新的氮杂环庚烷衍生物 本发明涉及新的氮杂环庚烷衍生物，或其药用盐，其具有抗细胞增殖活性如抗癌活性，并因此用于人或动物体的治疗方法中。本发明还涉及制备所述氮杂环庚烷衍生物的方法，包含它们的药物组合物和它们在制备药物中的应用，所述药物用于在温血动物如人中产生抗细胞增殖作用。
背景技术
细胞信号途径调节细胞生长，增殖，和编程性细胞死亡。激酶通过它们的底物的磷酸化转导细胞生长或编程性细胞死亡的信号，这些底物大多数是本身涉及细胞信号过程的下游激酶。通过影响激酶构象变化的磷酸化和脱磷酸化调节激酶活性。涉及抗编程性细胞死亡或增殖信号途径的激酶的过表达或组成型激活是肿瘤细胞的一个典型特征(Cross，T.G.，等，Exp.Cell Res.256(2000)34-41)。
AKT蛋白家族位于PI-3激酶途径的下游，并磷酸化急速增长列表的涉及几种细胞存活和编程性细胞死亡抑制途径的底物，如最近所示(Kandel，E.S.，和Hay，N.，Exp.Cell Res.253(1999)210-229；Blume-Jensen，P.，和Hunter，T.，Nature 411(2001)355-365；Datta，S.R.，等，Genes Dev.13(1999)2905-2927)。在人前列腺癌，乳腺癌，和卵巢癌中经常发现AKT1的组成型激活。这是因为脂磷酸酶PTEN基因地完全丧失，该基因是PI-3激酶途径的负调节物(Nesterov，A.，等，J.Biol.Chem.276(2001)10767-10774)。这些数据表示AKT1激酶是肿瘤发生中的重要参与者和癌症干预的潜在目标。AKT1激酶的抑制剂作为有效敏化剂或编程性细胞死亡的诱导物是癌症治疗的有希望的试剂(Beresford，S.A.，等，J.Interferon Cytokine Res.21(2001)313-322)。
AKT1属于蛋白激酶家族。它显示与PKC和PKA同源的序列。已知几种结构类别的PKC和PKA抑制剂。特别地，WO94/20062(Sphinx药物公司，“Balanoids”)，WO95/30640(Eli Lilly and company，“Substitutedfused and bridged bicyclic compounds as therapeutic agents”)，WO97/02249(F.Hoffmann-La Roche，“Novel azepanes and their ring homologues fortherapy and prophylaxis of protein kinase mediated diseases”)，和EP 0 663393-A1(F.Hoffmann-La Roche，“Neue 3-amino/hydroxy-4-[4-benzoyl-Phenyl-Carbonylamino/oxy]-Azepane und Homologe als Protein KinaseHemmer”)报导具有PKC抑制活性的balanol衍生物。在EP 0 657 458-A1中报导二吲哚基顺丁烯二酰亚胺作为PKC抑制剂(Eli Lilly，“Proteinkinase C inhibitors”)，EP 1 020 471-A1(Kyowa Hakko Kogyo Co.，“Processfor producing UCN-01”)，和EP 0 296 110-A2(Ciba-Geigy AG，“AnMethylamino-Stickstoff substituierte Derivate von Staurosporin”)。在文献中未报导AKT1小分子抑制剂。
已经发现某些新的氮杂环庚烷衍生物在体外和在各种肿瘤细胞系中是有效的AKT1抑制剂，具有抗细胞增殖性能，诱导编程性细胞死亡，并且是血浆稳定的，这使得它们比前述参考文献中的那些更有效。
【发明内容】
按照本发明，提供一种新的式I的氮杂环庚烷衍生物：
其中
A表示
·碳环基团
·杂环基团
n为0-4
每个R1是相同或不同的残基，其独立地选自卤原子，(1-4C)烷基-，或(1-4C)烷氧基-，
B表示
·苯基，其可以是未取代的或被1，2或3个取代基取代，且其可以通过碳环基团或通过杂环基团成环，所述取代基独立地选自卤原子，(1-4C)烷基，三氟甲基，羟基，(1-4C)烷氧基，硝基，氨基，氨基(1-4C)烷基，(1-4C)烷基氨基，二[(1-4C)烷基]氨基，(1-4C)烷酰基氨基，(1-4C)烷硫基，(1-4C)烷氧羰基，(1-3C)亚烷基二氧基，酰基，碳环或杂环基团，
·杂环基团，其立体异构体，对映异构体和外消旋物，及其药用盐。
碳环基团可以是
·非芳族的，优选单环或双环含有3-7个碳原子的系统，例如环戊烷，环己烷，环己烯或环丙烷，其可以是未取代的或被1，2，或3个取代基取代，且其可以通过芳基或杂芳基成环，形成例如1，2-二氢化茚或1，2，3，4-四氢化萘，所述取代基独立地选自卤原子，(1-4C)烷基，三氟甲基，羟基，(1-4C)烷氧基，芳基，杂芳基，芳烷基，芳烷基氧基，芳氧基，(1-3C)亚烷基二氧基，硝基，氨基，(1-4C)烷基氨基，二[(1-4C)烷基]氨基，(1-4C)烷酰基氨基或酰基，
·或者它可以是芳基。
芳基是碳环的，优选单环或双环的共轭环系统，例如苯基，萘基，优选苯基，其可以是未取代的或者被1，2，或3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤原子，(1-4C)烷基，三氟甲基，羟基，(1-4C)烷氧基，芳烷基氧基，芳氧基，(1-3C)亚烷基二氧基，硝基，氨基，(1-4C)烷基氨基，二[(1-4C)烷基]氨基，(1-4C)烷酰基氨基，或酰基，
杂环基可以是
·非芳族的，优选3-7元单环或双环和含有1个或2个独立地选自氮、氧、和硫的杂原子的系统，例如哌啶子基，吗啉代，吡咯烷基(pyrrolidino)，哌嗪基(piperazino)，其可以是未取代的或被1，2或3个取代基取代，且其可以通过芳基或杂芳基成环，以形成例如四氢喹啉，四氢异喹啉或二氢吲哚，所述取代基独立地选自卤原子，(1-4C)烷基，三氟甲基，羟基，(1-4C)烷氧基，芳基，杂芳基，芳烷基，芳烷基氧基，芳氧基，(1-3C)亚烷基二氧基，硝基，氨基，(1-4C)烷基氨基，二[(1-4C)烷基]氨基，(1-4C)烷酰基氨基，或酰基，
