1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮类化合物及其医药用 途 技术领域 本发明涉及 1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮类化合物， 其光学对映体、 消旋 体或可药用盐， 它们的制备方法， 含有它们的药物组合物， 以及这类化合物用于制备预防和 / 或治疗疼痛和由阿片类等镇痛药物引起的成瘾性和耐受性等病症的药物的用途。
背景技术
疼痛是许多疾病的常见症状， 目前的研究结果表明， N 型钙离子通道是疼痛产生和 痛觉传导过程中的一个重要环节， 由于针对 N 型钙离子通道的阻断剂直接作用于 N 型钙离 子通道， 不涉及第二信使或 G 蛋白， 因此不易产生成瘾性。高选择性的 N 型钙离子通道阻断 剂 ω- 芋螺毒素 (ω-conotoxin)MVIIA 已于 2004 年 12 月被美国 FDA 批准进入 市场销售， 其临床实践表明， N 型钙离子通道阻断剂已被证实为治疗疼痛的一个新型靶标， 具有良好的应用前景。
针对 N 型钙离子通道已发展出了多个系列的小分子化合物 (CoxB.， Current Review of Pain， 2000， 4： 488-498)， 其 中， WO99/43658 公 开 的 4- 哌 啶 基 苯 胺 类 小 分 子化合物作为可口服的选择性的 N 型钙离子通道阻断剂表现出明显的镇痛活性 ； Seko T. 等 从 化 合 物 库 的 筛 选 中 也 得 到 了 一 类 具 有 N 型 钙 离 子 通 道 阻 断 剂 活 性 的 化 合 物 (BioorganicMedicinal Chemistry， 2003， 11 ： 1901-1913)。Elisabetta T. 等人的研究也 得到了较好的结果 (Journal of Medicinal Chemistry， 2004， 47 ： 6070-6081)。但总体而 言， 目前的研究存在一定缺陷。 一方面， 这些化合物在结构上与芬太尼等阿片类镇痛药物过 于类似， 可能具有潜在的成瘾性 ； 另一方面， 这些化合物的药代动力学性质较差， 需通过外 脑室给药等在临床上非简单易行的给药途径才能产生镇痛活性， 因而， 对开发新型的 N 型 钙离子通道阻断剂仍存在需求。 发明内容
本发明的目的是寻找并开发新的预防和 / 或治疗与疼痛有关疾病的药物。本发明 人通过对 1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮类化合物进行结构改造， 现已发现具有下通 式 I 的 1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮类化合物表现出明显的镇痛活性并具有良好 的药代动力学性质。因此， 本发明的第一方面涉及通式 I 的 1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮类化 合物， 其光学对映体、 消旋体或可药用盐 ：
其中 ：
R1、 R2 和 R3 彼此独立地代表氢原子、 C1-8 烷基、 取代的 C1-8 烷基、 C3-8 链烯基、 C3-8 环 烷基、 取代的 C3-8 环烷基、 C1-8 烷氧基、 C5-20 芳基、 C5-20 芳氧基、 取代的 C5-20 芳基、 C3-20 杂芳基、 C5-20 杂芳氧基、 取代的 C3-20 杂芳基、 C3-20 杂环基、 取代的 C3-20 杂环基或 C3-20 杂环基氧基 ；
所述取代基选自卤素、 C1-8 烷基、 C1-8 烷氧基、 C3-10 环烷基、 氰基、 硝基、 巯基、 三氟 甲基、 氨基、 单 C1-8 烷基氨基、 二 C1-8 烷基氨基、 C1-8 烷基磺酰基、 羟基、 苯氧基、 C5-20 杂芳氧 基、 C5-20 芳基、 C3-20 杂环基、 C3-20 杂芳基， 这些取代基本身还可以任选地被另外的取代基单取 代或多取代， 所述另外的取代基选自叔丁基、 甲基、 三氟甲基、 氯、 氟、 溴、 甲氧基、 乙氧基、 羟 基、 二甲氨基、 二乙氨基和亚甲二氧基 ；
条件是 R1、 R2 和 R3 不同时为氢。
本发明第二方面涉及通式 I 的 1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮类化合物、 其 光学对映体、 消旋体或可药用盐的制备方法。
本发明第三个方面涉及药物组合物， 所述药物组合物包含至少一种通式 I 的 1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮类化合物、 其光学对映体、 消旋体或可药用盐以及一种或多 种可药用载体或赋形剂。
本发明第四个方面涉及通式 I 的化合物用于制备预防和 / 或治疗疼痛和由阿片类 等镇痛药物引起的成瘾性和耐受性等病症的药物的用途。
本发明第五个方面涉及采用通式 I 的化合物治疗疼痛和由阿片类等镇痛药物引 起的成瘾性和耐受性等病症的方法， 所述方法包括给予有此需要的患者预防和 / 或治疗有 效量的至少一种通式 I 的化合物、 其光学对映体、 消旋体或可药用盐。
根据本发明， 术语 “卤素” 为氟、 氯、 溴或碘。
根据本发明， 术语 “烷基” 表示饱和的直链或支链的烃链。所述烷基优选包含 1-8 个碳原子， 更优选 1-6 个碳原子， 最优选 1-4 个碳原。所述烷基的例子包括例如甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 丁基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁基、 戊基、 2- 乙基 - 丁基、 己基、 庚基、 辛基等。
根据本发明， 术语 “烷氧基” 表示 “烷基 -O-” ， 其中烷基如上所定义。
根据本发明， 术语 “链烯基” 表示包含一个或多个双键的碳链。所述链烯基优选包 含 2-8 个碳原子， 更优选 3-8 个碳原子， 更优选 3-6 个碳原子， 最优选 2-4 个碳原子。所述 链烯基的例子包括乙烯基、 1- 或 2- 丙烯基、 烯丙基、 1-， 2- 或 3- 丁烯基、 3- 甲基 - 丁 -2- 烯 基、 4- 甲基 -3- 烯 -1- 戊基等。
根据本发明， 术语 “环烷基” 表示环状烷基。所述环烷基优选包含 3-10 个碳原子， 更优选 3-8 个碳原子， 最优选 3-6 个碳原子。所述环烷基的例子包括环丙基、 环丁基、 环戊 基、 环己基、 环庚基和环辛基等。
根据本发明， 术语 “芳基” 优选包含 5-20 个碳原子， 更优选 6-18 个碳原子， 最优选 6-12 个碳原子。所述芳基的例子包括苯基、 萘基、 蒽基等。
根据本发明， 术语 “芳氧基” 表示 “芳基 -O-” ， 其中芳基如上所定义。
根据本发明， 术语 “杂环基” 优选包含 3-20 个碳原子、 更优选 4-18 个碳原子、 更优 选 5-16 个碳原子， 以及 1-3 个选自氧、 氮和硫的杂原子。所述杂环基的例子包括四氢呋喃 基、 吡咯烷基、 哌啶基、 吗啉基等、 噻唑烷基等。
根据本发明， 术语 “杂环基氧基” 表示 “杂环基 -O-” ， 其中杂环基如上所定义。
根据本发明， 术语 “杂芳基” 优选包含 3-20 个碳原子、 更优选 4-18 个碳原子、 更优 选 5-16 个碳原子， 最优选 6-12 个碳原子， 以及 1-3 个选自氧、 氮和硫的杂原子。所述杂芳 基的例子包括吡咯基、 吡啶基、 咪唑基、 呋喃基、 吡喃基、 噻吩基、 嘧啶基、 吡嗪基、 哒嗪基、 吲 哚基、 喹啉基、 吡啶并吡啶基等。
根据本发明， 术语 “杂芳氧基” 表示 “杂芳基 -O-” ， 其中杂芳基如上所定义。
根据本发明， 术语 “取代的” 表示所述基团上含有一个或多个取代基， 所述取代基 的例子包括但不局限于卤素、 C1-8 烷基、 C1-8 烷氧基、 C3-10 环烷基、 氰基、 硝基、 巯基、 三氟甲 基、 氨基、 单 C1-8 烷基氨基、 二 C1-8 烷基氨基、 C1-8 烷基磺酰基、 羟基、 苯氧基、 C5-20 杂芳氧基、 C5-20 芳基、 C3-20 杂环基和 C3-20 杂芳基。这些取代基本身还可以任选地被一个或多个另外的 取代基取代， 所述另外的取代基选自叔丁基、 甲基、 三氟甲基、 氯、 氟、 溴、 甲氧基、 乙氧基、 羟 基、 二甲氨基、 二乙氨基和亚甲二氧基。
在本发明的一个实施方案中， 本发明涉及通式 I 的化合物、 其光学对映体、 消旋 体、 其可药用盐 ：
其中 ：
R1、 R2 和 R3 彼此独立地代表氢原子、 C1-8 烷基、 取代的 C1-8 烷基、 C3-8 链烯基、 C3-8 环 烷基、 取代的 C3-8 环烷基、 C1-8 烷氧基、 C5-20 芳基、 C5-20 芳氧基、 取代的 C5-20 芳基、 C3-20 杂芳基、 C5-20 杂芳氧基、 取代的 C3-20 杂芳基、 C3-20 杂环基、 取代的 C3-20 杂环基或 C3-20 杂环基氧基 ；
