技术领域
本发明涉及医药，特别是一种具有抗乳腺癌活性的异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法 及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康和生命的常见病、多发病。现今，癌症已成为全世界 首要的致死病因。乳腺癌通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤，已经成为严重威胁中青年 妇女健康和生命的主要疾病之一，发病率较高，多见于40-60岁之间绝经期前后的妇女，全 国每年新发乳腺癌的人数约100万以上。目前治疗乳腺癌的药物虽很多，均具有较强的毒副 作用，其中以减退消化功能和抑制骨髓造血功能最为明显，往往使乳腺癌患者难以坚持完成 整个化疗过程，难以彻底治愈。同时长期用药以后，出现多药耐药现象，这也是制约乳腺癌 成功治疗的主要障碍。中草药在抗肿瘤方面的应用历史悠久，从中草药中寻找高效低毒的抗 乳腺癌活性物质，研制选择性强、毒副作用低的新型抗乳腺癌药物是药学科研工作者迫切解 决的首要问题。
小叶莲是小檗科桃儿七属植物鬼臼Sinopodophyllumemodi(Wall.)Ying.的干燥成熟 果实。鬼臼是一种具有悠久历史的药用植物，古代《神农本草经》中就有记载：杀大毒，疗 咳嗽喉疾，风邪烦感，失魄妄见。不入汤。以后的历代本草亦多有记载，主要用于活血散结、 祛风除湿、虫蛇咬伤、跌打、心胃痛、风寒咳嗽、月经不调、铁棒锤中毒、风湿筋骨痛及气 管炎等症。鬼臼分布比较广泛，我国主要分布在四川、青海、西藏、甘肃、陕西。小叶莲作 为传统藏药始载于《月王药诊》，具有悠久的药用历史。化学成分研究表明主要含有木脂素和 黄酮类化合物，其中异戊烯基化黄酮是小叶莲中代表性的活性成分，具有重要而广泛的生物 活性如抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗骨质疏松、预防老年痴呆、抗糖尿病、心脑血管保 护、雌激素样等。本发明所涉及的异戊烯基化黄酮类化合物及其生物活性，迄今为止未见有 专利或文献报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种具有抗乳腺癌活性 的异戊烯基化黄酮类化合物的制备方法及其应用，可有效解决制备具有抗乳腺癌活性的异戊 烯基化黄酮类化合物，实现制备抗乳腺癌药物的问题。
本发明解决的技术方案是，该类化合物是从小叶莲中分离得到的桃儿七酮J (SinoflavonoidJ)、桃儿七酮K(Sinoflavonoid)、桃儿七酮L(SinoflavonoidL)、桃儿七酮M (SinoflavonoidM)、桃儿七酮N(SinoflavonoidN)、桃儿七酮O(SinoflavonoidO)，分子结 构式分别为：
其制备方法是，以小叶莲6–9kg为原料，以2–5倍原料重量、体积比为75％–95％的乙醇 加热回流提取3次，提取温度为90–95℃，每次提取时间为1.5–2小时，减压回收乙醇，得浸 膏状乙醇提取物，混悬于2–3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇 萃取3次，每次2–3.2L，时间为1.5–2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次 用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100 的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用9.1–13L洗脱液，流速为10–15mLmin-1， 每350–500mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254 薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比5︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以 体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果， 分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133 –144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、 流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到Fr.1-Fr.16 个组份；
将组份Fr.4经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每5–10mL为一流份，收集27 个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比6︰1的二氯甲烷- 丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据 薄层色谱检测结果，分别合并流份5–18、流份19–27，得到2个亚组份Fr.4-1，Fr.4-2，将 亚组份Fr.4-1经开放ODS柱色谱，用体积比70︰30的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，收集洗脱 液，得桃儿七酮O(化合物VI)；
将组份Fr.5经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每5–10mL为一流份，收集36 个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5︰1的二氯甲烷- 丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据 薄层色谱检测结果，分别合并流份4–16、流份17–28、流份29–36，得到3个亚组份Fr.5-1， Fr.5-2，Fr.5-3，将亚组份Fr.5-1经高效液相色谱，用体积比80︰20的甲醇-水作洗脱液进行洗 脱，收集洗脱时间为21min的峰得到桃儿七酮J(化合物I)、收集洗脱时间为25min的峰得 到桃儿七酮K(化合物II)、收集洗脱时间为33min的峰得到桃儿七酮M(化合物IV)，收 集洗脱时间为36min的峰得到桃儿七酮N(化合物V)；
将组份Fr.6经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每5–10mL为一流份，收集38 个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷- 丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据 薄层色谱检测结果，分别合并流份6–18、流份19–32、33–38流份，得到3个亚组份Fr.6-1， Fr.6-2，Fr.6-3，亚组份Fr.6-1经过开放ODS柱色谱，体积比20:80-80:20的甲醇-水作为洗脱 液进行梯度洗脱，分别收集体积比50:50、60:40、70:30的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.6-1-1， Fr.6-1-2，Fr.6-1-3，将亚组份Fr.6-1-2经高效液相色谱，用体积比80︰20的甲醇-水作洗脱液 进行洗脱，收集洗脱时间为31min的峰得到桃儿七酮L(化合物III)。