·或者它可以是杂环基团。
杂芳基可以是5或6元环的含有1个或2个独立地选自氮、氧、和硫的杂原子的共轭环系统，例如吡啶基，嘧啶基，噻吩基，呋喃基或吡咯基，或成环的二环共轭环系统，如吲哚基，喹啉基或异喹啉基，其可以是未取代的或被1，2或3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤原子，(1-4C)烷基，三氟甲基，羟基，(1-4C)烷氧基，芳烷基氧基，芳氧基，(1-3C)亚烷基二氧基，硝基，氨基，(1-4C)烷基氨基，二[(1-4C)烷基]氨基，(1-4C)烷酰基氨基，或酰基。
当取代基为卤原子时，其优选值为例如氟，氯，溴，和碘；当其为(1-4C)烷基时，优选值为例如甲基，乙基，丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基；当其为(1-4C)烷氧基时，优选值为例如甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基或丁氧基；当其为氨基(1-4C)烷基时，优选值为例如氨甲基，1-或2-氨基乙基，或1-，2或3-氨基丙基；当其为(1-4C)烷基氨基时，优选值为例如甲氨基，乙氨基或丙氨基；当其为二[(1-4C)烷基]氨基时，优选值为例如二甲氨基，N-乙基-N-甲氨基，二乙氨基，N-甲基-N-丙氨基或二丙氨基；当其为(1-4C)烷酰基氨基时，优选值为例如甲酰氨基，乙酰氨基，丙酰氨基或丁酰氨基；当其为(1-3C)亚烷基二氧基时，优选值为例如亚甲基二氧基，亚乙基二氧基或亚丙基二氧基；当其为酰基时，优选值为例如甲酰基，乙酰基，丙酰基，苯甲酰基，或苯乙酰基。
式I的氮杂环庚烷衍生物的对映异构体，非对映异构体，外消旋物及其混合物和药用盐也是本发明的一部分。
“药用盐”是指保留式I化合物的生物学效力和性能的常规酸加成盐或碱加成盐，并且由适当的无毒有机或无机酸或者有机或无机碱形成。样品酸加成盐包括衍生自无机酸的那些和衍生自有机酸的那些，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸，所述有机酸如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等。样品碱加成盐包括衍生自氢氧化铵、钾、钠和季铵如例如氢氧化四甲铵的那些。将药物化合物(即药物)化学修饰为盐是药物化学家公知的获得改善的化合物的物理和化学稳定性，吸湿性，流动性和溶解度的技术。参见例如H.Ansel等，Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems(6th Ed.1995)，第196页和第1456-1457页。
本发明一个优选实施方案是式(I)的化合物，其中
A为碳环或杂环基团；
B为苯环，其可以是未取代的或被1，2或3个取代基取代，且其可以通过碳环基团或通过杂环基团成环，所述取代基独立地选自卤原子，(1-4C)烷基，三氟甲基，羟基，(1-4C)烷氧基，硝基，氨基，(1-4C)烷基氨基，二[(1-4C)烷基]氨基，(1-4C)烷酰基氨基，(1-4C)烷硫基，(1-4C)烷氧羰基，(1-3C)亚烷基二氧基，酰基，碳环或杂环基团，或
杂环基团，
其立体异构体，对映异构体和外消旋物，及其盐；
(R1)n是相同或不同的卤原子，(1-4C)烷基-，或(1-4C)烷氧基-，且n＝0-4。
本发明另一优选实施方案是式(I)的化合物，其中
A为吡啶，2-氨基吡啶或嘧啶；
B为取代基，其选自：
2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯基，2-氟-6-羟基-3-甲基-苯基，6-羟基-3-甲基硫烷基-苯基，6-羟基-2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-5-基，6-羟基-2，3-二甲氧基-苯基，2-羟基-5-甲氧基-苯基，2-羟基-5-甲基-苯基，5-羟基-2-甲基-吡啶-4-基，3-氟-5-羟基-2-甲基-吡啶-4-基，8-氟-6-羟基-喹啉-7-基，8-氟-6-羟基-2-甲基-喹啉-7-基，2-叔丁基-8-氟-6-羟基-喹啉-7-基，6-羟基-喹啉-5-基，3-二甲氨基-2-氟-6-羟基-苯基，5-二甲氨基-2-羟基-苯基，2-羟基-5-哌啶-1-基-苯基，2-氟-6-羟基-3-哌啶-1-基-苯基，3-(3，3-二甲基-哌啶-2-基)-2-氟-6-羟基-苯基，3-(3，3-二甲基-哌啶-2-基)-6-羟基-苯基；
且对于(R1)n，n＝0。
按照本发明的另外一个方面，提供一种药物组合物，其包含如上定义的式I的氮杂环庚烷衍生物或其药用盐，以及药用稀释剂或载体。组合物可以是适于口服给药的形式，例如片剂或胶囊，适于肠胃外(包括静脉内，皮下，肌内，血管内或输注)注射的形式如无菌溶液，混悬剂或乳剂，适于局部给药的形式如软膏剂或乳膏剂，或适于直肠给药的形式如栓剂。通常可以以使用常规赋形剂的方法制备上述组合物。氮杂环庚烷衍生物将通常以每平方米动物身体面积5-5000mg，即约0.1-100mg/kg的单剂量施用于温血动物，这通常提供治疗有效剂量。单位剂量形式如片剂或胶囊将通常包含例如1-250mg活性成分。优选使用1-100mg/kg的日剂量。然而，日剂量必定将根据治疗的宿主、具体给药途径、和治疗疾病的严重性而变化。因此最适剂量可以由治疗任何特定患者的医师确定。
按照本发明的第四方面，提供如上定义的式I的氮杂环庚烷衍生物，其用于通过疗法治疗人或动物体的方法中。现在已经发现本发明的化合物具有抗细胞增殖性能，其被认为是起因于它们的AKT1抑制活性。因此本发明的化合物提供治疗恶性细胞增殖的方法。因此期望本发明的化合物通过提供抗增殖作用而用于治疗癌症，特别是治疗乳腺癌，肺癌，结肠癌，直肠癌，胃癌，前列腺癌，膀胱癌，胰腺癌和卵巢癌。还期望本发明的衍生物将具有抗多种白血病，淋巴癌和实体瘤如在诸如肝，肾，前列腺和胰腺的组织中的癌和肉瘤的活性。
