本申请是原申请的申请日为2008年7月11日，申请号为200880023896.8，发明名称为《柔软的自立性的蛋白质纳米薄膜、其制造方法和应用》的中国专利申请的分案申请。
发明内容
本发明所要解决的问题
为了解决上述纤维性纳米复合物存在的问题，本发明人们进一步研究了使用蛋白质涂覆正电荷的金属氢氧化物纳米链的方法。这样，通过用戊二醛(GA)使纤维性复合物中的蛋白质进行共价键交联，之后除去无机纳米链，幸运的是，能够成功地开发出强健的柔软的自立性的超薄(纳米)的或者薄的纯蛋白质膜。
解决问题的手段
即，本发明提供一种自立性蛋白质膜，它是蛋白质交联而形成的多孔质的自立性蛋白质膜，其特征在于，构成所述多孔质膜的孔的至少一部分是通过去除纳米结构物而形成。这里，本说明书中，“膜”和“フイルム(film)”的意思相同，“自立性”和“自支撑性”的意思相同。所述纳米结构物优选是纳米链。
另外，本发明还提供一种制造方法，它是蛋白质交联而形成的多孔质的自立性蛋白质膜的制造方法，其特征在于，包括如下工序：
(1)第一工序：混合纳米结构物和蛋白质，获得由蛋白质和纳米结构物形成的复合物；
(2)第二工序：通过所述由蛋白质和纳米结构物形成的复合物形成膜状体，通过交联剂使所述蛋白质相互交联；
(3)第三工序：溶解去除所述纳米结构物，制造多孔质膜。
在所述自立性蛋白质膜的制造方法中，优选所述纳米结构物是金属氢氧化物纳米链，优选所述膜状体是集聚由蛋白质和金属氢氧化物纳米链形成的复合物-纳米纤维而形成。
另外，本发明还提供上述多孔质自立性蛋白质膜的几种应用。作为一个应用，本发明提供一种复合蛋白质膜，它是蛋白质膜和其他分子膜成为一体的复合蛋白质膜，其特征在于，所述蛋白质膜为上述的多孔质的自立性蛋白质膜。
在所述复合蛋白质膜中，优选所述分子膜和所述蛋白质膜是由交联剂交联而成为一体。
发明的效果
本发明的蛋白质交联而形成的多孔质的自立性蛋白质膜为薄且新型的膜。(使用脱铁铁蛋白作为蛋白质的)有的例子中，得到的蛋白质膜是这样的膜：厚度为均一的25nm，直径为7.5cm，直径/厚度之比为3,000,000(如此高的比率以前还没有报道过。)。
本发明的多孔质的自立性蛋白质薄膜，能够应用于小分子量(约1000或其以下)的分子的尺寸选择性分离。它们还可以进一步以非常高的容量(摩尔比)应用于：pH控制下的分子的高效分离，或者一边使pH变动一边进行的色素分子的可逆的吸附和解吸。
根据本发明的制造方法，能够较容易地制造蛋白质交联而形成的多孔质的自立性蛋白质薄膜。
本发明的由两层构成的自立性薄膜，其一层为上述的多孔质的自立性蛋白质薄膜，另外一层为在前述蛋白质膜上沉积规定的分子、并且用二官能性交联剂交联而形成的薄的分子膜，该自立性薄膜是新型的多层膜，应该能够和上述多孔质的自立性蛋白质薄膜具有不同的使用方法。
具体实施方式
首先，详细说明自立性的超薄(纳米)的或者薄的蛋白质膜的制造方法。本发明的制造方法，如上所述，包含以下各工序：
(1)形成金属(Cd、Cu或者Zn)氢氧化物纳米链的工序；
(2)得到由蛋白质和上述金属氢氧化物纳米链形成的复合纳米纤维的工序；
(3)过滤工序；
(4)交联工序；以及
(5)除去金属氢氧化物的工序。
这里，不一定要按照上述顺序进行，不过，上述顺序，即(1)→(2)→(3)→(4)→(5)的顺序是最优选的。
进一步地，工序(4)(交联工序)之后，也能够增加剥离由蛋白质和金属氢氧化物生成的复合纳米纤维的工序。
本发明中，能够使用各个种类的蛋白质。在后面将示出使用铁蛋白、脱铁铁蛋白、细胞色素c、肌红蛋白以及葡萄糖·氧化酶(不必说，也能够使用其他的蛋白质)的例子。尽管不限于单一的蛋白质，也可以使用混合的蛋白质，但是从期望得到膜的均一性这方面来看，单一蛋白质的使用是优选的。
自立性的超薄的(纳米)或者薄的蛋白质膜的典型的制造过程的路线如图1所示。
