并在真空中浓缩， 得到 1 呈游离碱形式的产物 (2.55gr， 67％ )。LCMS ： (FA)ES+463。 H NMR(400MHz， d1- 氯仿 )δ ： 7.59-7.55(m， 1H)， 7.43-7.30(m， 2H)， 3.90-3.82(m， 4H)， 3.64-3.57(m， 4H)， 3.53-2.85(m， 4H)。
步骤 2 ： 4-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(4， 5- 二氢 -1H- 咪唑 -2- 基 )-2- 吗啉 -4- 基噻 吩 -3- 甲腈
向 N-(2- 氨基乙基 )-4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 吗啉 -4- 基噻吩 -2- 甲酰
胺 (2.50g， 5.90mmol) 的甲苯 (20mL) 悬浮液中添加磷酰氯 (4.70mL， 50.0mmol) 且在 120℃ 微波辐射下搅拌混合物 25 分钟。蒸发反应混合物且将残余物悬浮于二氯甲烷中， 接着用 冰水中止反应。通过添加 KOH 碱化水层， 分离各层并再次用二氯甲烷萃取水层。合并有机 层且用盐水洗涤， 经无水硫酸钠干燥， 过滤并在真空中浓缩， 得到粗产物 (2.3gr， 77 ％ )。 1 LCMS ： (FA)ES+408。 H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 7.78-7.75(m， 1H)， 7.52-7.49(m， 2H)， 3.79-3.73(m， 4H)， 3.63-3.55(m， 2H)， 3.54-3.48(m， 4H)， 3.20-3.11(m， 2H)。
步骤 3 ： 4-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(1H- 咪唑 -2- 基 )-2- 吗啉 -3- 甲腈
在 -78℃下， 在氩气氛围下向二甲亚砜 (2.50mL， 35.3mmol) 的二氯甲烷 (100mL) 溶 液中添加乙二酰氯 (2.98mL， 35.3mmol)。搅拌溶液 40 分钟， 接着逐滴添加 4-(2， 4- 二氯苯 基 )-5-(4， 5- 二氢 -1H- 咪唑 -2- 基 )-2- 吗啉 -4- 基噻吩 -3- 甲腈 (1.45g， 3.03mmol) 的 二氯甲烷 (40mL) 溶液并在 -78℃下搅拌反应物 1 小时。添加三乙胺 (14.0mL， 100mmol) 且 在 -78℃下持续搅拌 1 小时。接着添加 33％氢氧化铵 (10mL)， 并使混合物升温到室温。添 加碳酸氢钠溶液， 分离各层且经无水硫酸钠干燥有机萃取物， 过滤并在真空中浓缩， 得到粗 产物。通过柱色谱法来纯化残余物， 产生呈黄色固体状的产物 (0.90gr， 75％ )， 在 39℃真 1 空烘箱中干燥过夜。LCMS ： (FA)ES+406。 H NMR(400MHz， d1- 氯仿 )δ ： 8.20-8.11(s， 1H)， 7.65-7.62(m， 1H)， 7.45-7.41(m， 1H)， 7.37-7.33(m， 1H)， 7.03-7.00(m， 1H)， 6.85-6.81(m， 1H)， 3.90-3.84(m， 4H)， 3.62-3.55(m， 4H)。
以类似于实例 4 的方法由适当起始物质制备下表中的化合物 ：
16 30
LCMS ： (FA)ES+401。 LCMS ： (FA)ES+437。实例 5 ： 合成 4-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(4- 甲基 -1H- 咪唑 -2- 基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈 ( 化合物 I-13)
步骤 1 ： 5- 乙酰基 -4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈 在 80 ℃ 下 加 热 4- 氰 基 -3-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-5-(N- 吗 啉 基 ) 噻 吩 -2- 甲 酸(508.0mg， 0.001326mol) 于亚硫酰氯 (1.7mL， 0.024mol) 和甲苯 (10mL， 0.098mol) 中的混合 物 1 小时。在真空中蒸发混合物且将残余物与甲苯共蒸发 3 次， 得到呈深棕色油状物的酰 氯。 将这油状物溶解于 DCM(3mL， 0.05mol) 中且在 0℃下添加到含 TEA(1.3mL， 0.0093mol) 和 N， O- 二甲基羟基胺盐酸盐 (282mg， 0.00289mol) 的 DCM(9mL， 0.1mol) 中。在相同温度下搅 拌混合物 1 小时。用水洗涤反应混合物并经硫酸钠干燥。蒸发有机层， 得到 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-N- 甲氧基 -N- 甲基 -5-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -2- 甲酰胺。在 -78℃下向上述中 间物 (207.0mg， 0.0004856mol) 的 THF(21mL， 0.26mol) 溶液中添加氢化二异丁基铝的己烷 溶液 (1M， 0.1ml， 0.0019mol) 且在相同温度下搅拌混合物 30 分钟。使反应混合物升到 0℃ 历时 5 分钟并再次冷却到 -78℃。 通过 MeOH 和水中止反应， 接着通过柱色谱法来纯化， 得到 4-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 甲酰基 -2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈 (115mg， 65％ )。LCMS ： (FA) 1 ES+367。H NMR(400MHz， d1- 氯仿 )δ ： 9.23(s， 1H)， 7.55(d， 1H)， 7.37(dd， 1H)， 7.30(d， 1H)， 3.88-3.84(m， 4H)， 3.74-3.70(m， 4H)， 1.90(s， 3H)。