因此按照本发明的这个方面，提供如本文所定义的式I的氮杂环庚烷衍生物或其药用盐在制备药物中的应用，所述药物用于在温血动物如人类中产生抗细胞增殖作用。
按照本发明该方面的另一特征，提供在需要该治疗的温血动物如人中产生抗细胞增殖作用的方法，其包含向所述动物施用有效量的如上定义的氮杂环庚烷衍生物。
上述定义的抗细胞增殖治疗可以用作单独治疗或者除了本发明的氮杂环庚烷衍生物以外可以涉及一种或多种其它的抗肿瘤物质，例如选自以下各项的那些：例如有丝分裂抑制剂，例如长春碱；烷化剂，例如顺铂，卡铂，和环磷酰胺；微管组装抑制剂，如紫杉醇或其它紫杉烷类；抗代谢物，例如5-氟尿嘧啶，卡培他滨，胞嘧啶阿拉伯糖苷和羟基脲，或例如插入抗生素，例如阿霉素和博来霉素；免疫刺激剂，例如曲妥单抗；DNA合成抑制剂，例如吉西他滨；酶例如天冬酰胺酶；拓扑异构酶抑制剂，例如依托泊苷；生物反应修饰剂，例如干扰素；和抗激素，例如抗雌激素药他莫昔芬或，例如抗雄激素药如(4’-氰基-3-(4-氟苯基磺酰基)-2-羟基-2-甲基-3’-(三氟甲基)-N-丙酰苯胺)，或其它治疗剂和原理，如例如Cancer：Principles & Practice of Oncology，Vincent T.DeVita，Jr.，Samuel Hellmann，Steven A.Rosenberg；5th ed.，Lippincott-Raven Publishers，1997所述。通过同时，顺序或分开剂量给药治疗的单独组分可以实现该联合治疗。按照本发明的这个方面，提供用于联合治疗癌症的药品，其包含如上定义的式I的氮杂环庚烷衍生物和如上定义的另外的抗肿瘤物质。
本发明的另一目的是药物组合物，其包含与药用赋形剂和/或稀释剂混合的药理有效量的一种或多种式I的化合物。
式I化合物的生理可接受的盐的实例是生理可接受的酸的盐。其中这些盐可以是盐酸盐，硫酸盐，甲磺酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，乙酸盐，和磷酸盐。
本发明化合物的制备
式I的氮杂环庚烷衍生物或其药用盐可以通过已知可用于制备化学相关化合物的任何方法制备。当用于制备式I的氮杂环庚烷衍生物，或其药用盐时，这些方法被提供为本发明的另一特征并通过下列代表性的实例举例说明，其中除非另外指出，A，B和R1具有上述定义的任何含义，R2是适当的保护基，优选叔丁氧羰基或甲氧甲基。必要的原材料可以通过标准有机化学方法获得。这些原材料的制备在伴随的非限制性的实施例中描述。备选地原材料可以通过与属于有机化学家的普通技术内的那些类似的方法获得。
优选的生产式I的化合物的方法涉及式II的化合物与脱保护剂例如HCl在二噁烷中在室温下的反应：
其中R1和R2具有上述定义的含义，A’和B’表示上述定义的A和B，或适当保护的其衍生物。适当的保护基是例如叔丁氧羰基或甲氧甲基。
式II的化合物由式III和IV的化合物制备，其中A’，B’，R1和R2具有上述定义的含义。
该反应典型地包括两步一罐方法。在第一步中，式III的羧酸酯被活化。该反应在惰性溶剂或稀释剂例如二氯甲烷，二噁烷，或四氢呋喃中在活化剂的存在下进行。酸的适当活性衍生物是酸和碳二亚胺如二环己基碳二亚胺的反应产物，或酸与二-(2-氧代-3-噁唑烷基)-磷酰氯的反应产物；或酸与羰二咪唑的反应产物；或酸和N-羟基琥珀酰亚胺的反应产物；酰基卤，例如通过酸和无机酰基氯例如亚硫酰(二)氯反应形成的酰基氯；混合酸酐，例如通过酸与氯甲酸酯如氯甲酸异丁酯反应形成的酸酐；活性酯，例如通过酸和酚如五氟苯酚反应形成的酯；通过酸与N-羟基苯并三唑反应形成的活性酯；酰叠氮，例如通过酸和叠氮化物如二苯基磷酰叠氮反应形成的叠氮化物；酰腈，例如通过酸与氰化物如二乙基磷酰腈反应形成的氰化物。活化反应在-30℃和60℃之间，便利地在0℃或0℃以下进行。在第二步中，在用于活化的温度下将式IV的胺加入溶液，将温度缓慢调整至室温。可以将适当的清除碱如例如二甲氨基吡啶，三乙胺，或二异丙基乙胺加入反应溶液。这些方法对于本领域技术人员公知。原则上，如在例如“Methodender organischen Chemie(Houben-Weyl)”Band XV/1和XV/2中所述的肽化学中所用的所有酰胺合成方法也可适用。
式IV的化合物可以通过V与氢和例如在10％的THF和乙醇中的Pd/C或在甲醇中的阮内镍在室温下在1巴下反应，由式V的化合物制备，
其中A’和R2具有上述定义的含义。
式V的化合物可以通过VI与例如叠氮化钠在DMF中、60-90℃下反应，由式VI的化合物制备，
其中A’和R2具有上述定义的含义。
式VI的化合物可以通过VII与甲磺酰氯例如在吡啶中、0℃下反应，
由式VII的化合物制备，
其中A’和R2具有上述定义的含义。
式VII的化合物由式VIII的化合物和化合物IX制备，
其中A’和R2具有上述定义的含义。
该反应典型地包括两步一罐步骤。在该步骤中，式VIII的化合物的羧酸酯通过关于式III所述方法中的任何一种活化。在第二步中，以与关于胺IV所述相同的方式将式IX的胺加入溶液。
式VIII的化合物可商购或通过文献已知的方法合成并且为本领域技术人员所公知。
化合物IX的合成在EP0 802 190A1中描述。
如EP0 663 393 A1和WO97/702249所述制备式III的化合物。
现在将在下列非限制性的实施例中举例说明本发明，除非另外指出：
(i)通过在真空中旋转蒸发进行蒸发，在通过过滤去除残余的固体如干燥剂以后进行处理(work-up)步骤。
(ii)在室温下即18-25℃的范围内和在惰性气体如氩或氮的气氛下进行操作；
(iii)在获自E.Merck，Darmstadt，Germany的Merck Kieselgel硅石或Merck Lichroprep RP-18反相silica上进行柱色谱法(通过快速方法)和高效液相色谱(HPLC)；
(iv)给出产率仅是用于举例说明，未必是可获得的最大值；
