一类噻吩并吡啶衍生物及制备方法与用途 技术领域 本发明属于医药领域， 具体涉及一类结构新颖的 3- 氨基 -6- 芳基 - 噻吩并 [2， 3-b] 吡啶 -2- 甲酰胺类化合物， 和其制备方法及在制备抗肿瘤药物组合物中的用途。
背景技术 恶性肿瘤已成为危害人类健康和生存的重要杀手， 特别是近年来， 随着环境的恶 化， 恶性肿瘤的发病率已出现明显的上升趋势。 目前在我国， 癌症是仅次于心血管疾病的第 二死亡原因， 尽管近年来对其治疗取得了一些进展， 随着新一代化疗药物如吉西他宾、 格力 卫等的应用， 患者的生存获得一定益处， 但大多数癌症患者的预后仍较差， 死亡率高。 因此， 研发新型特别是具有崭新母体结构的抗肿瘤药物或从现有的化合物中筛选出新的抗肿瘤 药物已成为当务之急。
发明内容 发明人在先前对激光激酶 A(Aurora-A) 抑制剂的筛选中， 发现了一个先导化合 物， 该化合物体外对人肝癌细胞株 HepG2 显示了良好的细胞增殖抑制活性。在接下来对该 化合物的结构优化中， 发明人自行设计路线 ( 该化合物的合成之前没有文献报道 ) 合成得 到了该化合物， 并合成了一些结构类似物 ( 该部分工作已申请中国专利， 发明名称为 ： 2- 甲 酰胺基噻吩并吡啶衍生物制备方法及医药用途， 申请号为 ： 200810046188.8)。
在该专利申请的基础上， 发明人继续进行了合成噻吩并吡啶新衍生物的深入研 究， 所做的工作如下 ：
1、 按照如下的反应合成路线， 以芳香酮 1 为原料， 首先与 N， N- 二甲基甲酰胺二甲 缩醛 (DMF DMA) 反应得到烯胺酮 2， 接着与氰基硫代乙酰胺关环得到中间体 6- 芳基 -3- 氰 基吡啶 -2- 硫酮 3， 后再与氯乙酰胺关环得到 3- 氨基 -6- 芳基 - 噻吩并 [2， 3-b] 吡啶 -2- 甲 酰胺类系列化合物 4。 该类化合物体外对人肝癌 HepG2 细胞株的增殖有明显抑制作用， 有成 为抗肿瘤药物的良好前景。
2、 发展了两步一锅法合成关键中间体 6- 芳基 -3- 氰基吡啶 -2- 硫酮 3 的新工艺。 两步一锅法具体操作如下 ： 芳香酮 1 与 N， N- 二甲基甲酰胺二甲缩醛 (DMFDMA) 反应完后， 直 接减压蒸馏除去过量的 DMF DMA， 粗品不经纯化直接与氰基硫代乙酰胺环化得到产物。 该工 艺与以前的分步法相比， 一是避免了过滤洗涤烯胺酮的操作， 二是提高了关键中间体 3 的 两步总产率。
3、 筛选了烯胺酮 2 与氰基硫代乙酰胺的反应条件， 提高了该步反应产率。发明人
筛选了碱， 溶剂和反应温度， 发现当碱为 1， 4- 二氮杂二环 [2.2.2] 辛烷 (DABCO) 和 N， N， N’ ， N’ - 四甲基乙二胺 (TMEDA)， 以乙醇为溶剂， 回流 3 小时取得了最好的产率。 具体实施方式
以下通过对若干具体化合物合成实例的实施方式再对本发明的上述内容作进一 步的详细说明 ； 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述的实例 ； 凡基于本发 明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例 1 3- 氨基 -6-(3- 甲氧基苯基 ) 噻吩 [2， 3-b] 并吡啶 -2- 甲酰胺 (4a) 的 制备
将 间 甲 氧 基 苯 乙 酮 (5g， 33.3mmol) 与 N， N- 二 甲 基 甲 酰 胺 二 甲 缩 醛 (DMFDMA) (9.2ml， 69.3mmol) 加热回流， 直至原料反应完全， 冰浴冷却反应液， 抽滤析出固体， 用冷石 油醚和冷乙醇洗涤滤饼， 干燥得到黄色固体 5.2 克， 产率 75％， 直接用于下一步反应。
将上述烯胺酮固体 (1g， 4.9mmol)， 2- 氰基硫代乙酰胺 (0.74g， 7.35mmol)， 1， 4- 二 氮杂二环 [2.2.2] 辛烷 (DABCO)(0.54g， 2.45mmol) 溶于 8ml 无水乙醇中， 加热回流至反应 完全， 冷却反应液至室温， 用稀盐酸调节反应体系至中性， 抽滤析出固体， 滤饼用无水乙醇 洗涤， 干燥得到黄色固体 1.0 克， 产率 85％， 直接用于下一步反应。