本发明制备的具有抗乳腺癌活性的异戊烯基化黄酮类化合物桃儿七酮J(Sinoflavonoid J)、桃儿七酮K(Sinoflavonoid)、桃儿七酮L(SinoflavonoidL)、桃儿七酮M(Sinoflavonoid M)、桃儿七酮N(SinoflavonoidN)、桃儿七酮O(SinoflavonoidO)具有抗乳腺癌活性，有 效用于制备抗乳腺癌药物，具有实际的临床意义，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中，具有抗乳腺癌活性的异戊烯基化黄酮类化合物可由小叶莲9kg为 原料，以18L、体积比为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，每次提取时间为 1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、 二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次3.2L，时间为1.5小时；将乙酸乙酯萃取部位 经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、 100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用13L洗脱液，流 速为15mLmin-1，每500mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析， 用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比5︰1的二氯甲烷-甲醇作为展 开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检 测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、 流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183 –188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260， 得到Fr.1-Fr.16个组份；
将组份Fr.4经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每10mL为一流份，收集27个 流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比6︰1的二氯甲烷-丙 酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄 层色谱检测结果，分别合并流份5–18、流份19–27，得到2个亚组份Fr.4-1，Fr.4-2，将亚 组份Fr.4-1经开放ODS柱色谱，用体积比70︰30的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，收集洗脱液， 得桃儿七酮O(化合物VI)；
将组份Fr.5经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每10mL为一流份，收集36个 流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5︰1的二氯甲烷-丙 酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄 层色谱检测结果，分别合并流份4–16、流份17–28、流份29–36，得到3个亚组份Fr.5-1， Fr.5-2，Fr.5-3，将亚组份Fr.5-1经高效液相色谱，用体积比80︰20的甲醇-水作洗脱液进行洗 脱，收集洗脱时间为21min的峰得到桃儿七酮J(化合物I)、收集洗脱时间为25min的峰得 到桃儿七酮K(化合物II)、收集洗脱时间为33min的峰得到桃儿七酮M(化合物IV)，收 集洗脱时间为36min的峰得到桃儿七酮N(化合物V)；
将组份Fr.6经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每10mL为一流份，收集38个 流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙 酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄 层色谱检测结果，分别合并流份6–18、流份19–32、33–38流份，得到3个亚组份Fr.6-1， Fr.6-2，Fr.6-3，亚组份Fr.6-1经过开放ODS柱色谱，体积比20:80-80:20的甲醇-水作为洗脱 液进行梯度洗脱，分别收集体积比50:50、60:40、70:30的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.6-1-1， Fr.6-1-2，Fr.6-1-3，将亚组份Fr.6-1-2经高效液相色谱，用体积比80︰20的甲醇-水作洗脱液 进行洗脱，收集洗脱时间为31min的峰得到桃儿七酮L(化合物III)。
实施例2
本发明在具体实施中，具有抗乳腺癌活性的异戊烯基化黄酮类化合物也可由小叶莲6kg 为原料，以30L、体积比为75％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间 为2小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二 氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶 柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、 100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用9.1洗脱液，流速为 10mLmin-1，每350mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用 GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比5︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开 剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测 结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、 流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183 –188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260， 得到Fr.1-Fr.16个组份；
将组份Fr.4经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每5.5mL为一流份，收集27个 流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比6︰1的二氯甲烷-丙 酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄 层色谱检测结果，分别合并流份5–18、流份19–27，得到2个亚组份Fr.4-1，Fr.4-2，将亚 组份Fr.4-1经开放ODS柱色谱，用体积比70︰30的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，收集洗脱液， 得桃儿七酮O(化合物VI)；
