技术领域
本发明涉及水凝胶领域，更加具体地说，涉及具有药物和基因释放双功能的高强度 水凝胶及其制备方法，即β-环糊精和2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共聚物 （PCD-co-PVDT）水凝胶的制备以及对其作为药物载体和基因载体性能的研究。
背景技术
水凝胶是一类以水为分散介质，在水中能够吸收大量的水分并能够保持其原有结构 而不被溶解的具有三维网络结构的聚合物。同时，还具有良好的水渗透性，生物相容性， 固作为人体植入物可以减少不良反应。因而水凝胶被作为优良的生物医用材料得到广泛 应用。但是，对于传统的水凝胶，较差的机械性能限制了其作为生物材料尤其是力学器 件的应用。近年来，有很多研究者致力于改善水凝胶的力学性能，例如双网络凝胶（J.P. Gong,Y.Katsuyama,T.Kurokawa,Y.Osada,Double-Network Hydrogels with Extremely High Mechanical Strength.Adv.Mater.15(2003)1155-1158）、滑环凝胶、纳米复合材料凝 胶、四臂-聚乙二醇凝胶、大分子微球复合凝胶、偶极-偶极增强凝胶、离子/共价交联凝 胶和疏水的薄层状复合凝胶等。这些文献报道的技术主要是致力于增强水凝胶的强度， 如拉伸、压缩、延展性和断裂能等。最近，文献报道了一系列基于二氨基三嗪氢键的高 强度凝胶(L.Tang,W.Liu,G.Liu,High-Strength Hydrogels with Integrated Functions of H‐bonding and Thermoresponsive Surface-Mediated Reverse Transfection and Cell Detachment Adv.Mater.22(2010)2652-2656)。二氨基三嗪残基内可以形成氢键，导致水 凝胶机械强度增加；同时在其表面二氨基三嗪组分能够结合质粒DNA，用于反向转染或 基质-介导的基因转染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种既可以载药又能载基因的水凝胶， 具体为合成的带有双键的β-环糊精和2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪的共聚物 （PCD-co-PVDT），该水凝胶具有较高的抗拉伸和抗压缩能力，以及良好的生物相容性。 以布洛芬（IBU）为疏水性模型药物研究了PCD-co-PVDT水凝胶的药物释放性能，同时 考察了其吸附质粒DNA转染细胞的能力。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：
一种聚乙二醇修饰的β-环糊精单体交联的高强度水凝胶（基于环糊精交联的二氨基 三嗪氢键增强水凝胶），由2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪（VDT）和带有双键的 β-环糊精通过自由基聚合共聚而成，将这两种单体和引发剂溶解在溶剂中，通过引发剂 引发它们分子上的不饱和键，通过自由基聚合反应制备出水凝胶。
其制备方法，包括以下步骤：
首先，合成聚乙二醇修饰的β-环糊精交联剂。采用N,N’-羰基二咪唑活化聚乙二醇甲 基丙烯酸酯（Mn=526，即PEG526MA），然后加入β-环糊精反应至少24小时，将反应 后的混合物通过透析和冻干得到目标产物PEG526MA-β-CD，其反应机理如下化学反应 方程式所示：
其中N,N’-羰基二咪唑（CDI）和聚乙二醇甲基丙烯酸酯的质量比为1：1，反应温 度为20-25℃，反应时间优选24-30小时，采用二甲基亚砜（DMSO）为反应溶剂。
其次，制备本发明水凝胶的方法，按照下述步骤进行：
将合成的PEG526MA-β-CD、2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪（VDT）和引发剂 溶解在溶剂中，通过引发剂引发PEG526MA-β-CD和VDT的不饱和键，在隔绝氧气的条 件下通过自由基聚合反应制备出既可负载药物又可作为基因载体的水凝胶。
