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一类取代苯腙类化合物，及其制备方法和用途
    【技术领域】

    本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，更具体涉及多取代的单或双苯腙类化合物及其制备方法。该类化合物可用于治疗登革病毒(DV，Dengue virus)引起的疾病。

    背景技术

    登革病毒是黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属(flavivirus)登革亚组的重要成员。它是单股RNA病毒，具感染性，与碱性衣壳蛋白c构成病毒的核衣壳。自然界中存在的登革病毒可分为4个血清，分别为DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4，不同血清型间存在抗原交叉反应。可引起较轻微的登革热(DF，Dengue fever)和极其严重的登革出血骨痛热/登革休克综合征(DHF/DSS，Dengue hemorrhagic fever/Dengue shock syndrome)。其传播媒介为埃及伊蚊和白纹伊蚊，易感人群是儿童。

    据报道，登革热广泛流行于热带和亚热带的100多个国家和地区，全球每年有0.5～1亿DF和25～50万DHF患者，其中约有5000人由于DHF/DSS而死亡。我国的广东、海南、台湾等省都曾有过DF的发生或大流行，它是我国发病率最高的虫媒病毒性疾病之一，而且DHF和DSS有着很高的死亡率，故DV传播所造成的危害已成为一个严重的公共卫生问题。

    目前对登革病毒的热门研究方向包括登革病毒感染机制研究(细胞水平研究和病毒水平研究)，登革病毒感染诊断方法，登革疫苗的研究，动物模型的构建，以及抗登革药物的研究。目前，仅靠控制蚊媒的传播来预防登革热的流行，安全有效的登革疫苗仍处于实验阶段，也没有特效抗病毒药物应用于临床，主要采取对症治疗和支持疗法。现有的抗病毒药物虽然体外试验抗DV有效，但体内试验效果皆不明显。在这种情况下，亟待研发具有显著治疗作用的抗登革病毒药物。

    登革热病毒的复制是通过其11kb的RNA基因组编码一个多聚蛋白，在病毒和寄主蛋白酶的作用下，将该多聚蛋白酶分解成具有不同功能的蛋白，包括三个结构蛋白(C，prM和E)和七个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。NS3蛋白是这十种蛋白中第二大的病毒蛋白，拥有四种不同的酶活性：丝氨酸蛋白酶、RNA解旋酶、NTP蛋白酶和RNA三磷酸酶。NS3的蛋白酶活性和解旋酶活性对病毒复制过程十分重要，这使得NS3蛋白成为一个潜在的抗登革病毒靶标。进一步研究表明，NS2B蛋白作为NS3蛋白酶的辅助因子，对NS3蛋白酶发挥酶活性起至关重要的作用，只有在两者形成二聚体复合物后，才能激活NS3蛋白酶。

    近年来，“计算机辅助药物设计”(Computer-Aided Drug Design，CADD)已成为现代药物研究与开发的一个重要方法和工具。运用计算机辅助药物设计平均而言能缩短新药研究周期0.9年，节省研究与开发费用1.3亿美元。因此，CADD方法已广泛地应用于先导化合物的发现与优化。计算机辅助药物设计已经成为目前常用的一种计算机辅助药物发现方法。其原理是运用超级计算机通过分子对接的方法在多达数百万的小分子化合物库中寻找可以与某一特定疾病靶标蛋白结合的化学结构，为进一步的分子、细胞、动物和临床研究提供高效可靠的小分子先导化合物。

    综上所述，以登革病毒NS2B-NS3蛋白酶为靶标，结合CADD和各种水平的生物活性测试试验，设计并合成的小分子化合物，对开发抗登革药物具有重要的现实意义。

    本发明综合运用CADD和酶抑制活性实验，发现了一个取代双苯腙类化合物具有抑制登革病毒NS2B-NS3蛋白酶的活性。本发明进一步运用合理药物设计方法针对此化合物进行结构修饰获得了一类结构全新的取代苯腙类化合物，并测试此类化合物在体外酶水平实验测试中抑制登革病毒NS2B-NS3蛋白酶的活性，结果证明本申请化合物具有较强的登革病毒NS2B-NS3蛋白酶抑制活性。

    【发明内容】

    本发明以登革病毒NS2B-NS3蛋白酶为靶标设计了一类多取代的单或双苯腙类化合物，发明了其制备方法，并测定了该类化合物抑制登革病毒NS2B-NS3蛋白酶活性的能力。