(v)使用Mettler SP62自动熔点测定器，油浴装置或Kofler电热板装置测定熔点。
(vi)通过核(通常质子)磁共振(NMR)和质谱技术(使用APCI的Micromass Platform II机器或使用电子喷雾的Micromass Platform ZMD)证实式I的终产物的结构；
(vii)中间体通常不完全表征，通过薄层色谱法评估纯度；
(viii)使用下列缩写：
DMF，N，N-二甲基甲酰胺；
DMSO，二甲基亚砜；
THF，四氢呋喃；
MeOH，甲醇；
HCl，盐酸；
NaH，氢化钠
CH2Cl2，二氯甲烷；
H2SO4，硫酸
sat.，饱和的
sol.，溶液
rt，室温
eq，当量
mp，熔点
提供下列实施例和参考文献帮助理解本发明，本发明的真实范围在后附的权利要求中阐明。应当理解可以不背离本发明精神下在阐明的方法中进行修改。
实施例1a
N-{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐(1a)
在室温下将0.05g 1b溶解在2ml盐酸的二噁烷(4M)溶液中并搅拌24小时。在真空中蒸发溶剂并将残渣再溶解在甲醇中并蒸发干三次，产生0.038g(82％)1a，其为淡黄色晶体。MS(ESI)：m/z(％)：507(MH+)，505([M-H]+)。Mp.200-222℃。
实施例1b
(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-甲氧基甲氧基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-3-[(吡啶-4-羰基)-氨基]-氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯(1b)
在室温下将0.167g 1c溶解在5mL CH2Cl2中。加入0.167g 4-(2-氟-3-甲氧基-6-甲氧基甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酸(1d)，0.031g 4-二甲氨基吡啶，和0.113g DCC。在室温下搅拌反应混合物5小时。滤去沉淀并用CH2Cl2洗涤。在真空中蒸发残渣以产生0.46g粗制产物。柱色谱法(SiO2，戊烷/乙酸乙酯1∶10)提供0.248g(76％)1b，其为白色晶体。M.p.106℃；MS(ESI)：m/z(％)：651(MH+)，649([M-H]+。
实施例1c
(3R，4R)-4-氨基-3-[(吡啶-4-羰基)-氨基]-氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯(1c)
将5.5g 1e溶解在135mL THF和15mL乙醇中，加入1g Pd/C(10％)。在1巴下将反应混合物氢化8小时。在过滤后，在真空中蒸发残渣以产生4.6g(90％)1c，其为浅棕色粉末。MS(ESI)：m/z(％)：335(MH+)，333([M-H]+)。
1d(4-(2-氟-3-甲氧基-6-甲氧基甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酸)的合成在EP0663 393A1中描述。
实施例1e
(3R，4R)-4-叠氮基-3-[(吡啶-4-羰基)-氨基]-氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯(1e)
将6.4g 1f溶解在150mL DMF中并加入5.1g叠氮化钠。在90℃下搅拌反应混合物2小时，然后在室温下搅拌24小时。在真空中蒸发溶剂，将残渣再溶解在200mL乙酸乙酯中。用200mL水萃取有机相2次，用饱和NaCl溶液萃取1次。在真空中蒸发以有机相以产生5.6g粗产物。柱色谱法(SiO2，己烷/乙酸乙酯3∶7)提供5.4g(97％)1e，其浅棕色固体。MS(ESI)：m/z(％)：361(MH+)，359([M-H]+)。
实施例1f
(3R，4S)-4-甲磺酰基氧基-3-[(吡啶-4-羰基)-氨基]-氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯(1f)
将6.6g 1g溶解在100mL吡啶中，在0℃下加入6.76g甲磺酰氯。搅拌反应混合物24小时。在真空中蒸发溶剂，将残渣再溶解在100mL乙酸乙酯中，用水萃取3次，用饱和NaCl溶液萃取1次。在真空中蒸发有机相。柱色谱法(SiO2，乙酸乙酯/甲醇99∶1)提供6.4g(79％)1f，其为白色泡沫。MS(ESI)：m/z(％)：414(MH+)，412([M-H]+)。
实施例1g
(3R，4S)-4-羟基-3-[(吡啶-4-羰基)-氨基]-氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯(1g)
将36.85g(3R，4S)-3-氨基-4-羟基-氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯，19.70g 4-吡啶羧酸，和9.76g二甲氨基吡啶溶解在500mL CH2Cl2中，并冷却至5℃。将33.01g DCC溶解在250mL CH2Cl2中，在2小时内加入上述混合物。在室温下搅拌反应混合物48小时。加入200mL水，在室温下搅拌混合物2小时。滤去沉淀，用500mL水萃取有机相2次。在真空中蒸发有机溶剂。然后将粗产物进行柱色谱法(SiO2，乙酸乙酯/甲醇99∶1)提供46.2g(86％)1g，其为白色固体。MS(ESI)：m/z(％)：334(MH+)，336([M-H]+)。
实施例2
类似于实施例1所述方法，获得下列化合物并通过熔点表征。
1.N-{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.181-184℃
2.N-{(3R，4R)-4-[4-(6-羟基-3-甲硫烷基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.183-185℃