将组份Fr.5经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每5.5mL为一流份，收集36个 流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5︰1的二氯甲烷-丙 酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄 层色谱检测结果，分别合并流份4–16、流份17–28、流份29–36，得到3个亚组份Fr.5-1， Fr.5-2，Fr.5-3，将亚组份Fr.5-1经高效液相色谱，用体积比80︰20的甲醇-水作洗脱液进行洗 脱，收集洗脱时间为21min的峰得到桃儿七酮J(化合物I)、收集洗脱时间为25min的峰得 到桃儿七酮K(化合物II)、收集洗脱时间为33min的峰得到桃儿七酮M(化合物IV)，收 集洗脱时间为36min的峰得到桃儿七酮N(化合物V)；
将组份Fr.6经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每5.5mL为一流份，收集38个 流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙 酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄 层色谱检测结果，分别合并流份6–18、流份19–32、33–38流份，得到3个亚组份Fr.6-1， Fr.6-2，Fr.6-3，亚组份Fr.6-1经过开放ODS柱色谱，体积比20:80-80:20的甲醇-水作为洗脱 液进行梯度洗脱，分别收集体积比50:50、60:40、70:30的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.6-1-1， Fr.6-1-2，Fr.6-1-3，将亚组份Fr.6-1-2经高效液相色谱，用体积比80︰20的甲醇-水作洗脱液 进行洗脱，收集洗脱时间为31min的峰得到桃儿七酮L(化合物III)。
实施例3
本发明在具体实施中，具有抗乳腺癌活性的异戊烯基化黄酮类化合物也可由小叶莲8kg 为原料，以24L、体积比为85％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，每次提取时间 为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、 二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2.8L，时间为1.5小时；将乙酸乙酯萃取部位 经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、 100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用11.7L洗脱液， 流速为13mLmin-1，每450mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分 析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比5︰1的二氯甲烷-甲醇作 为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色 谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116 –132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、 流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235 –260，得到Fr.1-Fr.16个组份；
将组份Fr.4经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每7mL为一流份，收集27个流 份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比6︰1的二氯甲烷-丙酮 作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层 色谱检测结果，分别合并流份5–18、流份19–27，得到2个亚组份Fr.4-1，Fr.4-2，将亚组 份Fr.4-1经开放ODS柱色谱，用体积比70︰30的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，收集洗脱液， 得桃儿七酮O(化合物VI)；
将组份Fr.5经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每7mL为一流份，收集36个流 份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5︰1的二氯甲烷-丙酮 作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层 色谱检测结果，分别合并流份4–16、流份17–28、流份29–36，得到3个亚组份Fr.5-1， Fr.5-2，Fr.5-3，将亚组份Fr.5-1经高效液相色谱，用体积比80︰20的甲醇-水作洗脱液进行洗 脱，收集洗脱时间为21min的峰得到桃儿七酮J(化合物I)、收集洗脱时间为25min的峰得 到桃儿七酮K(化合物II)、收集洗脱时间为33min的峰得到桃儿七酮M(化合物IV)，收 集洗脱时间为36min的峰得到桃儿七酮N(化合物V)；
将组份Fr.6经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每7mL为一流份，收集38个流 份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙酮 作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层 色谱检测结果，分别合并流份6–18、流份19–32、33–38流份，得到3个亚组份Fr.6-1， Fr.6-2，Fr.6-3，亚组份Fr.6-1经过开放ODS柱色谱，体积比20:80-80:20的甲醇-水作为洗脱 液进行梯度洗脱，分别收集体积比50:50、60:40、70:30的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.6-1-1， Fr.6-1-2，Fr.6-1-3，将亚组份Fr.6-1-2经高效液相色谱，用体积比80︰20的甲醇-水作洗脱液 进行洗脱，收集洗脱时间为31min的峰得到桃儿七酮L(化合物III)。
实施例4
本发明在具体实施中，具有抗乳腺癌活性的异戊烯基化黄酮类化合物还可由小叶莲7kg 为原料，以28L、体积比为75％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间 为2小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.4L的蒸馏水中，依次以石油醚、 二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2.4L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经 硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、 100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用10.4L洗脱液， 流速为12mLmin-1，每400mL为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分 析，用GF254薄层板，分别以体积比1︰1的石油醚-丙酮和体积比5︰1的二氯甲烷-甲醇作 为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色 谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116 –132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、 流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235 –260，得到Fr.1-Fr.16个组份；