将上述化合物 (1g， 4.2mmol) 悬浮于 6mlDMF 之中， 加入 10％ KOH 水溶液 (3ml)， 室 温搅拌下加入氯乙酰胺 (0.5g， 5.0mmol)， 室温搅拌 20 分钟， 再加入 10％ KOH 水溶液 (3ml)， 升温至 85℃， 直至反应完全， 冷却反应液， 过滤， 滤饼用无水乙醇洗涤， 干燥得到黄色固体 0.95 克， 产率 75％。 1
HNMR(400MHz， DMSO-d6) ： δ3.87(s， 3H)， 7.06(dd， J ＝ 8.0， 2.0Hz， 1H)， 7.19(br， 2H)， 7.22(br， 2H)， 7.44(t， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 7.72(s， 1H)， 7.76(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.06(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 8.51(d， J ＝ 8.4Hz， 1H) ；
ESI-MS(m/z，％ ) ： 334.16(M+Cl-)
m.p. ： 234-236℃ . 实施例 2 3- 氨基 -6-(3- 氟苯基 ) 噻吩 [2， 3-b] 并吡啶 -2- 甲酰胺 (4b) 的制备将间氟苯乙酮 (5g， 36.2mmol) 和 N， N- 二甲基甲酰胺二甲缩醛 (DMF DMA)(10ml， 73.1mmol) 加热回流， 直至反应完全， 冰浴冷却反应液， 抽滤析出固体， 用冷石油醚和冷乙醇 洗涤滤饼， 得到黄色固体 4.8 克， 产率 69％， 直接用于下一步反应。
将上述烯胺酮固体 (1g， 5.2mmol)， 2- 氰基硫代乙酰胺 (0.8g， 7.7mmol)， 1， 4- 二氮 杂二环 [2.2.2] 辛烷 (DABCO)(0.6g， 2.6mmol) 溶于 8ml 无水乙醇中， 加热回流至反应完全， 冷却反应液至室温， 用稀盐酸调节反应体系至中性， 抽滤析出固体， 滤饼用无水乙醇洗涤， 干燥得到黄色固体 0.92 克， 产率 76％， 直接用于下一步反应。 1
HNMR(400MHz， DMSO-d6) ： δ7.14(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 7.45(t， J ＝ 7.8Hz， 1H)， 7.56-7.63(m， 2H)， 7.70(d， J ＝ 10.0Hz， 1H)， 8.18(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 14.31(br， 1H).
m.p. ： 198-200℃ .
将上述固体 (1g， 4.5mmol) 悬浮于 8mlDMF 之中， 加入 10％ KOH 水溶液 (2.7ml)， 室 温搅拌下加入氯乙酰胺 (0.5g， 5.4mmol)， 室温搅拌 20 分钟， 加入 10％ KOH 水溶液 (2.7ml)， 升温至 85 ℃， 直至反应完全， 冷却反应液， 过滤， 滤饼用无水乙醇洗涤， 干燥得到黄色固体 1.08g， 产率 84％。 1
HNMR(400MHz， DMSO-d6) ： δ7.22(br， 2H)， 7.23(br， 2H)， 7.33(dt， J ＝ 8.4， 2.2Hz， 1H)， 7.58(q， J ＝ 7.3Hz， 1H)， 7.99(d， J ＝ 10.4Hz， 1H)， 8.08(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 8.11(d， J ＝ 8.8， 1H)， 8.54(d， J ＝ 8.4Hz， 1H).