最先的工序(形成金属氢氧化物纳米链的工序；不过，在这里图中未示出)中，按照其他地方(参照非专利文献3、4)所示的那样，制备聚合物状正电荷的金属氢氧化物纳米链。简而言之，将稀碱液添加至Cd、Cu或者Zn的硝酸盐(对于Cd或者Zn，盐酸盐也可以)的稀溶液中，将pH调至中性或者弱碱性(pH＝6.0～8.5)，以此状态在室温下放置数分钟到一天，自发地形成金属氢氧化物纳米链(其粗度直径达到约2～3nm，其长度达到数十μm)。
把得到的金属氢氧化物纳米链和带负电荷的蛋白质的水溶液一起混合规定的时间，则生成由蛋白质和金属氢氧化物纳米链形成的复合纳米纤维分散液。把得到的分散液在孔径为200nm(孔隙率为约10％)的聚碳酸酯(PC)膜那样的过滤器的上面过滤，形成复合纳米纤维性膜。接下来，将得到的膜用二官能性交联剂的溶液(例如，10重量％戊二醛水溶液)中处理足够长的时间，完成交联反应。
使用戊二醛的场合的反应如下：
Protein·NH2+O＝CHC3H6HC＝O→Protein·N＝CHC3H6HC＝N·protein+2H2O
除了戊二醛，也能够使用其他的二官能性交联剂，例如，作为蛋白质的二官能性交联剂为人熟知的各种酰亚胺酯类、N-羟基琥珀酰亚胺酯类或者碳二亚胺类。
图1表示的是这些交联之后的纳米纤维性复合膜的剥离例。为了所述剥离，可以把带有上述膜的过滤器浸渍在醇(例如乙醇)中，而得到具有自立性的交联膜。
接着，把具有自立性的上述交联膜浸入盐酸溶液那样的无机酸水溶液中，除去金属氢氧化物纳米链。然后，用精制水洗去过剩的金属离子和盐酸。这样，能够得到纯净的(即，不含金属氢氧化物)、漂浮在水中的自立性蛋白质膜。为了进一步的应用或者评价，可以将这些膜保存在醇中。
蛋白质膜的厚度，通过调节被过滤的纤维性复合物液的容量，能够在10nm到10μm的范围内较容易地控制。(参照实施例3、表1。)
为了施行作为对象的材料的迅速而且简便的分离(或者浓缩)，蛋白质膜的厚度，优选为15nm～1000nm、更优选为20nm～1000nm。想要过滤规定浓度的纤维性复合物的时候，蛋白质膜的厚度及其过滤操作的时间、与过滤液的容量呈线性关系。
蛋白质膜的大小(直径)没有限制。原因是，蛋白质膜的直径基本上由漏斗的大小(内径)所决定。上述的自立性的超薄(纳米)的或者薄的蛋白质膜具有各种应用。如上所述，一个应用是，制备由两层构成的自立性的薄膜，一层为上述的蛋白质膜，另外一层为在前述蛋白质膜上沉积规定的分子、并且用二官能性交联剂交联而形成的薄的分子膜。
这里，作为“规定的分子”，能够使用在合成高分子那样结构的已知的各种分子中，具有不能通过上述蛋白质膜的通路的程度的大分子量的分子。作为那样的合成高分子，例如可以使用具有末端氨基的树形物。然后，作为那样的树形物，优选使用分子量约2000以上(不能通过上述蛋白质膜的通路的大小)的聚酰胺胺。
实施例
实施例中使用的材料如下。CdCl2·2.5H2O、Cu(NO3)2·3H2O、2-氨基乙醇、直接黄50、伊文思蓝(evansblue)、8-氨基萘-1，3，6-三磺酸二钠盐、K3[Fe(CN)6]、氯化氢(5M溶液)和戊二醛(50重量％水溶液)是从关东化学购入。四(1-甲基吡啶鎓-4-基)卟吩、对甲苯磺酸、8-辛酰基羟基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐、铜酞菁四磺酸四钠盐、葡萄糖氧化酶、细胞色素c、肌红蛋白、马脾铁蛋白(76mg/ml溶液)和脱铁铁蛋白(38mg/ml溶液)是从西格玛奥德里奇公司购入。去离子水(18.2MΩ)是由密理博公司的直接-Q(Direct-Q)系统制造，用于全部实验之中。为了制备自立性膜，使用聚碳酸酯(PC)膜和直径为2.5cm、4.7cm、以及9.0cm的过滤器(Nuclepore，沃特曼公司)。氧化铝膜(Anodisc，孔径为0.2μm，直径为2.5cm，厚度为60μm)也是从沃特曼公司购入。