    本发明的一个目的是提供具有抗登革病毒NS2B-NS3蛋白酶作用的新型多取代的单或双苯腙类化合物，其结构通式如式(1)所示。

    本发明的另一个目的是提供多取代的单或双苯腙类化合物的制备方法。

    本发明的再一个目的是提供作为登革病毒NS2B-NS3蛋白酶抑制剂的多取代的单或双苯腙类化合物在制备预防或治疗登革病毒导致的相关疾病方面的药物组合物中的应用。

    本发明还提供包含治疗有效量的一种或多种上述多取代的单或双苯腙类化合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。

    本发明所涉及的多取代的单或双苯腙类化合物可作为登革病毒NS2B-NS3蛋白酶的小分子抑制剂，通过抑制NS2B-NS3蛋白酶活性而抑制登革病毒的复制，从而阻断登革病毒的生命周期。因此可开发成为新的抗登革病毒药物，可用于预防或治疗登革病毒引起的各类疾病，如登革热(dengue fever，DF)，登革出血热(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome，DSS)。

    本发明提供具有如下通式(1)结构的多取代的单或双苯腙类化合物：

    

    其中：

    R₁选自H、-NO₂和C1-C4烷氧基羰基；

    R₂选自H和-OH；

    R₃选自直链或支链的饱和或不饱和C1-C10烷基、ArC(O)-、Ar-、和或者R₃与连接的N形成1，3-二氢-1，3-二氧代-2H-异吲哚基；

    R₄选自C1-C4烷基、-COOH和

    R₅选自H、直链或支链的饱和或不饱和C1-C4烷基和Ar-；

    Ar选自取代或未取代的苯基和含有1～3个选自N、O和S的杂原子的5-7元芳香杂环基，且所述5-7元芳香杂环基非必需地被苯基并合，取代基可以是1～4个独立地选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4不饱和烃氧基、羧基、酯基、C1-C6羧基烷氧基、C1-C6酯基烷氧基、C1-C6羧基烷基、C1-C6酯基烷基、氰基、硝基、氨基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、巯基、氨磺酰基、二氧五环和C1-C4酰基的基团。

    优选地，上述通式(1)中：

    R₁选自H、-NO₂和-COOC₂H₅；

    R₂选自H和-OH；

    R₃选自直链或支链的饱和或不饱和C1-C4烷基、ArC(O)-、Ar-、和或者R₃与连接的N形成1，3-二氢-1，3-二氧代-2H-异吲哚-2-基；

    R₄选自-CH₃、-COOH和

    R₅选自H、-CH₃、-C₂H₅、-CH₂-CH＝CH₂和Ar-；

    Ar选自取代或未取代的苯基、苯并咪唑基和吡啶基，取代基可以是1～4个独立地选自C1-C6直链或支链烃基、C1-C4烷氧基、硝基、二氧五环和氨磺酰基的基团。

    进一步地，本发明式(1)化合物的第一个优选实施方案是化合物I_A，

    其中：

    R₁选自-COOC2_XH₅；

    R₂选自-OH；

    R₃、R₄和R₅的定义与上述相同；

    本发明式(1)化合物的第二个优选实施方案是化合物I_B，

    其中：

    R₁选自-NO₂；

    R₂选自-OH；

    R₄选自-CH₃；

    R₃和R₅的定义与上述相同；

    本发明式(1)化合物的第三个优选实施方案是化合物I_C，

    其中：

    R₁选自H；

    R₂选自-OH；

    R₄选自-CH₃和

    R₃和R₅的定义与上述相同。

    进一步优选地，上述通式(1)化合物具体为：

    

    

    

    

    本发明还提供通式(1)结构的多取代的单或双苯腙类化合物(I_A～I_C)及其中间体II～XII的制备方法，具体合成策略分别如下。

    I_A的合成：

    

    1)将4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸投入到无水乙醇中，加入适量的酸催化剂(如浓硫酸、浓盐酸和冰醋酸)，于60-80℃搅拌10-20小时，蒸除溶剂，得到4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯(中间体II)。

    2)将中间体II与醋酸酐于120-140℃混合搅拌10-20小时，蒸除溶剂，得到4-乙酰氧基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯(中间体III)。