在本发明的技术方案中，为了赋予基于二氨基三嗪氢键增强凝胶更多的功能，在本 研究中，我们在β-环糊精上接有双键，将其作为交联剂与VDT形成凝胶。β-环糊精由 （β-CD）7个D-吡喃葡萄糖单元通过α-1，4糖苷键连接而成的一种环状低聚糖组成，且 其内部有一个疏水的空腔。通过主客体相互作用，β-环糊精的空腔能够与很多有机分子 形成包合物，包括药物、偶氮苯和金刚烷等。聚乙二醇丙烯酸酯修饰的β-环糊精上带有 多个双键，可以当作交联剂。聚乙二醇丙烯酸酯分子链中间为“氧—碳—碳—氧”单键相 连的骨架结构(即聚乙二醇分子的主链结构-(CH2CH2O)n)，采用热源或者光源使引发剂 提供自由基，再由自由基引发聚乙二醇丙烯酸酯修饰的β-环糊精与2-乙烯基-4,6-二氨基- 三嗪中的双键，发生共聚反应。最终制备的水凝胶材料中，具有聚乙二醇丙烯酸酯修饰 的β-环糊精和聚2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪两种物质的链段。其中，2-乙烯基-4， 6-二氨基-1，3，5-三嗪分子上的大量氨基间形成大量氢键，极大提高了水凝胶的韧性和 强度，同时可以将质粒DNA固定在凝胶的表面，赋予该凝胶负载基因的功能；聚乙二醇 丙烯酸酯修饰β-环糊精结构不仅能提供柔性的亲水链段，而且其疏水的空腔可以包覆疏 水性药物，可作为药物载体。上述两部分协同作用，使整个水凝胶材料体现出生物相容 性和一定的力学强度，同时具有双功能：即可作为药物载体又可以负载基因。
利用引发剂提供的自由基引发VDT和PEG526MA-β-CD交联剂发生反应。其中引 发剂可以选择高分子聚合领域中常用的热引发剂，如偶氮二异丁腈（ABIN）、过氧化苯 甲酰（BPO），或者光引发剂，如1-[4-（2-羟乙氧基）-亚苯基]-2-羟基-2′，2′ -二甲基乙酮（Irgacure2959）、甲基乙烯基酮、安息香。如果选择热引发剂，则需要首 先利用惰性气体（如氮气、氩气或者氦气）排除反应体系中的氧气，避免阻聚作用；然 后根据引发剂的活性和用量，将反应体系加热到所用引发剂的引发温度之上并保持相当 长的时间，如1h以上或者更长（1-5h），以保证引发剂能够产生足够多的自由基，引 发反应体系持续发生自由基聚合反应，最终制备本发明的水凝胶。如果选择光引发剂， 则可以选用透明密闭的反应容器，在紫外光照射的条件下引发自由基聚合，由于光引发 效率高于热引发，需要根据所选引发剂的活性和用量调整照射时间，照射时间可短于热 引发的加热时间，如20分钟或者更长（30min-1h）。
在本发明的技术方案中，应当根据VDT、PEG526MA-β-CD和使用的引发剂的溶解 性，选择能够完全溶解上述三种物质或者能够与上述三种物质完全互溶的溶剂，形成均 匀反应体系，例如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜等。
在制备方案中，合成聚乙二醇丙烯酸酯修饰的β-环糊精交联剂时，聚乙二醇甲基丙 烯酸酯与β-环糊精的投料摩尔比为（4-6）：1，产率为50%-70%。制备凝胶时，VDT 和PEG526MA-β-CD的质量比为（0.5-2）：1，优选（1-2）：1，引发剂的质量为单体与 交联剂总质量（即两种单体）的2%-4%。在反应结束后，从反应容器中取出共聚物，去 除未参加反应的单体、引发剂和溶剂后，浸泡在水中直至达到溶胀平衡（如浸泡7天， 每隔12h更换一次水，达到溶胀平衡）。
本发明提供的一种高强度PCD-co-PVDT水凝胶是聚乙二醇丙烯酸酯修饰的β-环糊精 和2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪为原料，在引发剂存在引发下共聚制成。使水凝 胶同时综合了聚β-环糊精和2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪的性质，具有很高的吸水 率，很强的抗拉伸和抗压缩能力，具有良好的生物相容，既提高凝胶的力学性能又可以 将质粒DNA固定在凝胶的表面，达到基因转染的目的，同时聚乙二醇修饰的β-环糊精交 联剂一方面可以提高凝胶的亲水性，另一方面β-环糊精的空腔有利于负载疏水性的药物 实现控制药物释放。该水凝胶（如附图1所示分子结构示意图）在室温下制备，制备方 法简单，耗能低，产品易于长期保存和长途运输。