所述取代基选自卤素、 C1-8 烷基、 C1-8 烷氧基、 C3-10 环烷基、 氰基、 硝基、 巯基、 三氟甲 基、 氨基、 单 C1-8 烷基氨基、 二 C1-8 烷基氨基、 C1-8 烷基磺酰基、 羟基、 苯氧基、 C5-20 杂芳氧基、 C5-20 芳基、 C3-20 杂环基和 C3-20 杂芳基， 这些取代基本身还可以任选地被另外的取代基单取 代或多取代， 所述另外的取代基选自叔丁基、 甲基、 三氟甲基、 氯、 氟、 溴、 甲氧基、 乙氧基、 羟 基、 二甲氨基、 二乙氨基和亚甲二氧基 ；
条件是 R1、 R2 和 R3 不同时为氢。
根据本发明的一个优选实施方式， 通式 I 的化合物为以下化合物、 其光学对映体、
消旋体或可药用盐 ：
其中 ：
R1 为氢、 苯基、 4- 二甲氨基苯基、 2- 甲氧基 -4- 二甲氨基苯基、 4- 二乙氨基苯基、 5- 甲基呋喃 -2- 基、 5- 溴呋喃 -2- 基、 3， 5- 二甲基 -4- 羟基 - 苯基、 3， 5- 二叔丁基 -4- 羟 基 - 苯基、 4- 甲氧基苯基、 4- 异丙氧基苯基、 4- 丁氧基苯基、 4- 己氧基苯基、 4- 氰基苯基、 4- 苄氧基苯基、 3- 苄氧基苯基、 2- 苄氧基苯基、 3， 4- 亚甲二氧基 - 苯基、 4， 5- 亚甲二氧 基 -2- 氯 - 苯基、 4， 5- 亚甲二氧基 -2- 溴 - 苯基、 4- 氟苯基、 4- 硝基苯基、 4- 乙基苯基、 4- 叔 丁基苯基、 2- 氟 -4- 甲氧基苯基、 3， 5- 二 ( 三氟甲基 )- 苯基、 4-(1- 哌啶基 )-3- 硝基 - 苯 基、 4-(1- 吡咯基 )-3- 硝基 - 苯基、 3， 4- 二甲氧基 - 苯基、 3， 5- 二甲基 -4- 苄氧基 - 苯基、 叔丁氧基或 3- 溴 -4- 氟 - 苯基 ；
R2 为氢、 3- 甲基丁基、 3- 甲基 -2- 烯 -1- 丁基、 2- 甲氧基乙基、 2- 乙基丁基、 己基、 辛基、 2- 二甲氨基乙基、 3- 二甲氨基丙基、 环丙甲基、 2- 环丙基乙基、 2- 吡咯乙基、 2-(N- 乙 基吡咯 -2- 基 )- 乙基、 环戊基、 环己基或 3， 4- 二甲氧基苯乙基 ；
R3 为氢、 苯基、 芴基、 4- 二甲氨基苯基、 2- 甲氧基 -4- 二甲氨基苯基、 4- 二乙氨基苯 基、 5- 甲基呋喃 -2- 基、 5- 甲基 - 噻吩 -2- 基、 5- 溴呋喃 -2- 基、 3， 5- 二甲基 -4- 羟基 - 苯 基、 3， 5- 二溴 -4- 羟基 - 苯基、 3， 5- 二甲氧基 -4- 羟基 - 苯基、 3， 5- 二叔丁基 -4- 羟基 - 苯 基、 4- 甲氧基苯基、 4- 异丙氧基苯基、 4- 丁氧基苯基、 4- 己氧基苯基、 4- 氰基苯基、 4- 苄 氧基苯基、 3- 苄氧基苯基、 2- 苄氧基苯基、 3， 4- 亚甲二氧基 - 苯基、 2- 氯 -4， 5- 亚甲二氧 基 - 苯基、 4， 5- 亚甲二氧基 -2- 溴 - 苯基、 4- 氟苯基、 4- 硝基苯基、 4- 乙基苯基、 4- 叔丁基 苯基、 2- 氟 -4- 甲氧基苯基、 3， 5- 二 ( 三氟甲基 )- 苯基、 4-(1- 哌啶基 )-3- 硝基 - 苯基、 4-(1- 吡咯基 )-3- 硝基 - 苯基、 3， 4- 二甲氧基 - 苯基、 3， 5- 二甲基 -4- 苄氧基 - 苯基、 叔丁 氧基、 3- 溴 -4- 氟 - 苯基、 3- 氯 -4- 氟 - 苯基、 2- 氟 -4- 三氟甲基 - 苯基、 3， 4- 二甲氧基苯 基、 2， 3- 二甲氧基苯基、 2- 羟基 -4， 5- 二氯 - 苯基、 2- 甲氧基 -4- 溴 - 苯基、 2- 氟 -4- 甲氧 基 - 苯基、 3- 溴 -5- 甲氧基 - 苯基、 2- 氯 -5- 硝基 - 苯基、 4-(4- 氟 - 苄氧基 )- 苯基、 5- 苯 基 - 呋喃 -2- 基、 3- 甲氧基 -4- 羟基 - 苯基、 3， 4， 5- 三甲氧基 - 苯基、 2- 羟基 -4- 溴 - 苯 基、 4-[(2- 氰基乙基 ) 甲胺基 ]- 苯基或 2-(4- 氯苯基巯基 )- 苯基 ；
根据本发明， 通式 I 的化合物优选为下列化合物、 其光学对映体、 消旋体或可药用 盐：
(±)8-(3- 甲氧基 - 苯甲酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-(3- 甲基 - 丁酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 )，
(±)(1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 -8- 基 )- 酮 - 乙酸甲酯，
(±)8-(4- 甲氧基 - 苯甲酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8- 环戊甲酰基 -1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-(3， 3- 二甲基 - 丁酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)(1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 -8- 基 )- 酮 - 乙酸乙酯，
(±)8-(4- 氯 - 苯甲酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-(3- 苯 基 - 丙 酰 基 )-1-(4- 氟 - 苯 基 -)-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)8-(3- 甲 基 - 丁 酰 基 )-1-(4- 氟 - 苯 基 -)-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)[1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 -8- 基 ]- 酮 - 乙 酸甲酯，
(±)8-[2-(4- 甲氧基 - 苯基 - 乙酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-(4- 氯 - 苯 甲 酰 基 )-1-(4- 氟 - 苯 基 )-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮， (±)8-(2- 氟 - 苯 甲 酰 基 )-1-(4- 氟 - 苯 基 )-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)8-(3- 甲氧基 - 苯甲酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)8-(4- 甲氧基 - 苯甲酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)8- 二苯基乙酰基 -1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8- 环戊甲酰基 -1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)[1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 -8- 基 ]- 酮 - 乙 酸乙酯，
(±)8-(3， 3- 二甲基 - 丁酰基 )-1-(3， 5- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-(3- 甲基 -2- 苯基 - 丁酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-(2- 甲基 - 丁酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)(2- 氯基 -4- 硝基 - 苯甲酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 -)-8-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-(4- 氟 - 苯 甲 酰 基 )-1-(4- 氟 - 苯 基 -)-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)[1-(3 ， 5- 二 甲 基 - 苯 基 -)-1 ， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 -8- 基 ]- 酮 - 乙酸乙酯，
