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1、(10)授权公告号 CN 102168017 B (45)授权公告日 2012.07.11 CN 102168017 B *CN102168017B* (21)申请号 201010296985.9 (22)申请日 2010.09.29 CCTCC M2010181 2010.07.16 C12N 1/14(2006.01) C12P 17/12(2006.01) (73)专利权人 湖南农业大学 地址 410128 湖南省长沙市芙蓉区东湖湖南 农业大学 (72)发明人 禹利君 史云峰 刘仲华 黄建安 胡维新 (74)专利代理机构 长沙正奇专利事务所有限责 任公司 43113 代理人 何为 CN 。
2、101195804 A,2008.06.11, 全文 . US 2007248696 A1,2007.10.25, 全文 . CN 101240304 A,2008.08.13, 全文 . CN 101265451 A,2008.09.17, 全文 . 鞠錾 等 .“4 种石杉科植物中产生石杉碱甲 的内生真菌的分离及初步鉴定和 HPLC 测定石杉 碱甲的含量” .复旦学报 （医学版） .2009, 第 36 卷 ( 第 4 期 ), Zhu D, et al.“A novel endophytic Huperzine A-producing fungus, Shiraia sp. Slf14,。
3、 isolated from Huperzia serrata.” . J Appl Microbiol. .2010, 第 109 卷 ( 第 4 期 ), 黎万奎 等 .“蛇足石杉内生真菌 2F09P03B 产石杉碱甲发酵条件的研究” .中国医药生物技 术 .2007, 第 2 卷 ( 第 4 期 ), 谢丹凤 .“福建蛇足石杉内生真菌的分离 鉴定与石杉碱甲的 HPLC 检测” .中国优秀硕士 学位论文全文数据库 （电子期刊） 医药卫生科技 辑 .2009,( 第 12 期 ), (54) 发明名称 一种产石杉碱甲的胶孢炭疽菌及用其发酵生 产石杉碱甲的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种。
4、产石杉碱甲的胶孢炭 疽菌及用其发酵生产石杉碱甲的方法， 属于 生物技术领域。该产石杉碱甲的胶孢炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides isolate) YLJ-13， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏 日期为 2010 年 7 月 16 日， 保藏编号为 ： CCTCC M2010181。本发明的菌种经压力筛选从皱边石杉 中分离纯化得到， 经分子生物学手段鉴定该菌种 为胶孢炭疽菌的一新种。该菌株在改良马铃薯液 体培养基进行发酵， 从发酵液中得到石杉碱甲。 发 酵生产获得石杉碱甲可分泌到胞外， 以改良马铃 薯液体培养基作为生物转化的前体物， 每升培养 体系可获。
5、得石杉碱甲高达 199.6mg/L。采用本发 明的菌种生产石杉碱甲， 既保护了现有珍稀药用 石杉科植物资源免遭破坏， 还缓解了石杉碱甲用 药需求短缺的格局。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员 董桂灵 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 1 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种产石杉碱甲的胶孢炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides isolate) YLJ-13， 该菌株已保藏于中国典型培养物。
