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1、10申请公布号CN102040578A43申请公布日20110504CN102040578ACN102040578A21申请号201010605530022申请日20101227C07D311/30200601C07D311/40200601A61K31/352200601A61P35/0020060171申请人国际竹藤网络中心地址100102北京市朝阳区望京阜通东大街8号72发明人岳永德郭雪峰汤锋王进姚曦74专利代理机构北京市惠诚律师事务所11353代理人雷志刚54发明名称从竹叶中制备高纯度苜蓿素的方法57摘要本发明公开了从竹叶中制备高纯度苜蓿素的方法。该方法包括以下步骤A使干燥竹叶用95乙。
2、醇提取，用石油醚萃取，水相浓缩成浸膏；B使浸膏上AB8大孔树脂柱，先用纯水洗脱，再用80乙醇洗脱，将洗脱液浓缩并干燥；C向步骤B干燥产物中加入盐酸甲醇溶液，加热进行酸解处理；D使步骤C所得酸解液上C18柱层析洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩；E使步骤D所得浓缩物上凝胶分离柱，用纯甲醇作流动相洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩到干燥，即得苜蓿素。本发明以一种简便的方法以高收率获得了高纯度的苜蓿素。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书10页附图10页CN102040581A1/1页21一种从竹叶中制备高纯度苜蓿素的方法，其包括以下步骤A使干燥竹叶用95乙醇在60回流。
3、提取三次，将合并的提取液浓缩至无醇味，再用石油醚萃取，水相浓缩成浸膏；B使浸膏用少量95乙醇溶解后上AB8大孔树脂柱，先用纯水洗脱，再用80乙醇洗脱，将洗脱液浓缩并干燥；C向步骤B干燥产物中加入盐酸甲醇溶液，加热进行酸解处理，处理完毕后用用稀NAOH溶液中和；D使步骤C所得酸解液与样品同等重量的C18填料混合，浓缩拌样干燥，再使干燥的C18填料拌样固体上样，按110的样品和填料比例上C18柱层析，先用20甲醇水溶液洗脱，再用60甲醇水溶液洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩；E使步骤D所得浓缩物用甲醇溶解，按110的样品和填料比例，上凝胶分离柱，用纯甲醇作流动相洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩到干燥，即得苜蓿。
4、素。2根据权利要求1的方法，其中在步骤A中，所述三次回流提取的料液比分别是1/10、1/8、1/5，回流提取时间分别为3H、2H、2H。3根据权利要求1的方法，其中在步骤A中，所述石油醚萃取是萃取三次，并且每次石油醚体积大约为浓缩液体积的1/3。4根据权利要求1的方法，其中在步骤C中，所述盐酸甲醇溶液是甲醇与25盐酸的混合物。5根据权利要求1的方法，其中在步骤C中，所述酸解处理的时间为13小时。6根据权利要求1的方法，在步骤C中，所述盐酸甲醇溶液是甲醇与25盐酸二者以体积比约41的混合物，所述加热是在沸水浴中回流，所述酸解处理的时间为约2小时，所述步骤B干燥产物与盐酸甲醇溶液的比为约50MG2。
5、5ML。7根据权利要求1的方法，该方法的收率为50WT以上，和/或该方法所得苜蓿素的纯度大于95WT。8一种竹叶提取物，其中包含纯度大于95WT的苜蓿素。9苜蓿素或包含苜蓿素的提取物在制备抗肿瘤的药物中的用途。10权利要求9的用途，其中所述肿瘤是肺癌或肝癌。权利要求书CN102040578ACN102040581A1/10页3从竹叶中制备高纯度苜蓿素的方法技术领域0001本发明属于天然产物化学领域，涉及一种天然产物苜蓿素的制备方法，特别涉及一种从竹叶中制备天然产物苜蓿素的方法，更特别涉及一种从竹叶中制备高纯度天然产物苜蓿素的方法。本发明还涉及由本发明方法获得的苜蓿素，以及苜蓿素在制备抗肿瘤药物。