附图说明
图1是水凝胶的分子结构示意图。
图2是β-环糊精和聚乙二醇丙烯酸酯修饰的β-环糊精在氘代DMSO中的核磁谱图，其中 （1）为PEG526MA-β-CD，（2）为β-CD。
图3是不同配比水凝胶的衰减全反射的红外光谱图，其中1为cr-PVDT；2为PCV1-2； 3为PCV1-1.5；4为PCV1-1；5为PCV2-1。
图4是不同配比水凝胶在常温时释放布洛芬的曲线图，其中1（方块）为cr-PVDT；2（圆） 为PCV1-2；3（正三角）为PCV1-1.5；4（倒三角）为PCV1-1；5（菱形）为PCV2-1。 图5是用YOYO-1标记的不同配比水凝胶吸附PVDT/pDNA复合物的荧光照片，其中A为 PCV2-1，B为PCV1-1，C为PCV1-2。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
其中聚乙二醇丙烯酸酯(PEGDA)可直接购买自美国Sigma公司（Mn=526， PEG526MA），采用4gN,N’-羰基二咪唑（购自天津市科威试剂有限公司）活化4g聚乙 二醇甲基丙烯酸酯，然后加入2gβ-环糊精（购自天津市科威试剂有限公司）反应24小 时，反应温度为20-25℃，采用DMSO作为反应溶剂，将反应后的混合物通过透析和冻 干，得到目标产物PEG526MA-β-CD。图2是β-环糊精和聚乙二醇丙烯酸酯修饰的β-环糊 精在氘代DMSO中的核磁谱图，所用仪器为UNITY plus-500NMRspectrometer(Varian, USA)，其中δ4.8ppm为环糊精上与一号位碳直接相连的氢原子（即H1）,δ3.5-3.6ppm为 H3（环糊精上与三号位碳直接相连的氢原子）,H5（环糊精上与五号位碳直接相连的氢 原子）,H6（环糊精上与六号位碳直接相连的氢原子）；δ3.2-3.3ppm是H2（环糊精上 与两号位碳直接相连的氢原子）,H4（环糊精上与四号位碳直接相连的氢原子）和HPEG； δ4.4(环糊精上与六号位碳直接相连的羟基上的氢原子，即O6H)、δ5.7(环糊精上与二号 位碳直接相连的羟基上的氢原子，即O2H)和δ5.6ppm(环糊精上与三号位碳直接相连的 羟基上的氢原子，即O3H)分别是羟基上的质子峰，在核磁谱线（1）上出现的a（δ1.46ppm） 和b（δ6.0ppm）分别为a位上和b位上氢的位移。结果显示，聚乙二醇丙烯酸酯成功的 接到了β-环糊精上，β-环糊精羟基上的取代度为71.4%。
将合成的交联剂PEG526MA-β-CD（14mg），2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪 （7mg），加入到1.5ml离心管中，用200μl的二甲基亚砜（DMSO）溶解单体和交联剂 后，加入光引发剂Irgacure2959（0.8mg，1-[4-(2-羟乙氧基)-亚苯基]-2-羟基-2′,2′-二甲基 乙酮）。将含有单体，交联剂和引发剂的溶剂加入圆形模具中，模具在紫外固化箱中照射 30min，以充分引发自由基聚合。随后打开模具取出凝胶，用去离子水反复冲洗数次，并 浸泡7天，每隔12h更换上述去离子水。测试所制得的水凝胶的吸水率。按相同步骤制 备凝胶片状物，进行力学性能、包覆药物布洛芬和细胞实验。此凝胶样品命名为PCV2-1。 改变交联剂PEG526MA-β-CD和单体VDT的质量比例，分别进行物理性能测试。对于本 发明实施例中的凝胶，我们用PCVx-y表示，x-y代表PEG526MA--β-CD/VDT的质量比。
