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1、10申请公布号CN102010392A43申请公布日20110413CN102010392ACN102010392A21申请号201010522046122申请日20101027C07D311/1620060171申请人浙江工业大学地址310014浙江省杭州市下城区朝晖六区72发明人王鸿杨春应国清易喻梅建凤程文亮74专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司33201代理人黄美娟王兵54发明名称一种应用高速逆流色谱分离香豆素类化合物的方法57摘要本发明公开了一种应用高速逆流色谱分离香豆素类化合物的方法取正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水混合充分后静置分层，取上相为流动相，下相为固定相，取柳叶腊梅的初提物溶。
2、于下相中作为供试品，将固定相充满多层线圈分离柱，在5001000R/MIN转速下，以013ML/MIN的流速注入流动相，以波长60400NM的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，取供试品进样，同时用自动部分收集器收集流出液，HPLC检测，将与6，7二甲氧基香豆素标准品保留时间相同且纯度大于98的洗脱液合并，旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7二甲氧基香豆素。本发明方法分离效果好，污染小，提取率高，产品纯度高，时间短，操作方便，条件固定，易于重复，从而可以进行工业化生产。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书4页附图1页CN102010394A1/2页21。
3、一种应用高速逆流色谱分离香豆素类化合物的方法，其特征在于所述的方法为取柳叶腊梅的初提物为原料，以高速逆流色谱法分离提取，取体积比为01212051512的正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为流动相，下相为固定相，超声脱气，取柳叶腊梅的初提物，溶于下相中作为供试品，所述柳叶腊梅的初提物与下相的质量体积比为1G2080ML；将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在5001000R/MIN转速下，以013ML/MIN的流速注入流动相，以波长60400NM的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始取供试品作为样品溶液进样，。
4、同时开始用自动部分收集器收集流出液，将收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与6，7二甲氧基香豆素标准品保留时间相同且6，7二甲氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7二甲氧基香豆素；所述的柳叶腊梅的初提物为弱极性溶剂的超声提取物的干燥物，所述所极性溶剂为水、甲醇、乙醇或者乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合，所述的样品溶液中含有的柳叶腊梅初提物的质量与高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱的体积比为0105350G/ML。2如权利要求1所述的方法，其特征在于所述收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与6，7，8三甲氧基香豆素标准品保留时间相同且6，7，8三甲氧基香豆素。
5、纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7，8三甲氧基香豆素。3如权利要求1或2所述的高速逆流色谱分离香豆素类化合物的方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤（1）过20目筛的柳叶腊梅枝干粉末加入弱极性溶剂中，在频率20300KHZ超声作用下提取052小时，然后过滤，取滤液浓缩至质量无变化，干燥得到柳叶腊梅初提物，所述弱极性溶剂为水、甲醇、乙醇或者乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合；所述弱极性溶剂的用量以柳叶腊梅枝干粉末的质量计为2080ML/G；（2）取体积比为01212051512的正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系，混合后静置，按上下两相分开，取上相为流动相，下相。
6、为固定相，超声脱气后，将步骤（1）得到柳叶腊梅初提物溶于部分下相作为供试品，所述柳叶腊梅的初提物与下相的质量体积比为1G2080ML；（3）将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在5001000R/MIN转速下，以013ML/MIN的流速注入流动相，当明显有流动相流出时，取供试品作为样品溶液进样，同时开始用自动部分收集器收集流出液，所述样品溶液中含有的柳叶腊梅初提物的质量与高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱的体积比为0105350G/ML，用波长60400NM的紫外检测器检测，将收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与6，7二甲氧基香豆素标准品保留时间相同且6，7二甲。
7、氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7二甲氧基香豆素；将与6，7，8三甲氧基香豆素标准品保留时间相同且6，7，8三甲氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7，8三甲氧基香豆素。4如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中供试品中柳叶腊梅初提物的浓度为00170025G/ML。权利要求书CN102010392ACN102010394A2/2页35如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中的弱极性溶剂为体积百分含量4060的甲醇水溶液或体积百分含量4060的乙醇水溶液。6如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤（3）中高效。