6、中的用途。背景技术0002苜蓿素TRICIN又称小麦黄素、麦黄酮。苜蓿素为黄色针状结晶醋酸水，黄色粉末氯仿甲醇，熔点291292。苜蓿素存在于禾本科植物芒MISCANTHUSSINENSISANDERSS的茎、叶中，豆科植物紫苜蓿MEDICAGOSATIVAL，菊科植物等植物中。苜蓿素对离体豚鼠肠管有松弛作用，有轻度抗氧化作用，可防止肾上腺素氧化，并有轻度雌激素样作用。可用作染料中间体。0003目前，市场上售苜蓿素相关产品大多从紫苜蓿中制备而来，且资源有限，工艺复杂、成本高、产品纯度低，售价高。0004尽管我国竹叶资源丰富，但我国竹叶资源在大部分竹产区被弃用，所以，如何充分利用我国丰富的竹叶资。
7、源，开发出高附加值的竹叶化学成分产品是当前科研工作者研究热点之一。0005竹叶作为一种“药食两用的天然植物”已被广大消费者所接受，竹叶提取物主要功能性成分为竹叶黄酮糖苷，具有抗氧化和抑菌活性，可以作为一种生物黄酮类保健营养素进行开发，前景广阔。目前，以竹叶为原料，利用硅胶柱层析、大孔树脂柱层析、有机溶剂液液萃取等方法制备的竹叶黄酮粉产品已经上市，而且把竹叶黄酮粉在食品、保健品、化妆品、药物等领域的开发应用也很多，但很少有分离制备黄酮单体纯品，应用于抗肿瘤药物，且大部分产品生产工艺复杂、成本高、产品的总黄酮含量大多在40以下，并且黄酮得率低，这直接导致了产品售价较高。虽然从竹叶这种资源广泛的材料。
8、中提取各种类型的黄酮已有许多文献报道，但从竹叶或其粗制提取物中制备高纯度苜蓿素尚未见有报道。0006因此，寻找一种从竹叶中高效率制备高纯度天然产物苜蓿素的方法，填补市场空白，仍是本领域技术人员为之努力的方向。发明内容0007本发明的目的是为制备高纯度苜蓿素而提供一种简便的从竹叶中提取高纯度苜蓿素的方法。本发明人令人意外地发现，通过对竹叶粗提，然后进行酸解，再进一步进行C18柱层析分离，最后通过凝胶分离纯化，可以获得纯度在99以上的苜蓿素纯品。本发明基于上述发现而得以完成。0008发明概述0009为此，本发明第一方面提供了一种从竹叶中制备高纯度苜蓿素的方法，其包括以下步骤A使干燥竹叶用95乙醇提。
9、取，用石油醚萃取，水相浓缩成浸膏；B使浸膏上说明书CN102040578ACN102040581A2/10页4AB8大孔树脂柱，先用纯水洗脱，再用80乙醇洗脱，将洗脱液浓缩并干燥；C向步骤B干燥产物中加入盐酸甲醇溶液，加热进行酸解处理；D使步骤C所得酸解液上C18柱层析洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩；E使步骤D所得浓缩物上凝胶分离柱，用纯甲醇作流动相洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩到干燥，即得苜蓿素。0010本发明第二方面提供一种竹叶提取物，其中包含纯度大于95WT的苜蓿素。0011本发明第三方面提供苜蓿素或包含苜蓿素的提取物在制备抗肿瘤的药物中的用途。0012发明详述0013本发明第一方面提供了一种从。
10、竹叶中制备高纯度苜蓿素的方法，其包括以下步骤0014A使干燥竹叶用95乙醇在60回流提取三次，将合并的提取液浓缩至无醇味，再用石油醚萃取，水相浓缩成浸膏；0015B使浸膏用少量95乙醇溶解后上AB8大孔树脂柱，先用纯水洗脱，再用80乙醇洗脱，将洗脱液浓缩并干燥；0016C向步骤B干燥产物中加入盐酸甲醇溶液，加热进行酸解处理，处理完毕后用用稀NAOH溶液中和；0017D使步骤C所得酸解液与样品同等重量的C18填料混合，浓缩拌样干燥，再使干燥的C18填料拌样固体上样，按110的样品和填料比例上C18柱层析，先用20甲醇水溶液洗脱，再用60甲醇水溶液洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩；0018E使步骤D所得。
11、浓缩物用甲醇溶解，按110的样品和填料比例，上凝胶分离柱，用纯甲醇作流动相洗脱，收集苜蓿素级分，浓缩到干燥，即得苜蓿素。0019在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤A中，所述三次回流提取的料液比分别是1/10、1/8、1/5，回流提取时间分别为3H、2H、2H。0020在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤A中，所述石油醚萃取是萃取三次，并且每次石油醚体积大约为浓缩液体积的1/3。0021在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤C中，所述盐酸甲醇溶液是甲醇与25盐酸的混合物。在一个实施方案中，所述甲醇与25盐酸的混合物是二者以体积比261、251、或约。
