一种抑制白细胞介素-4，刺激g干扰素的免疫调节剂及制备方法 技术领域
本发明属于免疫学、化学和免疫药理学的交叉研究领域，更具体涉及一种抑制白细胞介素-4刺激γ干扰素的免疫调节剂，在临床上增强细胞免疫的抗胞内菌，抗病毒和寄生虫的感染的药物或作为抗移植排斥反应药物。同时涉及该免疫调节剂的制备方法。
背景技术
N-五氟苄基-1-脱氧野尻霉素(5F-DNM)是一种结构清楚的小分子免疫调节剂，与当今使用的抗排斥反应药物和免疫调节剂在结构上无任何相似性。目前现有的免疫调节剂或是化学合成的，或是微生物制剂，生物制剂或中草药等成分提取物，成分复杂，机制不清楚。按照WHO的标准，选择一种化合物作为免疫调节剂的基本条件是：①化学成分明确；②易于降解；③无致癌或制突变性；④免疫调节作用适中；⑤无毒副作用。已知现有地免疫抑制剂环孢素A(cyclosporinA，CYA)(一种真菌提取物)相比，环孢素A有较大的毒副作用。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种抑制白细胞介素-4刺激γ干扰素的免疫调节剂，此调节剂分子量小(MW：342.25)，具有对细胞无毒，能有效地降低免疫分子白细胞介素-4的分泌，刺激γ干扰素的分泌，对CD8T淋巴细胞有一定增强作用和对CD4T淋巴细胞有一定抑制作用。
本发明的另一目的涉及该免疫调节剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明的小分子免疫调节剂的合成方法是：将5mg～18mg的脱氧野尻霉素(DNM，1-deoxynojirimycin)与25～35mg的五氟苄基溴(N-pentafluorobenzyl)混合于DMF4～9mL试剂中。此混合物于20-30℃下搅拌20分钟至50分钟，然后加于10～30mg，碳酸铯(CsCO3)。将混合物于25～35℃搅伴16至25小时，用TLC/紫外线监测。混合物静置反应40分钟至90分钟，待出现白色沉淀，过滤去除沉淀，真空抽干母液，得到白色固体。进一步用C-18柱子纯化，溶剂为异丙醇/H2O/NH3.H2O＝190/10/1，20-30℃蒸干溶剂，即得到纯化的产品。采用该化合物的结构式是：
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：其结构清楚，分子量小，对细胞无毒。效果是可抑制白细胞介素-4的分泌，增强γ干扰素的产生，因而能用作临床上增强细胞免疫的抗胞内菌，抗病毒和寄生虫的感染和抗移植物的排斥的药物。
附图说明
图1新型小分子免疫调节剂(5F-DNM)对小鼠脾脏细胞分泌白细胞介素-4(IL-4)的抑制，并且随着药物浓度的增大，抑制能力增强，呈剂量依赖关系。分离小鼠脾脏细胞，调整至5×106/ml。以每孔加5×105细胞至96孔板中，然后加不同浓度的5F-DNM药物至每空孔中，于37℃下，5％CO2温育72h。收集上清，2000g离心5min，检测上清，用IL-4试剂盒检测(晶酶公司)。
图2新型小分子免疫调节剂(5F-DNM)刺激小鼠脾脏细胞分泌γ干扰素，并且随着药物浓度的增大，刺激能力增强，呈剂量依赖关系。分离小鼠脾脏细胞，调整至5×106/ml。以每孔加5×105细胞至96孔板中，然后加不同浓度的5F-DNM药物至每空孔中，于37℃下，5％CO2温育72h。收集上清，2000g离心5min，检测上清，用γ干扰素试剂盒检测(晶酶公司)。
图3流式细胞仪分析药物5F-DNM与环孢素A，以及阴性对照分别对正常人淋巴细胞CD4T和CD8T的作用比较。新鲜分离的人外周血单个核细胞100μl(1×106/ml)经用药不同处理，与5μlFITC-CD4抗体与5μlPE-CD8抗体在室温暗处反应20分钟，上样检测，收集2000个细胞分析。流式细胞仪为ALTRA EPICS(COULTER)。
其中：图3A对照组：正常人淋巴细胞
图3B 10μM 5F-DNM作用后的人淋巴细胞
图3C 10μM环孢素A作用后的淋巴细胞
具体实施方式