ESI-MS(m/z，％ ) ： 286.24(M-H+).
m.p. ： 253-255℃ . 实施例 3 3- 氨基 -6-(3， 4- 二氯苯基 ) 噻吩 [2， 3-b] 并吡啶 -2- 甲酰胺 (4c) 的制备
将 3， 4- 二氯苯乙酮 (5g， 26.5mmol) 和 N， N- 二甲基甲酰胺二甲缩醛 (DMFDMA) (8ml， 53.53mmol) 加热回流， 直至反应完全， 冰浴冷却反应液， 抽滤析出固体， 用冷石油醚和 冷乙醇洗涤滤饼， 干燥得到棕红色固体 5.7 克， 产率 88％， 直接用于下一步反应。
将上述烯胺酮固体 (1g， 4.1mmol)， 2- 氰基硫代乙酰胺 (0.6g， 6.2mmol)， 1， 4- 二氮 杂二环 [2.2.2] 辛烷 (DABCO)(0.5g， 2mmol) 溶于 8ml 无水乙醇中， 加热回流至反应完全， 冷 却反应液至室温， 用稀盐酸调节反应体系至中性， 抽滤析出固体， 滤饼用无水乙醇洗涤， 干 燥得到棕红色固体 1.1 克， 产率 97％， 直接用于下一步反应。
将上述固体 (2g， 7.1mmol) 悬浮于 13mlDMF 之中， 加入 10％ KOH 水溶液 (4.2ml)， 室 温搅拌下加入氯乙酰胺 (0.8g， 8.5mmol)， 室温搅拌 20 分钟， 加入 10％ KOH 水溶液 (4.3ml)， 升温至 85℃， 直至反应完全， 冷却反应液， 过滤， 滤饼用无水乙醇洗涤， 干燥得到黄色固体 4.32g， 产率 90％。 1
HNMR(400MHz， DMSO-d6) ： δ7.24(br， 4H)， 7.79(d， J ＝ 8.8Hz， 1H)， 8.14-8.20(m， 2H)， 8.42(d， J ＝ 2.0Hz， 1H)， 8.56(d， J ＝ 8.4Hz， 1H) ； ESI-MS(m/z，％ ) ： 373.97(M+Cl-).
m.p. ： 240-242℃ .
实施例 4 3- 氨基 -6-(2， 4- 二氯苯基 ) 噻吩 [2， 3-b] 并吡啶 -2- 甲酰胺 (4d) 的 制备
将 2， 4- 二氯苯乙酮 (5g， 26.5mmol) 和 N， N- 二甲基甲酰胺二甲缩醛 (DMFDMA) (8ml， 53.53mmol) 加热回流， 直至反应完全， 冷却反应液至室温， 除去残余 DMF DMA， 得到红 褐色油状物。
将上述油状物， 2- 氰基硫代乙酰胺 (6g， 60mmol)， 1， 4- 二氮杂二环 [2.2.2] 辛烷 (DABCO)(3.5g， 2.1mmol) 溶于 80ml 无水乙醇中， 加热回流至反应完全， 冷却反应液至室温， 用稀盐酸调节反应体系至中性， 抽滤析出固体， 滤饼用无水乙醇洗涤， 干燥得到砖红色固体 7.4 克， 两步产率 50％。
将上述固体 (2g， 7.1mmol) 悬浮于 13mlDMF 之中， 加入 10％ KOH 水溶液 (4.2ml)， 室 温搅拌下加入氯乙酰胺 (0.8g， 8.5mmol)， 室温搅拌 20 分钟， 加入 10％ KOH 水溶液 (4.3ml)， 升温至 85℃， 直至反应完全， 冷却反应液， 过滤， 滤饼用无水乙醇洗涤， 干燥得到黄色固体
1.6g， 产率 70％。 1
H-NMR(400Hz， DMSO-d6) ： δ7.23(s， 2H)， 7.25(s， 2H)， 7.58(dd， J ＝ 8.0， 2.0Hz， 1H)， 7.70(t， J ＝ 8.4Hz， 2H)， 7.80(d， J ＝ 1.6Hz， 1H)， 8.54(d， J ＝ 8.0Hz， 1H). +
ESI-MS(m/z，％ ) ： 359.15(M+Na ).
m.p. ： 254-256℃ .