凝胶的平衡吸水率按如下方法测得：将在纯水中充分浸泡好的水凝胶表面的水用称 量纸吸去，然后放在天平上称得湿重mwet，接着把凝胶放在烘箱内进行干燥，直到重量达 到平衡测得干重mdry，根据公式meq=(mwet-mdry)/mwet×100%计算凝胶的平衡吸水率，其中 mwet和mdry分别代表凝胶的湿重和干重。凝胶的机械性能用WDW-05电子机械仪测试， 进行拉伸力学性能测试的样品的尺寸为20mm×2mm，厚为30μm。测试时，标距和拉伸速 度固定为10mm和100mm/min以减少误差。
图3是不同配比水凝胶的衰减全反射的红外光谱图，采用Nicolet380FT-IR spectrometer(USA)测定。从图中可以看出，其中PVDT的特征峰位：3340cm-1为N-H伸缩 振动；2870cm-1为C-H的伸缩振动；1627cm-1为C=N伸缩振动；1022cm-1是β-环糊精上的 C-OH的伸缩振动峰。由此证明PEG526MA-β-CD和单体VDT共聚水凝胶成功的合成出来 了。
表1列出了不同配比水凝胶的平衡吸水率、拉伸强度和压缩强度，从表中可以看出随 着VDT比例的提高，水凝胶的力学性能有明显的增高，但吸水率则随之下降。
表1不同配比水凝胶的物理性能参数
采用如下方法对水凝胶的载药和释药能力进行测试：选用疏水的布洛芬作为药物模型 来考察水凝胶的载药能力和包封率。首先将凝胶冻干，在室温条件下将一定质量冻干的 凝胶浸泡在2mg/mL的布洛芬溶液中，浸泡三天直至水凝胶达到平衡。然后将水凝胶取 出，洗去其表面残留的布洛芬。接着将载药后的凝胶真空干燥，干燥后将其放在500μL 的水中，到一定时间取出溶液，再加入相同体积的水。借助可见-紫外光谱仪，在波长223nm 处检测布洛芬的释放量。其中，载药能力=凝胶载药的质量/干凝胶的质量；包封率=凝胶 载药的质量/投入药的质量×100%。
表2显示了不同配比水凝胶的载药能力和包封率，从表中可以看出：在水凝胶中，β- 环糊精的含量越高，其载药能力和包封率越好。这是因为布洛芬分子和β-环糊精之间通 过主-客体相互作用形成复合物。图4是不同配比水凝胶在常温时释放布洛芬的曲线图， 在前20小时，所有凝胶的释放速度都比较快，此时药物释放主要是由水凝胶的溶胀来控 制。水凝胶达到平衡后，布洛芬的释放速率随着交联剂聚乙二醇丙烯酸酯修饰的β-环糊 精含量的增加而降低，表明水凝胶中β-环糊精可以减缓布洛芬的释放。
表2不同配比水凝胶的载药能力和包封率
cr-PVDT（即PVDT）为2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪单体的单独聚合物，采 用与共聚物相同的制备工艺参数进行制备
采用如下方法利用水凝胶进行细胞实验，将得到的凝胶浸入医用酒精，在紫外灯下照 射20分钟灭菌后放入48孔板中，加入500μlDMEM培养基置换掉医用酒精。将本发 明制备的凝胶浸入DMEM培养基24小时候后，将一定体积的PVDT/pDNA复合物加入 到有凝胶的孔板中。20℃吸附24小时后，将培养至指数生长期的COS-7细胞悬液加 入到已经吸附了DNA的凝胶中，培养24小时后，换培养液培养24小时，之后裂解细胞， 测定其中的荧光素酶活性。
图5是YOYO-1标记的不同配比水凝胶吸附PVDT/pDNA复合物的荧光照片，采用 olympus,CKX41荧光显微镜拍照。结果显示：绿色荧光的点数随着VDT含量的增加而 增多；表明VDT含量越高，在凝胶表面固定的PVDT/pDNA复合物越多。表3列出了不 同配比水凝胶吸附PVDT/pDNA复合物介导体外转染COS-7细胞表达荧光素酶报告基因 和凝胶对COS-7细胞系的毒性（细胞毒性仪器型号SYNARGY HT），从中可以看出：凝 胶中VDT含量越高，反向转染效率越好；在制备的凝胶表面，细胞的存活率能达到80%， 意味着凝胶毒性较低。
改变制备凝胶时的反应时间、反应温度、引发方式及引发剂用量，最终制备的凝胶与 实施例中凝胶表现基本相同性质。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下， 任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落 入本发明的保护范围。