(±)[1-(3 ， 5- 二 甲 基 - 苯 基 -)-1 ， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 -8- 基 ]- 酮 - 乙酸甲酯，
(±)8-(2- 乙 基 - 丁 酰 基 )-1-(4- 氟 - 苯 基 )-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)8-(4- 氟基 - 苯甲酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-4- 酮 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -8- 甲酸苄 酯，
(±)8-(2- 乙基 - 丁酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)8-[2-(3- 甲氧基 - 苯乙酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8- 二 苯 乙 酰 基 -1-(3， 3- 二 甲 基 - 苯 基 )-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)8-(4- 氟 - 苯甲酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)8-(3， 4- 二甲氧基 - 苯甲酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮， (±)8- 环 戊 甲 酰 基 -1-(3， 3- 二 甲 基 - 苯 基 )-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)8-(2- 氯 -4- 硝基 - 苯甲酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-(4- 氟 - 苯甲酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-(2- 乙基 - 丁酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-(4- 甲氧基 - 苯甲酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-( 二苯基乙酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-(3- 甲氧基 - 苯甲酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 -8- 甲酸苄酯，
(±)8-[2-(3- 甲氧 - 苯基 )- 乙酰基 ]-1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)1-(3， 5- 二 氟 - 苯 基 )-4-[1-(4 氟 - 苯 基 )-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 -8- 基 ]-1， 4- 丁二酮，
(±)8-(4- 氯 - 苯甲酰基 )-1-(3， 5- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮，
(±)-8- 苯甲酰基 -1-(3， 5- 二甲基 - 苯基 )1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮，
(±)8-(2- 氟 - 苯甲酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 )， 或
(±)8-[2-(3- 甲氧基 - 苯基 )- 乙酰基 ]-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮。
可以采用如下反应方案中所示的合成路线合成本发明的通式 I 的化合物， 另外， 也可参见本发明实施例中的详细描述。根据需要， 还可以使本发明的通式 I 的化合物与酸
反应转化为其可药用盐。
反应方案
对于螺环母核的合成， 第一步反应采用冰醋酸做溶剂， 使苄基哌啶酮、 芳胺及氰化 钾反应， 室温搅拌 6 小时至 72 小时， 因芳胺取代基的位阻差异而定。 反应完毕后直接倒入冰 / 氨水混合物中， 即可析出固体， 抽滤后用乙醚洗涤可除去全部杂质。第二步反应是用 90％ 的硫酸催化水解氰基生成酰胺， 反应温度为 50-150℃， 反应时间为 10 分钟至 2 小时， 反应完 毕后倒入冰水中， 机械快速搅拌， 用氨水碱化至 pH 为 10 即可析出固体。第三步反应用甲酰 胺做溶剂同时作为反应原料， 关环形成螺环。 该步反应在常规加热 150-180℃条件下搅拌反 应 12 小时， 也可采用微波催化。反应完毕， 冷却溶液可析出目标产物。第四步反应是氢化 脱苄， 该步反应使用钯碳催化， 常压氢化反应， 温度为 25-80℃， 抽滤除去钯碳， 旋干后即可 得到各种 R1 取代的母核结构。然后再与适当的反应试剂如酰氯或卤代烃在碱如有机碱或碳酸钾存在下在适当的溶剂如丙酮中反应即可得到带有各种取代基 R2、 R3 的通式 I 的化合 物。
根据需要， 通式 I 的化合物还可以与适宜的酸反应转化为其可药用盐。
根据本发明， 通式 I 的化合物的可药用盐包括其无机酸盐或有机酸盐， 其中包括 但不限于 ： 盐酸盐、 氢溴酸盐、 氢碘酸盐、 硝酸盐、 硫酸盐、 硫酸氢盐、 磷酸盐、 磷酸氢盐、 乙酸 盐、 羟乙酸盐、 丙酸盐、 丁酸盐、 草酸盐、 三氟乙酸盐、 己二酸盐、 藻酸盐、 乳酸盐、 柠檬酸盐、 酒石酸盐、 琥珀酸盐、 马来酸盐、 富马酸盐、 苦味酸盐、 天冬氨酸盐、 葡糖酸盐、 苯甲酸盐、 甲 磺酸盐、 乙磺酸盐、 苯磺酸盐、 对甲苯磺酸盐、 双羟萘酸盐、 丙酮酸盐、 乙醇酸盐、 丙二酸盐、 三氟乙酸盐、 苹果酸盐、 水杨酸盐、 对氨基水杨酸盐、 扑酸盐和抗坏血酸盐等 ； 优选通式 I 的 化合物的盐酸盐。
本发明通式 I 的化合物或其可药用盐还可以形成溶剂化物， 例如水合物、 醇合物 等。上述化合物还可以是前药或可在体内代谢变化后释放出所述活性成分的形式。选择和 制备适当的前药衍生物是本领域技术人员公知技术。
根据本发明， 通式 I 的化合物如以立体异构体形式存在， 其中的不对称中心可为 R- 构型或 S- 构型。 本发明包括所有可能的立体异构体如对映异构体或非对映异构体， 以及 两种或多种立体异构体的混合物， 例如对映异构体和 / 或非对映异构体的任何所需比例的 混合物。如果存在顺 / 反异构体， 本发明涉及其顺式形式或反式形式或二者的混合物。如果需要， 单一立体异构体的制备可根据常规方法拆分混合物， 或通过立体选择性合成制备。 如果存在机动的氢原子， 本发明也涉及其互变异构形式。
实验结果表明， 本发明化合物在小鼠醋酸扭体模型和热板模型中， 在灌胃给药条 件下即能够表现出明显的镇痛活性， 表明其药代动力学性质和镇痛活性较好， 可以通过口 服给药途径用来预防和 / 或治疗手术后疼痛、 偏头痛、 内脏痛、 神经性疼痛等各种疼痛病 症； 另一方面， 本发明化合物不仅具有与 4- 哌啶基苯胺类化合物如芬太尼不同的结构特 征， 镇痛实验的研究结果还表明， 这类化合物的镇痛作用与阿片受体的作用没有相关性， 因 此其在产生镇痛作用的同时不会导致成瘾性的发生。进一步的实验结果还提示， 该类化合 物可以增强吗啡的镇痛作用， 并且还具有治疗和 / 或预防由阿片类镇痛药物引起的成瘾性 和耐受性等病症的用途。因此， 本发明化合物可以用于预防和 / 或治疗手术后疼痛、 偏头 痛、 内脏痛、 神经性疼痛等各种疼痛以及由阿片类等镇痛药物引起的成瘾性和耐受性等病 症。
本发明的活性化合物可以本身形式给药， 或者以药物组合物形式给药， 其中活性 化合物是与一种或多种药学上可接受的载体、 赋形剂或稀释剂混合的。本发明的药物组合 物通常是按常规方式配制的， 使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂， 它们有利 于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径， 可以按照本领域熟知的常识进行制备。
可用于本发明药物组合物的药用载体或赋形剂包括但不限于 ： 离子交换剂， 氧化 铝， 硬脂酸铝， 卵磷脂， 血清蛋白如人血清蛋白， 缓冲物质如磷酸盐， 甘油， 山梨酸， 山梨酸 钾， 饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物， 水， 盐或电解质， 如硫酸鱼精蛋白， 磷酸氢二钠， 磷酸氢钾， 氯化钠， 锌盐， 胶态二氧化硅， 三硅酸镁， 聚乙烯吡咯烷酮， 纤维素物质， 聚乙二 醇， 羧甲基纤维素钠， 聚丙烯酸酯， 蜂蜡， 聚乙烯 - 聚氧丙烯嵌段聚合物和羊毛脂。