12、41的混合物，优选是约41的混合物。0022在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤C中，所述加热是在沸水浴中加热。在一个实施方案中，所述加热是在沸水浴中回流。0023在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤C中，所述酸解处理的时间为13小时。在一个实施方案中，所述酸解处理的时间为1525小时。在一个实施方案中，所述酸解处理的时间为约2小时。0024在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤C中，所述步骤B干燥产物与盐酸甲醇溶液的比为50MG10ML50ML。在一个实施方案中，所述步骤B干燥产物与盐酸甲醇溶液的比为50MG15ML40ML、50MG20ML30。
13、ML、或约50MG25ML，优选的比为约50MG25ML。0025本领域技术人员理解，根据所述步骤B干燥产物中的苜蓿素的含量不同，所述步骤B干燥产物与盐酸甲醇溶液的比可以作适当的改变，以获得较佳的酸解效果；类似说明书CN102040578ACN102040581A3/10页5地，其它因素亦可作适当改变。在一个实施方案中，在步骤C中，所述盐酸甲醇溶液是甲醇与25盐酸二者以体积比约41的混合物，所述加热是在沸水浴中回流，所述酸解处理的时间为约2小时，所述步骤B干燥产物与盐酸甲醇溶液的比为约50MG25ML。0026在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中在步骤D和步骤E中，各步骤在洗脱时是通。
14、过HPLC监控并收集苜蓿素级分的。在一个实施方案中，所述HPLC监控各自独立地是采用包括以下的色谱条件色谱柱、流动相、包括等度和/或梯度的洗脱程序、以及装配有二极管阵列检测器或紫外检测器的色谱仪。在一个实施方案中，所述色谱柱是ODS柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5M粒度填料的ODS柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5M粒度填料的ODS柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5M粒度填料的YMCPACKODSAQ型色谱柱。在一个实施方案中，所述色谱柱是5M粒度填料的YMCPACKODSAQ型46MMX250MM色谱柱，或者是具有在本发明所述色谱条件下与该5M粒度填料的YMCPACKODSAQ型46。
15、MMX250MM色谱柱分离效果相当的色谱柱。在一个实施方案中，所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是乙腈，所述流动相B是05V/V磷酸水溶液。在一个实施方案中，所述流动相是乙腈05V/V磷酸水溶液以体积比为10509050比例的混合物，优选是10459055比例的混合物，优选是15308570比例的混合物。在一个实施方案中，所述洗脱程序是以052ML/MIN优选约1ML/MIN的流速，在第一洗脱时间段内以包含1015流动相A和加至100流动相B的混合液中进行等度洗脱，然后在第一洗脱时间段内从上述混合液经线性梯度变化到包含4050流动相A和加至100流动相B的混合液中进行梯度洗脱。在一。
16、个实施方案中，所述第一洗脱时间段使用的洗脱液是包含约12流动相A和约88流动相B本领域技术人员理解，1二者之和为100，和/或2两种流动相的比例可作适当调整以获得更佳的分离效果；此1和2在其它情况下亦是适用的的混合液。在一个实施方案中，所述第二洗脱时间段使用的梯度洗脱液是包含约12流动相A和约88流动相B的混合液经线性梯度变化到包含约45流动相A和约55流动相B的混合液。在一个实施方案中，所述第一洗脱时间段为3060MIN，优选3555MIN，优选4050MIN，优选约45MIN。在一个实施方案中，所述第二洗脱时间段为3060MIN，优选3555MIN，优选4050MIN，优选约45MIN。本。
