一种分离藏茵陈中苷类化学成分的方法.pdf

本发明公开了一种分离藏茵陈中苷类化学成分的方法，包括提取藏茵陈提取物水溶液、依据极性梯度萃取粗分和柱层析分离纯化三个工艺步骤；本发明对于考察藏茵陈的药理作用和药品的研发生产具有重要的意义。其将化学成分分离成为几个极性差异较大的成分组，对苷类化学成分大孔树脂分离，较以浸膏提取物上为后期的柱层析分离成本更低。

1.  一种分离藏茵陈中苷类化学成分的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)获取藏茵陈提取物水溶液；
2)采用三氯甲烷、四氯甲烷、二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯中的一种或一种以上对藏茵陈提取物水溶液进行萃取得到母液Ⅰ和有机相Ⅰ，采用正丁醇对母液Ⅰ进行萃取得到母液Ⅱ和有机相Ⅱ，减压回收有机相Ⅰ和有机相Ⅱ得到成分组Ⅰ和成分组Ⅱ。
3)采用温度为15～85℃乙醇或甲醇溶解成分组Ⅱ，冷却，析出淡黄色絮状沉淀，过滤絮状沉淀得到淡黄色母液，采用乙醇重结晶淡黄色絮状沉淀得到芒果苷；
4)将淡黄色母液回收乙醇至干，用水溶解残渣，将水溶液上样D₁₀₁大孔树脂，用水和浓度≥5％的乙醇或甲醇梯度洗脱分别得到各苷类化学成分；
5)浓缩每段洗脱液，得到各个苷类化学成分。

2.  根据权利要求1所述的分离藏茵陈中苷类化学成分的方法，其特征在于：所述步骤3)得到的芒果苷结构式如下所示：

步骤5得到的苷类化学成分，包括：
龙胆苦苷：结构式如下所示：

獐牙菜苦苷：结构式如下所示：

8-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖]-1，7-二羟基-3-甲氧基酮，其结构式如下所示：


3.  根据权利要求1所述的分离藏茵陈中苷类化学成分的方法，其特征在于：所述的提取藏茵陈提取物水溶液为：分别用90％乙醇、60％乙醇、30％乙醇和水的渗滤同一药材，合并上述渗漉液，回收至无乙醇残留，得到藏茵陈提取物水溶液。

一种分离藏茵陈中苷类化学成分的方法
技术领域
本发明涉及一种藏茵陈成分的提取方法，更加具体的说涉及一种分离藏茵陈中苷类化学成分的方法。
技术背景
藏茵陈是西藏、青海、四川、云南和甘肃等地藏医常用的民间草药之一，很早就用于肝胆疾病，尤以治疗急性肝炎黄疽而享誉中外。而对于藏茵陈中化学成分的研究却较为落后。
中国发明专利(专利号：92108809.4)公开了一种藏茵陈有效成分的提取工艺、设备和藏茵陈片剂的生产方法，用藏茵陈草为原料，乙醇为提取剂。连续提取工序生产特征是浸膏粉为45～90％，辅料为10～55％的藏茵陈片剂；中国发明专利(专利号：200710061832.4)公开了一种由提取、除杂、浓缩、初步分离、吸附分离、浓缩、干燥、粉碎、进一步精制等工艺制备而成的藏茵陈有效成分的提取方法，采用提取溶剂水、乙醇提取，乙醇可回收利用，不污染环境；超声辅助提取可缩短提取时间，提高提取效率，减少能源消耗；采用离心、大孔树脂吸附等处理可以保留有效成分，最大限度除去杂质，将中药作精、作细，减少服用剂量，可以方便的处理成多种剂型；中国发明专利(专利号：200710163097.8)公开了一种藏茵陈提取物，包含獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷、异荭草苷，所述五种成分的质量比为(0.04～0.71)∶(20～40)∶(1～15)∶(1.6～26)∶(0.01～0.16)；中国发明专利申请(申请号：200910078578.8)公开了一种藏茵陈提取物，其中至少含总黄酮，以该藏茵陈提取物总重为100％计，该总黄酮占该藏茵陈提取物的20～75％。但是上述藏茵陈提取方法只是涉及藏茵陈浸膏的提取。而对于藏茵陈中化学成分的提取方法却很少有报道。中国发明专利(专利号：92108809.4)公开了一种藏茵陈有效成分的提取工艺、设备和藏茵陈片剂的生产方法，用藏茵陈草为原料，乙醇为提取剂。连续提取工序生产特征是浸膏粉为45～90％，辅料为10～55％的藏茵陈片剂；中国发明专利(专利号：200710061832.4)公开了一种由提取、除杂、浓缩、初步分离、吸附分离、浓缩、干燥、粉碎、进一步精制等工艺制备而成的藏茵陈有效成分的提取方法，采用提取溶剂水、乙醇提取，乙醇可回收利用，不污染环境；超声辅助提取可缩短提取时间，提高提取效率，减少能源消耗；采用离心、大孔树脂吸附等处理可以保留有效成分，最大限度除去杂质，将中药作精、作细，减少服用剂量，可以方便的处理成多种剂型；中国发明专利(专利号：200710163097.8)公开了一种藏茵陈提取物，包含獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷、异荭草苷，所述五种成分的质量比为(0.04～0.71)∶(20～40)∶(1～15)∶(1.6～26)∶(0.01～0.16)；中国发明专利申请(申请号：200910078578.8)公开了一种藏茵陈提取物，其中至少含总黄酮，以该藏茵陈提取物总重为100％计，该总黄酮占该藏茵陈提取物的20～75％。但是上述藏茵陈提取方法只是涉及藏茵陈浸膏的提取。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种分离藏茵陈中苷类化学成分的方法，包括以下步骤：
1)获取藏茵陈提取物水溶液；
2)采用三氯甲烷、四氯甲烷、二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯中的一种或一种以上有机溶剂对藏茵陈提取物水溶液进行萃取得到母液Ⅰ和有机相Ⅰ，采用正丁醇对母液Ⅰ进行萃取得到母液Ⅱ和有机相Ⅱ，减压回收有机相Ⅰ和有机相Ⅱ得到成分组Ⅰ和成分组Ⅱ。
3)采用温度为15～85℃乙醇或甲醇溶解成分组Ⅱ，冷却，析出淡黄色絮状沉淀，过滤絮状沉淀得到淡黄色母液，采用乙醇重结晶淡黄色絮状沉淀得到芒果苷；
4)将淡黄色母液回收乙醇至干，用水溶解残渣，将水溶液上样D101大孔树脂，用水和浓度≥5％的乙醇或甲醇梯度洗脱分别得到各苷类化学成分；
5)浓缩每段洗脱液，得到各个苷类化学成分。
所述步骤3)得到的芒果苷结构式如下所示：