将组份Fr.4经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每6.5mL为一流份，收集27个 流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比6︰1的二氯甲烷-丙 酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄 层色谱检测结果，分别合并流份5–18、流份19–27，得到2个亚组份Fr.4-1，Fr.4-2，将亚 组份Fr.4-1经开放ODS柱色谱，用体积比70︰30的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，收集洗脱液， 得桃儿七酮O(化合物VI)；
将组份Fr.5经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每6.5mL为一流份，收集36个 流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5︰1的二氯甲烷-丙 酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄 层色谱检测结果，分别合并流份4–16、流份17–28、流份29–36，得到3个亚组份Fr.5-1， Fr.5-2，Fr.5-3，将亚组份Fr.5-1经高效液相色谱，用体积比80︰20的甲醇-水作洗脱液进行洗 脱，收集洗脱时间为21min的峰得到桃儿七酮J(化合物I)、收集洗脱时间为25min的峰得 到桃儿七酮K(化合物II)、收集洗脱时间为33min的峰得到桃儿七酮M(化合物IV)，收 集洗脱时间为36min的峰得到桃儿七酮N(化合物V)；
将组份Fr.6经SephadexLH-20凝胶柱色谱，甲醇洗脱，每6.5mL为一流份，收集38个 流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙 酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄 层色谱检测结果，分别合并流份6–18、流份19–32、33–38流份，得到3个亚组份Fr.6-1， Fr.6-2，Fr.6-3，亚组份Fr.6-1经过开放ODS柱色谱，体积比20:80-80:20的甲醇-水作为洗脱 液进行梯度洗脱，分别收集体积比50:50、60:40、70:30的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.6-1-1， Fr.6-1-2，Fr.6-1-3，将亚组份Fr.6-1-2经高效液相色谱，用体积比80︰20的甲醇-水作洗脱液 进行洗脱，收集洗脱时间为31min的峰得到桃儿七酮L(化合物III)。
本发明方法稳定可靠，易操作，所得产物经鉴定为具有抗乳腺癌活性的异戊烯基化黄酮 类化合物的桃儿七酮J(SinoflavonoidJ)、桃儿七酮K(Sinoflavonoid)、桃儿七酮L (SinoflavonoidL)、桃儿七酮M(SinoflavonoidM)、桃儿七酮N(SinoflavonoidN)、桃儿七 酮O(SinoflavonoidO)，并具有抗乳腺癌的活性，有关资料如下：
一、化合物的鉴定
经核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)及高分辨质谱(HR-ESI-MS)光 谱技术鉴定，其中：
化合物I，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给 出准分子离子峰m/z471.2024[M﹢H]+(calcdforC26H31O8,471.2019)，确定分子式为C26H30O8。 IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3395cm-1)，缔合羰基(1650cm-1)，苯环(1611 cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(263，344nm)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6) 显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.29(1H,s)、6.76(1H,d,J＝8.2Hz)、6.74(1H,d,J＝8.2Hz) 分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个1,2,3,4-四取代和五取代苯环 结构单元。由2组亚甲基质子信号δ2.56(2H,m)、1.45(2H,m)，两个季碳上的甲基质子信号 δ1.00(6H,s)，提示结构中存在1个3-羟基-3-甲基丁基。由1个烯氢质子信号δ4.98(1H,t,J＝ 6.8Hz)，2个与季碳相连的甲基质子信号δ1.27(3H,s)、1.42(3H,s)，1个亚甲基质子信号δ3.30 (2H,d,J＝6.8Hz)，提示结构中存在1个异戊烯基取代。1个甲氧基质子信号δ3.53(3H,s)。 四个酚羟基质子信号δ12.58(1H,s)、10.68(1H,s)、9.79(1H,s)、8.44(1H,s)，其中δ12.58(1H, s)为与羰基缔合的5位酚羟基质子信号。13CNMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有31个碳原子， 除了1个甲氧基的碳信号δ59.8，1组3-羟基-3-甲基丁基碳信号δ17.3、42.9、68.8、28.9(×2)， 1组异戊烯基碳信号δ25.6、122.9、130.2、17.3、25.3之外，还给出12个芳香碳信号，1个 羰基碳信号δ178.3，两个与氧相连的烯碳信号δ158.7、138.5，以上碳谱数据进一步表明化合 物I为异戊烯基化黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ2.56(2H,m,H-1″)与δ 161.6(C-7)、107.2(C-8)、154.2(C-9)的远程相关，表明3-羟基-3-甲基丁基在C-8位。通过亚 甲基质子信号δ3.30(2H,d,J＝6.8Hz,H-1″′)与δ121.3(C-1′)、127.8(C-2′)、143.2(C-3′)的 HMBC相关，表明异戊烯基连接在C-2′位。通过δ3.53(3H,s)与δ138.5(C-3)的远程相关，表 明未归属的甲氧基连接在C-3位。将化合物I的1HNMR、13CNMR信号通过HSQC、HMBC 谱进行归属(见表1)。因此化合物I的结构为8-(3-hydroxy-3-methylbutyl)-2′- (3-methylbut-2-enyl)-5,7,3′,4′-tetrahydroxy-3-methoxyflavone。命名为桃儿七酮J(sinoflavonoid J)。
表1.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignmentsforI.
