用于保护胍基和氨基基团的吲哚磺酰基保护性基团 技术领域 本发明涉及这样的化合物，其能够用于保护含有至少一种胍基部分和 / 或至少 一个氨基基团的有机化合物。 本发明另外涉及这些化合物的制备方法和它们作为保护剂 的用途。 本发明还涉及用于保护反应的方法和涉及其保护的化合物。
背景技术
胍基部分合适的保护仍然是化学中一个未解决的问题，这归因于已知的保护性 基团的难以除去。 这特别适用于缩氨酸化学，因为带有胍基部分的天然氨基酸精氨酸 对于多种药物的制备来说非常重要。 在偶联反应过程中，必需对精氨酸进行胍基保护， 来避免潜在的酰化，和随后的脱胍化，以及因此导致形成的不期望的鸟氨酸和 δ- 内酰 胺。
取决于偶联的策略，用于精氨酸的最普遍使用的保护性基团是对甲苯磺酰 (Tos)，2，2，5，7，8- 五甲基苯并二氢吡喃 -6- 磺酰 (Pmc) 和 2，2，4，6，7- 五甲基二 氢苯并呋喃 -5- 磺酰 (Pbf)。 但是，这些保护性基团具有过高的酸稳定性，因此需要苛刻 的除去条件和更长的除去时间。 所以，已知的胍基保护性基团倾向于在它们除去时形成 副产物。 具体的问题是它们在带有多个精氨酸残基的缩氨酸中的裂解或者在含有色氨酸 的缩氨酸中的裂解。 Carpino 等人 (Tetrahedron Letters1993，第 34 卷第 49 期，7829-7832) 比较了在用于精氨酸侧链保护时的 Pbf 保护性基团与 Pmc 保护性基团。
WO01/57045 公开了三环磺胺，其是经由苯并呋喃 -，苯并噻吩 - 和吲哚 - 中间 体来获得的。
等 人 描 述 了 杂 环 磺 酰 脲 的 合 成， 其 例 如 包 含 吲 哚 部 分 (J.HeterocyclicChem.，1996，33，763-766)。 发明内容 本发明的一个目标是提供一种化合物，其易于保护有机化合物的胍基部分，并 且其能够容易的除去。
上述目标是通过权利要求 1 的化合物来实现的，该化合物可以通过权利要求 5 的 方法来制备，并且其根据权利要求 9 用于权利要求 12 的保护方法中，来提供权利要求 16 的化合物。
在一方面，本发明涉及一种式 (II) 的化合物 ：
其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷 氧基或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ； R3 是氢、卤素、C1-6 烷基、C1-6 烷氧基、C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；和 X 是氯或者溴。
这里和下面，术语 “C1-n 烷基”被理解为表示任何的含有 1-n 个碳原子的线性或 者支化的烷基基团。 例如术语 “C1-6 烷基” 包含基团例如甲基，乙基，丙基，异丙基， 丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，异戊基 (3- 甲基丁基 )，新戊基 (2，2- 二甲基丙 基 )，己基，异己基 (4- 甲基戊基 ) 等等。
因此，术语 “C1-n 烷氧基”表示这样的基团，其由上述的 C1-n 烷基基团和通过单 个共价键连接的氧原子组成。
以同样的方式，术语 “C1-6 烷基硫”表示这样的基团，其由上述的 C1-6 烷基基团 和通过单个共价键连接的硫原子组成。
这里和下面，术语 “卤素” 表示氟，氯，溴和碘。
有利的，本发明涉及式 (II) 的化合物，其中 R1，R2，R3 和 X 定义同上，其不包 括 1- 甲基吲哚 -3- 磺酰氯。
在一种优选的实施方案中， R1 和 R2 独立的是 C1-4 烷基、 C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷 基硫 ；R3 是氢或者卤素 ；和 X 是氯或者溴。
在一种具体的实施方案中， R1 和 R2 二者都是甲基 ；R3 是氢 ；和 X 是氯，该化 合物是 1，2- 二甲基吲哚 -3- 磺酰氯。 为了方便起见，该化合物将缩写为 MIS-CI。
在本发明的另一方面，式 (II) 的化合物是通过这样一种方法制备的，该方法包 含步骤 ：将式 (I) 的化合物或者其盐与草酰氯或者草酰溴进行反应 ：
其中 R1， R2 和 R3 的定义同上。
在一种优选的实施方案中， R1 和 R2 独立的是 C1-4 烷基， C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷 基硫，和 R3 是氢或者卤素。
在一种更优选的实施方案中， R1 和 R2 二者都是甲基， R3 是氢。
在式 (II) 化合物的制备方法中，式 (I) 的化合物的酸形式和盐形式都可以用作反 应物。 可以使用式 (I) 的化合物的任何盐形式。 合适的盐是例如钠盐，钾盐，钙盐和吡 啶盐。
在一种优选的实施方案中，所述反应是用式 (I) 化合物的吡啶盐进行的。
优选将草酰氯用于所述反应。
对于该制备方法来说，可以使用任何合适的溶剂或者合适溶剂的混合物。 合适 的溶剂是这样的溶剂，其不与反应物或者与产物反应，并且其将反应物溶解到足够的程 度。 合适的溶剂的例子是二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，四氢呋喃和 1，4- 二噁烷。 优选 使用二氯甲烷作为溶剂。 该反应还可以无溶剂进行。
便利的，该反应是在 N， N- 二甲基甲酰胺的存在下进行的。
在本发明的另一方面，使用式 (II) 的化合物来保护含有至少一种胍基部分和 / 或 至少一个氨基基团的有机化合物 ：
其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷 氧基或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ； R3 是氢、卤素、C1-6 烷基、C1-6 烷氧基、C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；和 X 是氯或者溴。
在一种优选的实施方案中，该有机化合物是任选的树脂负载的缩氨酸化合物， 其是任选的侧链保护的和 / 或在自由端保护的 ；R1 和 R2 独立的是 C1-4 烷基、 C1-4 烷氧基 或者 C1-4 烷基硫， R3 是氢或者卤素。
这里和下面，术语 “缩氨酸化合物” 是以下文所定义的宽泛的方式来解释的。 所以，术语 “缩氨酸化合物” 被理解为表示下面类别 (a)-(d) 中之一的任何的化合物 ：
(a) 缩氨酸，即，通过在一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基之间形成酰胺 键而产生的化合物。 该酰胺键典型的是在一个氨基酸的 C-1 和另一个氨基酸的 N-2 之间 形成的 ( 真缩氨酸键 )，但是带有通过其他酰胺键 ( 异缩氨酸键 ) 连接的残基的化合物也 表示处于术语 “缩氨酸化合物” 范围内。 由 2-15 个氨基酸残基组成的低聚缩氨酸和由 16- 大约 50 个氨基酸残基组成的聚缩氨酸是这种类别典型的缩氨酸。 该氨基酸残基可以 是任何天然或者非天然的氨基酸。 缩氨酸的一个例子是 H-Arg-Val-OH。
(b) 氨基酸，其不仅可以是通常在蛋白质中发现的氨基酸 ( 天然的 α- 氨基 酸 )，而且可以是任何非天然的氨基酸。 例子是 H-Ala-OH( 天然氨基酸 ) 和高精氨酸 ( 非天然氨基酸 )。
(c) 缩 氨 酸 衍 生 物， 表 示 这 样 的 缩 氨 酸， 在 其 中 一 种 或 多 种 氨 基 酸 残 基 已 经 例 如 通 过 酰 化， 烷 基 化， 形 成 酯 或 者 形 成 酰 胺 进 行 了 化 学 改 性。 例 子 是 Ac-Phe-Arg-Gly-Ala-Val-OH(SEQ ID NO5)， H-Phe-Arg-Gly-Ala-Val-NH2(SEQ ID NO6) 和 H-Arg-Gly-Ala-Gly-Gly-Lys(Nε- 十 四 烷 酰 基 )-Ala-Gly-Gly-OH(SEQ ID NO7)。