17、领域技术人员理解，在优选的情况下，所述第一洗脱时间段洗脱操作完毕后，即刻开始所述第二洗脱时间段。在一个实施方案中，所述色谱系统设定的检测波长为320380NM，优选330370NM，优选340360NM，优选约350NM。在一个实施方案中，所述色谱柱的柱温控制在1545，优选2040，优选2535，优选约30。0027在第一方面所述方法的一个实施方案中，该方法包括以下步骤00281提取称取一定量原料，用95乙醇，温度60，回流提取三次，料液比分别是1/10，1/8，1/5，回流提取时间分别为3H，2H，2H；00292浓缩使以上提取液浓缩至无醇味；00303萃取使以上浓缩得到的无醇味浓缩液，若。
18、溶解不好，可适当加温和加入少量乙醇辅助溶解，然后用石油醚萃取三次，每次石油醚体积大约为浓缩液体积的1/3，石油醚相弃去，水相浓缩成浸膏；00314初步分离纯化原料提取物浸膏用尽量少的95乙醇溶解后上AB8大孔树脂说明书CN102040578ACN102040581A4/10页6柱，先用纯水洗脱，再用80乙醇洗脱，收集洗脱液，把80乙醇洗脱液浓缩干燥成粉末，备用。00325酸解称取干燥的样品500MG，置于50ML平底烧瓶中，先加入20ML甲醇，测其PH值后再加入25盐酸5ML，装好冷凝回流玻璃装置，在沸水浴中加热酸解2小时，迅速冷却后，备用；00336浓缩拌样把酸解后的溶液，用稀NAOH溶液调。
19、节PH值到酸解前PH值数值后，加入和样品同等重量的C18填料，浓缩拌样干燥后备用；00347C18柱层析分离把干燥的C18填料拌样，固体上样，按110的样品和填料比例，上C18柱层析，先用20的甲醇水溶液洗脱杂质，再用60的甲醇水溶液洗脱并收集苜蓿素级分；00358凝胶分离纯化把C18柱层析分离后的样品用甲醇溶解，按110的样品和填料比例，上凝胶分离柱，用纯甲醇作流动相洗脱，按一定的体积分别收集苜蓿素级分00369浓缩干燥将合并的纯苜蓿素收集液进行浓缩干燥，即得。0037在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，该方法的收率为50WT以上，优选收率为60WT以上，优选收率为70WT以上，以干燥。
20、竹叶计。0038在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，该方法所得苜蓿素的纯度大于95WT，优选纯度大于96WT，优选纯度大于98WT，优选纯度大于99WT。0039本发明第二方面涉及一种竹叶提取物，其中包含纯度大于95WT的苜蓿素，优选纯度大于96WT，优选纯度大于98WT，优选纯度大于99WT。0040在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中该提取物中通过本发明第一方面任一项所述方法获得的。0041在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中该提取物是基本上纯净的苜蓿素。0042在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中该提取物是苜蓿素纯品。0043本发明第三方面涉及苜。
21、蓿素或包含苜蓿素的提取物例如包含苜蓿素的竹叶提取物，例如本发明第二方面所述竹叶提取物在制备抗肿瘤的药物中的用途。0044在本发明第三方面所述用途的一个实施方案中，其中所述肿瘤是肺癌或肝癌。0045本发明第一方面所述方法的各个实施方案可以与一个或多个其它实施方案进行任意组合，只要这种组合不会出现矛盾。当然在相互之间组合时，必要的话可对相应特征作适当修饰。对于本发明的其它方面的各个实施方案亦可以类似地进行任意组合。0046本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的。
22、一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。0047如本文使用的，术语“竹叶提取物BAMBOOLEAVESEXTRACT”，是指以竹叶为原料，用一定的提取、初步分离方法而得到竹叶的粗提物或进一步精制的精提物的统称，其中包含竹叶黄酮类化合物，例如本发明所述苜蓿素等。0048如本文使用的，术语“酸解”，亦可称为“酸水解”。说明书CN102040578ACN102040581A5/10页70049在本发明中，术语“”时，如基础物质是液态并且分散于该基础物质中的物质是固体，则该是重量/体积表示的百分数。其。