3.N-{(3R，4R)-4-[4-(6-羟基-2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-5-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.230-240℃
4.N-{(3R，4R)-4-[4-(6-羟基-2，3-二甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.185-193℃
5.N-{(3R，4R)-4-[4-(2-羟基-5-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.230-240℃
6.N-{(3R，4R)-4-[4-(2-羟基-5-甲基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.215-219℃
7.N-{(3R，4R)-4-[4-(5-羟基-2-甲基-吡啶-4-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.203-208℃
8.N-{(3R，4R)-4-[4-(3-氟-5-羟基-2-甲基-吡啶-4-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
9.N-{(3R，4R)-4-[4-(8-氟-6-羟基-喹啉-7-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.247-251℃
10.N-{(3R，4R)-4-[4-(8-氟-6-羟基-2-甲基-喹啉-7-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.255-260℃
11.N-{(3R，4R)-4-[4-(2-叔丁基-8-氟-6-羟基-喹啉-7-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.215℃
12.N-{(3R，4R)-4-[4-(6-羟基-喹啉-5-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.215-220℃
13.N-{(3R，4R)-4-[4-(3-二甲氨基-2-氟-6-羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
14.N-{(3R，4R)-4-[4-(5-二甲氨基-2-羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.230-245℃
15.N-{(3R，4R)-4-[4-(2-羟基-5-哌啶-1-基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.218-224℃
16.N-{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-哌啶-1-基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
17.N-((3R，4R)-4-{4-[3-(3，3-二甲基-哌啶-2-基)-2-氟-6-羟基-苯甲酰基]-苯甲酰基氨基}-氮杂环庚烷-3-基)-异烟酰胺盐酸盐。Mp.265℃
18.N-((3R，4R)-4-{4-[3-(3，3-二甲基-哌啶-2-基)-6-羟基-苯甲酰基]-苯甲酰基氨基}-氮杂环庚烷-3-基)-异烟酰胺盐酸盐。
19.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.223-241℃
20.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐
21.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(6-羟基-3-甲硫烷基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
22.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(6-羟基-2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-5-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
23.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(6-羟基-2，3-二甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
24.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(2-羟基-5-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
25.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(2-羟基-5-甲基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
26.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(5-羟基-2-甲基-吡啶-4-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
27.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(3-氟-5-羟基-2-甲基-吡啶-4-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