(d) 氨基酸衍生物，表示这样的氨基酸，其已经例如通过酰化，烷基化，形成酯 或者形成酰胺进行了化学改性。 例子是 H-AIa-OMe。
在另外一种优选的实施方案中，该缩氨酸化合物包含至少一种胍基部分和任选 的至少一个氨基基团，该胍基部分是精氨酸，高精氨酸或者去精氨酸残基的一部分。 更 优选，所述的胍基部分是精氨酸或者高精氨酸残基的一部分。 甚至更优选的，该缩氨酸 化合物是 Z-Arg-OH。
普通氨基酸名字的前缀 “高”( 例如高精氨酸 ) 表示所述的氨基酸在碳链中包含 一个另外的亚甲基基团。
相反，普通氨基酸名字的前缀 “去”( 去精氨酸 ) 表示除去了碳链中的一个亚甲
基基团。 在另外一种优选的实施方案中，该缩氨酸化合物包含至少一个氨基基团和任选 的至少一种胍基部分，所述的至少一个氨基基团是 N- 端接的氨基基团或者是氨基酸残基 侧链的一部分。
更优选的，待保护的氨基基团是所述的缩氨酸化合物的 N- 端接的氨基基团。 最 优选该缩氨酸化合物是 H-Ala-OMe。
同样更优选的，待保护的氨基基团是所述的缩氨酸化合物的氨基酸残基侧链的 一部分。 甚至更优选的，所述的氨基基团是赖氨酸，高赖氨酸或者去赖氨酸残基的一部 分。 最优选，所述的缩氨酸化合物是 Z-Lys-OH。
在另一方面，本发明涉及一种保护有机化合物的方法，该化合物包含至少一种 胍基部分和 / 或一个氨基基团，所述方法包含将所述的化合物与式 (II) 的化合物反应 ：
其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷 氧基或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ； R3 是氢、卤素、C1-6 烷基、C1-6 烷氧基、C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；和 X 是氯或者溴， 因此提供了这样一种化合物，其包含式 (III) 的至少一部分，
其中 R1、 R2 和 R3 定义如上， m 是 0 或者 1。
在一种实施方案中， m 是 1，因此提供了这样一种化合物，其包含式 (IV) 的至 少一部分，
其中 R1、 R2 和 R3 定义如上。
在另外一种实施方案中，m 是 0，因此提供了这样一种化合物，其包含式 (V) 的 至少一部分，
其中 R1、 R2 和 R3 定义如上。
在一种优选的实施方案中， R1 和 R2 独立的是 C1-4 烷基， C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷 基硫，R3 是氢或者卤素。 在一种实施方案中，m 是 1，在另外一种实施方案中，m 是 0。
在一种更优选的实施方案中， R1 和 R2 是甲基， R3 是氢， X 是氯。 在一种实施 方案中， m 是 1 ；在另外一种实施方案中， m 是 0。
在另外一种优选的实施方案中，该有机化合物是任选的树脂负载的缩氨酸化合 物，其是任选的侧链保护的和 / 或自由端保护的，因此提供了所述的缩氨酸化合物，其 包含式 (III) 的至少一部分，
其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷 氧基或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ； R3 是氢、卤素、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基、 C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；m 是 0 或者 1。
优选 R1 和 R2 独立的是 C1-4 烷基、 C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷基硫 ；R3 是氢或者卤 素。 最优选 R1 和 R2 是甲基 ；R3 是氢。
在一种优选的实施方案中，所述的缩氨酸化合物包含至少一种胍基部分，该胍 基部分是精氨酸，高精氨酸或者去精氨酸残基的一部分，优选是精氨酸或者高精氨酸残 基的一部分，因此提供了所述的缩氨酸化合物，其包含式 (III) 的至少一部分，其中 R1 是 氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基 硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ；R3 是氢、卤素、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基、 C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；m 是 1 ；优选其中 R1 和 R2 独立的 是 C1-4 烷基、 C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷基硫 ；R3 是氢或者卤素 ；更优选其中 R1 和 R2 是甲 基 ；R3 是氢。
最优选所述的待反应的缩氨酸化合物仅仅包含一个胍基部分。
在一种优选的实施方案中，所述的待反应的缩氨酸化合物是 N-α- 苄氧基 - 羰 基 -L- 精氨酸 (Z-Arg-OH)。
在一种甚至更优选的实施方案中，待反应的缩氨酸化合物是 Z-Arg-OH ；式 (II) 化合物的 R1 和 R2 是甲基，式 (II) 化合物的 R3 是氢，式 (II) 化合物的 X 是氯，因此提供 了 N-α- 苄氧基羰基 -N-ω-(1，2- 二甲基吲哚 -3- 磺酰基 )-L- 精氨酸。 为了方便，这 种化合物在下面缩写为 Z-Arg(MIS)-OH。
在另外一种优选的实施方案中，所述的缩氨酸化合物包含至少一个氨基基团，
所述的至少一个氨基基团是 N- 端接的氨基基团或者是氨基酸残基侧链的一部分，因此提 供了所述的缩氨酸化合物，其包含式 (III) 的至少一部分，其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一 起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ；R3 是氢、卤素、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧 基、 C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；和 m 是 0 ；优选其中 R1 和 R2 独立的是 C1-4 烷基、 C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷基硫 ；R3 是氢或者卤素 ；更优选，其中 R1 和 R2 是甲基， R3 是氢。
最优选，所述的待反应的缩氨酸化合物仅仅包含一个氨基基团，其是 N- 端接的 氨基基团或者其是氨基酸残基侧链的一部分。
甚至更优选的，所述的待反应的缩氨酸化合物的氨基基团是 N- 端接的氨基基 团。
在一种优选的实施方案中，所述的待反应的缩氨酸化合物是 L- 丙胺酸甲酯 (H-Ala-OMe)。
在一种甚至更优选的实施方案中，该缩氨酸化合物是 H-Ala-OMe ；式 (II) 化合 1 物的 R 和 R2 是甲基，式 (II) 化合物的 R3 是氢，式 (II) 化合物的 X 是氯，因此提供了 N-α-(1，2- 二甲基吲哚 -3- 磺酰基 )-L- 丙胺酸甲酯。 为了方便，这种化合物在下面缩 写为 MIS-AIa-OMe。
同样甚至更优选的，所述待反应的缩氨酸化合物的氨基基团是氨基酸残基侧链 的一部分。 最优选所述的氨基基团是赖氨酸，高赖氨酸或者去赖氨酸残基的一部分。