本发明的通式 I 的化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为肠道或非肠道， 如口服、 肌肉、 皮下、 鼻腔、 口腔粘膜、 皮肤、 腹膜或直肠等。给药剂型为例如片剂、 胶囊、 滴 丸、 气雾剂、 丸剂、 粉剂、 溶液剂、 混悬剂、 乳剂、 颗粒剂、 脂质体、 透皮剂、 口含片、 栓剂、 冻干 粉针剂等。还可以制备成缓释制剂、 控释制剂及各种微粒给药系统。
本文所用的术语 “给药” 包括所有直接与间接释放化合物到其预期作用部位的手 段。
本文所述的化合物或其药学上可接受的衍生物可以单独给药或与其它本发明化 合物联合给药， 和 / 或与其它已知治疗剂联合给药。
本发明化合物针对不同患者的特定使用剂量和使用方法决定于诸多因素， 包括患 者的年龄， 体重， 性别， 自然健康状况， 营养状况， 化合物的活性强度， 服用时间， 代谢速率， 病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。通常， 本发明化合物的给药量将在 0.01mg/kg 体重至 100mg/kg 体重的范围内， 更优选为 0.1mg/kg 体重至 10mg/kg 体重， 特别是 1mg/kg 体重至 5mg/kg 体重。
本发明化合物的单位剂型通常将含有 0.1 至 99 重量％活性物质， 更通常为 5 至 75 重量％活性物质。举例来说， 单位剂型可以含有 1mg 至 1g 化合物， 更通常为 10mg 至 500mg 化合物， 例如在 50mg 与 400mg 化合物之间， 剂量通常为 100mg 至 200mg 化合物。具体实施方式
下面的实施例用来说明本发明， 但对本发明不构成任何限制。
实施例 1 ： (±)8-(3- 甲氧基 - 苯甲酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 (401)
取 1- 苯 基 -1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 置 于 50ml 的磨口三角瓶中， 加入无水碳酸钾 0.5g， 丙酮 30ml， 稍过量的 3- 甲氧苯甲酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)， 室温搅拌 12 小时， TLC(Cl2CH2 ∶ CH3OH 5 ∶ 1) 监测反应， 至原料 点消失， 旋干后加入 30ml 水和 30ml 二氯甲烷， 分离后， 无水硫酸钠干燥， 过滤后旋干， 加入 少量丙酮溶解， 加入通氯化氢的乙醚析出固体， 抽滤， 固体用丙酮 / 无水乙醚重结晶， 干燥 + 1 后得产物 0.12g， 产率 66.7％。m.p.216-218℃。M +1(m/z) ： 365。 HNMR(DMSO-d6， ppm)δ ： 7.35-7.39(t， 1H， J ＝ 8Hz)， 7.25-7.29(t， 2H， J ＝ 8Hz)， 6.96-7.03(m， 3H)， 6.77-6.80(m， 3H)， 4.61(s， 2H)， 4.41(s， 1H)， 3.77(s， 3H)， 3.6(m， 1H)， 3.32(s， 2H)， 2.50(m， 2H)， 2.35(s， 1H)， 1.74(d， 2H， J ＝ 8Hz)。
实施例 2 ： (±)8-(3- 甲 基 - 丁 酰 基 )-1- 苯 基 -1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 (402)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的异戊酰氯 (0.15ml， 约 0.001mol)。得到目标 + 化合物 0.12g， 产率为 76.4％。m.p.80-82℃。M +1(m/z) ： 345。
实施例 3 ： (±)(1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 -8- 基 )- 酮 - 乙 酸甲酯 (403)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4， 5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的甲基草酰氯 (0.15ml， 约 0.0013mol)。得到 + 目标化合物 0.10g， 产率为 69.2％。m.p.178-180℃。M +1(m/z) ： 318。
实施例 4 ： (±)8-(4- 甲氧基 - 苯甲酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 (404)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 4- 甲氧基苯甲酰氯 (0.15ml， 约 0.001mol)。 + 1 得到目标化合物 0.13g， 产率为 68.7％。 测熔点 148-150℃。 M +1(m/z) ： 379。HNMR(DMSO-d6， ppm)δ ： 7.24-7.26(d， 2H， J ＝ 8.4Hz)， 7.12-7.14(t， 2H， J ＝ 8.4Hz)， 6.86-6.93(m， 2H)， 6.70-6.73(t， 1H， J ＝ 8.0Hz)， 6.45-6.47(d， 2H， J ＝ 8Hz)， 4.54(s， 2H)， 4.36(dd， 1H， J＝ 4.8， 7.6Hz)， 3.83(s， 1H)， 3.79(s， 1H)， 3.69(s， 3H)， 3.39(t， 1H， J ＝ 7.2Hz)， 3.32(s， 2H)， 3.24(m， 1H)， 2.24(m， 1H)， 2.01(m， 1H)， 1.48-1.58(q， 2H， J ＝ 14Hz)。
实施例 5 ： (±)8- 环戊甲酰基 -1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (405)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的环戊甲酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。 得到目 + 1 标化合物 0.15g， 产率为 75％。m.p.120-122℃。M +1(m/z) ： 327。 HNMR(DMSO-d6， ppm)δ ： 6.76-7.23(m， 5H)， 4.62(d， 2H， J ＝ 6.0Hz)， 3.48-3.57(dd， 4H， J ＝ 12Hz)， 3.28(d， 4H， J＝ 10Hz)， 2.80-2.87(m， 4H)， 1.77-1.80(m， 6H)。实施例 6 ： (±)8-(3， 3- 二甲基 - 丁酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 (406)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的叔丁酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。得到目 + 标化合物 0.09g， 产率为 56.2 ％。m.p.238-240 ℃。M +1(m/z) ： 329。1HNMR(DMSO-d6， ppm) δ： 6.76-7.21(m， 5H)， 4.62(s， 2H)， 4.36(dd， 1H， J ＝ 4.8， 10Hz)， 3.94(s， 1H)， 3.51(m， 2H)， 3.28(m， 2H)， 2.82(t， 2H， J ＝ 8.4)， 2.25(m， 1H)， 1.78(d， 2H， J ＝ 14Hz)， 1.01(s， 6H)， 0.90(s， 3H)。
实施例 7 ： (±)(1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 -8- 基 )- 酮 - 乙 酸乙酯 (407)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4， 5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的乙基草酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。得到 + 目标化合物 0.1g， 产率为 66.7％。m.p.156-158℃。M +1(m/z) ： 331。