6、保藏中心， 保藏日期为 2010 年 7 月 16 日， 保藏编 号为 ： CCTCC NO.M2010181， 保藏单位地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学。 2. 一种发酵生产石杉碱甲的方法， 其特征在于 ： 发酵所用培养基为改良马铃薯液体培 养基 ； 发酵所用菌株为权利要求1所述的产石杉碱甲的胶孢炭疽菌 ； 发酵培养条件为 ： 按重 量接种 0.01 0.02的菌丝体于发酵培养液中， pH 值 4.0 7.5， 温度 25 34， 时间为 60 168 小时， 转速为 100 160 转 / 分钟 ； 发酵罐培养时， 通气量 1 0.3 0.7， 罐压 0.03 0.05Mpa ； 上述改。
7、良马铃薯液体培养基是 ： 每 1000 10000mL 培养体系， 是取 200 2000g 去皮 土豆煮沸 30 60min， 过滤， 于滤液中加入葡萄糖、 蔗糖、 淀粉或蜂蜜 15 150g， 加入蒸馏 水补充体积至 1000 10000mL， 调整 pH 值至 4.0 7.5 ； 于 121灭菌 20 30min， 取出冷 却至 60 70， 加入无菌链霉素至链霉素终浓度为 0.1g/L， 混匀。 3. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述发酵培养条件为 ： 按重量接种 0.01 的菌丝体于发酵培养液中， pH 值为 5.80， 转速为 130 转 / 分钟， 温度为 30。
8、， 时间为 96 小 时， 发酵罐培养时， 通气量 1 0.4， 罐压 0.04MPa。 权 利 要 求 书 CN 102168017 B 2 1/8 页 3 一种产石杉碱甲的胶孢炭疽菌及用其发酵生产石杉碱甲的 方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种石杉碱甲高产内生菌胶孢炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides isolate)YLJ-13， 及该菌种的分离纯化及压力筛选， 同时还涉及利用该菌种高产发酵生产石杉碱甲的方法。 背景技术 0002 石杉碱甲是治疗早老性痴呆的特效药物， 世界人口老龄化加剧， 石杉碱甲的临床 用药供给已呈现严重不。
9、足局面。 目前石杉碱甲来源有四条途径 ： 从植物中提取分离， 目前 已知含石杉碱甲的石杉科植物为获取石杉碱甲的主要植物来源， 但其自我繁殖能力低下， 自然生长周期长达 10 15 年， 人工栽培皱边石杉等石杉科植物难以成活。王俊等 (2003 年 ) 测定了 6 种石杉科植物中石杉碱甲含量， 仅为 0.0481 0.0706， 亲缘关系较近的 马尾杉植物中石杉碱甲含量也只有 0.0061 0.0345。从石杉科植物的组织培养材 料中获取。 石杉科植物组织培养因其表面消毒困难， 只有极少数获得了初步成功。 Wojciech Szypula等研究报道， 以伏贴石杉进行组织培养， 其幼嫩新梢石杉碱甲。
10、为3.33mg g-1d.w.。 但 未见其大田培养成功， 难以大规模获得石杉碱甲。人工合成石杉碱甲。鉴于石杉碱甲及 其相关化合物在治疗早老性痴呆的特效功能， 意大利的科学家Kozikowski AP等(1989年) 进行了石杉碱甲类似物合成、 英国的Lucey C等(2007年)进行了石杉碱甲的全合成。 由于 石杉碱甲结构比较复杂， 合成的石杉碱甲是左旋和右旋的混合物， 且产率低。 只有极少数石 杉碱甲类似物具有明显治疗早老性痴呆活性， 化学合成很难实现石杉碱甲的有效供给。这 些类似物的合成大都依赖于天然石杉碱甲作为其最初的分子合成骨架， 这些骨架目前也多 是从稀有石杉科植物资源中直接提取获。