作为用于该保护方法的溶剂，可以使用任何的能够溶解反应物的惰性液体溶 剂。 可以使用的溶剂包括卤化烃例如二氯甲烷，四氯化碳和二氯乙烷 ；醚类例如二乙基 醚，四氢呋喃，2- 甲基四氢呋喃 ；羧基酯和内酯例如乙酸乙酯，乙酸甲酯和戊内酯 ；和 含有杂原子的有机溶剂例如丙酮，乙腈，二甲基甲酰胺和二甲基亚砜。 该溶剂可以单独 使用或者作为混合物使用。 任选的，如果反应物的溶解需要水存在，则该溶剂或者溶剂 混合物可以包含水。 优选的溶剂是单独的或者有水存在的二氯甲烷和丙酮。
任选的，该反应混合物可以包含无机或者有机碱。 无机碱的例子是氢氧化钠， 氢氧化钾，氢氧化锂和碳酸钠。 有机碱的例子是二异丙基乙基胺，吡啶和三乙基胺。 优 选的碱是氢氧化钠和二异丙基乙基胺。
式 (II) 化合物的量随着反应器体积而变化，并且相对于有机化合物 ( 该有机 化合物包含至少一种胍基部分和 / 或一个氨基基团 ) 的摩尔比为 0.9 ∶ 1-4 ∶ 1，优选 1 ∶ 1-3 ∶ 1。 式 (II) 的化合物可以分成几部分加入到反应混合物中。
该保护方法可以在低温或者稍高的温度进行。 例如合适的温度范围是 -10℃到 30℃，优选 0℃到室温。
反应时间取决于不同的因素，例如温度或者式 (II) 的化合物与有机化合物 ( 该有 机化合物包含至少一种胍基部分和 / 或一个氨基基团 ) 的摩尔比。 所以，该反应可以在 几分钟或者几小时内完成。
在另一方面，本发明涉及一种有机化合物，其包含式 (III) 的至少一部分，
其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷 氧基或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ； R3 是氢、卤素、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基、 C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；m 是 0 或者 1。
在一种实施方案中， m 是 1，因此该有机化合物包含式 (IV) 的至少一部分 ：
其中 R1、 R2 和 R3 定义如上。 在另外一种实施方案中， m 是 0，因此该有机化合物包含式 (V) 的至少一部分：
其中 R1、 R2 和 R3 定义如上。
在一种优选的实施方案中， R1 和 R2 独立的是 C1-4 烷基， C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷 基硫，R3 是氢或者卤素。 在一种实施方案中，m 是 1，在另外一种实施方案中，m 是 0。
在一种更优选的实施方案中， R1 和 R2 是甲基， R3 是氢， X 是氯。 在一种实施 方案中， m 是 1，在另外一种实施方案中， m 是 0。
在另外一种优选的实施方案中，该有机化合物是任选的树脂负载的缩氨酸化合 物，其是任选的侧链保护的和 / 或在自由端保护的，并且其包含式 (III) 的至少一部分，
其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷 氧基或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ；R3 是氢、卤素、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基、 C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；m 是 0 或者 1，优 选 m 是 1。
优选 R1 和 R2 独立的是 C1-4 烷基， C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷基硫， R3 是氢或者卤 素。 最优选 R1 和 R2 是甲基， R3 是氢。
在一种优选的实施方案中，所述的缩氨酸化合物包含至少一种胍基部分，该胍 基部分是精氨酸，高精氨酸或者去精氨酸残基的一部分，优选是精氨酸或者高精氨酸残 基的一部分，该化合物包含式 (III) 的至少一部分，其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基 或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成 式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ；R3 是氢、卤素、C1-6 烷基、C1-6 烷氧基、C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；和 m 是 1 ；优选其中 R1 和 R2 独立的是 C1-4 烷基、C1-4 烷氧基或 者 C1-4 烷基硫 ；R3 是氢或者卤素 ；和更优选其中 R1 和 R2 是甲基 ；R3 是氢。
最优选所述的缩氨酸化合物仅仅包含一个胍基部分。
甚至更优选所述的缩氨酸化合物是 Z-Arg(MIS)-OH。
在另外一种优选的实施方案中，所述的缩氨酸化合物包含至少一个氨基基团， 所述的至少一个氨基基团是 N- 端接的氨基基团或者是氨基酸残基侧链的一部分，其包含 式 (III) 的至少一部分，其中 R1 是氢、C1-6 烷基、C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ；R3 是氢、卤素、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基、 C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；和 m 是 0 ；优选其中 R1 和 R2 独立的是 C1-4 烷基、C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷基硫 ；R3 是氢或者卤 素 ；和更优选，其中 R1 和 R2 是甲基， R3 是氢。
同样更优选的，所述的缩氨酸化合物仅仅包含一个氨基基团，其是 N- 端接的氨 基基团或者其是氨基酸残基侧链的一部分。
甚至更优选的，所述的缩氨酸化合物的氨基基团是 N- 端接的氨基基团。
最优选的，所述的缩氨酸化合物是 MIS-Ala-OMe。
同样甚至更优选的，所述的缩氨酸化合物的氨基基团是氨基酸残基侧链的一部 分。 最优选所述的氨基基团是赖氨酸，高赖氨酸或者去赖氨酸残基的一部分。
本发明的另一方面是在后面的步骤中改性和 / 或偶联按照本发明所获得的有机 化合物。
因为按照本发明所获得的有机化合物是重要的构件，因此可以使用它们来形成 有机化合物，该化合物可以用作例如药物物质。
根据本发明，该有机化合物是在后面的步骤中化学改性的，该化合物包含式 (III) 的至少一部分，
其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ； R3 是氢、卤素、C1-6 烷基、C1-6 烷氧基、C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；和 m 是 0 或者 1。
在一种优选的实施方案中，在后面的步骤中改性的有机化合物是任选的树脂负 载的缩氨酸化合物，其是任选的侧链保护的和 / 或在自由端保护的，并且其包含式 (III) 的至少一部分，其中 R1、 R2 和 R3 和 m 定义同上。
优选所述的缩氨酸化合物包含至少一种胍基部分，该胍基部分是精氨酸，高精 氨酸或者去精氨酸残基的一部分，优选是精氨酸或者高精氨酸残基的一部分，该化合物 包含式 (III) 的至少一部分，其中 R1、 R2 和 R3 和 m 定义同上 ；优选其中 R1 和 R2 独立的 是 C1-4 烷基、 C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷基硫， R3 是氢或者卤素 ；和更优选其中 R1 和 R2 是 甲基 ；R3 是氢。