使用的器具和方法如下。通过扫描电子显微镜(SEM、日立S-4800)、透射电子显微镜(TEM、JEOL 1010)和具备能量分散性X射线分析系统的高分解能透射电子显微镜(HR-TEM，JEM 2100F)，对得到的膜进行特性评价。将该自立性膜移动至用碳涂覆的栅格上，来准备用于TEM和HR-TEM观察的样品。关于SEM观察，是用日立e-1030离子溅射仪，在10Pa的压力、10mA的电流密度下，涂覆2nm厚度的铂层之后进行。关于紫外可见吸收光谱，是用SHIMAZU UV-3150分光光度计得到。关于光致发光光谱，是通过JASCOEP-6500分光光度计得到。关于磁性，是通过具备超导干涉装置的市售的磁强计(MPMS-XL、量子设计公司)测定。关于机械特性，是用原位纳米力学测试系统(TriboIndenter，Hysitron公司)，使用带有硅基板的金刚石制博克维茨压头(Berkovitch indenter)测定。关于分子的大小，是通过Chem3D Ultra 10.0(剑桥科学计算公司，Cambridge Scientific Computing)测定。
实施例1本发明的蛋白质膜的制备及特性评价
(a)制备
首先，利用文献(参照非专利文献2-4)中记载的方法，制备聚合物那样的带有正电荷的氢氧化镉纳米链。简而言之，把稀苛性钠溶液或者氨基乙醇溶液(2mM，20mL)投入到20mL的4mM硝酸镉水溶液中，迅速混合，进一步搅拌数分钟，制备出氢氧化镉纳米链。
在得到的氢氧化镉纳米链分散液中，加入蛋白质(铁蛋白、脱铁铁蛋白、细胞色素c、肌红蛋白或者葡萄糖氧化酶)，然后搅拌30分钟。铁蛋白和脱铁铁蛋白的情况，其混合液是由3.8mg/mL的蛋白质液1mL和氢氧化镉纳米链分散液20mL制得。细胞色素c、肌红蛋白和葡萄糖氧化酶的情况，其混合液是由6.4mg/mL的蛋白质液1mL和氢氧化镉纳米链分散液20mL混合而制得。
在表压(压差)90KPa的条件下，将规定量的该混合物在聚碳酸酯膜(用于过滤的膜/漏斗的直径：3.2cm)上过滤。然后，将该膜浸入10重量％的戊二醛水溶液中，室温下交联反应1小时。把带有膜的PC膜浸入乙醇中，剥离，得到这些交联反应后的纳米纤维性复合膜。把得到的自立性膜浸渍在10mM盐酸溶液中3小时，除去无机的纳米链，然后，用密理-Q(mili-Q)精制水洗去过剩的镉离子和盐酸。这样，得到5种漂浮在各自的水中的纯粹的自立性蛋白质(铁蛋白、脱铁铁蛋白、细胞色素c、肌红蛋白或者葡萄糖氧化酶)膜。
(b)特性评价
图2是交联反应后的铁蛋白/氢氧化镉纳米链的纳米纤维性膜的TEM照片，从该照片可以看出，纤维性结构比较明显，另外，对于蛋白质而言，大部分沿着纳米链聚集。在该照片中，由于铁蛋白的铁化合物核的原因，铁蛋白蛋白质被显示成直径约8nm的黑点。氢氧化镉纳米链则被显示成(粗度)约2nm的纤维结构。
图3是从图2所示的铁蛋白/氢氧化镉纳米链的纳米纤维性膜中除去氢氧化镉纳米链之后的、纯铁蛋白膜的TEM照片。在该照片中，纤维性结构消失，这意味着纳米链已经完全被除去。
图4是直径为7.5cm的自立性铁蛋白膜的照片的复印件。该膜的直径与过滤用的漏斗的尺寸相等。
利用SEM和EDX，进一步详细研究了氢氧化镉纳米链除去之前及除去之后的膜的形态及组成。把自立性膜移至孔径为200nm的阳极氧化铝膜之上。
图5是除去氢氧化镉纳米链之前的铁蛋白/氢氧化镉纳米链膜(厚度：40nm)的SEM截面照片(a)和SEM平面照片(b)；图6是除去氢氧化镉纳米链之后的铁蛋白膜(厚度：40nm)的SEM截面照片(a)和SEM平面照片(b)。
图5a和图6a相比较，膜的厚度没有大的区别，即，除去纳米链之后，膜的厚度没有减少。这意味着没有因为纳米链的除去而引起崩溃。但是，纳米链除去后的膜表面，和纳米链除去前相比变得更加平滑。(请比较图5b和图6b。)