11、得。 因此， 人工合成石杉碱甲也不能形成有效供给。 石杉碱甲微生物合成。从微生物发酵途径生产石杉碱甲， 我国研究起步很晚。黎万奎等 (2007 年 ) 从蛇足石杉中分离出支顶孢属 (Acremonium) 内生真菌菌株 2F09P03B， 可能产生 微量与宿主植物相同的活性成分石杉碱甲。寻找石杉碱甲高产菌株， 发酵生产获得石杉碱 甲， 国内还是空白。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是 ： 针对上述现有技术的不足， 提供一种石杉碱甲高 产菌株胶孢炭疽菌， 同时还提供一种采用该菌种发酵生产高产石杉碱甲的方法， 以缓 解目前石杉碱甲临床用药供给严重不足的局面。 0004 为了解决上述技。
12、术问题， 本发明所采用的技术方案是 ： 一种石杉碱甲高产菌 株是取新鲜皱边石杉外植体， 消毒后， 以改良 MS 培养基培养， 目标菌株经分离、 纯化， 压 力筛选获得， 该皱边石杉新鲜材料取自湖南湘西自治州原始次森林小溪国家自然保护 区。该菌株经形态学鉴定及 ITS1-5.8Sr RNA-ITS4 分子生物学鉴定， 确定为胶孢炭疽 菌 (Colletotrichum gloeosporioides) 的新种， 命名为胶孢炭疽菌 (Colletotrichum 说 明 书 CN 102168017 B 3 2/8 页 4 gloeosporioides isolate)YLJ-13， 现保藏于中。
13、国典型培养物保藏中心， 保藏日期为 2010 年 7 月 16 日， 保藏编号为 ： CCTCC NO.M2010181， 保藏单位地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学。 0005 以改良PDA平板培养基进行本发明的胶孢炭疽菌YLJ-13的保存及活化， 以改良马 铃薯液体培养基发酵培养获得石杉碱甲。对液体发酵培养碳源种类及其用量、 pH 值、 培养 温度、 摇床转速、 培养时间等进行单因素试验， 在此基础上进行正交试验， 获得相对优化的 发酵条件。 在该优化的发酵条件下， 每升培养体系可获得石杉碱甲高达199.6mg/L。 比收获 自然生长的石杉科植物及运用组织培养收获新梢提取石杉碱甲更加便利，。
14、 周期短、 效率高、 生产成本低。以此菌株进行放大发酵培养， 每升培养体系可获得石杉碱甲高纯品产品 ( 纯 度 98 ) 至少可达 178.4mg， 证明该菌株具备放大生产的实际应用能力。使用该菌进行 发酵生产获得石杉碱甲， 既保护了现有珍稀石杉科植物资源， 也为促进石杉碱甲在抗老年 痴呆药物及开发记忆力保健品等方面的产业化提供了物质保障。 0006 结合图 1， 对本发明进行细化说明 ： 0007 1 胶孢炭疽菌 YLJ-13 的分离纯化 0008 1.1 皱边石杉外植体内生菌的初步培养 0009 将新鲜皱边石杉材料小心刷净表面杂物后用流动自来水冲洗 4 6h， 先用 0.01M HCl、 。
15、5 NaOCl、 2.4mM 柠檬酸依次洗涤约 1min， 再用 70乙醇消毒 1min， 然后依次用 5 NaOCl 消毒 10 15min， 7 H2O2消毒 10 15min， 最后用灭菌蒸馏水洗涤 4 5 次。取茎 段， 叶片、 不定根分别接种于改良 MS 培养基。于黑暗条件下， 24 28进行培养。取培养 2 4 周后仍保持鲜绿的菌团， 转接于改良 PDA 平板培养， 以备后续各菌株分离纯化之用。 0010 本说明书中提及的改良MS培养基的配方及制备为 ： 每1000mL培养体系中， 加入有 蔗糖 20 30g、 琼脂 5 15g、 磷酸二氢钠 0.2 2.0g、 及活性炭 1.5 。