最优选所述的缩氨酸化合物仅仅包含一个胍基部分。
甚至更优选所述的缩氨酸化合物是 Z-Arg(MIS)-OH。
改性包含任何这样的有机反应，其与本发明的保护性基团相适应。 作为一个例 子， Z-Arg(MIS)-OH 可以通过 Z 基团的脱保护来改性，因此形成了 H-Arg(MIS)-OH。
任选的，因此获得的改性化合物进行至少一次进一步的改性。 作为一个例子， 通过首次改性获得的 H-Arg(MIS)-OH 可以通过保护它的 N- 端基来进一步改性，因此形 成了例如 Fmoc-Arg(MIS)-OH。 该脱保护和保护步骤可以使用缩氨酸合成领域已知的反应条件来进行。
同样根据本发明，将有机化合物在后面的步骤偶联到有机化合物 Q 上，前者的 有机化合物包含式 (III) 的至少一部分 ：
其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷 氧基或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ； R3 是氢、卤素、C1-6 烷基、C1-6 烷氧基、C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；和 m 是 0 或者 1。
任选的，所述的偶联步骤可以重复至少一次和 / 或可以用合适的偶联化合物进 行至少一种另外的偶联。 因此获得的化合物可以是化学改性的，并且在所述的化合物是 树脂负载的情况中可以随后从该树脂上分离。
在一种优选的实施方案中，该在后面的步骤中偶联到有机化合物 Q 上的有机 化合物是任选的树脂负载的缩氨酸化合物，其是任选的侧链保护的和 / 或在自由端保护 的，其包含式 (III) 的至少一部分，其中 R1、 R2 和 R3 和 m 定义同上。
优选所述的缩氨酸化合物包含至少一种胍基部分，该胍基部分是精氨酸，高精 氨酸或者去精氨酸残基的一部分，优选是精氨酸或者高精氨酸残基的一部分，该化合物 包含式 (III) 的至少一部分，其中 R1、 R2 和 R3 和 m 定义同上 ；优选其中 R1 和 R2 独立的 是 C1-4 烷基、 C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷基硫， R3 是氢或者卤素 ；和更优选其中 R1 和 R2 是
甲基 ；R3 是氢。
最优选所述的缩氨酸化合物仅仅包含一个胍基部分。
甚 至 更 优 选 所 述 的 缩 氨 酸 化 合 物 是 Fmoc-Arg(MIS)-OH 或 者 Z-Arg(MIS)-OH。
有机化合物 Q 优选是任选的树脂负载的缩氨酸化合物，其是任选的侧链保护的 和 / 或自由端保护的。 最优选有机化合物 Q 是这样的缩氨酸化合物，其是任选的侧链保 护的和其是任选的树脂负载的。
在 一 种 优 选 的 实 施 方 案 中， 所 述 的 缩 氨 酸 化 合 物 是 H-Val- 树 脂 或 者 H-Trp(Boc)-Ala-Gly- 树 脂， 优 选 该 树 脂 源 自 于 Sieber 酰 胺 树 脂 (9-Fmoc- 氨 基 - 呫 吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂 )。
在 一 种 甚 至 更 优 选 的 实 施 方 案 中， 待 偶 联 的 缩 氨 酸 化 合 物 是 Fmoc-Arg(MIS)-OH， 并 且 所 述 的 缩 氨 酸 化 合 物 偶 联 到 其 上 的 缩 氨 酸 化 合 物 是 H-Val-NH- 呫 吨 -3- 氧 基 -Merrifield 树 脂， 因 此 提 供 了 Fmoc-Arg(MIS)-Val-NH- 呫 吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂。
优选所述的偶联反应重复三次，因此提供了 Fmoc-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(M IS)-Arg(MIS)-Val-NH- 呫吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂 (SEQ ID NO8)。 还优选在所述的 树脂负载的缩氨酸的 N- 端基脱保护之后，将 Fmoc-Phe-OH 偶联，因此提供了 Fmoc-Phe -Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Val-NH- 呫吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂 (SEQ ID NO1)。 更优选将该 N- 端基脱保护和乙酰基化，因此提供了 Ac-Phe-Arg(MIS)-Arg( MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Val-NH- 呫吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂 (SEQ ID NO1)。 最 优选将所述的树脂负载的缩氨酸从树脂上分离，因此提供了 Ac-Phe-Arg(MIS)-Arg(MIS )-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Val-NH2(SEQ ID NO2)。
在 一 种 同 样 甚 至 更 优 选 的 实 施 方 案 中， 待 偶 联 的 缩 氨 酸 化 合 物 是 Z-Arg(MIS)-OH， 所 述 的 化 合 物 偶 联 到 其 上 的 缩 氨 酸 化 合 物 是 H-Trp(Boc)-Ala-Gly-NH- 呫 吨 -3- 氧 基 -Merrifield 树 脂， 因 此 提 供 了 Z-Arg(MIS)-Trp(Boc)-Ala-Gly-NH- 呫吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂 (SEQ ID NO3)。 优 选将所述的树脂负载的缩氨酸从树脂上分离，因此提供了 Z-Arg(MIS)-Trp(Boc)-Ala-GI y-NH2(SEQ ID NO3)。
向有机化合物 Q 上的偶联过程可以按照本领域技术人员已知的任何偶联方法来 进行。 在待偶联的有机化合物是缩氨酸化合物的情况中，偶联优选是在固相或者液相中 进行的。 最优选的，任选的在前和任选的在后的偶联步骤也是在固相和 / 或液相中进行 的。
术语 “固相”被理解为表示固相缩氨酸合成 (SPPS)。 在 SPPS 中，氨基酸或者 缩氨酸基团 ( 任选的是保护的 ) 被结合到固体载体树脂上。 然后，连续的将氨基酸或者 缩氨酸基团 ( 任选的是保护的 ) 结合到载体负载的缩氨酸上，直到形成所感兴趣的缩氨酸 材料。 该载体负载的缩氨酸然后典型从载体上切割下来，并且进行进一步的加工和 / 或 纯化。 在一些情况中，固相合成产生了成熟的缩氨酸产品 ；在其他情况中，与载体分离 的缩氨酸 ( 即， “缩氨酸中间体片段” ) 被用于制备更大的、成熟的缩氨酸产品。
术语 “溶液相” 被理解为表示溶液相缩氨酸合成。 在溶液相缩氨酸合成中，两种缩氨酸中间体片段 ( 任选的是保护的 )，或者缩氨酸中间体片段和反应性氨基酸 ( 二 者都任选是保护的 ) 是在适当的溶剂中，通常在另外的反应物存在下偶联的，该另外的 反应物促进了该偶联反应的效率和品质。 缩氨酸中间体片段是反应性排列的，以使得一 个片段的 N- 端基偶联到另一片段的 C- 端基上，反之亦然。 另外，侧链保护性基团 ( 其 是在固相合成中存在的 ) 通常在溶液相偶联过程中保持在所述片段上，来保证所述片段 端部的特定反应性。 这些侧链保护性基团典型的不被除去，直到形成成熟的缩氨酸化合 物。