化合物II，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给 出准分子离子峰m/z509.1581[M﹢K]+(calcdforC26H30O8K,509.1578)，确定分子式为 C26H30O8。IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3417cm-1)，缔合羰基(1651cm-1)，苯 环(1591cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(264，342nm)。1HNMR(500MHz, DMSO-d6)显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.29(1H,s)、6.74(1H,d,J＝8.5Hz)、6.72(1H,d, J＝8.5Hz)分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个1,2,3,4-四取代和五 取代苯环结构单元。由2组亚甲基质子信号δ2.54(2H,m)、1.41(2H,m)，两个季碳上的甲基 质子信号δ0.89(6H,s)，提示结构中存在1个3-羟基-3-甲基丁基。由1个烯氢质子信号δ5.02 (1H,t,J＝7.2Hz)，2个与季碳相连的甲基质子信号δ1.53(3H,s)、1.44(3H,s)，1个亚甲基质 子信号δ3.21(2H,d,J＝7.2Hz)，提示结构中存在1个异戊烯基取代。1个甲氧基质子信号δ 3.59(3H,s)。四个酚羟基质子信号δ12.58(1H,s)、10.75(1H,s)、9.77(1H,s)、8.43(1H,s)， 其中δ12.58(1H,s)为与羰基缔合的5位酚羟基质子信号。13CNMR(125MHz,DMSO-d6)显示 含有31个碳原子，除了1个甲氧基的碳信号δ60.0，1组3-羟基-3-甲基丁基碳信号δ22.3、 43.5、68.6、28.7(×2)，1组异戊烯基碳信号δ21.2、121.9、130.8、17.4、25.4之外，还给出 12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ178.3，两个连氧烯碳信号δ158.8、138.7，以上碳谱数据 进一步表明化合物II为异戊烯基化黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ2.54(2H, m,H-1″′)与δ121.4(C-1′)、129.3(C-2′)、143.2(C-3′)的远程相关，表明3-羟基-3-甲基丁基在 C-2′位。通过亚甲基质子信号δ3.21(2H,d,J＝7.2Hz,H-1″)与δ161.4(C-7)、105.8(C-8)、154.2 (C-9)的HMBC相关，表明异戊烯基连接在C-8位。通过δ3.59(3H,s)与δ138.7(C-3)的远程 相关，表明未归属的甲氧基连接在C-3位。将化合物II的1HNMR、13CNMR信号通过HSQC、 HMBC谱进行归属(见表2)。因此化合物II的结构为8-(3-methylbut-2-enyl)-2′- (3-hydroxy-3-methylbutyl)-5,7,3′,4′-tetrahydroxy-3-methoxyflavone,命名为桃儿七酮K (sinoflavonoidK)。
表2.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignmentsforII.
化合物III，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给 出准分子离子峰m/z493.1836[M﹢Na]+(calcdforC26H30O8Na,493.1838)，确定分子式为 C26H30O8。IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3411cm-1)，缔合羰基(1650cm-1)，苯环 (1595cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(263，344nm)。1HNMR(500MHz, DMSO-d6)显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.29(1H,s)、6.88(1H,d,J＝8.2Hz)、6.74(1H,d, J＝8.2Hz)分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个1,2,3,4-四取代和五 取代苯环结构单元。由2组亚甲基质子信号δ2.68(2H,t,J＝6.6Hz)、1.73(2H,t,J＝6.6Hz)， 2个与季碳相连的甲基质子信号δ1.30(6H,s)，表明结构中存在1个2,2-二甲基-二氢吡喃环。 由2组亚甲基质子信号δ2.58(2H,m)、1.46(2H,m)，两个季碳上的甲基质子信号δ1.04(6H, s)，提示结构中存在1个3-甲基-3-羟基丁基。1个甲氧基质子信号δ3.57(3H,s)。三个酚羟 基质子信号δ12.64(1H,s)、10.68(1H,s)、9.17(1H,s)，其中δ12.64(1H,s)为与羰基缔合的5 位酚羟基质子信号。13CNMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有31个碳原子，除了1个甲氧基的 碳信号δ60.2，1组3-甲基-3-羟基丁基碳信号δ17.3、43.0、68.7、28.9(×2)、48.2，1组2,2- 二甲基-二氢吡喃环的碳信号δ20.3、31.8、73.9、26.5(×2)之外，还给出12个芳香碳信号，1 个羰基碳信号δ178.3，两个与氧相连的烯碳信号δ158.5、138.7，以上碳谱数据进一步表明化 合物2为异戊烯基化黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ2.68(2H,t,J＝6.6Hz, H-1″′)与δ120.3(C-1′)、120.9(C-2′)、141.9(C-3′)的远程相关，表明2,2-二甲基-二氢吡喃环连 接在C-2′和C-3′位。通过亚甲基质子信号δ2.58(2H,m,H-1″)与δ161.6(C-7)、107.6(C-8)、 154.0(C-9)的HMBC相关，表明3-甲基-3-羟基丁基连接在C-8位。通过δ3.57(3H,s)与δ138.7 (C-3)的远程相关，表明未归属的甲氧基连接在C-3位。将化合物III的1HNMR、13CNMR 信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见表3)。因此化合物III的结构为 8-(3-hydroxy-3-methylbutyl)-2′,3′-(2,2-dimethyldihydropyrano)-5,7,4′-trihydroxy-3-methoxyflavon e，命名为桃儿七酮L(sinoflavonoidL)。
表3.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignmentsforIII.