图7表示由氢氧化镉纳米链除去之前(前)以及除去之后(后)的交联膜记录的EDX谱图。这些EDX谱图证明镉元素已经从膜完全除去，这并不与根据前述的TEM的研究结果相矛盾。天然铁蛋白(未交联)和在本发明得到的纯铁蛋白膜的各自的FTIR谱图如图8所示。两者的特征峰大致上相同，不过对于峰的强度而言，铁蛋白膜比天然铁蛋白强。峰的位置相同的原因是在交联反应期间膜中没有导入任何新的官能团。约1660cm-1处的峰强度的增加，是由于在交联反应期间C＝N共价键的形成(Rozkiewicx，D.I.et al，Chem.Eur.J.12，6290-6297，2006)。这些结果表示蛋白质没有变性。
另外，氢氧化镉纳米链虽然不会因除去它而对蛋白质膜带来不良影响，但是与氢氧化镉纳米链有同样的性质、并且比它更安全的氢氧化铜纳米链、氢氧化锌纳米链那样的纳米链也可以使用，来制备自立性蛋白质膜(此处未示出数据)。
实施例2各种厚度和直径的蛋白质膜的控制合成
(a)制备
变化过滤时间和/或过滤液量，并且，使用的膜/漏斗的直径为1.7cm、3.2cm或者7.5cm，除此之外与实施例1相同地操作，制备具有自立性的超薄的纯蛋白质膜。结果如表1所示。
表1
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这里，Vmixturea是指，以由铁蛋白或者脱铁铁蛋白蛋白质3.8mg/ml(其他的蛋白质为6.4mg/ml)溶液2ml和氢氧化镉纳米链液40ml制作的混合物作为供给源时混合物的过滤容量。蛋白质膜的厚度是通过截面SEM照片测定。
(b)特性评价
通过肉眼观察(或者照片)和SEM照片及TEM照片(这里未示出)对得到的膜进行评价。从这些结果可以看出，蛋白质膜的厚度和过滤操作的时间，与过滤液量呈线性关系。这些例子中，得到1.7cm、3.2cm和7.5cm三个直径的薄膜。另外，对于铁蛋白的情况而言，1.7cm直径时为最薄的厚度即40nm，3.2cm和7.5cm直径时各自为60nm的厚度。最厚的薄膜是，1.7cm直径的情况下过滤时间为1小时的薄膜，达到了4000nm。即，对于铁蛋白的情况，铁蛋白的厚度从40nm开始到4000nm为止的范围内，能够实现控制。
比较氢氧化镉纳米链除去前的厚度60nm、200nm、600nm和4000nm的膜，膜的厚度越大颜色越深。除去氢氧化镉纳米链之后，对应的膜的厚度也几乎没有变化。这表示，除去纳米链之后的膜并没有牢固地结合，而是变成了更加多孔性的膜。
对于另外一种蛋白质即脱铁铁蛋白的情况而言，得到的脱铁铁蛋白超薄蛋白质膜，即使直径为7.5cm(序号12)的时候，厚度也是均一的25nm。直径对厚度的比率达到了3,000,000倍。TEM照片(这里未示出)表示，该膜是nm尺寸的非常柔软的膜。如此极端大尺寸的柔软性，可以通过如下证据得到证明：将直径为7.5cm的脱铁铁蛋白自立性膜吸入到端部0.8mm孔径的移液管中。该蛋白质膜能够可逆地穿过比其面积(大小)小8790倍的小孔，应该是令人惊奇的事情。这是因为该蛋白质膜是柔软而且极端薄的。
用金刚石博克维茨压头，通过使用Triboindenter(Hysitron公司)的纳米压头，分别测定氢氧化镉纳米链除去之前和除去之后的厚度1500nm的铁蛋白和脱铁铁蛋白膜的各自的机械特性。它们的典型的负荷-脱负荷曲线如图9所示。各自的样品测定3次，求出其平均值。硬度(H)和杨氏模量如表2所示。
表2
铁蛋白和脱铁铁蛋白膜的机械特性
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a泊松比为0.5，用于杨氏模量的计算。
b n1表示测定点的号码，n1、n2和n3意思是3点测定。
c Avg是指3点测定值的平均值。
d(前)是指氢氧化镉纳米链除去前。
e(后)是指氢氧化镉纳米链除去后。