16、5.0g， 再按照下表 1 加入 1/10MS 培养基母液， 加入蒸馏水补充体积至 1000mL， 调整 pH 值至 5.0 6.5， 最后 121灭菌 20 30min， 取出冷却至室温备用。 0011 本说明书中提及的改良 PDA 培养基的配方及制备为 ： 每 1000 10000mL 培养 体系， 是取 200 2000g 去皮土豆煮沸 30 60min， 3 层纱布过滤获滤液， 于滤液中加入 葡萄糖、 蔗糖、 淀粉或蜂蜜 15 150g， 及琼脂粉 7 70g， 再加蒸馏水补充体积至 1000 10000mL， 调整 pH 值至 4.0 7.5 ； 于 121灭菌 20 30min， 。
17、取出冷却至 60 70， 加入 无菌链霉素至链霉素终浓度为 0.1g/L， 混匀。倒 PDA 平板， 每一平板约 20mL 培养基为宜。 0012 本说明书中发酵培养本发明菌株所使用的培养基为改良马铃薯液体培养基， 则是 改良 PDA 培养基中仅不添加琼脂粉 ； 其制备为 ： 每 1000 10000mL 培养体系， 是取 200 2000g 去皮土豆煮沸 30 60min， 3 层纱布过滤获滤液， 于滤液中加入葡萄糖、 蔗糖、 淀粉或 蜂蜜15150g， 再加蒸馏水补充体积至100010000mL， 调整pH值至4.07.5 ； 于121 灭菌2030min， 取出冷却至6070， 加入无菌。
18、链霉素至链霉素终浓度为0.1g/L， 混匀。 0013 表 11/10MS 培养基母液配方 0014 说 明 书 CN 102168017 B 4 3/8 页 5 0015 1.2 新鲜材料组织破碎法内生菌的初步培养 0016 新鲜皱边石杉用自来水冲洗干净， 75乙醇漂洗 1 2min， 灭菌蒸馏水冲洗 3 5 次 ； 0.1升汞消毒 10 15min， 灭菌蒸馏水冲洗 6 8 次， 取茎段， 叶片、 不定根分别在无 菌研钵中轻轻研碎成匀浆， 加入无菌生理盐水， 低速离心， 吸取上层细胞悬浊液， 涂布于改 良 PDA 培养基上， 28恒温培养箱中培养 3 5 天， 将长菌团转接于一新的改良 P。
19、DA 平板培 养， 以备后续各菌株分离纯化之用。 说 明 书 CN 102168017 B 5 4/8 页 6 0017 1.3 皱边石杉氯仿提取物压力筛选菌株 0018 将前述1.1和1.2步骤初步培养获得的内生菌， 从菌团周边挑取少量菌丝或孢子， 在新的改良 PDA 平板上反复划线分离， 直至得到单菌落。将分离纯化获得的各菌株， 进行压 力筛选培养， 28恒温培养， 挑取生长状态良好的菌株， 保存做发酵培养及发酵产物的薄层 色谱 (TLC)、 高效液相色谱 (HPLC) 鉴定及含量检测， 获得本发明的高产石杉碱甲的胶孢炭 疽菌 YLJ-13。 0019 其中， 压力筛选培养用培养基的配方及。
20、制备如下 ： 0020 (1) 称取 50 500g 皱边石杉磨碎干样， 加入 50 500mL 分析纯氯仿， 超声浸提 10 60min， 收集浸提液 ； 于浸提液中加入等体积分析纯氯仿超声浸提 10 60min， 再重复 2 次， 合并 3 次浸提的滤液。 0021 (2) 减压浓缩回收氯仿， 用分析纯甲醇洗出浓缩物 ( 少量多次 )， 全部转入培养皿 中， 在通风橱下挥发至干， 冷冻干燥 24h。收集干燥物， 4封存待用。 0022 (3) 称取 0.1 1.0g 皱边石杉提取物， 装入试管， 加入分析纯乙醇， 振荡溶解。与 此同时， 称取 0.1 0.5g 酵母粉、 及 5 15g 琼。
21、脂溶解在 800mL 沸水中。趁热加入事先溶 解好的皱边石杉提取物， 振荡混匀， 定容至1000mL。 121灭菌20min， 取出冷却至60-70， 加入无菌链霉素， 使链霉素终浓度为 0.1g/L， 混匀， 倒制压力筛选平板， 每一平板约 20mL 培 养基为宜。 0023 2 分子生物学方法确认胶孢炭疽菌 YLJ-13 的种属 0024 2.1ITS 区 (ITS1-5.8S rRNA-ITS2) 基因序列 PCR 扩增 0025 对已分离纯化的本发明菌株 YLJ-13， 通过平板培养、 斜插法制片观察其形态学特 征， 扫描电镜观察其菌丝体、 孢子体结构。其特征可归纳为 ： 培养初期， 。