28.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(8-氟-6-羟基-喹啉-7-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
29.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(8-氟-6-羟基-2-甲基-喹啉-7-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
30.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(2-叔丁基-8-氟-6-羟基-喹啉-7-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
31.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(6-羟基-喹啉-5-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
32.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(3-二甲氨基-2-氟-6-羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
33.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(5-二甲氨基-2-羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
34.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(2-羟基-5-哌啶-1-基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
35.2-氨基-N-{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-哌啶-1-基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
36.2-氨基-N-((3R，4R)-4-{4-[3-(3，3-二甲基-哌啶-2-基)-2-氟-6-羟基-苯甲酰基]-苯甲酰基氨基}-氮杂环庚烷-3-基)-异烟酰胺盐酸盐。
37.2-氨基-N-((3R，4R)-4-{4-[3-(3，3-二甲基-哌啶-2-基)-6-羟基-苯甲酰基]-苯甲酰基氨基}-氮杂环庚烷-3-基)-异烟酰胺盐酸盐。
38.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。Mp.256-265℃
39.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
40.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(6-羟基-3-甲硫烷基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
41.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(6-羟基-2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-5-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
42.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(6-羟基-2，3-二甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
43.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(2-羟基-5-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
44.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(2-羟基-5-甲基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
45.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(5-羟基-2-甲基-吡啶-4-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
46.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(3-氟-5-羟基-2-甲基-吡啶-4-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
47.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(8-氟-6-羟基-喹啉-7-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
48.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(8-氟-6-羟基-2-甲基-喹啉-7-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
49.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(2-叔丁基-8-氟-6-羟基-喹啉-7-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