实施例 8 ： (±)8-(4- 氯 - 苯 甲 酰 基 )-1- 苯 基 -1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 (408) 按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4， 5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 4- 氯 - 苯甲酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。 + 得到目标化合物 0.12g， 产率为 65％。m.p.90-92℃。M +1(m/z) ： 365。
实施例 9 ： (±)8-(3- 苯基 - 丙酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (409)
按照化合物 401 的合成方法制备。原料为 1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4， 5] 癸烷 -4- 酮 0.12g( 约 0.0005mol) 和稍过量的苯丙酰氯 (0.15ml， 约 0.0011mol)。得 + 到目标化合物 0.08g， 产率为 42％。m.p.120-122℃。M +1(m/z) ： 381。
实 施 例 10 ： (±)8-(3- 甲 基 - 丁 酰 基 )-1-(4- 氟 - 苯 基 -)-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (410)
按 照 化 合 物 401 的 合 成 方 法 制 备。 其 中 原 料 为 1-(4- 氟 - 苯 基 )-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 0.12g( 约 0.0005mol) 和 稍 过 量 的 异 戊 酰 氯 (0.15ml， 约 + 0.0012mol)。得到目标化合物 0.13g， 产率为 78％。m.p.158-160℃。M +1(m/z) ： 333。
实 施 例 11 ： (±)[1-(4- 氟 - 苯 基 -)-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 -8- 基 ]- 酮 - 乙酸甲酯 (411)
按 照 化 合 物 401 的 合 成 方 法 制 备。 其 中 原 料 为 1-(4- 氟 - 苯 基 )-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 0.12g( 约 0.0005mol) 和 稍 过 量 的 甲 基 草 酰 氯 (0.15ml， 约 + 0.0012mol)。得到目标化合物 0.11g， 产率为 71.7％。m.p.180-182℃。M +1(m/z) ： 335。
实施例 12 ： (±)8-[2-(4- 甲氧基 - 苯基 - 乙酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (412)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.12g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 4- 甲氧基 - 苯乙酰氯 (0.15ml， 约 0.001mol)。得到目标化合物 0.13g， 产率为 65.6％。m.p.188-190℃。M++1(m/z) ： 397。 1 HNMR(DMSO-d6， ppm)δ ： 6.89-7.23(m， 6H)， 6.53-6.54(m， 2H)， 4.32(m， 4H)， 3.70-3.72(m，
6H)， 3.57(m， 1H)， 3.24(t， 1H， J ＝ 3.2Hz)， 2.02(m， 1H)， 1.81(m， 1H)， 1.49(m， 2H)。
实施例 13 ： (±)8-(4- 氯 - 苯甲酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (413)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.12g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 4- 氯 - 苯甲酰氯 (0.15ml， 约 + 0.0012mol)。得到目标化合物 0.09g， 产率为 46.1％。m.p.218-220℃。M +1(m/z) ： 387。
实施例 14 ： (±)8-(2- 氟 - 苯甲酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (414)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.12g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 2- 氟 - 苯甲酰氯 (0.15ml， 约 + 0.0012mol)。得到目标化合物 0.12g， 产率为 64.7 ％。m.p.105-107 ℃。M +1(m/z) ： 371。 1 HNMR(DMSO-d6， ppm)δ ： 7.11-7.60(m， 6H)， 6.84-6.85(m， 2H)， 4.57(m， 2H)， 3.35-3.39(m， 4H)， 2.28(m， 1H)， 2.06(m， 1H)， 1.79(d， 1H， J ＝ 10Hz)， 1.67(d， 1H， J ＝ 10Hz)， 1.09(t， 1H， J ＝ 6.8Hz)。
实施例 15 ： (±)8-(3- 甲氧基 - 苯甲酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (415) 按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 0.12g( 约 0.0005mol) 和 稍 过 量 的 3- 甲 氧 甲 基 - 苯 甲 酰 氯 (0.15ml， 约 0.001mol)。得到目标化合物 0.11g， 产率为 57.9％。m.p.146-148℃。M++1(m/ z) ： 383 。 1HNMR(DMSO-d 6， ppm) δ ： 7.11-7.37(m ， 6H) ， 6.90-6.93(m ， 2H) ， 4.54(d ， 2H) ， 3.70-3.76(m， 5H)2.28(m， 1H)， 2.07(m， 1H)， 1.75(m， 3H)， 1.06(t， 1H， J ＝ 6.8Hz)。
实施例 16 ： (±)8-(4- 甲氧基 - 苯甲酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (416)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.12g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 4- 甲氧基 - 苯甲酰氯 (0.15ml， 约 0.001mol)。得到目标化合物 0.13g， 产率为 68.4％。m.p.226-227℃。M++1(m/z) ： 383。 1 HNMR(DMSO-d6， ppm)δ ： 7.73-7.75(d， 2H， J ＝ 8.4Hz)， 7.39-7.4(d， 2H， J ＝ 8.4Hz)， 6.85(d， 2H， J ＝ 8.4Hz)， 6.75(d， 2H， J ＝ 4.4Hz)， 4.57(s， 2H)， 3.72-3.78(m， 5H)， 2.08-2.21(m， 2H)， 1.73(m， 3H)， 1.06(t， 1H， J ＝ 6.8Hz)。
实施例 17 ： (±)8- 二苯基乙酰基 -1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (417)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.12g( 约 0.0005mol) 和稍过量的二苯乙酰氯 (0.25ml)。得到目 1 标化合物 0.15g， 产率为 68.2％。 m.p.208-210℃。 M++1(m/z) ： 443。 HNMR(DMSO-d6， ppm)δ ： 7.21-7.38(m， 10H)， 7.04(m， 2H)， 6.54(m， 2H)， 5.59(s， 1H)， 4.50(s， 2H)， 4.01(d， 1H， J ＝ 10Hz)， 4.05(d， 1H， J ＝ 12Hz)， 3.71(m， 1H)， 3.31(m， 1H)， 2.08(m， 2H)， 1.63(m， 2H)， 1.45(t， 1H， J ＝ 6.8Hz)。