实施例 5 3- 氨基 -6-(3， 5- 二三氟甲基苯基 ) 噻吩 [2， 3-b] 并吡啶 -2- 甲酰胺 (4e) 的制备
将 3， 5- 二 三 氟 甲 基 苯 乙 酮 (5g， 19.52mmol) 和 N， N- 二 甲 基 甲 酰 胺 二 甲 缩 醛 (DMFDMA)(5ml， 39.43mmol) 加热回流， 直至反应完全， 冰浴冷却反应液， 抽滤析出固体， 用冷 石油醚和冷乙醇洗涤滤饼， 得到黄色固体 3.6 克， 产率 60％， 直接用于下一步反应。
将上述烯胺酮固体 (2g， 6.4mmol)， 2- 氰基硫代乙酰胺 (0.84g， 8.4mmol)， 1， 4- 二 氮杂二环 [2.2.2] 辛烷 (DABCO)(0.64g， 3.2mmol) 溶于 20ml 无水乙醇中， 加热回流至反应 完全， 冷却反应液至室温， 用稀盐酸调节反应体系至中性， 抽滤析出固体， 滤饼用无水乙醇 洗涤， 干燥得到砖色固体 0.85g， 产率 39％， 直接用于下一步反应。 1
HNMR(400MHz， DMSO-d6) ： δ7.34(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 8.24(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.34(s， 1H)， 8.50(s， 1H)， 14.61(br， 1H).
m.p. ： 190-192℃ .
将 上 述 固 体 (0.85g， 2.44mmol) 悬 浮 于 8mlDMF 之 中， 加 入 10 ％ KOH 水 溶 液 (1.7ml)， 室温搅拌下加入氯乙酰胺 (0.3g， 2.9mmol)， 室温搅拌 20 分钟， 加入 10％ KOH 水溶 液 (1.7ml)， 升温至 85℃， 直至反应完全， 冷却反应液， 过滤， 滤饼用无水乙醇洗涤， 干燥得 到黄色固体 0.5g， 产率 50％。 1
H-NMR(400Hz， DMSO-d6) ： δ7.26(br， 4H)， 8.23(s， 1H)， 8.38(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 8.63(d， J ＝ 8.4Hz， 1H)， 8.81(s， 2H).
ESI-MS(m/z，％ ) ： 440.39(M+Cl-).
m.p. ： 216-219℃ .
实施例 6 3- 氨基 -6-(4- 苯基苯基 ) 噻吩 [2， 3-b] 并吡啶 -2- 甲酰胺 (4f) 的制 备
将 对 苯 基 苯 乙 酮 (10g， 47.56mmol) 和 N， N- 二 甲 基 甲 酰 胺 二 甲 缩 醛 (DMFDMA) (13.14ml， 96.07mmol) 加热回流， 直至反应完全， 冰浴冷却反应液， 抽滤析出固体， 用冷石油 醚和冷乙醇洗涤滤饼， 得到黄色固体 11.4 克， 产率 95％， 直接用于下一步反应。
将上述烯胺酮固体 (3g， 11.9mmol)， 2- 氰基硫代乙酰胺 (1.6g， 15.5mmol)， 1， 4- 二 氮杂二环 [2.2.2] 辛烷 (DABCO)(1.31g， 6mmol) 溶于 30ml 无水乙醇中， 加热回流至反应完 全， 冷却反应液至室温， 用稀盐酸调节反应体系至中性， 抽滤析出固体， 滤饼用无水乙醇洗 涤， 干燥得到砖色固体 3.3g， 产率 95％， 直接用于下一步反应。 1
H-NMR(400Hz， DMSO-d6) ： δ7.18(d， J ＝ 7.6Hz， 1H)， 7.44(t， J ＝ 7.8Hz， 1H)， 7.52(t， J ＝ 7.6Hz， 2H)， 7.77(d， J ＝ 7.2Hz， 2H)， 7.88(q， J ＝ 19.2Hz， 4H)， 8.17(d， J＝ 8.0Hz， 1H)， 14.28(br， 1H)
ESI-MS(m/z，％ ) ： 287.23(M-H+)
m.p. ： ＞ 230℃ .