本发明的另一方面是有机化合物的分离，该化合物包含式 (III) 的至少一部分 ：
其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷 氧基或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ； R3 是氢、卤素、C1-6 烷基、C1-6 烷氧基、C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；和 m 是 0 或者 1， 所述的分离任选的是在至少一种清除剂存在下进行的。
在一种优选的实施方案中，分离方法是通过使用酸，优选使用三氟乙酸 (TFA) 来进行的。 该酸是单独使用的或者是作为与惰性溶剂的混合物来使用的。
合适的惰性溶剂的一个例子是二氯甲烷 (DCM)。 优选酸和溶剂的摩尔比是 1 ∶ 0 到 1 ∶ 2，优选是 1 ∶ 0 到 1 ∶ 1。
在分离之后，所形成的磺酰鎓化合物可以通过任何合适的清除剂来收集。 清除 剂的例子是三异丙基硅烷 (TIS)，水，二甲基硫，C1-4 烷氧基苯例如 1，3，5- 三甲氧基苯
(TMB) 和 C1-4 烷氧基酚例如 3，4- 二甲氧基酚和 3，5- 二甲氧基酚。 该清除剂可以单独 使用或者作为混合物例如水 /TIS 使用。
优选将 C1-4 烷氧基苯和 C1-4 烷氧基酚用作清除剂，因为它们是比例如水更低极性 的亲核试剂。 作为结果，因此获得的加成物更容易在下面的加工方法中从目标化合物中 分离。 在一种优选的实施方案中，所述的待分离的有机化合物是任选的树脂负载的缩 氨酸化合物，其是任选的侧链保护的和 / 或在自由端保护的。 优选 R1 和 R2 独立的是 C1-4 烷基、C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷基硫 ；R3 是氢或者卤素，最优选 R1 和 R2 是甲基，R3 是氢。
在一种更优选的实施方案中，所述的待分离的缩氨酸化合物是 Ac-Phe-Arg(M IS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Val-NH- 呫 吨 -3- 氧 基 -Merrifield 树 脂 (SEQ ID NO1)，因此提供了 Ac-Phe-Arg-Arg-Arg-Arg-Val-NH2(SEQ ID NO2)。 优选将 TFA/ DCM/TIS/ 水作为分离溶液使用，最优选的摩尔比是 50 ∶ 45 ∶ 2.5 ∶ 2.5。 同样优选的， 将 TFA/DCM/3，4- 二甲氧基酚作为分离溶液使用，最优选的摩尔比是 50 ∶ 40 ∶ 10。 同 样 优 选 的， 将 TFA/DCM/3，5- 二 甲 氧 基 酚 作 为 分 离 溶 液 使 用， 最 优 选 摩 尔 比 是 50 ∶ 40 ∶ 10。 同样优选的，将 TFA/DCM/TMB 作为分离溶液使用，最优选的摩尔比是
50 ∶ 40 ∶ 10。
在 一 种 同 样 更 优 选 的 实 施 方 案 中， 所 述 的 待 分 离 的 缩 氨 酸 化 合 物 是 Z-Arg(MIS)-Trp(Boc)-Ala-Gly-NH- 呫吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂 (SEQ ID NO3)，因 此提供了 Z-Arg-Trp-Ala-Gly-NH2(SEQ ID NO4)。 优选将 TFA/DCM/TMB 用作分离溶 液，最优选的摩尔比 50 ∶ 40 ∶ 10。
在 一 种 同 样 更 优 选 的 实 施 方 案 中， 所 述 的 待 分 离 的 缩 氨 酸 化 合 物 是 MIS-Ala-OMe，因此提供了 H-Ala-OMe。 优选将 TFA/ 二甲基硫用作分离溶液，最优选 的摩尔比是 90 ∶ 10。 实施例 下面的实施例进一步解释本发明，但是目的绝非限制。 实施例 1-8 涉及制备方 法，实施例 9-20 涉及除去检验。
如果没有其他指示，则使用氨基酸残基的 L- 对映体，并且全部的试剂是市售 的。
缩写 ：
Boc ＝叔丁氧基羰基
DIC ＝二异丙基碳二酰亚胺
DIPEA ＝二异丙基乙基胺
ESMS ＝电喷雾质谱
Fmoc ＝芴 -9- 基甲氧基羰基
HOAt ＝ N- 羟基 -7- 氮杂苯并三唑
HOBt ＝ N- 羟基苯并三唑
HRMS(Cl) ＝高解析度质谱 ( 化学电离 )
MALDI-TOF ＝基质辅助激光解吸飞行电离时间
MIS ＝ 1，2- 二甲基吲哚 -3- 磺酰基
PyBOP ＝苯并三唑 -1- 氧基 - 三吡咯烷酮鏻六氟磷酸盐
TFA ＝三氟乙酸
TIS ＝三异丙基硅烷
TMB ＝ 1，3，5- 三甲氧基苯
Z-OSu ＝ N-( 苄氧基羰氧基 ) 琥珀酰亚胺
实施例 1 ：吡啶 1，2- 二甲基吲哚 -3- 磺酸盐的制备
将 1，2- 二 甲 基 吲 哚 (19.7g，135.9mmol) 和 三 氧 化 硫 吡 啶 络 合 物 (20.4g， 128.3mmol) 在氩气氛下溶解在吡啶 (100mL) 中。将该反应混合物回流 40 小时，然后冷却 到室温。 加水 (400mL) 后，用二乙基醚 ( 每次 250mL) 将所形成的溶液清洗 4 次。 蒸发 水相来干燥，并且在真空干燥器中干燥来产生作为红色油的吡啶 1，2- 二甲基吲哚 -3- 磺 酸盐 (37.6g，96％产率 )。 1
H NMR(400MHz， D2O) ：δ ＝ 8.44(d，2H， J ＝ 5.8Hz)，8.31(m，1H)， 7.75(m，2H)，7.67(d，1H， J ＝ 7.7Hz)，7.14(d，1H， J ＝ 7.4Hz)，7.05(m，2H)， 3.38(s，3H)，2.41(s，3H)。
15CN 102026971 A CN 102026986 A
13说明书13/19 页C NMR(100MHz， D2O) ：δ ＝ 147.0，140.9，139.2，135.6，127.3，124.1， 122.0，121.0，119.2，112.8，109.9，29.2，10.4。
HRMS(Cl) ：m/z， 对 于 C10H10NO3S[M-H]+ 来 说 计 算 为 224.0386， 测 得 为 224.0388。
实施例 2 ：1，2- 二甲基吲哚 -3- 磺酰氯 (MIS-CI) 的制备
将实施例 1 的吡啶 1，2- 二甲基吲哚 -3- 磺酸盐 (16.4g，53.7mmol) 在氮气氛 下悬浮于无水的二氯甲烷 (120mL) 中。 在冰浴中冷却该溶液，并且缓慢的加入草酰氯 (14mL，161mmol)。 然后，在搅拌下非常缓慢的加入 N，N- 二甲基甲酰胺 (0.5mL)。 将 该反应混合物在冰浴中搅拌另外 30 分钟，然后置于室温。 6 小时后，将该溶液在冰浴中 冷却。 加入另外的草酰氯 (4mL，46mmol) 和 N， N- 二甲基甲酰胺 (0.4mL)，并将该反 应混合物在室温搅拌另外 15 小时。 加入草酰氯 (2mL，23mmol) 和另外搅拌 4 小时后， 该反应进行完全 ( 通过 HPLC 进行测量 ；在测量之前，用小等分的甲醇处理 20 分钟 )。
将该反应混合物室温蒸发干燥。 加入 N，N- 二甲基甲酰胺 (200mL)，然后加入 水 (100mL)。 搅拌该混合物 5 分钟来除去草酰氯。 然后，相分离，用水 ( 每次 100mL) 清洗有机相 3 次。 将该有机相在无水硫酸镁上干燥，并且蒸发干燥，这提供了作为紫色 固体的 1，2- 二甲基吲哚 -3- 磺酰氯 (MIS-CI)(10.2g，78％产率 )。 H NMR(400MHz，DMSO) ：δ ＝ 7.82(d，1H，J ＝ 7.8Hz)，7.36(d，1H，J ＝ 8.0Hz)，7.08(m，2H)，7.00(m，2H)，3.63(s，3H)，2.56(s，3H)。 13