    3)将中间体III加入到适量的等体积的冰醋酸和醋酸酐混合液中，控温0-5℃下，滴加适量的浓硫酸，之后再分批加入过量的三氧化铬(5-10当量)，用时约2-4小时。保持反应温度继续搅拌24-48小时，将反应液倾入冰水中，加入偏重亚硫酸钠淬灭反应，室温搅拌15-30分钟。用有机溶剂(如乙醚)萃取，干燥，蒸除溶剂。向残余物加入适量乙醇和催化量浓硫酸，回流3-5小时。蒸除溶剂，残余固体经硅胶柱层析分离，按极性由小到大次序，依次得到3-甲酰基-4-羟基-5-甲基苯甲酸乙酯(中间体IV)、3，5-二甲酰基-4-羟基-苯甲酸乙酯(中间体V)和2-羟基-3-甲酰基-5-乙氧羰基-苯甲酸(中间体VI)。

    4)将三个中间体IV、V、VI分别与R₃取代的肼投入到无水乙醇中，加入催化量的冰醋酸，于60-80℃搅拌2-5小时，抽滤，乙醇洗，分别得到三个化合物I_A，即3-取代肼基甲叉基-4-羟基-5-甲基苯甲酸乙酯、3，5-双(取代肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯和2-羟基-3-取代肼基甲叉基-5-乙氧羰基-苯甲酸。

    其中，R₃和R₄的定义同上。

    I_B的合成：

    

    1)将2，6-二甲基苯酚溶于适量冰醋酸，控温0-5℃，滴入浓硝酸和冰醋酸的混合溶液(V/V＝1/3)，保持反应温度继续搅拌2-5小时，将反应液倾入冰水中，抽滤，水洗固体，干燥，得到4-硝基-2，6-二甲基苯酚(中间体VII)。

    2)将中间体VII以上述的I_A的合成中的第2)步类似的方法制备中间体VIII O-(4-硝基-2，6-二甲基苯基)乙酸酯；

    3)以上述的I_A的合成中的第3)、4)步类似的方法，制备得到化合物I_B，即2-取代肼基甲叉基-4-硝基-6-甲基-苯酚。

    其中，R₃的定义同上。

    I_C的合成：

    

    1)将2，6-二甲基苯酚以上述的I_A的合成中的第2)步类似的方法制备O-(2，6-二甲基苯基)乙酸酯(中间体X)。

    2)以上述的I_A的合成中的第3)、4)步类似的方法，制备得到化合物I_C，即2-取代肼基甲叉基-6-甲基-苯酚和2，6-双(取代肼基甲叉基)-苯酚。

    其中R₄选自-CH₃和R₃的定义如上所述。

    【附图说明】

    图1为化合物I_A-2对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。

    图2为化合物I_A-5对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。

    图3为化合物I_A-7对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。

    图4为化合物I_A-9对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。

    图5为化合物I_A-14对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。

    图6为化合物I_A-16对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。

    图7为化合物I_C-2对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图。

    【具体实施方式】

    在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量(克)为单位。

    实施例14-羟基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯(中间体II)的制备

    

    将0.50克4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸投入到20毫升无水乙醇中，加入1毫升浓硫酸，回流搅拌15小时，蒸除溶剂，得到0.54克4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯(中间体II)。为白色固体，收率92％。Mp 115-116℃；¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ1.36(t，3H)，2.26(s，6H)，4.34(q，2H)，7.72(s，2H)。

    实施例24-乙酰氧基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯(中间体III)的制备

    

    将0.16克4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯(中间体II)与5毫升醋酸酐于140℃混合搅拌18小时，蒸除溶剂，得到0.16克4-乙酰氧基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯(中间体III)。为白色固体，收率82％。¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ1.36(t，3H)，2.18(s，6H)，2.34(s，3H)，4.34(q，2H)，7.75(s，2H)。

    实施例33-甲酰基-4-羟基-5-甲基苯甲酸乙酯(中间体IV)、3，5-二甲酰基-4-羟基-苯甲酸乙酯(中间体V)和2-羟基-3-甲酰基-5-乙氧羰基-苯甲酸(中间体VI)的制备

    