根据化合物结构式，其具体步骤如下：将10mg的脱氧野尻霉素DNM(1-deoxynojirimycin)与32mg的五氟苄基溴(N-pentafluorobenzyl)混合于DMF(5mL)试剂中。此混合物于30℃下搅拌30分钟，然后加于21mg碳酸铯(CsC03)。将混合物于30℃搅伴18小时，用TLC/紫外线监测。混合物静置反应60分钟，待出现白色沉淀，过滤去除沉淀，真空抽干母液，得到白色固体。进一步用C-18柱子(溶剂为异丙醇/H2O/NH3.H2O＝190/10/1)纯化，25℃蒸干溶剂，即得到纯化的产品。合成免疫调节剂的化合物，称为5-氟地恩们，或化学名称：N-五氟苄基-1-脱氧野尻霉素(5F-DNM)。
取小鼠脾脏浸泡于无血清的RPMI-1640培养基中，并用钢丝网碾磨。再用200目的尼龙网过滤。滤液2000g离心10min，然后弃上清。沉淀溶于5ml pH7.2 Tris-NH4Cl，并于37℃反应6～10min以裂解细胞，然后离心2000g，10min，将细胞沉淀溶解于含有10μg/ml，10％新生小牛血清的RPMI-1640培养基中。数细胞数，调整细胞浓度至5×106/ml。以每孔加5×105细胞至96孔板中，然后加不同浓度的5F-DNM药物至每空孔中，于37℃下，5％CO2温育72h。收集上清，2000g离心5min，上清待检测。
将上述得到的上清用IL-4和IFN-γ试剂盒检测(晶酶公司)。按照试剂盒步骤，96孔板用孔板用anti-IL-4或anti-IFN-γ包被，不同浓度的样品和IL-4或IFN-γ标准品(500、250、125、62.5、31.25、15.63pg/ml)加入至每孔中，20-25℃温育120min，用磷酸缓冲液洗板5次，加入100μl biotin-标记的anti-IL-4或anti-IFN-γ至每孔中，于20-25℃温育60min。再洗板5次，加入100μl HRP-streptoavidin至每孔中，于20-25℃温育30min。再洗板5次，加入HRP酶的底物，并测颜色变化OD450nm。用已知浓度的IL-4或IFN-γ作标准曲线，根据标准曲线确定样品的浓度。见表1，2和图1、2。
表1.新型小分子免疫调节剂(5F-DNM)对白细胞介素-4(IL-4)的抑制作用，并且随着药物浓度的增大，抑制能力增强，呈剂量依赖关系 药物 对照 无药 无细胞 5F-DNM μM 0 0 25 50 100 IL-4(pg/ml) 0.8±0 144.8±13.0 19.8±4.3** 12.3±4.3** 9.8±7.5** IL-4相对 产量(％) 100 6.78 13.69 8.51 6.78
**代表药物与未加药对照组相比有显著差异，p＜0.05，各值代表至少三次独立实验的平均值
表2.新型小分子免疫调节剂(5F-DNM)增强小鼠脾脏细胞IFN-γ的分泌，并且随着药物浓度的增大，分泌能力增强，呈剂量依赖关系 药物 对照 无药 无细胞 5F-DNM μM 0 0 25 50 100 IFN- γ(pg/ml) 31.3±6.86 0 57.4±15** 75.8±8.1** 96.3±27** IFN-γ相对 产量 100 0 183 241 306
**代表药物与未加药对照组相比有显著差异，p＜0.05，各值代表至少三次独立实验的平均值
5F-DNM的细胞毒性的检测
采用细胞毒性检测试剂盒(Promega)。按照试剂盒的步骤定量检测浆膜破损的细胞释放至培养基上清中细胞质酶：LDH(lactate dehydrogenase)。结果证明5F-DNM对细胞无毒性作用。见表3。
表3.药物5F-DNM对细胞没有细胞毒作用
Drugs(μM) ％Cytotoxicity
无药 0
25 5.66±0
50 4.60±3.29
100 3.69±5.03
采用流式细胞仪检测发现10μM 5F-DNM对CD8T具有一定增强作用，对CD8T细胞从正常23％百分率增至31.3％，而10μM环孢素A对CD8T细胞无作用(正常CD8T为23％，10μM环孢素A作用后为25％)；10μM 5F-DNM对CD4T具有一定抑制作用，从正常CD4T 52％百分率降为19％，比环孢素A对CD4T抑制作用弱，10μM环孢素A对CD4T细胞，从正常CD4T 52％百分率降为为3.95％，与已知的对CD4T细胞选择性的抑制剂环孢素A(cyclosporin A，CYA)相比，免疫调节作用适中。见图3A、3B、3C。