C NMR (100 MHZ ， DMSO ) ：δ ＝ 137 . 2 ， 135 . 9 ， 125 . 5 ， 121 . 4 ， 120 . 8 ， 120.1，109.7，30.0，11.3。
HRMS(Cl) ：m/z， 对 于 C10H10NO2S[M-Cl]+ 来 说 计 算 为 208.0426， 测 得 为 208.0427。
实施例 3 ：Z-Arg(MIS)-OH 的制备
将 Z-Arg-OH(2g，6.5mmol) 溶解在丙酮 (65mL) 和 3N 氢氧化钠水溶液 (18mL， 54mmol) 中。 将该反应在冰浴中冷却，在 10 分钟内加入溶解在丙酮 (50mL) 中的实施 例 2 的 MIS-Cl(1.59g，6.5mmol)。 将该反应混合物在 0 ℃搅拌 1 小时。 然后，加入另 外的在丙酮 (20mL) 中的 MIS-Cl(0.95g，3.9mmol)，随后在 0 ℃搅拌 90 分钟。 最后， 加入最后一部分的在丙酮 (15mL) 中的 MIS-Cl(0.95g.3.9mmol)。 将该反应混合物在 0℃ 搅拌另外 30 分钟，在室温搅拌另外 3 小时，直到通过 TLC( 己烷∶乙酸乙酯 1 ∶ 1) 不 能检测出 MIS-CI 为止。 该反应的 pH 用 10％的柠檬酸水溶液中和。 在丙酮真空蒸发之 后，加入水 (100mL)，将 pH 用 10％的柠檬酸水溶液酸化到 pH3。 然后，将该溶液用乙 酸乙酯 ( 每次 100mL) 萃取三次。 将有机相合并，水洗 3 次 ( 每次 75mL)，在硫酸镁上 干燥，最后蒸发干燥。 将所获得的粗产物通过柱色谱法 ( 二氯甲烷，甲醇，乙酸 ) 净化 两次。 合并净化部分，真空除去溶剂，得到一种油。 为了沉淀，加入最小量的乙酸乙 酯，二氯甲烷和甲醇的混合物，随后加入己烷，直到不再观察到另外的沉淀。 滗析掉溶 剂，用二氯甲烷和己烷的混合物清洗固体 4 次，最后在硫酸镁上干燥，获得 18％ (0.61g) 的 Z-Arg(MIS)-OH。 1
H NMR(400MHz， DMSO) ：δ ＝ 7.85(d，1H， J ＝ 7.6Hz)，7.52(d，1H， J ＝ 8.0Hz)，7.43(d，1H， J ＝ 8.0Hz)，7.30(m，5H)，7.10(m，2H)，5.01(s，2H)，
163 . 87( m ， 1 H ) ， 3 . 66( s ， 3 H ) ， 3 . 0( m ， 2 H ) ， 2 . 60( s ， 3 H ) ， 1 . 64( m ， 1 H ) ， 1 . 49( m ， 1H)，1.41(m，2H)。 13
C NMR (100 MHZ ， DMSO ) ：δ ＝ 174 . 4 ， 157 . 0 ， 156 . 8 ， 139 . 4 ， 137 . 7 ， 135.9，129.0，128.5，128.4，125.2，122.1，121.1，120.1，110.4，66.1，54.3，40.0， 30.2，28.9，26.4，11.4。
HRMS(CI) ：m/z， 对 于 C24H30N5O6S[M+H]+ 来 说， 计 算 为 516.1911， 测 得 为 516.1911。
实施例 4 ：Fmoc-Arg(MIS)-OH 的制备
1.H-Arg(MIS)-OH 的制备
将获自实施例 3 的 Z-Arg(MIS)-OH(486mg，0.94mmol) 和 10 ％ Pd/C(110mg) 的甲醇 (60mL) 溶液的混合物在大气压下氢化过夜。 在该反应仍然没有进行完全时 ( 通 过 TLC 测量 ；二氯甲烷∶甲醇∶乙酸，90 ∶ 9 ∶ 1)，加入 10％ Pd/C(100mg)，将该反 应氢化另外 24 小时，直到完全 ( 通过 TLC 测量 )。
将 该 反 应 混 合 物 通 过 寅 式 盐 过 滤， 并 且 蒸 发 干 燥， 产 生 98 ％ (352mg) 的 H-Arg(MIS)-OH。 1
H NMR(400MHz， DMSO) ：δ ＝ 7.83(d，1H， J ＝ 7.6Hz)，7.47(d，1H， J ＝ 8.1Hz)，7.42(d，1H， J ＝ 8.1Hz)，7.11(m，2H)，3.65(s，3H)，3.17(m，1H)， 3.00(m，2H)，2.60(s，3H)，1.65(m，1H)，1.54(m，1H)，1.42(m，2H)。
2.Fmoc-Arg(MIS)-OH 的制备
将 Fmoc-Cl(84mg，0.32mmol) 溶解在 1，4- 二噁烷 (0.5mL)。 加入叠氮化钠 (25mg，0.39mmol) 在水 (0.4mL) 中的溶液，将所形成的乳液在室温搅拌 2 小时。 然后， 将该乳液缓慢加入到前面步骤中所获得的 H-Arg(MIS)-OH(136mg，0.36mmol) 在水和 二噁烷的 1 ∶ 1 混合物的溶液中，该溶液的 pH 为 9，这是通过加入 10％的碳酸钠的水溶 液来控制。 搅拌该反应混合物，同时将 pH 保持在 9。 一旦 pH 稳定了，则将该混合物 搅拌过夜。 然后加入水 (30mL)，将该混合物用叔丁基甲基醚 ( 每次 20mL) 清洗 3 次。 用 1N 的 HCl 将水相酸化到 pH 为 2-3，然后用乙酸乙酯 (30mL) 快速萃取 3 次。 合并 有机相，通过硫酸镁干燥。 在蒸发干燥后，获得一种油 (115mg)，将其溶解在最小量的 丙酮中。 然后，加入 pH 为 9 的碳酸钠水溶液 (20mL)，用叔丁基甲醚 ( 每次 30mL) 清 洗该水溶液 3 次。 将因此获得的水溶液用 1N 的 HCl 酸化到 pH 为 2-3，然后用乙酸乙 酯 ( 每次 20mL) 萃取 3 次，通过硫酸镁干燥，最后蒸发干燥，产生 34.3 ％ (67.4mg) 的 Fmoc-Arg(MIS)-OH。 1
H NMR(400MHz， DMSO) ：δ ＝ 7.86(m，3H)，7.70(d，2H， J ＝ 7.4Hz)， 7.59(d，1H， J ＝ 7.9Hz)，7.42(d，1H， J ＝ 8.1Hz)，7.39(m，2H)，7.30(m，2H)， 7. 10(m，2H )， 4. 27( m， 2H )， 4.20( m， 1 H )13 . 86( m ， 1 H ) ， 3 . 66( s， 3 H ) ， 3 . 01( m ， 2H)，2.61(s，3H)，1.65(m，1H)，1.52(m.1H)，1.38(m，2H)。 13
C NMR (100 MHZ ， DMSO ) ：δ ＝ 174 . 4 ， 157 . 0 ， 156 . 8 ， 144 . 5 ， 141 . 4 ， 139.4，135.9，128.3，127.8，126.0，125.2，122.1，121.1，120.8，120.1，110.4，66.3， 55.6，47.3，40.0，30.2，28.8，26.5，11.4。
HRMS(Cl) ：m/z， 对 于 C31H34N5O6S[M+H]+ 来 说， 计 算 为 604.2224， 测 得 为604.2222。
实 施 例 5 ：AC-PrIe-Arg(MiS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-VaI-NH2(SEQ ID NO2) 的制备