实施例 18 ： (±)8- 环戊甲酰基 -1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 (418)
按 照 化 合 物 401 的 合 成 方 法 制 备。 其 中 原 料 为 1-(4- 氟 - 苯 基 )-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和 稍 过 量 的 环 戊 甲 酰 氯 (0.15ml， 0.0012mol)。得到目标化合物 0.13g， 产率为 74.9％。m.p.141-142℃。M++1(m/z) ： 345。
实 施 例 19 ： (±)[1-(4- 氟 - 苯 基 -)-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 -8- 基 ]- 酮 - 乙酸乙酯 (419)
按 照 化 合 物 401 的 合 成 方 法 制 备。 其 中 原 料 为 1-(4- 氟 - 苯 基 )-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和 稍 过 量 的 乙 基 草 酰 氯 (0.15ml， 约 + 0.0013mol)。得到目标化合物 0.12g， 产率为 75％。m.p.160-162℃。M +1(m/z) ： 349。
实施例 20 ： (±)8-(3， 3- 二甲基 - 丁酰基 )-1-(3， 5- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (420)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的叔丁酰氯 (0.15ml， 约 + 0.0012mol)。得到目标化合物 0.13g， 产率为 74.9％。m.p.172-173℃。M +1(m/z) ： 347。
实施例 21 ： (±)8-(3- 甲基 -2- 苯基 - 丁酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 -)-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (421)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 3- 甲基 -2- 苯基 - 丁酰氯 (0.25ml)。得到目标化合物 0.15g， 产率为 73.3％。m.p.168-170℃。M++1(m/z) ： 421。
实施例 22 ： (±)8-(2- 甲基 - 丁酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (422)
按照化合物 401 的合成方法制备。 其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 2- 甲基丁酰氯 (0.15ml， 约 + 0.0012mol)。得到目标化合物 0.08g， 产率为 48.2％。m.p.286-288℃。M +1(m/z) ： 427。
实施例 23 ： (±)(2- 氯基 -4- 硝基 - 苯甲酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 -)-8-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (423)
按 照 化 合 物 401 的 合 成 方 法 制 备。 其 中 原 料 为 1-(4- 氟 - 苯 基 )-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和 稍 过 量 的 2- 氯 -4 硝 基 苯 甲 酰 氯 (0.25ml)。得到目标化合物 0.13g， 产率为 60.2％。m.p.140-141℃。M++1(m/z) ： 432。
实 施 例 24 ： (±)8-(4- 氟 - 苯 甲 酰 基 )-1-(4- 氟 - 苯 基 -)-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (424)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 4- 氟苯甲酰氯 (0.15ml， 约 + 0.0012mol)。得到目标化合物 0.09g， 产率为 48.5％。m.p.150-152℃。M +1(m/z) ： 369。
实 施 例 25 ： (±)[1-(3， 5- 二 甲 基 - 苯 基 -)-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 -8- 基 ]- 酮 - 乙酸乙酯 (425)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的乙基草酰氯 (0.15ml， 0.0013mol)。得到目标化合物 0.10g， 产率为 60.4％。m.p.91-93℃。M++1(m/z) ： 359。
实 施 例 26 ： (±)[1-(3， 5- 二 甲 基 - 苯 基 -)-1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 -8- 基 ]- 酮 - 乙酸甲酯 (426)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的甲基草酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。得到目标化合物 0.11g， 产率为 69.4％。m.p.210-212℃。M++1(m/z) ： 345。
实施例 27 ： (±)8-(2- 乙基 - 丁酰基 )-1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (427)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和 稍 过 量 的 2- 乙 基 丁 酰 氯 (0.15ml， 0.0012mol)。得到目标化合物 0.07g， 产率为 40.3％。m.p.181-183℃。M++1(m/z) ： 347。
实施例 28 ： (±)8-(4- 氟基 - 苯甲酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (428)
按照化合物 401 的合成方法制备。 其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 4- 氟 - 苯甲酰氯 (0.15ml， 约 + 1 0.0012mol)。 得到目标化合物 0.12g， 产率为 63.1％。 M +1(m/z) ： 381。 HNMR(DMSO-d6， ppm) δ： 7.31-7.40(m， 4H)， 6.39-6.44(m， 3H)， 4.59(m， 2H)， 4.57(d， 1H， J ＝ 4.8Hz)， 3.74(d， 1H， J ＝ 3.2Hz)， 3.47(d， 1H， J ＝ 3.2Hz)， 3.39(m， 1H)， 2.49(s， 1H)， 2.27(s， 6H)， 2.08-2.21(m， 2H)， 1.75(d， 1H， J ＝ 12Hz)， 1.62(d， 1H， J ＝ 12Hz)。
实 施 例 29 ： (±)1-(3， 3- 二 甲 基 - 苯 基 )-4- 酮 -1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -8- 甲酸苄酯 (429)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的苄氧甲酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。得到目标化合物 0.14g， 产率为 71.2 ％。m.p.164-166 ℃。M+(m/z) ： 393。 1 HNMR(DMSO-d6， ppm)δ ： 7.33-7.37(m， 5H)， 6.33-6.43(m， 3H)， 4.57(m， 2H)， 3.94(m， 2H)， 3.42(s， 1H)， 3.39(m， 1H)， 2.50(s， 2H)， 2.15(s， 6H)， 2.08-2.21(m， 2H)， 1.63(d， 2H， J ＝ 14Hz)。
实施例 30 ： (±)8-(2- 乙基 - 丁酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (430)
按照化合物 401 的合成方法制备。 其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 2- 乙基 - 丁酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。得到目标化合物 0.06g， 产率为 33.6％。M++1(m/z) ： 357。