步骤5得到的苷类化学成分，包括：
龙胆苦苷：结构式如下所示：

獐牙菜苦苷：结构式如下所示：

8-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖]-1，7-二羟基-3-甲氧基山酮，其结构式如下所示：

所述的提取藏茵陈提取物水溶液为：分别用90％乙醇、60％乙醇、30％乙醇和水的渗滤同一药材，合并上述渗漉液，回收至无乙醇残留，得到藏茵陈提取物水溶液。
本发明的有益技术效果是：本发明分离出藏茵陈中苷类化学成分的纯品，对于考察藏茵陈的药理作用和药品的研发生产具有重要的意义。将化学成分分离成为几个极性差异较大的成分组，对苷类化学成分进行柱层析分离，较以浸膏提取物上为后期的柱层析分离上柱时间更短、成本更低。
具体实施方式
实施例1
称取20kg藏茵陈药材，烘干，粉碎，用90％乙醇浸润发胀，填装在直径20cm的渗漉桶中；浸泡6小时后，以每分钟1～2mL的速度，开始渗漉，接收3倍体积，得到90％乙醇渗漉液；在渗漉桶中添加60％乙醇，浸泡6小时后，以每分钟1～2mL的速度，开始渗漉，接收3倍体积，得到60％乙醇渗漉液；在渗漉桶中添加30％乙醇，浸泡6小时后，以每分钟1～2mL的速度，开始渗漉，接收3倍体积，得到30％乙醇渗漉液；在渗漉桶中添加水，浸泡6小时后，以每分钟1～2mL的速度，开始渗漉，接收3倍体积，得到水渗漉液。
分别将上述乙醇渗漉液和水渗漉液减压回收至无醇味，合并，得到藏茵陈提取物水溶液。
采用三氯甲烷、二氯甲烷中的一种对藏茵陈提取物水溶液进行萃取以有机相∶藏茵陈提取物水溶液＝1∶3的体积比加入有机相，萃取藏茵陈提取物水溶液，以藏茵陈提取物水溶液的粘度和水接近为考察标准，决定具体萃取次数，得到母液Ⅰ和有机相Ⅰ；在室温高于25℃时采用氯仿为有机相，在室温低于25℃时采用二氯甲烷为有机相。
采用正丁醇对母液Ⅰ进行萃取，以有机相∶母液Ⅰ＝1∶3的比例加入有机相，萃取母液Ⅰ，以獐芽菜苦苷的转移率≥95％为考察标准，但必须萃取3次以上，决定具体萃取次数；得到母液Ⅱ和有机相Ⅱ。
分别减压回收有机相Ⅱ得到成分组Ⅱ。
采用温度为15～85℃乙醇或甲醇溶解成分组Ⅱ，冷却，析出淡黄色絮状沉淀，过滤絮状沉淀得到淡黄色母液，乙醇重结晶淡黄色絮状沉淀得到芒果苷；
将淡黄色母液回收乙醇至干，用水溶解残渣，将水溶液上样D101大孔树脂柱(10*80cm)，用水和浓度≥5％的乙醇或甲醇梯度洗脱分别得到各苷类化学成分；
浓缩每段洗脱液，得到各个苷类化学成分。
实施例2
称取20kg川西獐芽菜药材，提取方法与实施例1相同。
从D101大孔树脂柱分离中取得的苷类单体化学成分为以下1-3个苷类化学成分：
1、龙胆苦苷：结构式如下所示：