将 Sieber 酰胺树脂 (25mg，0.42mmol/g，9-Fmoc- 氨基呫吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂 ) 放入 2mL 聚丙烯注射器中，该注射器安装有聚乙烯过滤盘。 将该树脂用二氯 甲烷溶胀。 随后，用二氯甲烷和 N， N- 二甲基甲酰胺进行清洗，将 Fmoc 基团通过用 2 ∶ 8 的哌啶和 N， N- 二甲基甲酰胺混合物处理来除去 ( 一次 1 分钟，两次 10 分钟 )。 将 Fmoc-Val-OH(14.3mg，42.1μmol) 使 用 HOBt(5.7mg，42.1μmol) 和 DIC(6.7μL， 42.1μmol) 在 N， N- 二甲基甲酰胺中的溶液偶联 1.5 小时。 以常规方式除去 Fmoc 基 团，将获自实施例 4 的 Fmoc-Arg(MIS)-OH(15.8mg，26.3μmol) 使用 PyBOP(13.7mg， 26.3μmol)，HOAt(3.6mg，26.3μmol) 和 DIPEA(13.4μL，78.9μmol) 在 N，N- 二甲基 甲酰胺中的溶液偶联 90 分钟。 将该树脂通过用乙酸酐 (50 当量 ) 和 DIPEA(50 当量 ) 的 DMF 溶液处理 25min 来乙酰基化，目的是将未反应的胺封端，除去 Fmoc 基团，重复相 同的程序 3 次以上，包括在除去 Fmoc 之前树脂的乙酰基化。 在最后的 Fmoc 除去之后， 将 Fmoc-Phe-OH(13.6mg，35μmol) 使 用 PyBOP(18.3mg，35μmol)， HOAt(4.8mg， 35μmol) 和 DIPEA(17.9μL，105.2μmol) 在 N，N- 二甲基甲酰胺中的溶液偶联 90min。 除去 Fmoc 基团，将所形成的游离氨基以上述同样的方式乙酰基化。 将因此获得的被保 护的树脂负载的缩氨酸 Ac-Phe-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Val-NH- 呫 吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂用 N， N- 二甲基甲酰胺，二氯甲烷和二乙基醚清洗，真空干 燥，然后分成五等份。
将一等份用于制备这个实施例的目标化合物，将其他等份作为起始材料，用于 例如实施例 9 的除去检验。
因 此， 将 一 等 份 用 二 氯 甲 烷 溶 胀， 用 1.5mL 的 TFA， 二 氯 甲 烷， TIS 和 水 (2 ∶ 93 ∶ 2.5 ∶ 2.5) 的混合物处理 20 分钟，来从树脂上分离被保护的缩氨酸。 过滤该树 脂，将所收集的溶液用二氯甲烷稀释，通过加入 DIPEA(80μL，1.2 当量 / 当量的 TFA) 中和。 真空除去溶剂。 在加入水和乙腈之后，将溶液冻干，获得 Ac-Phe-Arg(MIS)-Ar g(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Val-NH2(SEQ ID NO2)。
该产物用 LC-MS 和 HRMS(Cl) 来表征 ：m/z，对于 C80H107N23O15S4[M+Na]+ 来 说，计算为 1780.7092，所得为 1780.7152。
实施例 6 ：Z-Arg(MIS)-Trp(Boc)-Ala-Gly-NH2(SEQ ID NO4) 的制备
将 Sieber 酰 胺 树 脂 (70mg，0.40mmol/g) 放 入 2mL 聚 丙 烯 注 射 器 中， 该 注 射器安装有聚乙烯过滤盘。 将该树脂用二氯甲烷溶胀，用二氯甲烷和 N， N- 二甲 基 甲 酰 胺 进 行 清 洗， 将 Fmoc 基 团 除 去。 将 Fmoc-Gly-OH(33.3mg，112μmol)， Fmoc-Ala-OH(34.9mg，112μmol) 和 Fmoc-Trp(Boc)-OH(59.0mg，112μmol) 依次使用 PyBOP(58.3mg，112μmol)、 HOAt(15.2mg，112μmol) 和 DIPEA(57.4μL，336μmol) 在 N， N- 二甲基甲酰胺中的溶液偶联 1.5 小时。 将该树脂分成 2 等份。 一份用于制备 这个实施例的目标化合物，另一份用于制备 Z-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Ala-Gly-NH2( 参见实 施例 8.2)。
因 此， 将 Z-Arg(MIS)-OH(28.9mg，56μmol) 用 一 树 脂 份， 使 用PyBOP(29.2mg，56μmol)， HOAt(7.6mg，56μmol) 和 DIPEA(28.7μL，168μmol) 在 N， N- 二甲基甲酰胺中的溶液偶联 1.5 小时。 将因此获得的被保护的树脂负载的缩氨酸 Z-Arg(MIS)-Trp(Boc)-Ala-Gly-NH- 呫吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂用 N，N- 二甲基甲酰 胺，二氯甲烷和二乙基醚清洗，真空干燥，然后分成 4mg 的等份。 一等份用于制备这个 实施例的目标化合物，其他等份作为起始材料，用于例如实施例 19 的除去检验。
因 此， 将 一 等 份 用 二 氯 甲 烷 溶 胀， 用 1.5mL 的 TFA， 二 氯 甲 烷， TIS 和 水 (2 ∶ 93 ∶ 2.5 ∶ 2.5) 的混合物处理 20 分钟，来从树脂上分离被保护的缩氨酸。 过滤 该树脂，将所收集的溶液用二氯甲烷稀释，通过加入 DIPEA(80μL，1.2 当量 / 当量的 TFA) 中和。 真空除去溶剂。 在加入水和乙腈之后，将溶液冻干，获得纯度为 95％ ( 通 过 HPLC 分析 ) 的 Z-Arg(MIS)-Trp(Boc)-Ala-Gly-NH2。 将所获得的产物通过 LC-MS 来表征。
实施例 7 ：MIS-Ala-OMe 的制备
将 H-Ala-OMe(95mg，0.68mmol，1 当量 ) 溶解在无水二氯甲烷中，并且加入 DIPEA(3 当量 )。 加入获自实施例 2 的 MIS-Cl(200mg，1.2 当量 ) 在无水二氯甲烷中的 溶液，并将该反应混合物室温搅拌 1.5 小时。 以常规方式加工，产生 85.4mg(40％ ) 的 MIS-Ala-OMe。
实施例 8 ：Pbf 保护的对照化合物的制备
8.1
Ac-Phe-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Val-NH2(SEQ IDNO2) 的制备
使 用 与 制 备 Ac-Phe-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Val-NH2 相 同 的 程 序 ( 参 见 实 施 例 5)， 除 了 用 Fmoc-Arg(Pbf)-OH(17.1mg，26.3μmol) 代 替 Fmoc-Arg(MIS)-OH 之外。 将所获得的产物通过 LC-MS 和 HRMS(Cl) 表征 ：m/z，对 于 C92H136N19O19S4[M+H]+ 来说计算是 1938.9137，测得为 1938.9202。
8.2 Z-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Ala-Glv-NH2(SEQ ID NO4) 的制备
将 Fmoc-Arg(Pbf)-OH(36.3mg，56μmol) 用 实 施 例 6 的 另 一 份 树 脂， 使 用 PyBOP(29.2mg，56μmol)， HOAt(7.6mg，56μmol) 和 DIPEA(28.7μL，168μmol) 在 N，N- 二甲基甲酰胺中的溶液偶联 1.5 小时。 除去 Fmoc 基团，通过用 Z-OSu(14.0mg， 56μmol) 和 DIPEA(35.9μL，210μmol) 处理，来用 Z 基团保护游离胺。 将因此获得的 被保护的树脂负载的缩氨酸 Z-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Ala-Gly-NH- 呫吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂用 N，N- 二甲基甲酰胺，二氯甲烷和二乙基醚清洗，真空干燥，然后分成 4mg 的等 份。