8、液相色谱的条件为色谱柱为AGILENTECLIPSEXDBC185UM46150MM；流动相甲醇水（4555，V/V）；等度洗脱；流速1ML/MIN；柱温30；检测波长326NM；进样量10L。权利要求书CN102010392ACN102010394A1/4页4一种应用高速逆流色谱分离香豆素类化合物的方法一技术领域0001本发明涉及医药及生物领域，关于柳叶腊梅的有效成分的提取方法，具体涉及一种利用高速逆流色谱从柳叶腊梅中提取并分离香豆素类化合物的方法。二技术背景0002畲药是我国民族特色药物之一，在畲族中有着悠久的应用历史。浙南地区畲族百姓主要用于治疗伤食所致的痞满证和慢性胃炎、胃及十二指肠溃。
9、疡引起的胃胀、胃痛、泛酸等。柳叶腊梅鲜叶可按茶叶炒青工艺制成茶冲泡饮用，也可炼制挥发油制成片剂、滴丸，用于镇咳、平喘、防治感冒和流行性感冒。柳叶腊梅具有抗菌、消炎、抗病毒，增强肌体免疫力等功能，无毒副作用，其市场及经济效益前景非常看好。0003香豆素类化合物在医药方面的应用是广泛认可的，特别是6，7二甲氧基香豆素如式1所示，又称滨蒿内酯、二甲氧香豆素、七叶内酯二甲醚、蒿属香豆精和东喘宁，具有显著的降压作用及利胆、抗炎、镇痛、降血脂、平喘、抗凝等作用。临床上主要用于治疗心绞痛、心律失常、支气管哮喘等疾病。00040005然而目前国内外对柳叶腊梅的化学成分研究甚少，更未见关于上述化合物的同时分离的。
10、报道。一般柱分离等传统的分离方法不仅耗时，费力，而且高污染，高成本，高风险。三发明内容0006本发明的目的在于针对目前柳叶腊梅的有效成分的提取还未见报道，并且在避免传统工艺的缺点基础上而建立起来的一种香豆素类化合物的分离方法。0007为达到上述目的，本发明采用的技术方案是0008一种应用高速逆流色谱分离香豆素类化合物的方法，所述的方法为取柳叶腊梅的初提物为原料，以高速逆流色谱法分离提取，取体积比为01212051512的正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为流动相，下相为固定相，超声脱气，取柳叶腊梅的初提物，溶于下相中作为供试品，所述柳叶腊梅的。
11、初提物与下相的质量体积比为1G2080ML；将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在5001000R/MIN转速下，以013ML/MIN的流速注入流动相，以波长60400NM的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始取供试品作为样品溶液进样，同时开始用自动部分收说明书CN102010392ACN102010394A2/4页5集器收集流出液，将收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与6，7二甲氧基香豆素标准品保留时间相同且6，7二甲氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7二甲氧基香豆素。0009所述收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测。
12、，将与6，7，8三甲氧基香豆素标准品保留时间相同且6，7，8三甲氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7，8三甲氧基香豆素。0010所述的柳叶腊梅的初提物为弱极性溶剂的超声提取物的干燥物，所述所极性溶剂为水、甲醇、乙醇或者乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合，所述的样品溶液中含有的柳叶腊梅初提物的质量与高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱的体积比为0105350G/ML。0011更具体的，所述的方法包括如下步骤00121过20目筛的柳叶腊梅枝干粉末加入弱极性溶剂中，在频率20300KHZ超声作用下提取052小时，然后过滤，取滤液浓缩至质量无变化，干燥得到柳叶腊梅初提物，所述弱。
13、极性溶剂为水、甲醇、乙醇或者乙酸乙酯中的一种或两种以上的混合；所述弱极性溶剂的用量以柳叶腊梅枝干粉末的质量计为2080ML/G；00132取体积比为01212051512的正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成高速逆流溶剂体系，混合后静置，按上下两相分开，取上相为流动相，下相为固定相，超声脱气后，将步骤1得到柳叶腊梅初提物溶于下相作为供试品，所述柳叶腊梅的初提物与下相的质量体积比为1G2080ML；00143将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在5001000R/MIN转速下，以013ML/MIN优选083ML/MIN的流速注入流动相，当明显有流动相流出时，取供试品作为样品。
14、溶液进样，同时开始用自动部分收集器收集流出液，所述样品溶液中含有的柳叶腊梅初提物的质量与高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱的体积比为0105350G/ML，用波长60400NM优选210320NM的紫外检测器检测，将收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与6，7二甲氧基香豆素标准品保留时间相同且6，7二甲氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7二甲氧基香豆素；将与6，7，8三甲氧基香豆素标准品保留时间相同且6，7，8三甲氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7，8三甲氧基香豆素。0015所述步骤2中供试品中柳叶腊梅初提物的浓度优选为001。
15、70025G/ML。0016所述步骤1中的弱极性溶剂优选为体积百分含量4060的甲醇水溶液或体积百分含量4060的乙醇水溶液。0017所述步骤3中高效液相色谱的条件为色谱柱为AGILENTECLIPSEXDBC185UM46150MM。流动相甲醇水4555，V/V，等度洗脱。流速1ML/MIN。柱温30。检测波长326NM。进样量10L。0018发明人首次从柳叶腊梅中分离得到天然化合物6，7二甲氧基香豆素式1所示和6，7，8三甲氧基香豆素式2所示，填补了目前柳叶腊梅中主要香豆素类化合物提取分离的空白。本发明利用的高速逆流色谱采用非固定相载体的液液分配色谱技术，相对于传统的分离方法具有分离效果好。