化合物IV，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给 出准分子离子峰m/z471.2021[M﹢H]+(calcdforC26H31O8,471.2019)，确定分子式为C26H30O8。 IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3413cm-1)，缔合羰基(1657cm-1)，苯环(1593 cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具具有黄酮醇骨架(264，337nm)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6) 显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.15(1H,s)、6.76(1H,d,J＝8.2Hz)、6.74(1H,d,J＝8.2Hz) 分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个1,2,3,4-四取代和五取代苯环 结构。由2组亚甲基质子信号δ2.65(2H,t,J＝6.4Hz)、1.77(2H,t,J＝6.4Hz)，2个与季碳相 连的甲基质子信号δ1.29(6H,s)，表明结构中存在1个2,2-二甲基-二氢吡喃环。由2组亚甲 基质子信号δ2.59(2H,m)、1.54(2H,m)，两个季碳上的甲基质子信号δ0.92(6H,s)，提示结 构中存在1个3-甲基-3-羟基丁基。1个甲氧基质子信号δ3.59(3H,s)。三个酚羟基质子信号 δ12.45(1H,s)、9.83(1H,s)、8.46(1H,s)，其中δ12.45(1H,s)为与羰基缔合的5位酚羟基质 子信号。13CNMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有31个碳原子，除了1个甲氧基的碳信号δ 60.0，1组3-甲基-3-羟基丁基碳信号δ22.6、43.3、68.5、28.8(×2)，1组2,2-二甲基-二氢吡喃 环的碳信号δ15.8、30.9、76.2、26.2(×2)之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ178.2， 两个与氧相连的烯碳信号δ158.7、139.2，以上碳谱数据进一步表明化合物IV为异戊烯基化 黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ2.59(2H,m,H-1″′)与δ120.9(C-1′)、129.2 (C-2′)、143.4(C-3′)的远程相关，表明3-甲基-3-羟基丁基连接在C-2′位。通过亚甲基质子信号 δ2.65(2H,t,J＝6.4Hz,H-1″)与δ159.8(C-7)、99.8(C-8)、153.9(C-9)的HMBC相关，表明连 接2,2-二甲基-二氢吡喃环在C-7和C-8位。通过δ3.59(3H,s)与δ139.2(C-3)的远程相关，表 明未归属的甲氧基连接在C-3位。将化合物IV的1HNMR、13CNMR信号通过HSQC、HMBC 谱进行归属(见表4)。因此化合物IV的结构为7,8-(2,2-dimethyldihydropyrano)- 2′-(3-hydroxy-3-methylbutyl)-5,3′,4′-trihydroxy-3-methoxyflavone，命名为桃儿七酮M (sinoflavonoidM)。
表4.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignmentsforIV.