将上述固体 (1.3g， 4.5mmol) 悬浮于 8mlDMF 之中， 加入 10％ KOH 水溶液 (3.2ml)， 室 温 搅 拌 下 加 入 氯 乙 酰 胺 (0.5g， 5.4mmol)， 室 温 搅 拌 20 分 钟， 加 入 10 ％ KOH 水 溶 液 (3.2ml)， 升温至 85℃， 直至反应完全， 冷却反应液， 过滤， 滤饼用无水乙醇洗涤， 干燥得到黄 色固体 1.5g， 产率 94％。 1
H-NMR(400Hz， DMSO-d6) ： δ7.20(br， 2H)， 7.23(br， 2H)， 7.41(t， J ＝ 7.0Hz， 1H)， 7.51(t， J ＝ 7.4Hz， 2H)， 7.77(d， J ＝ 7.6Hz， 2H)， 7.84(d， J ＝ 8.0Hz， 2H)， 8.11(d， J＝ 8.4Hz， 1H)， 8.29(d， J ＝ 8.0Hz， 2H)， 8.53(d， J ＝ 8.4Hz， 1H). +
ESI-MS(m/z，％ ) ： 344.36(M-H )
m.p. ： ＞ 280℃
实施例 7 3- 氨基 -6-(2- 噻唑 ) 噻吩 [2， 3-b] 并吡啶 -2- 甲酰胺 (4g) 的制备
将 2- 乙 酰 基 噻 唑 (10g， 47.56mmol)， N， N- 二 甲 基 甲 酰 胺 二 甲 缩 醛 (DMFDMA) (13.14ml， 96.07mmol) 加热回流， 直至反应完全， 冰浴冷却反应液， 抽滤析出固体， 用冷石油 醚和冷乙醇洗涤滤饼， 得到红色固体 7.4 克， 产率 85％， 直接用于下一步反应。
将烯胺酮固体 (1g， 5.5mmol)， 2- 氰基硫代乙酰胺 (0.8g， 8.2mmol)， 1， 4- 二氮杂二 环 [2.2.2] 辛烷 (DABCO)(0.6g， 2.7mmol) 溶于 8ml 无水乙醇中， 加热回流至反应完全， 冷却 反应液至室温， 用稀盐酸调节反应体系至中性， 抽滤析出固体， 滤饼用无水乙醇洗涤， 干燥 得到红褐色固体 0.87g， 产率 68％， 直接用于下一步反应。 1
H NMR(400Hz， DMSO-d6) ： δ7.48(s， 1H)， 8.13(s， 2H)， 8.23(s， 1H). +
ESI-MS(m/z，％ ) ： 217.98(M-H) .
m.p. ： 221-222℃ .
将上述固体 (1g， 4.5mmol) 悬浮于 8ml DMF 之中， 加入 10％ KOH 水溶液 (2.7ml)， 室 温搅拌下加入氯乙酰胺 (0.5g， 5.4mmol)， 室温搅拌 20 分钟， 加入 10％ KOH 水溶液 (2.7ml)， 升温至 85℃， 直至反应完全， 冷却反应液， 过滤， 滤饼用无水乙醇洗涤， 干燥得到黄色固体 1.1g， 产率 87％。
H-NMR(400Hz， DMSO-d6) ： δ7.25(br， 2H)， 7.27(br， 2H)， 7.95(d， J ＝ 3.2Hz， 1H)， 8.05(d， J ＝ 2.8Hz， 1H)， 8.18(d， J ＝ 8.0Hz， 1H)， 8.57(d， J ＝ 8.4Hz， 2H) ； +
ESI-MS(m/z，％ ) ： 275.12(M+H ).