22、菌落菌丝体呈白色， 菌落不规则圆形， 菌丝体蔓延生长， 呈棉絮状， 生长速度较快。培养 5-7 天后， 菌落正面略带 灰色， 反面略带黄色。周围有白色气生菌丝， 气生菌丝较为发达， 长绒毛状。镜鉴菌丝体无 隔膜、 无菌核， 菌丝呈丝状体、 不对称分支 ； 扫描电镜下观察偶见菌丝体膨大， 内有圆形孢子 器， 但未见孢子释放。参考魏景超的 真菌鉴定手册 、 戴芳澜的 真菌的形态和分类 、 齐祖 同的 中国真菌志 ( 第五卷 ) 等， 可确定该菌为炭疽菌属的真菌。 0026 在此基础上， 选择真菌 ITS1、 ITS4 引物进行本发明菌株 YLJ-13 菌丝体 DNA 的 PCR 扩增， 获得本发明。
23、菌株 YLJ-13 核糖体内转录间区 ITS 区 (ITS1-5.8SrRNA-ITS2) 基因序列。 ITS1位于18S rRNA和5.8S rRNA之间， ITS2位于5.8SrRNA和28S rRNA之间。 在生物进化 过程中， 其进化速度快， 种内具有高度保守性， 而在不同种间又有不同程度的变异。 以ITS1、 ITS4 为上下游引物扩增该段基因序列， 对可产石杉碱甲的目标菌株进行种的快速鉴定。 0027 本发明菌株 Y L J - 1 3 的 I T S 1 、I T S 4 引物序列为 ： ITS1(5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ) ； ITS4(5 -TCCT。
24、CCGCTTATTGATATGC-3 )。PCR 扩增基本条件为 ： 总体积 25L， 内含无菌 ddH2O 17L ； 10PCR buffer( 含 Mg2+)2.5L ； dNTP(10mM)0.5L ； 引物 (10pmol/L)1.25L ； Taq E(1U/L)1.25L ； DNA 模板 (10ng/ L)2.5L。反应热循环程序设定为预变性 94， 5min ； 变性 94， 45S ； 适宜温度下退火， 时间为 45S ； 延伸 72， 60S ； 循环 30 次 ； 后延伸 72， 5min。在 PTC-100TM PCR 仪上进行扩 增反应。 0028 扩增产物回收， 。
25、测序分析。序列为 ： TGGATTGGGGCATTCTACATGATCGAGGTCAACCTTTGG 说 明 书 CN 102168017 B 6 5/8 页 7 AAAATTGGGGGTTTTACGGCAAGAGTCCCTCCGGATCCCAGTGCGAGTACGTAAAGTTACTACGCAAAGGAGGCTCC GGGAGGGTCCGCCACTACCTTTGAGGGCCTACATCAGCTGTAGGGCCCCAACACCAAGCAGAGCTTGAGGGTTGAAA TGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCG。
26、ATGATTCACTGAATT CTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTT TTGATTATTTGCTTGTACCACTCAGAAGAAACGTCGTTAAATCAGAGTTTGGTTATCCTCCGGCGGGCGCCGACCCG CCCGGGGGCGGGAGGCCGGGAGGGTCACGGAGACCCTGCCCGCCGAAGCAACAGTTAIAGGTATGTTCACAAAGGGT TGTAGAGCGTAAACTCAGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGAAG。