position δC,type δH(J in Hz) HMBC 2 158.7,C 3 139.2,C 4 178.2,C 5 159.4,C 6 99.1,CH 6.15s 5,7,8,10 7 159.8,C 8 99.8,C 9 153.9,C 10 105.3,C 1′ 120.9,C 2′ 129.2,C 3′ 143.4,C 4′ 147.9,C 5′ 112.4,CH 6.74d(8.2) 1′,3′,4′,6′ 6′ 121.0,CH 6.76d(8.2) 2,1′,2′,4′,5′ 1″ 15.8,CH2 2.65t(6.4) 7,8,9,2″,3″ 2″ 30.9,CH2 1.77t(6.4) 8,1″,3″,4″,5″ 3″ 76.2,C 4″ 26.2,CH3 1.29s 2″,3″ 5″ 26.2,CH3 1.29s 2″,3″ 1″′ 22.6,CH2 2.59m 1′,2′,3′,2″′,3″′ 2″′ 43.3,CH2 1.54m 2′,1″′,3″′,4″′,
5″′ 3″′ 68.5,C 4″′ 28.8,CH3 0.92s 2″′,3″′ 5″′ 28.8,CH3 0.92s 2″′,3″′ OCH3 60.0,CH3 3.59s 3 5-OH 12.45s
化合物V，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给 出准分子离子峰m/z507.1993[M﹢Na]+(calcdforC27H32O8Na,507.1995)，确定分子式为 C27H32O8。IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3392cm-1)，缔合羰基(1652cm-1)，苯 环(1595cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(264，344nm)。1HNMR(500MHz, DMSO-d6)显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.29(1H,s)、6.83(1H,d,J＝8.2Hz)、6.73(1H,d, J＝8.2Hz)分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个1,2,3,4-四取代和五 取代苯环结构。由2组亚甲基质子信号δ2.55(2H,m)、1.50(2H,m)，两个季碳上的甲基质子 信号δ1.03(6H,s)，一个甲氧基质子信号δ2.94(6H,s)，提示结构中存在1个3-甲氧基-3-甲 基丁基。由2组亚甲基质子信号δ2.66(2H,t,J＝6.7Hz)、1.72(2H,t,J＝6.7Hz)，两个季碳上 的甲基质子信号δ1.30(6H,s)，表明结构中存在1个2,2-二甲基-二氢吡喃环。三个酚羟基质 子信号δ12.59(1H,s)、10.73(1H,s)、9.17(1H,s)，其中δ12.59(1H,s)为与羰基缔合的5位酚 羟基质子信号。13CNMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有26个碳原子，除了一个甲氧基碳信号 δ60.2，一组3-甲氧基-3-甲基丁基碳信号δ16.5、38.2、73.6、24.8(×2)，1组2,2-二甲基-二氢 吡喃环的碳信号δ20.3、31.8、73.9、26.4(×2)之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信 号δ178.3，两个与氧相连的烯碳信号δ158.4、138.7，以上碳谱数据进一步表明化合物V为异 戊烯基化黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚甲基质子信号δ2.55(2H,m,H-1″)与δ161.7(C-7)、 106.8(C-8)、154.1(C-9)的远程相关，表明3-甲氧基-3-甲基丁基连接在C-8位。通过亚甲基质 子信号δ2.66(2H,t,J＝6.7Hz,H-1″′)与δ120.8(C-1′)、121.3(C-2′)、141.9(C-3′)的HMBC相 关，表明2,2-二甲基-二氢吡喃环连接在C-2′和C-3′位。将化合物V的1HNMR、13CNMR信 号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见表5)。因此化合物V的结构为 8-(3-methoxy-3-methylbutyl)-2′,3′-(dimethyldihydropyrano)-5,7,4′-tetrahydroxy-3-methoxyflavone ，命名为桃儿七酮N(sinoflavonoidN)。
表5.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignmentsforV.