23、它情况下使用亦具有类似含义。0050为了克服现有的从苜蓿中制备天然产物苜蓿素工艺复杂、成本高、纯度低、得率低的不足，改变市场没有苜蓿素纯品的现状，本发明的第一方面的目的是提供一种竹叶天然产物苜蓿素纯品，该天然产物苜蓿素纯品的纯度明显高于现有的苜蓿素产品。本发明的第二方面目的是提供一种制备竹叶天然产物苜蓿素纯品的方法，本发明第三方面的目的是提供所述竹叶天然产物苜蓿素纯品的用途。0051本发明结合溶剂提取、酸解和色谱层析的组合，可以从具有丰富来源的竹叶中以较高收率提取高纯度苜蓿素。附图说明0052图1描绘了酸解时间对苜蓿素含量的影响。0053图2是60的甲醇水溶液洗脱苜蓿素收集液检测图。0054图。
24、3是凝胶分离纯化后纯苜蓿素收集液检测图。0055图4是苜蓿素质谱图。0056图5是苜蓿素红外光谱图。0057图6是苜蓿素紫外光谱图。0058图7是苜蓿素碳谱图。0059图8是苜蓿素氢谱图。0060图9是苜蓿素DEPT135谱图。0061图10是苜蓿素DEPT90谱图。0062图11是苜蓿素HMBC谱图。0063图12是苜蓿素HSQC谱图。具体实施方式0064下面通过具体的实施例/实验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和实验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。0065本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本。
25、发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。0066实施例一、苜蓿素的制备00671制备工艺00681提取工艺的选择0069水提法以纯水进行提取，设不同提取时间和不同提取温度；0070醇提取法用醇如5098的乙醇进行提取，设不同提取时间和不同提取温度；0071有机溶剂提取法用有机溶剂，如乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇等进行提取，设不同说明书CN102040578ACN102040581A6/10页8提取时间和不同提取温度。0072利用液质联用仪、高效液相色谱仪等分析检测提。
26、取物中黄酮等活性物质的得率，核算成本，对以上的提取技术进行优化。0073本发明人发现，用以下工艺提取，可获得最佳的产品收率，即热回流提取法称取干燥竹叶原料10KG，用95乙醇，温度60，回流提取三次，料液比分别是1/10，1/8，1/5，回流提取时间分别为3H，2H，2H。00742浓缩0075把以上提取液浓缩至无醇味。00763萃取0077把以上浓缩得到的无醇味浓缩液，若溶解不好，可适当加温和加入少量乙醇辅助溶解，然后用石油醚萃取三次，每次石油醚体积大约为浓缩液体积的1/3，石油醚相弃去，水相浓缩成浸膏。00784初步分离纯化0079考察以下方法进行分离纯化0080柱层析法用聚酰胺柱层析法、。
27、硅胶柱层析法、葡聚糖凝胶柱层析法、大孔树脂柱层析法；0081膜分离法用超滤、微滤、纳滤和反渗透方法；0082高效制备液相法用高效制备液相色谱方法。0083利用液质联用仪、高效液相色谱仪等分析检测黄酮等活性物质的纯度，核算成本，对分离制备技术进行优化。本发明人发现，采用以下分离纯化工艺可以获得最佳的分离纯化效果原料提取物浸膏用尽量少的95乙醇溶解后上AB8大孔树脂柱，先用纯水洗脱去除糖类、蛋白质等杂质后，再用80乙醇洗脱，收集洗脱液，把80乙醇洗脱液浓缩干燥成粉末，备用。00845酸解0085初步确定的酸解方法0086称取干燥的样品500MG，置于50ML平底烧瓶中，先加入20ML甲醇，测其PH。
28、值后再加入25盐酸5ML，装好冷凝回流玻璃装置，在沸水浴中加热进行酸解。0087酸解时间的确定0088称取干燥的样品500MG，置于50ML平底烧瓶中，先加入20ML甲醇，再加入25盐酸5ML，装好冷凝回流玻璃装置，在沸水浴中分别加热酸解20MIN，迅速冷却后，倒入50ML容量瓶中，用甲醇定容，待测。重复上述步骤八次，酸解时间分别为30、50、60、90、120、150、180、240MIN。0089对酸解后样品测定结果显示，样品中苜蓿素含量随酸解时间变化明显见图1。从图1可以看出样品酸解20MIN，苜蓿素含量均为最低，随着酸解时间的增加，苜蓿素含量逐渐增加，样品酸解120MIN，苜蓿素含量达。