步骤 2 ： 4-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(4- 甲基 -4， 5- 二氢 -1H- 咪唑 -2- 基 )-2-(N- 吗 啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈
向 4-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-5- 甲 酰 基 -2- 吗 啉 -4- 基 噻 吩 -3- 甲 腈 (52.0mg， 0.000142mol) 的 叔 丁 醇 (0.75g， 0.010mol) 溶 液 中 添 加 1， 2- 二 氨 基 丙 烷 (12.9mg， 0.000174mol) 且 搅 拌 混 合 物 30 分 钟。 添 加 碘 (51mg， 0.00020mol) 和 碳 酸 钾 (65.7mg， 0.000475mol)， 在 70℃下搅拌混合物 3 小时。通过饱和碳酸氢钠溶液和盐水使反应混合物 中止反应。收集有机层且通过柱色谱法来纯化， 得到 4-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(4- 甲基 -4， 5- 二氢 -1H- 咪唑 -2- 基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈 (19mg， 32％ )。 LCMS ： (FA)ES+421。 1H NMR(400MHz， d1- 氯仿 )δ ： 7.60(s， 1H)， 7.50-7.40(m， 1H)， 7.40-7.30(m， 1H)， 4.20-4.05(m， 1H)， 3.90-3.75(m， 5H)， 3.60-3.70(m， 4H)， 3.38-3.20(m， 1H)， 1.25(s， 3H)。
步骤 3 ： 4-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-5-(4- 甲 基 -1H- 咪 唑 -2- 基 )-2-(N- 吗 啉 基 ) 噻 吩 -3- 甲腈
在 -78℃下向 DMSO(32.0uL， 0.000451mol) 的 DCM(3mL， 0.05mol) 溶液中添加乙二 酰氯 (38.2uL， 0.000451mol) 且搅拌混合物 30 分钟。添加 4-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(4- 甲 基 -4， 5- 二氢 -1H- 咪唑 -2- 基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈 (19mg， 0.000045mol) 的 DCM(1.5mL， 0.023mol) 溶液。 1 小时后， 添加 TEA(0.188mL， 0.00135mol) 且再搅拌混合物 30 分钟。添加 33％氢氧化铵 (33 ∶ 67 氨∶水， 0.117mL) 且使反应混合物升温到室温。通过 柱色谱法来纯化混合物， 得到 4-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(4- 甲基 -1H- 咪唑 -2- 基 )-2-(N- 吗 啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈 (4.04mg， 21％ )。LCMS ： (FA)ES+419.13， ES-417.17。1H NMR(400MHz， d 1- 氯 仿 ) δ ： 7.61(d， 1H)， 7.42(dd， 1H)， 7.34(d， 1H)， 6.61(s， 1H)， 3.88-3.84(m， 4H)， 3.62-3.57(m， 4H)， 2.21(s， 3H)。
以类似于实例 5 的方法由适当起始物质制备下表中的化合物 ：
2
LCMS ： (FA)ES+473。实例 6 ： 合成 4-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(1H- 咪唑 -5- 基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲 腈 ( 化合物 I-19)步骤 1 ： 5- 乙酰基 -4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈
在 80 ℃ 下 加 热 4- 氰 基 -3-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-5-(N- 吗 啉 基 ) 噻 吩 -2- 甲 酸 (508.0mg， 0.001326mol) 于亚硫酰氯 (1.7mL， 0.024mol) 和甲苯 (10mL， 0.098mol) 中的混合 物 1 小时。在真空中蒸发混合物且将残余物与甲苯共蒸发 3 次， 得到呈深棕色油状物的酰 氯。 将这油状物溶解于 DCM(3mL， 0.05mol) 中且在 0℃下添加到含 TEA(1.3mL， 0.0093mol) 和 N， O- 二甲基羟基胺盐酸盐 (282mg， 0.00289mol) 的 DCM(9mL， 0.1mol) 中。在相同温度下搅 拌混合物 1 小时。用水洗涤反应混合物并经硫酸钠干燥。蒸发有机层， 得到 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-N- 甲氧基 -N- 甲基 -5-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -2- 甲酰胺。在 -78℃下向上述中