    将0.35克4-乙酰氧基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯(中间体III)加入到15毫升的等体积的冰醋酸和醋酸酐混合液中，控温0℃下，滴加1毫升的浓硫酸，之后再分批加入0.69克的三氧化铬(5当量)，用时约2小时。保持反应温度继续搅拌20小时，将反应液倾入冰水中，加入10克偏重亚硫酸钠淬灭反应，室温搅拌15分钟。用乙醚萃取，干燥，蒸除溶剂。向残余物加入10毫升乙醇，3滴浓硫酸，回流4小时。蒸除溶剂，残余固体经硅胶柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1/6，按极性由小到大次序，依次得到：

    25毫克3-甲酰基-4-羟基-5-甲基苯甲酸乙酯(中间体IV)，为黄色固体，收率8％。¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ1.40(t，3H)，2.25(s，3H)，4.40(q，2H)，8.04(s，1H))，8.15(s，1H)，9.95(s，1H)。

    38毫克3，5-二甲酰基-4-羟基-苯甲酸乙酯(中间体V)，为黄色固体，收率11％。¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ1.36(t，3H)，4.40(q，2H)，8.52(s，2H)，10.30(s，2H)；MS(EI)m/z 222.1[M]⁺。

    35毫克2-羟基-3-甲酰基-5-乙氧羰基-苯甲酸(中间体VI)，为红色固体，收率10％。¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ1.40(t，3H)，4.40(q，2H)，8.68(s，1H)，8.87(s，1H)，10.42(s，1H)；MS(EI)m/z 238.1[M]⁺。

    实施例43-(2-(1H-苯并咪唑-2-基)肼基甲叉基)-4-羟基-5-甲基苯甲酸乙酯(化合物I_A-1)的制备

    

    将75毫克3-甲酰基-4-羟基-5-甲基苯甲酸乙酯(中间体IV)与69毫克1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼分别投入到5毫升无水乙醇中，加入3滴冰醋酸，于80℃搅拌2小时，抽滤，乙醇洗，得到80毫克3-(2-(1H-苯并咪唑-2-基)肼基甲叉基)-4-羟基-5-甲基苯甲酸乙酯(化合物I_A-1)，为黄色固体，收率65％。Mp 279-282℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.31(t，3H)，2.28(s，3H)，4.27(q，2H)，6.96(d，2H)，7.13(d，2H)，7.71(s，1H)，7.87(s，1H)，8.37(s，1H)；MS(EI)m/z 338.1[M]⁺。

    实施例53，5-双(2-(1H-苯并咪唑-2-基)肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-2)的制备

    

    将75毫克3，5-二甲酰基-4-羟基-苯甲酸乙酯(中间体V)与110毫克1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼分别投入到5毫升无水乙醇中，加入2滴冰醋酸，于80℃搅拌2小时，抽滤，乙醇洗，得到36毫克3，5-双(2-(1H-苯并咪唑-2-基)肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(I_A-2)，收率22％。为黄色固体，Mp＞300℃；¹HNMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.36(q，2H)，7.00(s，4H)，7.22(s，4H)，8.25(s，2H)，8.42(s，2H)；MS(ESI)m/z 505.2[M+Na]⁺。

    实施例62-羟基-3-(2-(1H-苯并咪唑-2-基)肼基甲叉基)-5-乙氧羰基苯甲酸(化合物I_A-3)的制备

    

    将74毫克2-羟基-3-甲酰基-5-乙氧羰基-苯甲酸(中间体VI)与60毫克1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼分别投入到5毫升无水乙醇中，加入2滴冰醋酸，于80℃搅拌2小时，抽滤，乙醇洗，得到8毫克2-羟基-3-(2-(1H-苯并咪唑-2-基)肼基甲叉基)-5-乙氧羰基苯甲酸(I_A-3)，收率7％。为黄色固体，Mp＞300℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.32(q，2H)，7.80(s，1H)，7.85(m，2H)，7.87(m，2H)，8.53(s，1H)，9.72(s，1H)；MS(EI)m/z 368.3[M]⁺。

    实施例73，5-双(4-硝基苯肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-4)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成4-硝基苯肼之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得化合物I_A-4，黄色固体26毫克，收率24％。Mp＞300℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.37(q，2H)，7.14(d，4H)，8.20(d，4H)，8.24(s，2H)，8.43(s，2H)；MS(EI)m/z 492.1[M]⁺。

    实施例83，5-双(2-(1H-苯并咪唑-2-基)肼基甲叉基)-苯甲酸乙酯(化合物IA-5)的制备

    