能够得出这样的结论：氢氧化镉纳米链除去前的膜的硬度和杨氏模量，比纳米链除去后的膜的硬度和杨氏模量大。同时，铁蛋白膜的硬度和杨氏模量比脱铁铁蛋白膜的硬度和杨氏模量大。纳米链除去前后的膜的这些差异表明，蛋白质膜的机械特性的增强是由于无机成分和蛋白质之间的相互作用而产生的。同时，铁蛋白中的铁化合物，使得铁蛋白膜成为具有比脱铁铁蛋白膜更高的硬度和杨氏模量的膜。铁蛋白膜、脱铁铁蛋白膜的硬度和杨氏模量的值，比以前报道的明胶、大豆、酪蛋白或者酪蛋白酸钠等乙二醛交联结构的天然蛋白质膜(Vaz，C.M.et al，J.Mater.Sci.：Mater.In Medicine 14，789-796，2003)的值高10倍，比戊二醛交联结构的大豆蛋白质膜(Chabba，S.et al，J.Matter.Sci.40，6263-6273，2005)高4倍。
进一步地，我们用厚度为60nm的膜封住内径为5mm且外径为7mm的塑料管的孔口，在其上连接内径为7mm且外径为10mm的别的塑料管，然后，把直接黄的乙醇溶液非常谨慎地注入到大的塑料管中，使其维持垂直。该膜能够支撑21cm的乙醇柱(由此，乙醇没有明显透过时，可以计算出能够支撑膜自身重量的约180,000倍的重量)。
从铁蛋白或者脱铁铁蛋白膜除去纳米链之后的膜，用肉眼观察厚度1550nm的膜时变得更加柔软(照片未示出)。关于该现象，不仅纳米链除去后的这些蛋白质膜在酸性或者碱性的任一条件下都非常稳定，而且对丙酮、苯、氯仿等有机溶剂也非常稳定，对于应用膜而言是期望的特性。
实施例3本发明的蛋白质膜在分离、浓缩、吸附或者解吸的应用
通过研究具有各种大小、电荷状态和pH特性的分子的透过，检验这些自立性纯蛋白质膜的分离特性。过滤操作是在90kPa的压力下进行。该分子(包含其的溶液)的容量为20ml。流速等于根据有效面积和操作时间而标准化的透过液的容量。根据对过滤前后的溶液、进而上部液记录的紫外可见吸收光谱来监控透过特性。结果汇总于表3.
表3
各种pH情况下，厚度为60nm的自立性铁蛋白薄膜的分离特性
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通过使用厚度为60nm、直径1.7cm的铁蛋白薄膜，实现了分子尺寸选择性的分子的高速分离。PC/Cu(MW：984.25)、TMPyP染料(MW：1363.6)和Cyt.c(MW：13000)那样的大分子，从它们的水性介质中完全分离。ANTS分子(MW：650.58)和[Fe(CN)6]3+离子(MW：212)完全通过了膜。DY(直接黄50)(MW：956.82)和EB(伊文思蓝)(MW：960.81)分子，在中性pH时部分通过了膜。但是，变化DY、EB水溶液的pH，即，pH高于7时，这些色素分子完全通过了蛋白质膜，pH低于3.19时，膜通过受到了阻碍。这种pH依存性是由于蛋白质膜的表面电荷性状引起的。如果是铁蛋白和脱铁铁蛋白的场合，其等电点都是相同的约4.4。因此，pH比4.4低的时候，膜为正电荷，通过静电力吸附负电荷的色素分子，膜孔(通道)变窄。像ANTS![]()
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那样，如果分子足够小，也能够通过该变窄的膜孔(通道)。但是，如果分子的大小比该变窄的膜孔(通道)大，那么就不能通过膜。当然，如果分子的大小比(没有变窄的)膜孔大，无论pH是多少，其分子也不能通过膜。pH为13.03时，PC/Cu分子和DY分子的混合液的透过实验中，DY分子完全通过了膜，与此相对，PC/Cu分子显示出几乎不能通过。但是，(过滤)水的流速在90kPa的压力下全都大于5,000Lm-2h-1。由于大分子不能通过膜，所以能够实现稀液体的浓缩。