间物的 THF 溶液 (50mL， 0.6mol) 中添加甲基锂的乙醚溶液 (1.4M)(1.7ml， 0.00244mol)。 约 15 分钟后， 通过氯化铵溶液使反应混合物中止反应且用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机层 且通过柱色谱法来纯化， 得到 5- 乙酰基 -4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈 1 (397mg， 78％ )。 LCMS ： (FA)ES+381.05。H NMR(400MHz， d1- 氯仿 )δ ： 7.60(d， 1H)， 7.40(dd， 1H)， 7.28(dd， 1H)， 3.90-3.83(m， 4H)， 3.71-3.64(m， 4H)， 1.90(s， 3H)。
步骤 2 ： 5-(2， 2- 二溴乙酰基 )-4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈
用氩气冲洗 5- 乙酰基 -4-(2， 4- 二氯苯基 )-2- 吗啉 -4- 基噻吩 -3- 甲腈 (50.0mg， 0.000131mol) 和溴 (42mg， 0.00026mol) 的 AcOH(1.0mL， 0.018mol) 溶液， 接着在 120 ℃下 微波照射 5 分钟。浓缩反应混合物并将残余物悬浮于水中。收集固体， 产生 5-(2， 2- 二溴 乙酰基 )-4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈 (46.9mg， 66％ )。LCMS ： (FA) 1 ES+538.87 ； H NMR(400MHz， d1- 氯仿 )δ ： 7.82(d， 1H)， 7.45(dd， 1H)， 7.33(d， 1H)， 5.78(s， 1H)， 4.00-3.85(m， 4H)， 3.80-3.70(m， 4H)。
步骤 3 ： 5-(2- 溴乙酰基 )-4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈
在 0 ℃下向 5-( 二溴乙酰基 )-4-(2， 4- 二氯苯基 )-2- 吗啉 -4- 基噻吩 -3- 甲 腈 (46.9mg， 0.0000870mol) 于 THF(0.78mL， 0.0096mol) 中的混合物中添加亚磷酸二乙酯 (13.7uL， 0.000107mol) 和 TEA(14.9uL， 0.000107mol)。添加后， 使混合物在 20 分钟后升温 到室温。蒸发反应混合物且将残余物悬浮于冰 / 水中。过滤固体且通过柱色谱法来纯化， 得到 5-(2- 溴乙酰基 )-4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈 (12mg， 30％ )。1 LCMS ： (FA)ES+460.88 ； H NMR(400MHz， d1- 氯 仿 )δ ： 7.59(d， 1H)， 7.42(dd， 1H)， 7.33(d， 1H)， 3.90-3.85(m， 4H)， 3.75-3.69(m， 5H)， 3.62(d， 1H)。
步骤 4 ： 4-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(1H- 咪唑 -5- 基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈
用氩气冲洗含 5-( 溴乙酰基 )-4-(2， 4- 二氯苯基 )-2- 吗啉 -4- 基噻吩 -3- 甲 腈 (50mg， 0.0001mol) 的 甲 酰 胺 (1.3mL， 0.033mol)， 接 着 在 180 ℃ 下 微 波 照 射 30 分 钟。 浓 缩 反 应 混合 物且 通过制备型 HPLC 纯化残 余 物， 得 到 4-(2， 4- 二氯 苯 基 )-5-(1H- 咪 唑 -5- 基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈 (2.8mg， 6％ )。 LCMS ： (FA)ES+405.18， ES-403.27 ； 1 H NMR(400MHz， d4- 甲醇 )δ ： 7.66(d， 1H)， 7.60(s， 1H)， 7.46(dd， 1H)， 7.35(d， 1H)， 6.27(s， 1H)， 3.89-3.40(m， 4H)， 3.55-3.49(m， 4H)。
实例 7 ： 合成 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 )-5-(1H- 吡唑 -5- 基 ) 噻吩 -3- 甲 腈 ( 化合物 I-21)
步骤 1 ： 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 )-5-(1H- 吡唑 -5- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈
用氩气冲洗 5- 乙酰基 -4-(2， 4- 二氯苯基 )-2- 吗啉 -4- 基噻吩 -3- 甲腈 (52.3mg， 0.000137mol) 的 1， 1- 二甲氧基 -N， N- 二甲基甲胺 (1.0mL， 0.0075mol) 溶液并在 160℃下微 波照射 30 分钟。 将反应混合物蒸发至干， 产生作为中间物的 4-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(3-( 二 甲基氨基 ) 丙烯酰基 )-2-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -3- 甲腈。 在 120℃下微波照射含上述中间物和 水合肼 (30mg， 0.0006mol) 的 AcOH(1.5mL， 0.026mol) 历时 15 分钟。 蒸发反应混合物且通过 柱色谱法来纯化残余物， 得到 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 )-5-(1H- 吡唑 -5- 基 ) 噻 1 吩 -3- 甲腈 (19.5mg， 84％ )。LCMS ： (FA)ES+405.06， ES-403.23 ； H NMR(400MHz， d4- 甲醇 ) δ： 7.65(d， 1H)， 7.45(m， 2H)， 7.33(d， 1H)， 5.48(s， 1H)， 5.45(br， 1H)， 3.85(m， 4H)， 3.54(m， 4H)。
以类似于实例 7 的方法由适当起始物质制备下表中的化合物 ：
29
LCMS ： (FA)ES+419。实例 8 ： 合成 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 )-5-(1H- 四唑 -5- 基 ) 噻吩 -3- 甲 腈 ( 化合物 I-23)步骤 1 ： 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗啉基 )-5-(1H- 四唑 -5- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈
向 叠 氮 化 钠 (34.01mg， 0.0005232mol) 于 ACN(0.3mL， 0.005mol) 中 的 混 合 物 中 添 加 含 氯 化 硅 (IV)(0.105mmol， 0.000105mol) 的 DCM(0.1mL， 0.002mol) 且 搅 拌 混 合 物 30 分钟。将 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5-(N- 吗啉基 ) 噻吩 -2- 甲酰胺 (20.0mg， 0.0000523mol) 添加到上述混合物中， 随后添加含叠氮化钠 (0.0340g， 0.000523mol) 和 氯化硅 (IV)(0.16mmol， 0.00016mol) 的 DCM(0.16mL， 0.0025mol) 并在 160 ℃下微波照射 混合物 30 分钟。蒸发反应物且通过柱色谱法来纯化， 得到 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(N- 吗 啉 基 )-5-(1H- 四 唑 -5- 基 ) 噻 吩 -3- 甲 腈 (11.6mg， 54.4 ％ )。LCMS ： (FA)ES+407.09， 1 ES-405.20 ； H NMR(300MHz ， d 1- 氯 仿 ) δ ： 7.60(d ， 1H) ， 7.42(dd ， 1H) ， 7.30(d ， 1H) ， 3.90-3.85(m， 4H)， 3.72-3.63(m， 4H)。
以类似于实例 7 的方法由适当起始物质制备下表中的化合物 ：
6
LCMS ： (FA)ES+389.22。实例 9 ： 合成 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(3， 6- 二氢 -2H- 吡喃 -4- 基 )-5-(4H-1， 2， 4- 三唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈 ( 化合物 I-34) 和 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-( 四氢 -2H- 吡 喃 -4- 基 )-5-(4H-1， 2， 4- 三唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈 ( 化合物 I-5)
步骤 1 ： 4- 氰基 -5-[(2， 4- 二甲氧基苯甲基 ) 氨基 ]-3- 碘噻吩 -2- 甲酸乙酯
将 4- 氰基 -3- 碘 -5-( 甲基磺酰基 ) 噻吩 -2- 甲酸乙酯 (5.60g， 0.0145mol) 和 2， 4- 二甲氧基苯甲基胺 (3.51mL， 0.0234mol) 组合于四氢呋喃 (100mL) 中并在 60℃下搅拌 三天。在真空中浓缩反应物， 用二氯甲烷和己烷稀释且过滤所得沉淀物， 得到呈黄色固体 + 1 状的标题化合物 (5.56， 81％ )。LCMS ： (FA)ES ， 473。 H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 9.05(s， 1H)7.10(d， 1H， J ＝ 8.57Hz)， 6.60-6.50(m， 2H)， 4.30(s， 2H)， 4.22-4.14(m， 2H)， 3.80(s， 3H)， 3.75(s， 3H)， 1.26-1.21(m， 3H)。
步骤 2 ： 4- 氰 基 -3-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-5-[(2， 4- 二 甲 氧 基 苯 甲 基 ) 氨 基 ] 噻 吩 -2- 甲酸乙酯