实施例 31 ： (±)8-[2-(3- 甲氧基 - 苯乙酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (431)
按照化合物 401 的合成方法制备。 其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 3- 甲氧基苯乙酰氯 (0.15ml， 约 0.001mol)。得到目标化合物 0.16g， 产率为 80％。m.p.215-217℃。M++1(m/z) ： 407。
实施例 32 ： (±)8- 二苯乙酰基 -1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (432)
按照化合物 401 的合成方法制备。 其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的二苯乙酰氯 (0.25ml)。得到目标化合物 0.14g， 产率为 61.8％。m.p.228-230℃。M++1(m/z) ： 453。
实施例 33 ： (±)8-(4- 氟 - 苯甲酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (433)
按照化合物 401 的合成方法制备。 其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.12g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 4- 氟基 - 苯甲酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。得到目标化合物 0.11g， 产率为 57.9％。m.p.201-203℃。M++1(m/z) ： 381。
实施例 34 ： (±)8-(3， 4- 二甲氧基 - 苯甲酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (434)
按照化合物 401 的合成方法制备。 其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 3， 4- 二甲氧基 - 苯甲酰氯 (0.25ml)。得到目标化合物 0.15g， 产率为 71.4％。m.p.148-150℃。M++1(m/z) ： 423。
实施例 35 ： (±)8- 环戊甲酰基 -1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮的合成 (435)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的环戊甲酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。得到目标化合物 0.13g， 产率为 73.4％。m.p.218-220℃。M++1(m/z) ： 355。
实施例 36 ： (±)8-(2- 氯 -4- 硝基 - 苯甲酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (436)
按照化合物 401 的合成方法制备。 其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯胺 )-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 2- 氯 -4- 硝基 - 苯甲酰氯 (0.25ml)。得到目标化合物 0.17g， 产率为 77.3％。m.p.138-140℃。M++1(m/z) ： 442。
实 施 例 37 ： (±)8-(4- 氟 - 苯 甲 酰 基 )-1- 苯 基 -1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 (437)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 4- 氟 - 苯甲酰氯 (0.15ml， 0.0012mol)。得 + 到目标化合物 0.12g， 产率为 67.9％。m.p.178-180℃。M +1(m/z) ： 352。
实 施 例 38 ： (±)8-(2- 乙 基 - 丁 酰 基 )-1- 苯 基 -1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 (438)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 2- 乙基 - 丁酰酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。 + 得到目标化合物 0.07g， 产率为 42.5％。m.p.218-220℃。M +1(m/z) ： 329。
实施例 39 ： (±)8-(4- 甲氧基 - 苯甲酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 (439)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 4- 甲氧基 - 苯甲酰氯 (0.15ml， 约 0.001mol)。 + 得到目标化合物 0.13g， 产率为 71.2％。m.p.102-103℃。M +1(m/z) ： 364
实施例 40 ： (±)8-( 二苯基乙酰基 )-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (440)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5]癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的二苯乙酰氯 (0.25ml)。得到目标化合物 0.18g， 产率为 84.7％。m.p.118-120℃。M++1(m/z) ： 425。
实施例 41 ： (±)8-(3- 甲氧基 - 苯甲酰基 )-1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (441)
按照化合物 401 的合成方法制备。 其中原料为 1-(3， 3- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.12g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 3- 甲氧基苯甲酰氯 (0.15ml， 约 0.001mol)。得到目标化合物 0.16g， 产率为 81.4％。m.p.138-140℃。M++1(m/z) ： 393。
实施例 42 ： (±)1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 -8- 甲酸苄酯 (442)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的苄氧甲酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。得到 + 目标化合物 0.11g， 产率为 60.3％。m.p.125-128℃。M +1(m/z) ： 365。
实施例 43 ： (±)8-[2-(3- 甲氧 - 苯基 )- 乙酰基 ]-1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (443)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 3- 甲氧基 - 苯甲酰氯 (0.15ml， 约 0.001mol)。得到目标化合物 0.15g， 产率为 75.6％。m.p.140-142℃。M++1(m/z) ： 397
实施例 44 ： (±)1-(3， 5- 二氟 - 苯基 )-4-[1-(4 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 -8- 基 ]-1， 4- 丁二酮 (444)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(4- 氟 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮 杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 4-(3- 氟 -5- 甲基 - 苯基 )-4- 丁 酰氯 (0.25ml)。得到目标化合物 0.17g， 产率为 76.4％。m.p.109-111℃。M++1(m/z) ： 445。