m.p. ： ＞ 280℃
试验例 1 关键中间体 6- 芳基 -3- 氰基吡啶 -2- 硫酮 3 的合成工艺研究
烯胺酮 2 与氰基硫代乙酰胺在碱性条件下环合得到关键中间体 6- 芳基 -3- 氰基 吡啶 -2- 硫酮 3， 反应方程式如下 ：
1通过对碱， 溶剂和反应温度三个反应条件的筛选 ( 如表 1 所示 )， 发现碱的种类 对产率影响很大， 与文献经常使用的无机碱 ( 氢氧化钾水溶液， 乙醇钠， 叔丁醇钾等等 ) 和 有机碱 ( 三乙胺， 哌啶等等 ) 相比， 当碱为二叔胺 1， 4- 二氮杂二环 [2.2.2] 辛烷 (DABCO) 和 N， N， N’ ， N’ - 四甲基乙二胺 (TMEDA)， 产率明显提高。以 1， 4- 二氮杂二环 [2.2.2] 辛烷 (DABCO) 为碱， 以乙醇为溶剂， 回流 3 小时取得了最好的产率。
表 1 烯胺酮 2 与氰基硫代乙酰胺反应的条件筛选
注： DMF 为 N， N- 二甲基甲酰胺， DBU 为 1， 8- 二氮杂二环 [5.4.0] 十一碳 -7- 烯， DIPEA 为 N， N- 二异丙基乙基胺， DABCO 为 1， 4- 二氮杂二环 [2.2.2] 辛烷， TMEDA 为 N， N， N’ ， N’ -四 甲基乙二胺的缩写。a ： 氰基硫代乙酰胺为 1.5 当量， 其它氰基硫代乙酰胺为 1.1 当量。
在合成关键中间体 6- 芳基 -3- 氰基吡啶 -2- 硫酮 3 时， 我们发展了一种新的两步 一锅法合成工艺， 即： 烯胺酮 2 可不经纯化， 直接将过量的 N， N- 二甲基甲酰胺二甲缩醛 (DMF DMA) 减压除去， 粗品可直接与氰基硫代乙酰胺反应， 3 的产率较之前的分步法明显提高， 且 提高了工作效率， 减少了工作量。
表 2 两步一锅法与分步法产率对照
注： 产率均为分离产率， 两种工艺的产物熔点一致 ； - 表示未进行相应操作， 所以 没有相应产率。
两步一锅法通用操作 ：
将间甲氧基苯乙酮 (1 当量 ) 与 N， N- 二甲基甲酰胺二甲缩醛 (DMF DMA)(2-3 当 量 ) 加热回流， 直至反应完全， 后减压除去过量 DMF DMA， 得到的粗品可以直接用于下一步 反应。将上述粗品 (1 当量 )， 2- 氰基硫代乙酰胺 (1.5 当量 )， 1， 4- 二氮杂二环 [2.2.2] 辛 烷 (DABCO)(0.5 当量 ) 溶于无水乙醇中， 加热回流至烯胺酮反应完全， 冷却反应液至室温， 用稀盐酸调节反应体系至中性， 抽滤析出固体， 滤饼用无水乙醇洗涤， 干燥得到的粗品可以 直接用于下一步反应。
具体例子 ：
将 间 甲 氧 基 苯 乙 酮 (30g， 200mmol) 和 N， N- 二 甲 基 甲 酰 胺 二 甲 缩 醛 (DMFDMA) (56ml， 404mmol) 加热回流直至间甲氧基苯乙酮反应完全， 冷却反应液至室温， 旋出多余 的 DMF DMA， 然后向残余物中加入 2- 氰基硫代乙酰胺 (30g， 300mmol)， 1， 4- 二氮杂二环 [2.2.2] 辛烷 (DABCO)(20g， 100mmol) 和 400ml 乙醇， 加热回流 2-4 小时， 冷却反应液至室 温， 加入稀盐酸调节反应体系至中性， 抽滤， 用无水乙醇洗涤滤饼， 真空干燥得到真空干燥 得到黄色固体 38.7 克， 两步产率 80％， m.p. ： 234-236℃。( 分步法操作详见实施例 1， 两步 产率 64％， m.p. ： 234-236℃ )。
分步法通用操作
将间甲氧基苯乙酮 (1 当量 ) 与 N， N- 二甲基甲酰胺二甲缩醛 (DMFDMA)(2-3 当量 ) 加热回流， 直至反应完全， 冰浴冷却反应液， 抽滤析出固体， 用冷石油醚和冷乙醇洗涤滤饼， 得到的固体可以直接用于下一步反应。