将 4- 氰基 -5-[(2， 4- 二甲氧基苯甲基 ) 氨基 ]-3- 碘噻吩 -2- 甲酸乙酯 (3.18g， 0.00673mol)、 2， 4- 二 氯 苯 基 硼 酸 (2.72g， 0.0143mol)、 四 ( 三 苯 基 膦 ) 钯 (0)(0.47g， 0.00040mol) 和 碳 酸 钠 (2.42g， 0.0228mol) 悬 浮 于 1， 2- 二 甲 氧 基 乙 烷 (23.5mL) 和 水 (13.5mL) 中。用氩气冲洗悬浮液且在 140℃ (300 瓦特 ) 下微波照射反应混合物 10 分钟。 用饱和碳酸氢钠水溶液稀释反应混合物并用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机萃取物， 经 无水硫酸钠干燥， 过滤并在真空中浓缩。进行柱色谱法， 得到标题化合物 (2.92g， 88％ )。 + 1 LCMS ： (FA)ES ， 491。 H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 9.05(bs， 1H)7.75(d， 1H， J ＝ 2.00Hz)， 7.52-7.48(m， 1H)， 7.40(d， 1H， J ＝ 8.28Hz)， 7.19(d， 1H， J ＝ 8.53Hz)， 6.62-6.53(m， 2H)， 4.35(bs， 2H)， 4.04-3.92(m， 2H)， 3.83(s， 3H)， 3.76(s， 3H)， 1.01-0.96(m， 3H)。
步骤 3 ： 5- 氨基 -4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 ) 噻吩 -2- 甲酸乙酯
将 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5-[(2， 4- 二甲氧基苯甲基 ) 氨基 ] 噻吩 -2- 甲 酸乙酯 (4.70g， 0.00956mol) 溶解于二氯甲烷 (100mL) 中。添加三氟乙酸 (25mL) 且在室温 下搅拌溶液 10 分钟。在真空中浓缩反应物， 用乙酸乙酯稀释并过滤。用饱和碳酸氢钠和盐 水洗涤滤液， 经无水硫酸钠干燥， 过滤并在真空中浓缩。进行柱色谱法， 得到呈黄色固体状 + 1 的标题化合物 (2.92g， 90 ％ )。LCMS ： (FA)ES ， 341。 H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 8.17(s， 2H)7.75(d， 1H， J ＝ 2.00Hz)， 7.52-7.48(m， 1H)， 7.39(d， 1H， J ＝ 8.28Hz)， 4.05-3.92(m， 2H)， 1.02-0.96(m， 3H)。
步骤 4 ： 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 碘噻吩 -2- 甲酸乙酯
在氩气氛围下向 5- 氨基 -4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 ) 噻吩 -2- 甲酸乙酯 (2.92g， 0.00856mol) 的乙腈 (10mL) 悬浮液中添加二碘甲烷 (2.41mL， 0.0300mol) 并在 38 ℃下加 热。 逐滴添加亚硝酸异戊酯 (2.61g， 0.0214mol) 且使反应混合物冷却到室温并搅拌 1 小时。 在真空中浓缩反应物且进行柱色谱法， 得到呈橙色固体状的标题化合物 (1.44g， 37％ )。1H NMR(400MHz， d1- 氯 仿 )δ ： 7.53(d， 1H， J ＝ 2.00Hz)， 7.38-7.34(m， 1H)， 7.21(d， 1H， J＝ 8.28Hz)， 4.25-4.15(m， 2H)， 1.21-1.16(m， 3H)。
步骤 5 ： 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 碘噻吩 -2- 甲酸
向 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 碘噻吩 -2- 甲酸乙酯 (1.44g， 0.00318mol) 于 四氢呋喃 (20mL) 和水 (10mL) 中的溶液中添加 1.00M 氢氧化钠水溶液 (16mL)。使溶液搅拌 过夜。用 1N 氯化氢水溶液 (18mL) 中止反应且用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机萃取物， 经无水硫酸钠干燥， 过滤并在真空中浓缩， 得到粗标题化合物 (1.50g， 100％ )， 其直接用于 + 1 下 一 反 应 中。LCMS ： (FA)ES ， 378。 H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 7.68(d， 1H， J ＝ 2.0Hz)， 7.46-7.34(m， 2H)。
步骤 6 ： 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 碘噻吩 -2- 甲酰胺
将 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 碘噻吩 -2- 甲酸 (1.30g， 0.00306mol) 溶解于 二氯甲烷 (30mL) 中。将 N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N ′ - 乙基碳化二亚胺盐酸盐 (1.27g， 0.00661mol) 和 1- 羟基苯并三唑 (0.880g， 0.00651mol) 添加到溶液中且搅拌反应物 30 分 钟。将氢氧化铵 (5.97mL， 0.153mol) 添加到溶液中且搅拌两相混合物 2 小时。浓缩反应混 合物， 用水稀释并用乙酸乙酯萃取。经无水硫酸镁干燥有机萃取物， 过滤并进行柱色谱法， + 1 得到标题化合物 (1.21g， 89％ )。LCMS ： (FA)ES ， 423。 H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 7.79(d， 1H， J ＝ 2.0Hz)， 7.68(bs， 1H)， 7.57-7.45(m， 2H)， 7.30(bs， 1H)。