一等份用于制备这个实施例的目标化合物，其他等份作为起始材料，用于例如 实施例 20 的除去检验。
因此，以实施例 5 所述相同的方式分离一等份。 获得纯度为 96％ ( 通过 HPLC 测量 ) 的 Z-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Ala-Gly-NH2。 将该产物用 LC-MS 来表征。
8.3 Pbf-Ala-OMe 的制备
类似于实施例 7 来制备，除了用 Pbf-CI(1.2 当量 ) 代替 MIS-CI 之外。 产率 ： Pbf-Ala-Ome 为 209mg(82％ )。
实施例 9-12 ：MIS 与 Pbf 保护的树脂负载的缩氨酸相比的除去检验一般程序
将被保护的树脂负载的缩氨酸 (3mg) 用分离溶液 (50μL) 处理。 在分离时间之 后，将该溶液倒入水 (4mL) 中。 然后，蒸发 TFA 和二氯甲烷。 将所形成的水溶液用二 氯甲烷 ( 每次 1mL) 清洗 6 次，并且冻干。 将所形成的固体通过 HPLC(λ ＝ 220nm) 和 ESMS 或者 MALDI-TOF 进行分析。
表 1 ：实施例 9-12，使用分离溶液 TFA/DCM/TIS/ 水 (50 ∶ 45 ∶ 2.5 ∶ 2.5) ( 水和 TIS 作为清除剂 )
10 11 12
a b b60min 30min 60min100％ 4％ 38％a ＝ Ac-Phe-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Val-NH- 呫 吨 -3- 氧 基 -Merrifield 树脂 (SEQ ID NO1)，获自实施例 5。
b ＝ Ac-Phe-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Val-NH- 呫 吨 -3- 氧 基 -Merrifield 树脂 (SEQ ID NO1)，获自实施例 8.1( 对比例 )。
DCM ＝二氯甲烷。
实施例 13-15 ：使用不同的清除剂的 MIS 保护的树脂负载的缩氨酸的除去检验
一般程序按照实施例 9-12 中所述。 使用获自实施例 5 的保护的树脂负载的缩氨 酸 Ac-Phe-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Arg(MIS)-Val-NH- 呫吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂 (SEQ ID NO1)。 分离时间是 60 分钟。 将 TFA，二氯甲烷和清除剂 (50 ∶ 40 ∶ 10) 的混合物用作分离溶液。
所测试的清除剂是 3，4- 二甲氧基酚 ( 实施例 13)，1，3，5- 三甲氧基 - 苯 (TMB)( 实施例 14) 和 3，5- 二甲氧基酚 ( 实施例 15)。
结果，与其中水 (2.5％ ) 和 TIS(2.5％ ) 被用作清除剂的实施例 9 相比，MIS-OH 的量减少了大于 10 倍。 在 Tmb 的情况中，甚至观察到减少了大于 40 倍。
实施例 16 和 17 ：MIS 与 Pbf 保护的树脂负载的含有 Trp 的缩氨酸的除去检验一般程序按照实施例 9-12 中所述。 所形成的粗产物是通过 LC-MS 表征的，并 且它的纯度是通过 HPLC(λ ＝ 220nm) 分析的。
所形成的粗产物的纯度对于 MIS 保护的起始材料来说高于 Pbf 保护的起始材料。 对于被保护的缩氨酸 c 和 d 二者来说，在所形成的产物中没有观察到不期望的 Trp 烷基 化，也没有观察到磺化。
表 2 ：实施例 16 和 17 ；使用分离溶液 TFA/DCM/TMB(50 ∶ 40 ∶ 10)(TMB 作 为清除剂 )
c ＝ Z-Arg(MIS)-Trp(Boc)-Ala-Gly-NH- 呫 吨 -3- 氧 基 -Merrifield 树 脂 (SEQID NO3)，获自实施例 6。
d ＝ Z-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Ala-Gly-NH- 呫吨 -3- 氧基 -Merrifield 树脂 (SEQ ID
NO3)，获自实施例 8.2( 对比例 )。
DCM ＝ 二 氯 甲 烷 -TMB ＝ 1，3，5- 三 甲 氧 基 苯 -*Z-Arg(MIS)-Trp-AlaGly-NH2(SEQ ID NO4) 没 有 在 所 形 成 的 粗 产 物 中 检 测 出 ( 通 过 LC-MS)-**20.4 ％ 的 Z-Arg(Pbf)-Trp-Ala-Gly-NH2(SEQ ID NO4) 在所形成的粗产物中检测出 ( 通过 HPLC)。
实施例 18-20 ：MIS 与 Pbf( 作为 Nα- 氨基保护性基团 ) 的除去检验
将该保护的氨基酸用分离溶液在室温处理，随后通过 TLC 脱保护。
在 5min 后， MIS 除去稍微更快，显示了积极的 Kaiser 测试 ( 表示了游离胺的存 在 )，而对于 Pbf 的情况来说，在接下来的对照中 (10min) 是积极的 Kaiser 测试。
表 3 ：实施例 18-20 ；使用分离溶液 TFA/ 二甲硫 (90 ∶ 10)( 二甲硫作为清除 剂)
e ＝ MIS-AIa-OMe，获自实施例 7。 f ＝ Pbf-Ala-OMe，获自实施例 8.3( 对比例 )。 * 通过 Kaiser 检测 H-Ala-OMe 的存在还是不存在。22CN 102026971 A CN 102026986 A权利要求书(按照条约第19条的修改)1/1 页13. 权利要求 12 的方法，其中 R1 和 R2 独立的是 C1-4 烷基，C1-4 烷氧基或者 C1-4 烷基 硫， R3 是氢或者卤素。 14. 权利要求 12 或者 13 的方法，其中 R1 和 R2 是甲基， R3 是氢， X 是氯。 15. 权利要求 12-14 中任何一个的方法，其中该有机化合物是任选的树脂负载的缩氨 酸化合物，其是任选的侧链保护的和 / 或在自由端保护的。 16. 一种有机化合物，其包含式 (IV) 的至少一部分 ：其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基 或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ；R3 是氢、卤素、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基、 C1-6 烷基硫、苯基或者苄基。 17. 权利要求 16 的化合物，其中该有机化合物是任选的树脂负载的缩氨酸化合物，其 是任选的侧链保护的和 / 或在自由端保护的。 18. 一种制备偶联产物的方法，其包含步骤 ：将包含下式 (III) 的至少一部分的有机 化合物偶联到有机化合物 Q 上 ：其中 R1 是氢、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基或者 C1-6 烷基硫 ；R2 是 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基 或者 C1-6 烷基硫 ；或者 R1 和 R2 一起形成式 -(CH2)n- 的部分，其中 n 是 3-5 的整数 ；R3 是氢、卤素、 C1-6 烷基、 C1-6 烷氧基、 C1-6 烷基硫、苯基或者苄基 ；和 m 是 0 或者 1。 19. 权利要求 18 的方法，其中该包含式 (III) 的至少一部分的有机化合物是任选的树 脂负载的缩氨酸化合物，该缩氨酸化合物是任选的侧链保护的和 / 或在自由端保护的， 其中 R1， R2， R3 和 m 定义同权利要求 18。 20. 权利要求 18 或者 19 的方法，其中有机化合物 Q 是任选的树脂负载的缩氨酸化合 物，该缩氨酸化合物是任选的侧链保护的和 / 或在自由端保护的。23