实施例 45 ： (±)8-(4- 氯 - 苯甲酰基 )-1-(3， 5- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (445)
按照化合物 401 的合成方法制备。 其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三 氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 4- 氯 - 苯甲酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。得到目标化合物 0.13g， 产率为 62.9％。m.p.136-138℃。M++1(m/z) ： 397。
实施例 46 ： (±)-8- 苯甲酰基 -1-(3， 5- 二甲基 - 苯基 )1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (446)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1-(3， 5- 二甲基 - 苯基 )-1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.12g( 约 0.0005mol) 和稍过量的苯甲酰氯 (0.15ml， 约 + 0.0012mol)。得到目标化合物 0.13g， 产率为 71.6％。m.p.125-127℃。M +1(m/z) ： 364。
实 施 例 47 ： (±)8-(2- 氟 - 苯 甲 酰 基 )-1- 苯 基 -1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺 [4.5] 癸 烷 -4- 酮 (447)
按照化合物 401 的合成方法制备。其中原料为 1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 2- 氟 - 苯甲酰氯 (0.15ml， 约 0.0012mol)。 + 得到目标化合物 0.10g， 产率为 56.6％。m.p.163-165℃。M +1(m/z) ： 397。
实施例 48 ： (±)8-[2-(3- 甲氧基 - 苯基 )- 乙酰基 ]-1- 苯基 -1， 3， 8- 三氮杂 - 螺 [4.5] 癸烷 -4- 酮 (448)
按 照 化 合 物 401 的 合 成 方 法 制 备。 其 中 原 料 为 1- 苯 基 -1， 3， 8- 三 氮 杂 - 螺[4.5] 癸烷 -4- 酮 0.11g( 约 0.0005mol) 和稍过量的 3- 甲氧基 - 苯乙酰氯 (0.15ml， 约 + 0.0012mol)。得到目标化合物 0.14g， 产率为 73.8％。m.p.121-123℃。M +1(m/z) ： 380。
下面的生物试验用来进一步说明本发明。
实施例 49 ： 实施例化合物的镇痛作用
实验目的 ： 测定化合物在小鼠醋酸扭体模型上的镇痛活性
实验材料 ： 昆明种小鼠 (18-22g)， 雌雄各半， 由军事医学科学院实验动物中心提 供。
实验方法 ：
将小鼠称重， 标记， 分组， 每组 10 只， 灌胃给药 (40mg/kg)。40 分钟后， 腹腔注射 0.6％醋酸 0.4ml， 5 分钟后记录在随后 15 分钟内小鼠扭体的次数， 按下式计算药物对小鼠 醋酸扭体的抑制率， 从而评价药物的镇痛效果， 结果见表 1。
表1： 小鼠醋酸扭体实验结果实施化合物编号 ZC1( 阳性对照 ) 401 402 403 404 405 406 413 414 418 423 扭体抑制率％ 54.4 68.8 34.0 23.2 44.2 7.9 41.4 27.3 2.73 5.8 35.5 每组动物数量 ( 只 ) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
21CN 101838269 A说424 425 434 435 436 439 443 445 447 448明0 0 58.6 28.8 0 0 16 40.4 7.3 0书10 10 10 10 10 10 10 10 10 1017/19 页以上实施例化合物镇痛作用评价结果表明， 本发明化合物在小鼠醋酸扭体模型上 表现出明显的镇痛作用。
实施例 50 ： 实施例化合物的 N- 型钙通道电流抑制活性
实验目的 ： 测定化合物对爪蟾卵母细胞瞬时表达的 N 型钙通道 (α1B/β1b/α2δ) 的电流抑制作用。
实验材料 ： 爪蟾卵母细胞。
实验方法 ：
(1) 细菌培养
100LB 溶液， 100μL 氨苄青霉素， 1ml 表达 α1B 的大肠杆菌于 37℃下， 以 200 转 / 分的转速振摇 12-17 小时， 备用。
(2) 提取质粒
取 4ml 细菌培养物用台式离心机 (13000g) 离心 5 分钟， 弃取上轻液， 并将试管倒 置于纸巾上吸去剩余的培养液。
加入 250μL 细胞悬浮液， 旋涡震荡或吹打以充分悬浮细胞 ( 细胞充分悬浮十分关 键 )， 将悬浮的细胞转移至 5ml 的消毒离心管中 ( 注意 ： 以后不要再旋涡震荡以免切断染色 体 DNA)。加入 250μL 细胞裂解液并颠倒 4 次， 以充分混合。孵育时间大约 1-5 分钟， 不要 超过 5 分钟， 否则质粒 DNA 会出现缺口 ( 注意 ： 加入碱性蛋白酶溶液前观察裂解液部分澄清 非常必要， 但是孵育时间不要超过 5 分钟 )。
加入 10μL 碱性蛋白酶溶液并颠倒离心管 4 次以充分混合， 于室温孵育 5 分钟。 碱 性蛋白酶能够灭活核酸酶以及其他细菌裂解过程中释放出的能够影响分离质粒质量的蛋 白。
加入 350μL 中和液并迅速颠倒 4 次以充分混合， 于室温将细胞裂解液以最大速度 (14000g) 离心 10 分钟。
将澄清的裂解液大约 850μL 转移到准备好的离心柱中， 不要搅动或将任何白色 沉淀与上清液一同转移。
用离心机以最大速度于室温离心 1 分钟， 从收集管上取下离心管并弃去收集管中 的液体， 将离心柱重新插入到收集管上。
加入 750μL 先前用 95％的乙醇稀释过的柱清洗液。
用离心机以最大速度于室温离心 1 分钟， 从收集管上取下离心管并弃去收集管中 的液体， 将离心柱重新插入到收集管上。
加入 250μL 柱清洗， 重复清洗一次。
用离心机以最大速度于室温离心 2 分钟。
将离心柱转移至一个新的 1.5ml 消毒的离心管中， 操作时需小心， 不要将清洗液 与离心柱一同转移。
将离心柱再转移至一个新的 1.5ml 消毒的离心管中， 加入 100μL 去核算酶的水， 以洗脱质粒 DNA( 可等 2 分钟， 便于完全溶解 )， 于室温用离心机以最大速度离心 1 分钟。
洗脱后将离心柱取出， 并弃之。合并离心液于 -20℃条件下保存备用。
(3) 爪蟾卵母细胞的分离和培养
将手术器械在 75％的乙醇中浸泡 30 分钟， 取出凉干。5 号丝线在沸水中消毒 10 分钟。
将爪蟾掩埋于碎冰中约 40 分钟， 使其麻醉。取出已麻醉的爪蟾， 腹部向上置于平 铺的碎冰上， 并用碎冰掩埋其头部和四肢。用酒精棉球消毒下腹部皮肤， 然后用针头挑起 ( 正中偏左或右 )， 用眼科剪刀剪开 1cm 左右的小口。用同样的方法剪开肌肉层 ( 注意不要 损伤任何内脏器官， 剪开肌肉层后即可看到卵母细胞 )。用镊子和剪刀取出 1cm3 大小的小 叶， 放入预先准备好的含有 OR-2( 含青霉素 ) 的培养液皿中， 分别缝合肌肉层和皮肤层。
将卵母细胞转移到无菌的玻璃管中重复用 OR-2 溶液清洗， 至洗净残留的血液为 止。加入胶原酶溶液振摇消化约 1 小时， 更换新胶原酶溶液继续振摇约 1 小时 ( 此时可看 到大多数已分离或单个细胞 )。
除去消化液， 用 OR-2 溶液清洗 5-6 次， 转入盛有 ND-96 溶液的培养皿中挑选 V 期 成熟的细胞置于 ND-96 溶液中， 于 1℃条件下用生化培养箱保存备用， 每天换液一次。
(4) 注入质粒
将质粒 α1B， α2δ， β1b 按照 1 ∶ 1 ∶ 1 的比例注入爪蟾卵母细胞， 每个细胞约注 入 50nM。注入后的细胞置于 ND-96 培养液中， 温度 18℃放置培养 48 小时后记录电流。
(5) 电流记录
灌流方法给药， 流速为 3ml/min， 药物浓度为 50μmol/L。采用双电极电压钳技术， 将细胞钳制在 -100mV， 以 10mV 为步阶， 去极化至 +60mV， 记录电流。
N- 型钙通道电流抑制实验结果见表 2。
表2： N- 型钙通道电流抑制实验结果
23CN 101838269 A说化合物编号 402 405 406明书细胞个数 3 3 319/19 页电流抑制率％ 59±1.8 78±3.7 85±2.724