步骤 7 ： 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2- 碘 -5-(4H-1， 2， 4- 三唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈
在 120℃ (300 瓦特 ) 下微波照射 4- 氰基 -3-(2， 4- 二氯苯基 )-5- 碘噻吩 -2- 甲 酰胺 (1.33g， 0.00314mol) 与 1， 1- 二甲氧基 -N， N- 二甲基甲胺 (10.0mL， 0.0753mol) 的 混合物 30 分钟。在真空中浓缩反应物。使残余物溶解于乙酸 (1.0mL， 0.18mol) 和水合肼 (0.69mL， 0.014mol) 中且在 120℃ (300 瓦特 ) 下微波照射 15 分钟。在真空中去除溶剂且 使残余物与甲苯共沸。 进行柱色谱法， 得到标题化合物 (1.25g， 85％ )。 LCMS ： (FA)ES+， 447。 1 H NMR(400MHz， d4- 甲醇 )δ ： 8.35(s， 1H)7.60(d， 1H， J ＝ 2.0Hz)， 7.45-7.35(m， 2H)。
步骤 8 ： 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2-(3， 6- 二氢 -2H- 吡喃 -4- 基 )-5-(4H-1， 2， 4- 三 唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈将 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2- 碘 -5-(4H-1， 2， 4- 三唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈 (180mg， 0.4mmol)、 三丁基 (3， 6- 二氢 -2H- 吡喃 -4- 基 ) 锡烷 (0.452g， 1.2mmol)、 氯化锂 (51.2mg， 1.2mmol)、 碘化铜 (I)(7.6mg， 0.04mmol)、 四 ( 三苯基膦 ) 钯 (46.4mg， 0.04mmol) 的混合 物溶解于二噁烷 (20mL) 中且在氩气氛围下加热到回流历时 3 小时。去除溶剂且使用 ISCO 硅胶色谱法， 用 20％乙酸乙酯的己烷溶液到乙酸乙酯洗脱来纯化残余物， 得到标题化合物 + 1 (24mg， 14％ )。 LCMS ： (FA)ES ， 403。 H NMR(400MHz， d4- 甲醇 )δ ： 8.35(s， 1H)， 7.59(d， 1H)， 7.43-7.36(m， 2H)， 6.72(dd， 1H)， 4.38-4.36(m， 2H)， 3.97-3.94(m， 2H)， 2.71-2.68(m， 2H)。
步骤 9： 4-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-2-( 四 氢 -2H- 吡 喃 -4- 基 )-5-(4H-1， 2， 4- 三 唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈
将 4-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-2-(3， 6- 二 氢 -2H- 吡 喃 -4- 基 )-5-(4H-1， 2， 4- 三 唑 -3- 基 ) 噻吩 -3- 甲腈 (20mg， 0.05mmol) 溶解于甲醇 (2mL) 中且添加 10％ Pd/C(10mg)。 在氢气氛围下搅拌混合物 2 小时。经由硅藻土过滤悬浮液， 蒸发溶剂且使用 ISCO 硅胶色 谱法， 用 20％乙酸乙酯的己烷溶液到乙酸乙酯洗脱来纯化残余物， 得到标题化合物 (16mg， + 1 80 ％ )。LCMS ： (FA)ES ， 405。 H NMR(400MHz， d4- 甲 醇 )δ ： 8.53(s， 1H)， 7.78(d， 1H)， 7.51-7.46(m， 2H)， 4.12-4.08(m， 1H)， 3.99-3.95(m， 1H)， 3.53-3.30(m， 2H)， 3.20-3.15(m， 1H)， 2.00-1.95(m， 1H)， 1.83-1.72(m， 1H)。
实 例 10 ： 合 成 4-[4-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-5-(4H-1， 2， 4- 三 唑 -3- 基 )-1， 3- 噻 唑 -2- 基 ] 吗啉 ( 化合物 I-1)
步骤 1 ： 合成 4- 氯 -2- 吗啉 -4- 基 -1， 3- 噻唑 -5- 甲腈
在 70 ℃下将 2， 4- 二氯 -5- 氰基噻唑 (1.26g， 0.00704mol) 和 N， N- 二异丙基乙 胺 (3.68mL， 0.0211mol) 溶解于乙醇中。将吗啉 (0.614mL， 0.0704mol) 添加到热溶液中且 搅拌混合物 30 分钟， 冷却到室温， 用水 (50mL) 稀释并收集所形成的沉淀物， 产生标题化合 物 (1.55g， 91 ％ )。LCMS ： (FA)ES+， 230。1H NMR(300MHz， d6-DMSO)δ ： 3.71-3.67(m， 4H)， 3.52-3.48(m， 4H)。
步骤 2 ： 合成 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2- 吗啉 -4- 基 -1， 3- 噻唑 -5- 甲腈
将 4- 氯 -2- 吗 啉 -4- 基 -1， 3- 噻 唑 -5- 甲 腈 (0.200g， 0.871mmol)、 2， 4- 二 氯 苯基硼酸 (0.249g， 1.31mmol)、 二氯化双 ( 三苯基膦 ) 钯 (0.061g， 0.0871mmol)、 碳酸钠