16、，污染小，提取率高，产品纯度高，时间说明书CN102010392ACN102010394A3/4页6短，操作方便等优点。本发明条件固定，易于重复，从而可以进行工业化生产。对柳叶腊梅的开发和利用具有重要的应用价值，可以有效的促进畲药资源保护和可持续发展再利用。四附图说明0019图16，7二甲氧基香豆素的高效液相色谱检测谱图。0020图26，7，8三甲氧基香豆素的高效液相色谱检测谱图。五具体实施方式0021下面以具体实施例对本发明方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。0022实施例10023取足量的干燥的柳叶腊梅枝干粉碎物过20目筛。准确称量粉碎物1G，加入20ML体积百分浓度为40的甲醇。
17、水溶液进行超声提取，超声时间为1H，频率为20KHZ。所得溶液过滤，取滤液浓缩至质量无变化，室温通风放置干燥得柳叶腊梅的初提物备用。0024高速逆流色谱的分离提取，在分液漏斗中加入正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水体积比为01121512，混合充分后静置4小时，按上下两相分开，上相为流动相，下相为固定相，20KHZ超声脱气20MIN。称取柳叶腊梅的初提物01G，溶于8ML下相中，得到供试品，作为样品溶液。0025将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，分离柱的柱体积为350ML，设定高速逆流色谱仪，当仪器以500R/MIN稳定旋转并且两相达到平衡时，以3ML/MIN泵入流动相，当明显有流动相流出时。
18、，注入样品溶液，同时开始用自动部分收集器收集流出液，收集速度为3MIN/TUBE，紫外检测器的检测波长为210NM，将收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与6，7二甲氧基香豆素标准品保留时间377MIN相同且6，7二甲氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7二甲氧基香豆素553MG，纯度为98，回收率为92；将与6，7，8三甲氧基香豆素标准品保留时间515MIN相同且6，7，8三甲氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7，8三甲氧基香豆素333MG，纯度为98，回收率为90。0026高效液相色谱条件色谱柱为AGILENTECLIPS。
19、E0027XDBC185UM46150MM。流动相甲醇水4555，等度洗脱。流速1ML/MIN。柱温30。检测波长326NM。进样量10L。0028实施例20029取足量的干燥的柳叶腊梅枝干粉碎物过20目筛。准确称量粉碎物1G，加入30ML体积百分浓度为60的乙醇水溶液进行超声提取，超声时间为05H，频率为300KHZ。所得溶液过滤，取滤液浓缩至质量无变化，室温通风放置干燥得柳叶腊梅的初提物备用。0030高速逆流色谱的分离提取，在分液漏斗中加入正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水体积比为2120512，混合充分后静置3小时，按上下两相分开，上相为流动相，下相为固定相，300KHZ超声脱气20MIN。称取。
20、柳叶腊梅的初提物04G，溶于15ML说明书CN102010392ACN102010394A4/4页7下相中，得到供试品，作为样品溶液。0031将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，分离柱的柱体积为350ML，设定高速逆流色谱仪，当仪器以1000R/MIN稳定旋转并且两相达到平衡时，以08ML/MIN泵入流动相，当明显有流动相流出时，注入样品溶液，同时开始用自动部分收集器收集流出液，收集速度为5MIN/TUBE，紫外检测器的检测波长为260NM，将收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与6，7二甲氧基香豆素标准品保留时间377MIN相同且6，7二甲氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用。
21、旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7二甲氧基香豆素22MG，纯度为98，回收率为89；将与6，7，8三甲氧基香豆素标准品保留时间515MIN相同且6，7，8三甲氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7，8三甲氧基香豆素132MG，纯度为98，回收率为91。0032高效液相色谱条件色谱柱为AGILENTECLIPSE0033XDBC185UM46150MM。流动相甲醇水4555，等度洗脱。流速1ML/MIN。柱温30。检测波长326NM。进样量10L。0034实施例30035取足量的干燥的柳叶腊梅枝干粉碎物过20目筛。准确称量粉碎物1G，加入50ML体积百分浓度为55的甲醇。
22、水溶液进行超声提取，超声时间为2H，频率为60KHZ。所得溶液过滤，取滤液浓缩至质量无变化，室温通风放置干燥得柳叶腊梅的初提物备用。0036高速逆流色谱的分离提取，在分液漏斗中加入正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水体积比为1120612，混合充分后静置6小时，按上下两相分开，上相为流动相，下相为固定相，60KHZ超声脱气20MIN。称取柳叶腊梅的初提物03G，溶于13ML下相中，得到供试品，作为样品溶液。0037将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，分离柱的柱体积为350ML，设定高速逆流色谱仪，当仪器以900R/MIN稳定旋转并且两相达到平衡时，以2ML/MIN泵入流动相，当明显有流动相流出时。
23、，注入样品溶液，同时开始用自动部分收集器收集流出液，收集速度为2MIN/TUBE，紫外检测器的检测波长为320NM，将收集得到的流出液用高效液相色谱进行检测，将与6，7二甲氧基香豆素标准品保留时间377MIN相同且6，7二甲氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7二甲氧基香豆素166MG，纯度为98，回收率为88；将与6，7，8三甲氧基香豆素标准品保留时间515MIN相同且6，7，8三甲氧基香豆素纯度大于98的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到6，7，8三甲氧基香豆素105MG，纯度为98，回收率为91。0038高效液相色谱条件色谱柱为AGILENTECLIPSE0039XDBC185UM46150MM。流动相甲醇水4555，等度洗脱。流速1ML/MIN。柱温30。检测波长326NM。进样量10L。说明书CN102010392ACN102010394A1/1页8图1图2说明书附图CN102010392A。