29、到最高值，酸解时间超过120MIN后，随酸解时间的增加，苜蓿素含量略有下降且渐趋稳定。因此，样品酸解120MIN为最佳酸解时间。0090最终确定的酸解方法0091称取干燥的样品500MG，置于50ML平底烧瓶中，先加入20ML甲醇，测其PH值后再加入25盐酸5ML，装好冷凝回流玻璃装置，在沸水浴中加热酸解2小时，迅速冷却后，备说明书CN102040578ACN102040581A7/10页9用。0092此方法可按同比进行放大。00936浓缩拌样0094把酸解后的溶液，用稀NAOH溶液调节PH值到酸解前PH值数值后，加入和样品同等重量的C18填料，浓缩拌样干燥后备用。00957C18柱层析分离0。
30、096把干燥的C18填料拌样，固体上样，按110的样品和填料比例，上C18柱层析，先用20的甲醇水溶液洗脱杂质，再用60的甲醇水溶液洗脱苜蓿素并收集见图2，浓缩备用。洗脱过程中使用紫外检测器进行监控，检测波长为350NM。00978凝胶分离纯化0098把C18柱层析分离后的样品用甲醇溶解，按110的样品和填料比例，上凝胶分离柱，用纯甲醇作流动相洗脱，按一定的体积分别收集，备用。洗脱过程中使用紫外检测器进行监控，检测波长为350NM。00999HPLC检测0100把凝胶分离纯化后按一定的体积分别收集的待测液，用液相色谱检测见图3，根据HPLC检测结果合并纯苜蓿素收集液。010110浓缩干燥010。
31、2把根据检测结果合并的纯苜蓿素收集液进行浓缩，干燥，即得苜蓿素20克。010311纯度和收率测定0104根据以下色谱条件测定本实施例所得苜蓿素0105I、色谱条件0106使用YMCPACKODSAQ不锈钢色谱柱5M，46MM250MM；以乙腈作为流动相A，05V/V的磷酸水溶液作为流动相B。0107洗脱程序为以12流动相A/88流动相B的混合液为流动相平衡色谱柱；将样品或标准品注入液相色谱仪后，以12流动相A/88流动相B的混合液作为洗脱溶液等度洗脱45MIN；然后使洗脱溶液从上述混合液开始，在45分钟时间内线性梯度变化到45流动相A/55流动相B的混合液进行洗脱。0108柱温30。0109进。
32、样量10L。0110检测波长350NM。0111II纯度结果通过面积归一化法计算纯度，为9948，并且通过上述色谱条件，采用二极管阵列检测器在200400NM的波长范围内扫描，未见有其它杂质。0112III收率结果，采用本发明制备方法所得酸解液测定其中苜蓿素含量，换算为投料竹叶中苜蓿素总含量，此总含量除根据本发明制备方法获得的终产物量，算得苜蓿素收率为772。0113实施例二、结构鉴定0114利用上述实施例一制备的苜蓿素，利用液质联用仪、高效液相色谱仪、核磁共振波谱仪等对其进行了结构鉴定。01151理化性状说明书CN102040578ACN102040581A8/10页100116苜蓿素为橙黄。
33、色粉末，熔程为MP为25122521，不易溶于甲醇。01172质谱ESIMS0118苜蓿素质谱图见图4。由图4可知，负模式ESIMSM/Z3291MH，68102M2HNA，其中3291MH为准分子离子峰，苜蓿素的分子量为3301。01193红外光谱FTIR0120苜蓿素的红外光谱图见图5。黄酮的羰基吸收峰大约在1649CM1；酚羟基、糖基上的羟基在32003650CM1范围吸收峰；苯环骨架振动在1450CM1、1500CM1、1580CM1、1600CM1有吸收峰；氧杂环在1400CM1、1500CM1、1600CM1有吸收峰。由图4可知，FTIRKBRMAXCM134227，16546，1。
34、6124，15785，15077，14655，14333，13592，13374，13063，12635，11823，11691，11186，8371，与黄酮类化合物吸收峰一致，可以判断苜蓿素为黄酮类化合物。01214紫外光谱UV0122苜蓿素的紫外光谱图见图6。黄酮母体的甲醇溶剂紫外数据为250，294，307SH；由图5可知，带I在3522NM，在300400NM的范围内，带II在2701NM，在240280NM的范围内，可以判断苜蓿素为黄酮类化合物。01235核磁共振谱NMR0124苜蓿素的碳谱13CNMR见图7。从图7可知，从碳谱可知该化合物有17个C，其中181889PPM处黄酮4位。