(0.184g， 1.74mmol) 溶解于 DME(3mL)、 乙醇 (1mL) 和水 (1mL) 中且在 125℃下微波处理 30 分 钟。用乙酸乙酯 (10mL) 稀释混合物并萃取。用硫酸钠干燥有机相， 过滤并蒸发。使用 10％ 乙酸乙酯的己烷溶液到 50 ％乙酸乙酯的己烷溶液进行硅胶 ISCO 纯化， 得到标题化合物 + 1 (45mg， 15％ )。 LCMS ： (FA)ES ， 340。H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 7.44(d， 1H)， 7.20-7.17(m， 2H)， 3.43-3.28(m， 4H)， 3.16-2.93(m， 4H)。
步骤 3 ： 合成 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2- 吗啉 -4- 基 -1， 3- 噻唑 -5- 甲酰胺
将 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2- 吗啉 -4- 基 -1， 3- 噻唑 -5- 甲腈 (30mg， 0.088mmol) 溶解 于硫酸 (0.200mL， 3.75mmol) 中且在室温下搅拌混合物 1 小时。 添加水 (1mL) 且用过量饱和 NaHCO3 使混合物中止反应。滤出沉淀物， 用水洗涤并干燥， 得到标题化合物 (27mg， 80％ )。 + 1 LCMS ： (FA)ES ， 358。 H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 7.67(d， 1H)， 7.47(d， 1H)， 7.43(dd， 1H)， 3.72-3.69(m， 4H)， 3.44-3.42(m， 4H)。
步骤 4： 合 成 4-[4-(2， 4- 二 氯 苯 基 )-5-(4H-1， 2， 4- 三 唑 -3- 基 )-1， 3- 噻 唑 -2- 基 ] 吗啉
在 160 ℃ (300 瓦特 ) 下微波照射 4-(2， 4- 二氯苯基 )-2- 吗啉 -4- 基 -1， 3- 噻 唑 -5- 甲酰胺 (23mg， 0.06mmol) 与 1， 1- 二甲氧基 -N， N- 二甲基甲胺 (0.8mL， 6mol) 的混合 物 30 分钟。 在真空中浓缩反应物。 将残余物溶解于乙酸 (1.0mL， 0.18mol) 和水合肼 (30mg， 0.7mmol) 中且在 120℃ (300 瓦特 ) 下微波照射 15 分钟。 在真空中去除溶剂， 用水 (1mL) 稀 释残余物， 收集沉淀物， 用水 (1mL) 洗涤并干燥， 得到标题化合物 (10mg， 40％ )。LCMS ： (FA) + 1 ES ， 382。 H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ ： 13.9(s， 1H)， 8.42(s， 1H)， 7.63(d， 1H)， 7.44-7.42(m， 2H)， 3.73-3.70(m， 4H)， 3.44-3.42(m， 4H)。
II. 生物学数据 ：
实例 1 ： PI3K 酶测定
PI3K 酶的表达和纯化
在千年医药公司 (Millennium Pharmaceuticals)， 从经含有氨基端 His 标记的 p110α 和 p85α 表达构建体的杆状病毒共感染的 SF9 昆虫细胞 ( 英杰公司 (Invitrogen)) 纯化活性磷脂酰肌醇 3′激酶 (PI3K) 酶。
PI3K 酶 HTRF 测定使用包含生物素 -PI(3， 4， 5)P3、 标记铕的抗 GST 单克隆抗体、 标记 GST 的 GRP1 普列克底物蛋白同源 (pleckstrin homology)(PH) 结构域和抗生蛋白链 菌素 -APC( 别藻蓝蛋白 ) 的能量转移复合物。所述复合物中铕的激发产生稳定的时间分辨 荧光共振能量传递 (FRET) 信号。磷脂酰肌醇 3， 4， 5 三磷酸 (PI(3， 4， 5)P3， PI3K 的产物 ) 通 过与生物素 -PI(3， 4， 5)P3 竞争结合于 GRP1 PH 结构域而破坏能量转移复合物， 从而导致荧 光信号减少。反应中的 PI3K 抑制剂防止荧光信号减少。
在 22-23 ℃下， 在 384 孔培养板中， 以多种浓度， 以 20.5μL 的最终体积， 将 PI3K 酶 (325pM) 与 di-C8 PI(4， 5)P2 底物 (3.5μM， 细胞信号公司 (CellSignals， Inc.) 在含有 25μM ATP 和 0.5μL 测试化合物 ( 在 100％ DMSO 中 ) 的测定缓冲液 (50mM HEPES(pH7.0)、 5mM DTT、 150mM NaCl、 10mM β- 甘油磷酸酯、 5mM MgCl2、 0.25mM 胆酸钠、 0.001％ CHAPS) 中 一起培育 30 分钟。 通过向各孔中添加 5μL 含有 EDTA(90mM) 和生物素 -PI(3， 4， 5)P3(150nM，
埃施朗生物科学公司 (Echelon Bioscience)) 的检测缓冲液 (50mM HEPES(pH 7.0)、 5mM DTT、 1mM NaCl、 10％吐温 -20(Tween-20)) 来终止反应。 接着向各孔中添加 5μL 含有与 GST 融合的 GRP1 PH 结构域蛋白 (210nM， 千年医药公司 (Millennium Pharmaceuticals))、 标记 铕的抗 GST 穴状化合物抗体 (2.25nM， CisBio)、 抗生蛋白链菌素 -XL(90nM， CisBio) 和氟化 钾 (240mM) 的检测缓冲液并培育 1 小时。接着在 LJL_Analyst( 分子仪器公司 (Molecular Devices)) 上测量各孔的荧光信号。通过计算经测试化合物处理的样品相对于经 DMSO 处 理 (0％抑制 ) 和经 EDTA 处理 (100％抑制 ) 的对照组中的荧光信号来产生浓度反应曲线， 并且从那些曲线中确定产生 50％抑制的浓度 (IC50 值 )。