    除了将4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸替换成3，5-二甲基苯甲酸之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，制得3，5-二甲基苯甲酸乙酯；随后按照实施例3所述操作，制得3，5-二甲酰基-苯甲酸乙酯；再按照实施例5所述操作，制得化合物I_A-5，黄色固体42毫克，收率37％。Mp＞300℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.32(q，2H)，7.00(m，4H)，7.27(m，4H)，8.15(s，1H)，8.17(s，1H)，8.26(s，1H)；MS(EI)m/z 466.2[M]⁺。

    实施例93，5-双((1，3-二氢-1，3-二氧代-2H-异吲哚-2-基)肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-6)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成N-氨基邻苯二甲酰亚胺之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得标题化合物，黄色固体47毫克，收率60％。Mp 250-255℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.32(q，2H)，7.82(m，2H)，7.91(m，4H)，7.97(m，4H)，8.57(s，2H)；MS(EI)m/z 510.2[M]⁺。

    实施例103，5-双(2-烟酰基肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-7)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成烟酰基肼之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得标题化合物，黄色固体43毫克，收率49％。Mp 169-170℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.32(q，2H)，7.60(q，3H)，8.27(d，2H)，8.35(s，2H)，8.79(d，3H)，9.12(s，2H)；MS(EI)m/z 460.2[M]⁺。

    实施例113，5-双(2-异烟酰基肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-8)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成异烟酰基肼之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得标题化合物，黄色固体19毫克，收率17％。Mp 169-170℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.32(q，2H)，7.70(q，1H)，7.82(d，4H)，8.37(s，2H)，8.68(q，1H)，8.81(d，4H)；MS(EI)m/z 460.2[M]⁺。

    实施例123，5-双(4-氨磺酰基肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-9)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成4-肼基苯磺酰胺之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得标题化合物，黄色固体70毫克，收率82％。Mp 242-248℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.32(q，2H)，7.11(d，4H)，7.73(d，4H)，8.22(s，2H)，8.35(s，2H)；MS(ESI)m/z 583.1[M+Na]⁺。

    实施例133，5-双(2-(苯氨基甲酰基)肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-10)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成4-苯基氨基脲之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得标题化合物，黄色固体71毫克，收率75％。Mp＞300℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.32(q，2H)，7.03(t，2H)，7.31(t，4H)，7.58(d，4H)，8.33(s，2H)，8.38(s，2H)；MS(ESI)m/z 511.2[M+Na]⁺。

    实施例143，5-双(2-脒基肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物IA-11)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成氨基脲之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得标题化合物，黄色固体39毫克，收率54％。Mp194-198℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.32(q，2H)，7.24(s，2H)，7.72(s，2H)，8.31(s，6H)，8.42(s，2H)；MS(ESI)m/z 357.2[M+Na]⁺。

    实施例153，5-双(2-(甲氨基硫羰基)肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-12)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成4-甲基氨基硫脲之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得标题化合物，黄色固体29毫克，收率56％。Mp 254-259℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.32(q，2H)，3.02(d，6H)，8.27(s，2H)，8.41(s，2H)，8.60(s，2H)；MS(EI)m/z 396.4[M]⁺。

    实施例163，5-双(2-(乙氨基硫羰基)肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-13)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成4-乙基氨基硫脲之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得标题化合物，黄色固体35毫克，收率43％。Mp 263-265℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，3.44(q，6H)，3.60(t，4H)，4.34(q，2H)，8.27(s，2H)，8.42(s，2H)，8.64(s，2H)；MS(EI)m/z424.2[M]⁺。

    实施例173，5-双(2-(氨基硫羰基)肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-14)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成氨基硫脲之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得标题化合物，黄色固体44毫克，收率54％。Mp 174-179℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.34(q，2H)，8.47(s，2H)，8.49(s，2H)；MS(ESI)m/z 391.3[M+Na]⁺。

    实施例183，5-双(2-((2-丙烯-1-基)氨基硫羰基))肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-15)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成4-(2-丙烯-1-基)-氨基硫脲之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得标题化合物，黄色固体27毫克，收率39％。Mp 250-253℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.37(t，3H)，4.34(q，2H)，4.32(d，4H)，5.14(m，4H)，5.42(m，2H))，8.26(s，2H)，8.43(s，2H)；MS(ESI)m/z 449.2[M]⁺。