50.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(6-羟基-喹啉-5-羰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
51.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(3-二甲氨基-2-氟-6-羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
52.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(5-二甲氨基-2-羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
53.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(2-羟基-5-哌啶-1-基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
54.嘧啶-4-羧酸{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-哌啶-1-基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。
55.嘧啶-4-羧酸((3R，4R)-4-{4-[3-(3，3-二甲基-哌啶-2-基)-2-氟-6-羟基-苯甲酰基]-苯甲酰基氨基}-氮杂环庚烷-3-基)-酰胺盐酸盐。
56.嘧啶-4-羧酸((3R，4R)-4-{4-[3-(3，3-二甲基-哌啶-2-基)-6-羟基-苯甲酰基]-苯甲酰基氨基}-氮杂环庚烷-3-基)-酰胺盐酸盐。
57.N-{(3R，4R)-4-[4-(3-甲基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.190-196℃
58.N-{(3R，4R)-4-[4-(2，5-二羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.108-114℃
59.N-{(3R，4R)-4-[4-(2-羟基-5-异丙氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.243-249℃
60.N-{(3R，4R)-4-[4-(3-氨基甲基-6-羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.215-218℃
61.N-{(3R，4R)-4-[4-(3-＜1-氨基-环丙基＞-6-羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
62.N-((3R，4R)-4-{4-[2-羟基-5-(哌啶-2-基)-苯甲酰基]-苯甲酰基氨基}-氮杂环庚烷-3-基)-异烟酰胺盐酸盐。Mp.195-210℃
63.N-((3R，4R)-4-{4-[3-(3，3-二甲基-哌啶-1-基)-6-羟基-苯甲酰基]-苯甲酰基氨基}-氮杂环庚烷-3-基)-异烟酰胺盐酸盐。Mp.194-198℃
64.N-((3R，4R)-4-{4-[3-(3，3-二甲基-哌啶-1-基)-2-氟-6-羟基-苯甲酰基]-苯甲酰基氨基}-氮杂环庚烷-3-基)-异烟酰胺盐酸盐。
65.N-((3R，4R)-4-{4-[3-(4，4-二甲基-哌啶-1-基)-6-羟基-苯甲酰基]-苯甲酰基氨基}-氮杂环庚烷-3-基)-异烟酰胺盐酸盐。Mp.229-234℃
66.N-{(3R，4R)-4-[4-(2-羟基-5-异丙基氨基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.227-230℃
67.N-{(3R，4R)-4-[4-(2-羟基-5-＜2-甲基-丙氨基＞-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.223-226℃
68.N-{(3R，4R)-4-[4-(3-＜2，2-二甲基-丙氨基＞-6-羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。Mp.243-246℃
69.N-{(3R，4R)-4-[4-(2，5-二甲氧基-6-氟-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
70.N-{(3R，4R)-4-[4-(3-＜3-氮杂二环[3.2.1]辛-3-基＞-6-羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-异烟酰胺盐酸盐。
71.4-羟基苯甲酸{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。Mp.190-196℃
72.4-羟基苯甲酸{(3R，4R)-4-[4-(3-二甲氨基-6-羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。Mp.203-206℃
73.3，5-二甲基-4-羟基苯甲酸{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。Mp.180-183℃
74.3，5-二甲基-4-羟基苯甲酸{(3R，4R)-4-[4-(3-二甲氨基-6-羟基-苯甲酰基)-苯甲酰基氨基]-氮杂环庚烷-3-基}-酰胺盐酸盐。Mp.217-219℃
实施例3
为了研究按照本发明的化合物的AKT抑制活性，对于丝氨酸/苏氨酸激酶，AKT已经开发基于ELISA的测定。该检测设计利用了N-末端生物素化的底物肽。当通过AKT酶将该底物磷酸化时，产物为已知与特定磷酸化的丝氨酸残基结合的底物/序列特异性抗体所识别。对于该检测，已经使用来自细胞信号激素/New England Biolabs的生物素-SGRARTSSFAEPG肽和抗磷酸-GSK-3αSer21抗体(兔)。