实例 2 ： PI3K 细胞测定
叉头 (Forkhead) 再分布测定
细胞中 PI3K 的抑制可使用叉头再分布测定 ( 生物成像公司 (BioImage)) 来评估。 当 PI3K 路径活跃地进行信号传导时， 在 U2OS 骨肉瘤细胞中表达的 Foxo1A 与 EGFP 的融合 物 (Foxo1A-EGFP) 定位于细胞质。路径信号传导的失活导致蛋白质从细胞质移位到细胞 核。因此， 路径抑制可通过定量细胞核中 Foxo1A-EGFP 的荧光强度来测量。
将组成性表达 Foxo1A-EGFP 的 U2OS 细胞 ( 每孔 6500 个细胞 ) 涂于 96 孔培养皿 (BDFalcon OPTILUX， 黑色透明底 ) 的内部 60 个孔中的 100μL 含有 10％胎牛血清 ( 海克隆 公司 (HyClone)) 和 1％青霉素 - 抗生蛋白链菌素 ( 英杰公司 (Invitrogen)) 的细胞培养 基 (DMEM( 英杰公司 (Invitrogen)) 中并在 37℃加湿室中生长过夜。去除细胞培养基并用 100μL 低血清培养基 ( 含有 0.933％胎牛血清和 1％青霉素 - 抗生蛋白链菌素的 DMEM) 冲 洗细胞且在 37℃加湿室中在 75μL 低血清培养基中培育 1 小时。 将以多种浓度悬浮于含有 1％青霉素 - 抗生蛋白链菌素的 DMEM 中的测试化合物 (25μL) 添加到细胞中并在 37℃加湿 室中培育 1 小时。 去除所述培养基并将细胞固定于 100μL 含 4％三聚甲醛的磷酸盐缓冲生 理盐水 (PBS) 中历时 10 分钟， 接着用 100μL PBS 洗涤。将用含有 RNA 酶 (1 ∶ 10,000， 西 格马公司 (Sigma)) 的 PBS 以 1 ∶ 5000 稀释的 DRAQ5 混合物 (100μL， 亚历克西斯生物化学 公司 (Alexis Biochemicals)) 添加到细胞中历时 30 分钟。 接着使用欧普拉成像器 (Opera Imager)( 艾维泰科公司 (Evotec)) 使培养板成像 ( 每孔 16 个场 ) 并且使用 Acapella 软 件 ( 艾维泰科公司 (Evotec)) 定量细胞核 (DRAQ5 阳性 ) 中的 Foxo1A-EGFP 荧光强度。通 过计算经测试化合物处理的样品中 Foxo-1A EGFP 的细胞核荧光强度来产生浓度反应曲线 并且从那些曲线中确定相对于阳性对照组而产生 50％抑制的浓度 (IC50 值 )。
实例 3 ： 抗增生测定
ATPlite 测定
ATPLiteTM( 帕金埃尔默公司 (Perkin-Elmer)) 测定通过产生由 ATP 依赖性酶萤火 虫荧光素酶形成的发光信号测量细胞三磷酸腺苷 (ATP)。发光信号强度可用作细胞增生及 因此 PI3K 抑制剂的抗增生作用的度量。
用 75μL 亨克氏缓冲生理盐水溶液 (Hanks Buffered Saline Solution)( 英杰公 司 (Invitrogen)) 稀释测试化合物 (4μL， 在 100％ DMSO 中 )。接着将经稀释的测试化合物 (8μL) 添加到经 TC 处理的 384 孔黑色 / 透明板 ( 猎鹰公司 (Falcon))。以每孔 1000 个细 胞添加维持于含有 10％胎牛血清和 1％青霉素 - 抗生蛋白链菌素的麦科伊氏 5a 改良培养 基 (McCoy′ s 5a modified media)( 英杰公司 (Invitrogen)) 中的 HCT-116 细胞 ( 美国菌种保藏中心 (American Type Culture Collection))。 以每孔 1500 个细胞添加维持于含有 10％胎牛血清和 1％青霉素 - 抗生蛋白链菌素的 RPMI 1640 中的 H460 细胞 ( 美国菌种保藏 中心 )。 接着在 37℃加湿室中将所述细胞与化合物一起培育 72 小时。 接着从细胞培养室中 移出培养板并使其平衡到室温历时 30 分钟。从各孔中去除全部 ( 但只有 )25μL 细胞培养 基， 且向各孔中添加 25μl ATPlite 试剂 ( 帕金埃尔默公司 (Perkin Elmer))。 在将 ATPlite 试剂添加到 LEADSeeker 发光计数器 ( 通用电气医疗集团生命科学部 (GE Healthcare Life Sciences)) 上的 5 分钟内测量发光。 通过计算经测试化合物处理的样品相对于经 DMSO 处理 的对照组中的发光减少来产生浓度反应曲线， 并且从那些曲线中确定生长抑制 (IC50) 值。
如上文所详述， 本发明的化合物抑制 PI3K。在某些实施例中， 本发明的化合物的 IC50 小于 5.0μM。在其它实施例中， 本发明的化合物的 IC50 小于 1.0μM。在其它实施例 中， 本发明的化合物的 IC50 小于 0.1μM。
虽然我们已描述本发明的许多实施例， 但显然， 可改变我们的基础实例以提供利 用本发明的化合物和方法的其它实施例。 因此， 应了解， 本发明的范围将由随附权利要求书 而非由举例呈现的特定实施例来界定。
如上文所详述， 本发明的化合物抑制 PI3K。在某些实施例中， 本发明的化合物的 IC50 小于 5.0μM。在其它实施例中， 本发明的化合物的 IC50 小于 1.0μM。在其它实施例 中， 本发明的化合物的 IC50 小于 0.1μM。
虽然我们已描述本发明的许多实施例， 但显然， 可改变我们的基础实例以提供利 用本发明的化合物和方法的其它实施例。 因此， 应了解， 本发明的范围将由随附权利要求书 而非由举例呈现的特定实施例来界定。59