27、， 见 SEQ ID No.1 所示。 0029 2.2ITS1-5.8S rRNA-ITS2 基因序列分析 0030 将本发明菌株 YLJ-13 进行 ITS1-5.8S rRNA-ITS2 基因序列分析， 在 GenBank 中进 行同源序列搜索 ； Clustal X 软件对所得到的 ITS1-5.8S rRNA-ITS2 基因序列进行多重对 位排列 ； MEGA等软件包进行系统发育分析和进化树的构建 ； 用p-distance模式计算遗传距 离， 邻位相连法进行进化距离分析， 确定本发明菌株 YLJ-13 为胶孢炭疽菌一新种， 为新发 现的真菌资源。 0031 3 本发明胶孢炭疽菌 Y。
28、LJ-13 的保存 0032 将上述分离纯化得到的胶孢炭疽菌 YLJ-13 接种于改良 PDA 培养基， 25 34培 养 2 6 天， 无菌石蜡油封存。 0033 4 本发明胶孢炭疽菌 YLJ-13 的活化 0034 将上述保存的胶孢炭疽菌 YLJ-13 以改良 PDA 培养基， 25 34培养 3 5 天， 活 化培养 2 4 次， 4短期保存。 0035 5 将本发明菌株进行发酵培养， 发酵产物的结构确认分析 0036 参照 中国药典 2000 版 ( 第二部 ) 附录， 于 200-400nm 范围内进行紫外光谱扫 描， 确定目标发酵产物与石杉碱甲标准品的最大吸收波长一致。 0037 。
29、5.1 发酵产物的薄层色谱 (TLC) 快速分析 0038 对做好处理的发酵液、 菌丝体样品， 配成系列上样浓度的醇液 ( 甲醇溶解 )、 水液 ( 无菌双蒸水溶解 )。采用硅胶薄层板进行薄层分析， 展开剂参照 中国药典 石杉碱甲检 测方法的配方配制， 正丁醇冰醋酸水712， 展开完成后， 于石杉碱甲标准品最大 吸收波长处进行观察。胶孢炭疽菌 YLJ-13 浓缩液对应标准品处的展开点， 做好标记， 硅胶 薄层板于 50烘干， 刮下， 以蒸馏水溶解、 氯仿萃取， 减压蒸干， 取少量进行熔点试验、 紫外 扫描， 检测与石杉碱甲标准品是否相符， 相符的样品， 作为 HPLC-MS 分析试样。 003。
30、9 5.2 发酵产物的 HPLC-MS 分析 0040 对 “5.1TLC 快速分析” 得到的目标样品进行 HPLC-MS 分析， 精确分析主产物结构， 确定为石杉碱甲。 0041 6 本发明胶孢炭疽菌 YLJ-13 发酵条件优化 0042 6.1 胶孢炭疽菌 YLJ-13 单因素工艺参数优化筛选 0043 通过对改良马铃薯液体培养基的碳源种类及用量、 pH 值、 培养温度、 摇床转速、 培 养时间进行单因素逐步筛选， 结果发现蔗糖为相对最佳碳源， 相对优化用量为每升培养体 系添加 20g ； 发酵培养条件为 ： 按重量接种 0.01 0.02的菌丝体于发酵培养液中， pH 值 4.0 7.5。
31、， 温度 25 34， 时间为 60 168 小时， 转速为 100 160 转 / 分钟 ； 以发酵罐 培养时， 通气量 1 0.3 0.7， 罐压 0.03 0.05MPa。 说 明 书 CN 102168017 B 7 6/8 页 8 0044 6.2 胶孢炭疽菌 YLJ-13 发酵培养正交试验 0045 通过单因素工艺参数优化筛选， 对影响发酵液、 菌丝体中石杉碱甲产率的碳源用 量、 培养温度、 转速、 培养时间， 4 个因素各取 3 个水平进行进一步优选， 按 L9(34) 正交表设 计试验， 设置重复、 考察各因素的交互影响， 并进行极差分析和方差分析， 确定优选的发酵 培养条件，。
32、 为 ： 按重量接种 0.01的菌丝体于发酵培养液中， pH 值为 5.80， 转速为 130 转 / 分钟， 温度为 30， 时间为 96 小时， 以发酵罐培养时， 通气量优选为 1 0.4， 罐压优选为 0.04MPa。 附图说明 0046 图 1 是本发明的具体工艺路线流程图。 具体实施方式 0047 本发明的实施例表示如下。构建这些实施例并非用来限制本发明的范围。实施例 1， 正交法确定胶孢炭疽菌 YLJ-13 发酵生产石杉碱甲的最佳培养条件 0048 在初始培养基的基础上， 每升马铃薯液体培养体系中分别加入 10-30g 的蔗糖、 摇 床转速 100 150r/min， 24 34恒。