例如，关于PC/Cu分子溶液进行考察(图10)。PC/Cu分子，通过使用氧化铝膜上的60nm厚的铁蛋白膜，在90kPa的压差下吸引，2分以内能够从10μM高效地浓缩到28.89μM。为了监控浓缩操作的效率，使用UV可见光谱。操作时间越长，上侧的液体越蓝，但是过滤液(通过液)中没有检出PC/Cu。过滤液的流速为6671.9Lm-2h-1。
由于蛋白质的可逆的电荷特性，如果pH比该等电点高或者低，蛋白质能够在不同的pH的溶液中作为对带电荷的分子或者粒子的吸收剂使用，也能够通过变化pH把这些带电荷的分子或者粒子释放于其他的溶液中。为了该研究，检验了色素分子(伊文思蓝和DY)的可逆性吸附和解吸。把厚度为300nm、直径为3.2cm的脱铁铁蛋白膜用于溶液中的伊文思蓝分子的吸附和解吸，控制该溶液的pH。pH为1.50的伊文思蓝(10μM)溶液10mL中的色素分子，一天之内，完全被该蛋白质膜捕捉。然后，这些被捕捉的分子，在pH为13.09的碱性条件下重新释放到液体中。该捕捉和释放的过程，用UV可见光谱监控。
图11a表示的是捕捉操作中的UV可见光谱的时间经过的典型例。图11b是原液及一天后的照片(复印件)，可以看出，利用膜，色素分子从溶液中完全除去。这与UV可见光谱的结果一致。释放的实验结果如图12a和图12b所示。2.5h(150min)之后，伊文思蓝分子的83.5％从膜释放到溶液中。随着时间的延长，更多的色素分子释放到溶液中。最初的释放循环的最大速度为94.5％，这与DY分子的释放速度(数据未显示)相似。但是，在该最初的捕捉和释放循环之后，释放效率在后面循环中为99.4％。捕捉和释放操作，根据脱铁铁蛋白膜的电荷特性的pH而诱发。(即)溶液的pH比脱铁铁蛋白的等电点4.4低的时候，该膜带正电，相反，溶液的pH比4.4高的时候，该蛋白质膜应该带负电。所以，在pH低于4.4的溶液中，负电荷的分子应该通过静电力被捕捉在膜中。相反(溶液的pH比4.4高)的场合，负电荷的色素分子应该通过排斥力从膜上被赶走。伊文思蓝溶液的pH为1.5时的蓝色(图11)以及pH为13.09时的紫色(图12)，各自为色素分子自身的颜色。
吸附实验的另外的一个例子如图13所示。在pH为1.39时，使10μM的8-辛酰基羟基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐(OPTAT)溶液10mL，吸附在厚度为300nm、直径为3.2cm的铁蛋白膜上。光致发光(PL)谱图表示的是，7h后，前述分子全部被捕获在铁蛋白膜上，膜的PL强度比原液的强。插入的照片(复制件)为用波长375nm激发膜所得到的。
实施例4在一层为蛋白质膜、另外一层为在其上形成的分子薄膜这样的两层所构成的自立性薄膜的制备中的，本发明的蛋白质膜的其他的应用。
(a)蛋白质(脱铁铁蛋白)膜的制备
蛋白质(脱铁铁蛋白)膜的制备方法和实施例1中所述的方法相同。
(b)两层，即，一层为蛋白质(脱铁铁蛋白)膜，另外一层为在该蛋白质(脱铁铁蛋白)膜表面上形成的分子薄膜的两层构成的自立性薄膜的制备
作为过滤器，将厚度为1.9μm的脱铁铁蛋白薄膜放置在孔径200nm的聚碳酸酯膜之上用于吸引过滤系统。对于树形物PAMAM(聚酰胺胺)分子(常规4(ジエネラル4)，分子量：14215，直径：4.5nm，表面的氨基数：64，从西格玛奥德里奇公司购入)的2重量％的甲醇溶液2ml，在90kPa的表压(压差)下，用前述吸引过滤系统过滤。通过过滤除去甲醇之后，使得PAMAM(聚酰胺胺)分子的滤饼用5重量％的戊二醛水溶液1ml交联反应1.5小时。最后，将得到的膜用甲醇和水洗涤4次。图14为1.9μm厚的脱铁铁蛋白膜表面上形成4.6μm厚的PAMAM膜的典型的SEM照片。
PAMAM膜的厚度能够通过PAMAM溶液的滤液量来控制。
进一步地，基于蛋白质膜利用相同的过滤操作和交联过程，还能够制备其他的分子膜。该方法提供构建例如分离等各种应用的功能性分子薄膜的简单的方法。