    实施例193，5-双(2-(苯并[1，3]二氧五环-5-甲酰基)肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-16)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成苯并[1，3]二氧五环-5-甲酰基肼之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得标题化合物，黄色固体50毫克，收率81％。Mp 253-258℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.36(t，3H)，4.34(q，2H)，6.15(s，4H)，7.10(d，2H)，7.50(s，2H)，7.58(d，2H)，8.33(s，2H)，8.77(s，2H)；MS(ESI)m/z 569.1[M+Na]⁺。

    实施例203，5-双(2-(4-异丙基苯基)肼基甲叉基)-4-羟基-苯甲酸乙酯(化合物I_A-17)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成4-异丙基苯肼之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5，得标题化合物，黄色固体28毫克，收率51％。Mp 262-264℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.19(d，12H)，1.36(t，3H)，2.82(m，2H)，4.34(q，2H)，6.95(d，4H)，7.16(d，4H)，8.22(s，2H)，8.36(s，2H)；MS(EI)m/z 486.3[M]⁺。

    实施例212-羟基-3-(2-(苯并[1，3]二氧五环-5-甲酰基)-5-乙氧羰基-苯甲酸(化合物I_A-18)的制备

    

    除了将1-(1H-苯并咪唑-2-基)肼替换成苯并[1，3]二氧五环-5-甲酰基肼之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例6，得标题化合物，黄色固体30毫克，收率94％。Mp 190-195℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.36(t，3H)，4.34(q，2H)，6.14(s，2H)，7.06(d，1H)，7.49(s，1H)，7.57(d，1H)，8.40(s，1H)，8.54(s，1H)，8.81(s，1H)；MS(EI)m/z 400.1[M]⁺。

    实施例224-硝基-2，6-二甲基苯酚(中间体VII)的制备

    

    将10.0克2，6-二甲基苯酚溶于100毫升冰醋酸，控温0℃下，滴入16毫升浓硝酸和冰醋酸的混合溶液(V/V＝1/3)，保持反应温度继续搅拌4小时，将反应液倾入冰水中，抽滤，水洗固体，干燥，得到3.0克4-硝基-2，6-二甲基苯酚(中间体VII)。为红色固体，收率22％。Mp 172-173℃；¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ2.32(s，6H)，7.96(s，2H)。

    实施例232-(1H-苯并咪唑-2-基)肼基甲叉基-4-硝基-6-甲基苯酚(化合物I_B-1)的制备

    

    除了将4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯(中间体II)替换成4-硝基-2，6-二甲基苯酚(中间体VII)之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，3和4，得标题化合物，黄色固体10毫克，收率18％。Mp 253-256℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ2.35(s，3H)，7.00(q，2H)，7.11(q，2H)，8.05(s，1H)，8.32(s，1H)，8.46(s，1H)；MS(EI)m/z 311.1[M]⁺。

    实施例242-(1H-苯并咪唑-2-基)肼基甲叉基-6-甲基苯酚(化合物I_C-1)的制备

    

    除了将4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯(中间体II)替换成2，6-二甲基苯酚之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，3和4，得标题化合物，黄色固体76毫克，收率40％。Mp＞300℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ1.89(s，3H)，6.81(t，1H)，6.90(d，2H)，6.95(d，2H)，7.12(d，1H)，7.23(d，1H)，8.28(s，1H)；MS(EI)m/z 266.1[M]⁺。

    实施例252，6-双(2-(1H-苯并咪唑-2-基)肼基甲叉基)苯酚(化合物I_C-2)的制备

    

    除了将4-羟基-3，5-二甲基苯甲酸乙酯(中间体II)替换成2，6-二甲基苯酚之外，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例2，3和5，得标题化合物，黄色固体70毫克，收率66％。Mp＞300℃；¹H NMR(DMSO，500MHz)δ6.96(m，4H)，7.12(t，1H)，7.20(m，4H)，7.71(d，2H)，8.40(s，2H)；MS(EI)m/z 410.2[M]⁺。