化合物VI，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给 出准分子离子峰m/z485.2157[M﹢H]+(calcdforC27H33O8,485.2175)，确定分子式为C27H32O8。 IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3406cm-1)，缔合羰基(1656cm-1)，苯环(1594 cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具具有黄酮醇骨架(264，337nm)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6) 显示两组芳香质子偶合系统信号δ6.16(1H,s)、6.78(1H,d,J＝8.3Hz)、6.75(1H,d,J＝8.3Hz) 分别归属于黄酮母核的A环和B环，提示结构中分别存在一个1,2,3,4-四取代和五取代苯环 结构。由2组亚甲基质子信号δ2.50(2H,m)、1.59(2H,m)，2个与季碳相连的甲基质子信号 δ0.93(3H,s)、0.93(3H,s)，1个甲氧基质子信号δ2.85(3H,s)，提示结构中存在1个3-甲氧 基-3-甲基丁基。由2组亚甲基质子信号δ2.62(2H,t,J＝6.6Hz)、1.77(2H,t,J＝6.6Hz)，两 个季碳上的甲基质子信号δ1.29(6H,s)，表明结构中存在1个2,2-二甲基-二氢吡喃环。1个 甲氧基质子信号δ3.59(3H,s)。三个酚羟基质子信号δ12.43(1H,s)、9.87(1H,s)、9.86(1H,s)， 其中δ12.43(1H,s)为与羰基缔合的5位酚羟基质子信号。13CNMR(125MHz,DMSO-d6)显示 含有26个碳原子，除了1个甲氧基的碳信号δ60.0，1组3-甲氧基-3-甲基丁基碳信号δ21.9、 39.9、73.5、24.4(×2)、48.2，1组2,2-二甲基-二氢吡喃环的碳信号δ15.8、30.8、76.2、26.1(×2) 之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ178.2，两个与氧相连的烯碳信号δ159.5、 139.3，以上碳谱数据进一步表明化合物VI为异戊烯基化黄酮醇衍生物。HMBC谱中，由亚 甲基质子信号δ2.50(2H,m,H-1″′)与δ121.0(C-1′)、128.8(C-2′)、143.4(C-3′)的远程相关，表 明3-甲氧基-3-甲基丁基连接在C-2′位。通过亚甲基质子信号δ2.62(2H,t,J＝6.6Hz,H-1″)与 δ159.7(C-7)、99.6(C-8)、153.8(C-9)的HMBC相关，表明2,2-二甲基-二氢吡喃环连接在C-7 和C-8位。通过δ3.59(3H,s)与δ139.3(C-3)的远程相关，表明未归属的甲氧基连接在C-3 位。将化合物VI的1HNMR、13CNMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见表6)。因 此化合物VI的结构为7,8-(2,2-dimethyldihydropyrano)-2′-(3-methoxy-3-methylbutyl)- 5,3′,4′-tetrahydroxy-3-methoxyflavone，命名为桃儿七酮O(sinoflavonoidO)。
表6.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignmentsforVI.
本发明方法稳定可靠，其提取分离的桃儿七酮J(SinoflavonoidJ)、桃儿七酮K (Sinoflavonoid)、桃儿七酮L(SinoflavonoidL)、桃儿七酮M(SinoflavonoidM)、桃儿七酮 N(SinoflavonoidN)、桃儿七酮O(SinoflavonoidO)经试验，对人乳腺癌细胞株MCF-7具 有细胞毒活性，有关实验资料如下：
1.实验材料
人乳腺癌细胞株MCF-7由中国医学科学院药物研究所提供，胎牛血清购自Gibco公司。
2.细胞培养
MCF-7细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链 霉素的RPMI1640培养基中，将培养瓶置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每1～2天 换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传 代。
3.MTT法
对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μL(含4000个肿瘤细胞)，置37℃、5％ CO2温箱中培养。次日，给药组加入含有不同浓度的测试化合物的稀释液，设4-5个剂量组， 每组至少设五个平行孔。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置37℃、5％CO2温箱中培养。 2天后弃培养液，每孔加50μL(1mg/mL)MTT溶液(培养基配置)。37℃孵育4小时，弃去 上清液，每孔加入DMSO200μL溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪，在检测波长490 nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞 的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过SPSS13.0软件处理得到半数抑制浓度(IC50)， 重复测试3次，取平均值为最终结果。
4.实验结果
通过MTT法采用人乳腺癌细胞株MCF-7对桃儿七酮J-O(sinoflavonoidsJ-O)进行细胞毒 活性测试，结果见表7。
表7.I化合物I-VI对HepG2细胞的细胞毒活性
化合物 IC50(μM) Sinodiflavonoid J 22.6±1.7 Sinodiflavonoid K 28.3±2.5 Sinodiflavonoid L 33.4±3.0 Sinodiflavonoid M 58.3±4.3 Sinodiflavonoid N 52.7±4.1 Sinodiflavonoid O 47.5±3.9
本发明经过多次反复实验证实，异戊烯基化黄酮类化合物由于黄酮母核及其所连异戊烯 基化基团的位置、数目、种类的不同，其细胞毒活性会存在很大的差异，由上述实验表明， 本发明制备出的桃儿七酮J(SinoflavonoidJ)、桃儿七酮K(Sinoflavonoid)、桃儿七酮L (SinoflavonoidL)、桃儿七酮M(SinoflavonoidM)、桃儿七酮N(SinoflavonoidN)、桃儿七 酮O(SinoflavonoidO)对人乳腺癌细胞MCF-7具有细胞毒活性，具有制备临床上抗乳腺癌 药物的应用价值，实现在制备抗乳腺癌药物中的应用，是治疗乳腺癌药物上的一大创新，经 济和社会效益显著。