mp.191.9℃～193.8℃；UVλ^MeOHnm 212.2、243.9、276.9；
¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：7.40(1H，d，J＝1Hz，3-H)，5.70(1H，m，6-H)，5.57(1H，d，J＝3Hz，1-H)，5.62(1H，m，8-H)，5.19(2H，m，9-H)；¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：96.5(C-1)，148.3(C-3)，103.3(C-4)，125.0(C-5)，116.0(C-6)，69.9(C-7)，133.9(C-8)，44.4(C-9)，117.7(C-10)，162.7(C-11)，98.8(C-1`)，72.7(C-2)，76.5(C-3`)，69.1(C-4`)，77.2(C-5`)，61.0(C-6`)。
2、獐牙菜苦苷：结构式如下所示：

UVλ^MeOHnm 247.5；IRv^KBrcm^-13390.2，1694.1，1618.4；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：7.55(1H，s，3-H)；
5.62(1H，d，1-H)；5.26(2H，t，8-H)；4.46(d，J＝8Hz，1-H)；2.84(1H，t，9-H)；1.69(2H，m，6-H)；5.26和5.41(1H，t，10-H)¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：96.39(C1)，151.85(C3)，108.06(C4)，62.42(C5)，31.99(C6)，64.03(C7)，132.78(C8)，49.82(C9)，120.28(C10)，164.32(C11)，98.20(C1’)，72.80(C2’)，76.00(C3’)，69.90(C4’)，77.35(C5’)，60.83(C6’)。
3、8-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖]-1，7-二羟基-3-甲氧基san酮，分子式为C16H14O6，其结构式如下所示：

FAB-MSm/z：[M+H]⁺553。UVλ_max^cH3OHnm：234.9，260.9，328.6。IRv^KBrcm^-1 3419.6、2976.0、2925.8、1662.5、1637.5、1606.6、1504.4、1463.9、1296.1、1276.8、1238.2、、1155.3、1130.2、1080.1、1047.3、983.6、812.0、586.3、536.1；13C-NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ：184.1(C-9)，167.1(C-3)，161.6(C-1)，157.5(C-4a)，150.2(C-8)，150.0(C-4b)，139.0(C-7)，126.3(C-6)，107.4(C-8a)，105.8(C-5)，101.7(C-8b)，97.3(C-2)，92.9(C-4)，56.2(3-OCH3)。Glu：δ：99.9(C-1″)，69.3(C-2″)，70.3(C-3″)，71.8(C-4″)，68.3(C-5″)，17.7(C-6″)。Xyl：δ：100.3(C-1′)，76.9(C-2′)，76.3(C-3′)，70.3(C-4′)，65.5(C-5′)。¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：11.84，11.75(各1H，s，1，7-OH)，7.54(1H，d，J＝9.2Hz，6-H)，6.96(1H，d，J＝9.2Hz，5-H)，6.62(1H，d，J＝2.4Hz，2-H)，6.40(1H，d，J＝2.0Hz，4-H)，3.88(3H，s，3-OMe)。Glu：：5.07(1H，d，J＝7.6Hz，1″-H)，1.07(3H，d，J＝7.6Hz，6″-H)。Xyl：5.15(1H，s，1′-H)。3.11～3.91(9H，m)；
4、芒果苷：结构式如下所示：

mp.268.5-271.8℃碳化；UVλ^MeOHnm 213.8、257.4、319.0、363.1；IRv^KRrcm^-13367.5、3215.1、3203.5、1649.0、1622.0、1595.0、1521.7、1492.8、1463.9、1296.1、1255.6、1199.6、1095.5、1076.2、1051.1、1031.8、827.4、588.2、520.7；EI-MS 425、404、385、368、350、329、330、274、273、256、245、219、203、200、185、153、123、100、95、83、69、55；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：6.35(1H，s，4-H)，6.89(1H，S，6-H)，7.44(1H，s，H-8)，4.91(1H，d，J＝10Hz，1-H)。
从成分组Ⅰ中提取得到的化学成分如下：
正二十六烷酸：C₁₆H₁₄O₆结构式如下所示：

mp.88.1-89.4℃；IRv/cm^-1：2954，1705，1473，1298，729。1H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：2.35(2H，t，J＝7.2Hz)，1.62(2H，m)，1.25(44H，brs)，0.88(3H，t，J＝6.4Hz)，13C-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：181.8(C-1)，33.4(C-2)，31.9(C-3)，29.7～29.1(C-4～C-23)，24.7(C-24)，22.7(C-25)，14.1(C-26)。