    实施例26本发明化合物对NS2B-NS3蛋白酶百分抑制活性的测定

    (1)NS2B-NS3蛋白的表达与纯化

    将含有NS2B-Gly-NS3pro181的pET19b载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，细菌培养及蛋白诱导方法除将诱导温度改为25℃外，其余均参见Liew等的文献(Protein.Expr.Purif.2005，41，332-340.)。诱导5小时后，4℃，5000rpm离心10分钟收菌。使用Novagen公司的BugBusterTM高通量蛋白抽提试剂破菌。4℃，8000g离心20分钟收集上清液，参照Liew等的文献通过Ni²⁺亲和色谱单步纯化目标蛋白。使用洗脱缓冲液(1M咪唑，50mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 7.9)将目标蛋白最后洗脱，并将目标蛋白透析至5mMTris-C1pH 8.0溶液中，蛋白纯度通过SDS-PAGE电泳检测。使用兔的内源多克隆抗体通过免疫印迹法进一步确定目标蛋白NS3pro。使用免疫检测法通过光密度扫描(Bio-Rad GS-800光密度成像仪，美国)可检测到目标蛋白。

    (2)本发明化合物对FP-2酶抑制活性的测定

    向50μL的缓冲液(缓冲液，50mM Tris-C1，0.1％Triton X-100，30％甘油，pH 9.0)体系中加入NS2B-NS3蛋白(终浓度0.01μM)和溶于DMSO的待测化合物溶液，室温下孵育10min后加入Dabcyl-KQRRGRIE-Edans的底物(最终浓度10μM)。根据不同浓度化合物存在条件下，NS2B-NS3蛋白酶酶切荧光底物的反应速度，与未加化合物抑制剂的1％DMSO的反应速度进行比较，计算得到各浓度下的抑制率。即含1％DMSO条件下的酶活性为100％，抑制百分率为100％减去不同浓度抑制剂下酶的相对活性乘以100％。酶反应动力学在Infinite M200(Tecan)荧光分光光度计中连续测60min，激发波长340nm；发射波长480nm，平均动力学速率以RFU/min表达，以下列公式计算待测化合物在100μM下百分抑制率，

    计算公式为：(对照组值一实验组值)/对照组值×100％

    (3)化合物活性测试结果

    表1多取代的单或双苯腙类化合物对NS2B-NS3抑制率数据

    

    由表1可以看出，本发明的具有结构通式(1)的多取代的单或双苯腙类化合物大部分具有较强的NS2B-NS3蛋白酶抑制活性，说明本发明的化合物为NS2B-NS3蛋白酶抑制剂。

    实施例27本发明部分化合物对NS2B-NS3蛋白酶半数有效抑制浓度(IC₅₀)的测定

    选取100μM抑制率在70％以上的化合物测IC₅₀，选择合适的化合物浓度梯度，实验方法和体系如实施例26。酶反应动力学在TECAN荧光分光光度计中被测，平均动力学速率以RFU/min表达。根据不同浓度化合物存在条件下，NS2B-NS3蛋白酶酶切荧光底物的反应速度，与未加化合物抑制剂1％DMSO的反应速度进行比较，计算得到各浓度下的抑制率。即含1％DMSO条件下的酶活性为100％，抑制百分率为100％减去不同浓度抑制剂下酶的相对活性乘以100％。根据Logistic公式用IC₅₀值在GraphPad Prism5中计算得到待测化合物对NS2B-NS3蛋白酶活性抑制的IC₅₀值。公式如下：

     A(I)/A0=1-11+(I/IC50)p]]>

    上述公式中，A₀指加1％DMSO时的酶活性，A(I)指化合物在I浓度下的酶活性，I指待测化合物的浓度，p指μ因子。

    表2多取代的单或双苯腙类化合物对NS2B-NS3酶活抑制IC₅₀值

    

    由表2可以看出，本发明的具有结构通式(1)的部分多取代的单或双苯腙类化合物具有微摩级的NS2B-NS3蛋白酶抑制活性，说明本发明的化合物为NS2B-NS3蛋白酶抑制剂。

    化合物I_A-2、I_A-5、I_A-7、I_A-9、I_A-14、I_A-16和I_C-2对NS2B-NS3酶活抑制的量效曲线图见图1～图7。由量效曲线图可以看出，这7个抑制剂对NS2B-NS3酶的抑制活性具有较好的浓度依赖性。

    产业上利用的可能性

    本发明的多取代的单或双苯腙类化合物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点，且本发明的化合物毒性很低。

    本发明的多取代的单或双苯腙类化合物在计算机虚拟筛选以及在NS2B-NS3蛋白酶抑制试验中均显示了阳性结果。应证了其药理作用机制。因此，本发明的化合物可用于制备NS2B-NS3酶抑制剂并发展为抗登革病毒药物。