用Sf9细胞中表达的AKT(100ng/反应)，底物肽(300nM)和ATP(5μM)在不同浓度的溶解在DMSO中的化合物存在或不存在下进行酶促反应。DMSO的终浓度为1％。在测定缓冲液中在室温下混合物反应30’，终体积为40μl，所述缓冲液包含50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1.0mMDTT，2mM Na3VO4，pH7.5。加入10μl，0.12M EDTA/0.12M EGTA终止反应。将反应混合物转移至SA-包被的微量滴定板。在1小时温育后，使用384-孔Embla板用PBS洗涤板。加入抗磷酸-GSK-3αSer21抗体。在1小时温育后，用PBS洗涤板，通过加入来自Roche Diagnostics GmbH的多克隆<兔>S-IgG-POD-偶联物检测结合的抗体。在1小时温育后用PBS洗涤板。通过酶促显色反应(ABTS转化)和在405nm下光度计测量来测定磷酸化肽的量。
为了测定IC50值，在250nM-10pM的浓度范围内检测化合物。用ActivityBase进行IC50值的计算。按照本发明的化合物给出3-116nM的IC50值，例如对于下面的但非限制性的，实施例1a，2-1，2-2，2-4，2-5，2-6，测定值分别为3，7，11，116，15和16nM。
实施例4
除了实施例3以外，如下在细胞AKT活性测定上研究按照本发明的化合物的活性：
在含有10％胎小牛血清，50单位/ml青霉素，和50单位/ml链霉素的RPMI 1640中将前列腺癌细胞系LNCaP传代。LNCaP细胞通过AKT的组成型活化表征。在LNCaP细胞中组成型活性的AKT磷酸化糖原合酶激酶-3(GSK-3)的Ser21/Ser9。为了测量化合物对活细胞中AKT活性的影响，用各种浓度(6μM-187nM)的抑制剂处理LNCaP细胞。在1小时后，将细胞收获在裂解液中，该裂解液包含50mM HEPES(pH7.0)，150mMNaCl，1.5mM MgCl2，1mM EGTA，100mM NaF，10mM焦磷酸钠，10％甘油，1％Triton X-100，1mM Na3VO4，10mM胃蛋白酶抑制剂，10mg/ml抑肽酶，5mM碘乙酸，和2mg/ml亮抑酶肽。将来自全细胞提取物的蛋白质在7.5％SDS/PAGE凝胶上电泳。之后将蛋白质转移在硝化纤维素滤器上并进行使用增强化学发光(ECL)检测系统(Amersham Pharmacia)的免疫印迹。由此使用多克隆抗-P-GSK-3-Ser-21/9抗体(兔；New EnglandBiolabs)测定GSK-3-Ser21/Ser9磷酸化的水平。这里，对于上述的但非限制性的实例1a，2-1，2-2，2-4，2-5，2-6，分别发现值为3，3，1.5，＞24，2和1μM。
实施例5
为了证明按照本发明化合物的提高的血浆稳定性，已经如下使用小鼠血浆试验：制备包含标准浓度的(10μmol/l)按照本发明的各种化合物的小鼠血浆样品。在相对于将所述化合物加入小鼠血清的规定的时期后(t＝0，0.5，1，2，4小时)，从血浆中分离等份，用HPLC分离和通过质谱分析。在所有这步骤期间，将温度保持在恒定37℃。
在下表中，将按照本发明的化合物的血浆稳定性与来自EP0 663 393A1的一种优选化合物比较。
表1来自EP0 663 393 A1的参照化合物 降低[％] 实施例46 100(2小时后) 按照本发明的化合物 降低[％](在4小时后) 实施例1a 6.2 实施例2-1 21.9 实施例2-2 26.9
实施例6
片剂制剂
项 成分 mg/片
1 化合物2-1 25 100
2 无水乳糖 73 35
3 交联羧甲基纤维素钠 6 8
4 聚乙烯吡咯烷酮K30 5 6
5 硬脂酸镁 1 1
总重 110 150
化合物2-1在实施例2中描述。
步骤：
1.在适当的混合器中将第1，2和3项混合15分钟。
2.用20％聚乙烯吡咯烷酮K30溶液(第4项)将来自步骤1的粉末混合物造粒。
3.在50℃下干燥来自步骤2的颗粒。
4.将来自步骤3的颗粒通过适当的研磨设备。
5.将第5项加入磨碎的步骤4的颗粒并混合3分钟。
6.在适当的压力机上压制来自步骤5的颗粒。
实施例7
胶囊制剂
项 成分 mg/胶囊
1 化合物2-1 50 100
2 无水乳糖 123 148
3 玉米淀粉 35 40
4 滑石 15 10
5 硬脂酸镁 2 2
总填充重量 225 300
化合物2-1在实施例2中描述。
制备步骤：
1.在适当的混合器中将第1，2和3项混合15分钟。
2.加入第4&5项并混合3分钟。
3.装入适当的胶囊。
参考文献
Beresford，S.A.，等，J.Interferon Cytokine Res.21(2001)313-322
Blume-Jensen，P.，和Hunter，T.，Nature 411(2001)355-365
Cross，T.G.，等，Exp.Cell Res.256(2000)34-41
Datta，S.R.，等，Genes Dev.13(1999)2905-2927
de Vita，V.T.，Jr.，Hellmann，S.，Rosenberg，S.A.，Cancer：Principles &Practice of Oncology，5th ed.，Lippincott-Raven Publishers，1997
EP 0 296 110 A2
EP 0 657 458 A1
EP 0 663 393 A1
EP 0 802 190 A1
EP 1 020 471 A1
Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie，Vol.XV/1和XV/2
Kandel，E.S.，和Hay，N.，Exp.Cell Res.253(1999)210-229
Nesterov，A.，等，J.Biol.Chem.276(2001)10767-10774
WO 94/20062
WO 95/30640
WO 97/02249