33、温振荡培养 3 7d， 测定发酵液中石杉碱甲积累量。 0049 表 2 正交试验表头 0050 0051 表 3 正交试验设计表及结果 说 明 书 CN 102168017 B 8 7/8 页 9 0052 0053 表 4 正交试验结果分析表 0054 0055 正交试验分析结果表明 ： 0056 (1) 该菌株发酵的最好配比为 A2B2C3D2， 即蔗糖用量 20g/L， 培养温度 30， 摇床转 速 130r/min， 发酵时间 96h。 0057 (2) 各因素对石杉碱甲生成产生影响， 从主到次依次为 D( 发酵时间 ) C( 转速 ) B( 温度 ) A( 碳量 )。 0058 实施。
34、例 2， 摇瓶发酵生产石杉碱甲 ： 0059 1. 培养基和菌种 0060 菌种 ： 本发明的胶孢炭疽菌 YLJ-13 ； 0061 斜面保存、 活化培养基 ： 改良 PDA 培养基 ； 0062 发酵培养基 ： 改良马铃薯液体培养基 ； 0063 2. 发酵培养 0064 发酵培养条件 ： 将本发明活化的菌种取菌丝体， 按重量接种 0.01的菌丝体于 5L 发酵瓶中， pH 值为自然值 (5.80)， 在以下条件下发酵 ： 0065 蔗糖用量 ： 100g 0066 摇床温度 ： 29 1 0067 转速 ： 130 转 / 分钟 0068 发酵周期 ： 96 小时 0069 发酵结果如下 。
35、： 过滤菌丝体、 获滤液， 抽真空减压浓缩得发酵浓缩液， 紫外扫描、 薄 说 明 书 CN 102168017 B 9 8/8 页 10 层色谱分析、 高效液相色谱 - 质谱分析发酵液中目标物质与石杉碱甲标准品为同一物质 ； 高效液相色谱检测石杉碱甲含量达 187.2mg/L。 0070 该实施例表明， 本发明的发酵工艺在实验室是成功的。 0071 实施例 3， 石杉碱甲的放大发酵生产 ： 0072 1. 培养基和菌种 0073 菌种 ： 本发明的胶孢炭疽菌 YLJ-13 ； 0074 斜面保存、 活化培养基 ： 改良 PDA 培养基 ； 0075 发酵培养基 ： 改良马铃薯液体培养基 ； 0。
36、076 2. 发酵培养 0077 发酵培养条件 ： 将本发明活化的菌种取菌丝， 按重量添加 0.01的菌丝体到 100L 发酵液中， 于发酵罐中， pH 值为自然值 (5.80)， 在以下条件发酵 ： 0078 蔗糖用量 ： 2000g 0079 罐温 ： 29 1 0080 风量 ： 1 0.4 0081 转速 ： 100 转 / 分钟 0082 罐压 ： 0.04Mpa 0083 发酵周期 ： 115 小时 5 小时 0084 发酵结果如下 ： 过滤菌丝体、 获滤液， 抽真空减压浓缩得发酵浓缩液， 紫外扫描、 薄 层色谱分析、 高效液相色谱 - 质谱分析发酵液中目标物质与石杉碱甲标准品为同。
37、一物质。 每升培养体系得石杉碱甲 178.4mg/L。 0085 该实施例表明， 本发明的发酵工艺已具备放大生产能力。 0086 参考文献 ： 0087 1.Wojciech Szypula， Agnieszka Pietrosiuk， Piotr Suchocki， Olga Olszowska， Miroslawa Furmanowa and Olga Kazimierska.Somatic embryogenesis and in vitro culture of Huperzia selago shoots as a potential source of huperzine A， Plant Science， 2005， 168(6) ： 1443-1452 说 明 书 CN 102168017 B 10 1/1 页 11 0001 序 列 表 CN 102168017 B 11 1/1 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 102168017 B 12 。