35、羰基碳，139781166401PPM为黄酮骨架和氧相连接的碳，94872121239PPM黄酮骨架不和氧相连接的碳，148725PPM为两个碳叠加峰，且为季碳黄酮B环3，5，104812PPM为两个碳叠加峰黄酮B环2，6，56789PPM为两个连接在3和5碳上两个甲氧基的CH3的碳叠加峰。0125苜蓿素的氢谱1HNMR见图8。从图8可知，从氢谱可明显看到11个氢，有3个羟基活泼氢不出峰；根据碳和氢的数量以及分子量推算出含有氧的个数。0126苜蓿素的1HNMR、13CNMR、DEPT、HSQC、HMBC波谱数据见表1DEPT135、DEPT90、HMBC、HSQC图谱见图9、图10、图11、图。
36、12。从表1可知，根据DEPT谱判断每个所有21个C的类型，即为C、CH、CH2、CH3，确定每个C连接H的个数。根据苜蓿素的碳氢相关关系HSQC和HMBC，可分别确定每个碳和氢相连接的位置和关系。0127表1苜蓿素的1HNMR、13CNMR、DEPT、HSQC、HMBC波谱数据300MHZ，DMSOD6，PPM说明书CN102040578ACN102040581A9/10页1101280129综合该天然产物的各种图谱，初步鉴定该天然产物为5，7，4三羟基3，5二甲氧基黄酮后，再对该天然产物结构的各个C和H在碳谱和氢谱上进行指认，指认结果见表1。确认该天然产物为苜蓿素；分子量3301；分子式C。
37、17H14O7；分子结构式如下01300131苜蓿素0132三、苜蓿素的抗肿瘤活性测定体外抗肿瘤活性试验01331、实验原理0134四氮唑MTT，34，5DIMETHYLTHIAZOL2YL2，5DIPHENYLTETRAZOLIUMBROMIDE是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的FORMAZON，而死细胞则无此功能。用DMSO溶解FORMAZON后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，既可定量测出细胞的存活率。01352、实验方法和结果01361选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用10小牛血清的RPMI1640。
38、培养液配成5000个/ML的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100UL，37，5CO2培养24H。01372实验组加样品来自实施例1的苜蓿素10UL，每孔终体积为200UL，用1640培养液补足。37，5CO2培养3D。01383弃上清液，每孔加入100UL新鲜配制的05MG/MLMTT的无血清培养液，37继说明书CN102040578ACN102040581A10/10页12续培养4H。小心弃上清，并加入200ULDMSO溶解MTTFORMAZON沉淀，用微型超声振荡器混匀，在酶标仪上测定波长544NM处的光密度值。0139实验用肿瘤细胞A549人肺癌细胞；BEL7402人肝癌细胞；。
39、HCT8人结肠癌细胞。0140结果评定以下式计算肿瘤细胞生长抑制率01410142测定结果如下01430144结果显示苜蓿素对A549人肺癌细胞和BEL7402人肝癌细胞有一定的抑制效果，且对BEL7402人肝癌细胞抑制效果较好。0145虽然本发明结合实验例进行了详细的说明，然而，本领域技术人员理解，本发明的精神和范围不应限于这些实施例，还应包括本发明权利要求所限定的范围及其等同方案。说明书CN102040578ACN102040581A1/10页13图1说明书附图CN102040578ACN102040581A2/10页14图2说明书附图CN102040578ACN102040581A3/10页15图3图4说明书附图CN102040578ACN102040581A4/10页16图5图6说明书附图CN102040578ACN102040581A5/10页17图7说明书附图CN102040578ACN102040581A6/10页18图8说明书附图CN102040578ACN102040581A7/10页19图9说明书附图CN102040578ACN102040581A8/10页20图10说明书附图CN102040578ACN102040581A9/10页21图11说明书附图CN102040578ACN102040581A10/10页22图12说明书附图CN102040578A。