将上述固体 (1 当量 )， 2- 氰基硫代乙酰胺 (1.5 当量 )， 1， 4- 二氮杂二环 [2.2.2] 辛烷 (DABCO)(0.5 当量 ) 溶于无水乙醇中， 加热回流至烯胺酮反应完全， 冷却反应液至室
温， 用稀盐酸调节反应体系至中性， 抽滤析出固体， 滤饼用无水乙醇洗涤， 即得到粗品可以 直接用于下一步反应。
具体例子见实施例 1-7 中 4a-4g 的合成。
试验例 2 细胞增殖抑制实验
1、 实验材料
RPMI-1640、 DMEM、 胎 牛 血 清、 胰 酶 等 购 自 Gibco BRL 公 司 (InvitrogenCorporation， USA)， 顺铂， 阿霉素， 溴化噻唑蓝四唑 (MTT)、 二甲亚砜 (DMSO) 为 Sigma 公司 (USA) 产品。化合物 4a-4g 在体外实验时用 DMSO 配制成 10mM 储存液， 置于 4℃ 冰箱避光保存备用， 临用时再用培养基稀释至所需浓度。
细胞系及培养 ： 本实验所用的人肝癌细胞株 (HepG2) 购于美国 ATCC 公司。
人肝癌细胞株 (HepG2)， 用含 10％胎牛血清、 100U/mL 青霉素、 100μg/mL 链霉素的 DMEM 完全培养基、 5％ CO2、 37℃培养。
2、 实验方法 (MTT 法 )
用完全培养液调整细胞浓度为 2×104/mL， 接种于 96 孔板， 每孔 200μL， 培养 24 小时后， 分别用不同剂量的化合物 4a-4g( 终浓度分别为 5， 2.5， 1.25， 0.625， 0.312， 0.16g/ ml) 处理细胞作为实验组， 同时用等体积的空白溶剂作为对照组， 对照组的 DMSO 浓度为 0.1％ (0.1％的 DMSO 对细胞增殖无影响 )。每个组设 5 个复孔， 37℃， 5％ CO2 培养。培养 48 小时后， 每孔加入 5mg/mL MTT 试剂 20μL， 继续培养 2h， 弃上清， 再加 DMSO 150μL， 振荡混 匀 15min， 用酶标仪 (λ ＝ 570nm) 测定吸光度 (A) 值 (A 值与活细胞数成正比 )， 取其平均 值。 相对细胞增殖抑制率 (％ ) ＝ ( 溶剂对照组 A570- 实验组 A570)/ 溶剂对照组 A570×100％。 同时， 根据相对细胞增殖抑制率计算出半数抑制浓度 (IC50) 来表示化合物对肿瘤细胞增 殖抑制作用。
3、 实验结果
化合物 4a-4g 在不同肿瘤细胞株上的相对细胞增殖抑制作用见下表 3 ：
表 3 体外抑制 HepG2 细胞增殖实验 ( 相对细胞增殖抑制率，％ )
化合物 4a-4g 作用人肝癌细胞 HepG2 后， 随化合物浓度增高， 抑制作用增强， 各剂 量组与溶剂对照组相比， 相对细胞增殖抑制率差异均有统计学意义 (P ＜ 0.05)。其中尤以 化合物 4a， 4b， 4c， 4d， 4g 有明显的抗 HepG2 细胞增殖活性。化合物 4a-4g， 相应 2- 取代甲酰胺化合物， 及阳性对照物 ( 顺铂和阿霉素 ) 对照处 理 HepG2 细胞 48h 的半数抑制浓度 (IC50) 见下表
表 4 体外抑制 HepG2 细胞增殖试验 (IC50， μM)
注： 以上 IC50 为重复试验三次的结果 ；； - 表示相应产物未合成。
如上表所示， 该类化合物 2 位取代基的结构对活性影响很大， 将取代的甲酰胺结 构变为相应未取代的甲酰胺结构， 该类化合物对人肝癌细胞株 HepG2 细胞增殖抑制活性可 以明显提高。
4a， 4c 体外对人肝癌 HepG2 细胞株的增殖的抑制作用明显强于阳性对照阿霉素和 顺铂， 有成为抗肿瘤药物的良好前景。
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