滇瑞香所含的木脂素类化合物及其制备方法和应用 【技术领域】
本发明涉及从天然植物中提取分离化合物，更具体地说，本发明涉及一种新的滇瑞香所含的木脂素类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
滇瑞香(Daphne acutiloba Rehd.)为瑞香科植物滇瑞香的全株，英文名Shortpetal Daphne，分布在云南、贵州、四川等地。滇瑞香除作为观赏植物外，药用价值也很高。瑞香根、树皮、花均可入药。性味甘、咸，能活血化瘀。缓解痉挛，止痛，祛风除湿，治急喉风，手脚麻木，冻疮、烧伤。木脂素(lignan)又称木脂体，它们存在于许多种植物中，所在部位各异，甚至在植物的分泌物、人类和动物的尿液中也有发现；该类化合物具有广泛的生物活性，如：小檗科鬼臼等多种值物中所含的鬼臼毒素(podophyllotoxin)及其衍生物具抗肿瘤的活性，五味子素(schizandrin)能降低谷丙转氨酶(GPT)而用于治疗肝炎，厚朴酚(maganolol)具肌肉松弛作用，牛蒡子甙(arctiin)对风热感冒有效等。由于植物木脂素成分结构类型多，立体化学复杂，具有多种生物活性，国内外对该领域的研究十分活跃。本发明从滇瑞香中分离得到了一种具有生物活性的新木脂素类化合物，为滇瑞香的综合利用提供了新途经。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种新的木脂素类化合物。
本发明的另一个目的是提供一种从滇瑞香中提取所述化合物的方法。
本发明进一步的目的是提供所述化合物在抗氧化和抗HIV-1中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
A.本发明从滇瑞香中分离出一种新的木脂素类化合物，该化合物具有显著的抗氧化和抗HIV-1活性。
本发明提供的新的木脂素类化合物具有下述结构式：
该化合物的命名为：瑞香木脂素A(daphnelignan A)。
B.本发明提供了一种所述化合物的制备方法，该方法采用以下步骤：
1.滇瑞香全株粉碎后以甲醇分3次用超声提取；2.合并提取液，减压浓缩提取液至小体积，静置后滤除沉淀物，并将提取液浓缩成浸膏；3.浸膏用硅胶柱层析初分，然后采用高效液相半制备色谱进一步分离，即得到所需的该新化合物。
C.本发明对所述的新化合物进行了抗氧化和抗HIV-1活性检测，化合物显示出良好的抗氧化活性和抗HIV-1效果，可为医药工业提供有药用价值的新化合物或先导化合物。
【附图说明】
图1为本发明化合物的核磁共振炭谱(13C NMR)；
图2为本发明化合物的核磁共振氢谱(1H NMR)；
图3为本发明化合物的高分辨质谱(HRESIMS)；
图4为本发明化合物和已知化合物Wikstromol的结构对比；
图5为本发明化合物的主要HMBC相关。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应该理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
——化合物的制备
滇瑞香样品采于云南丽江。将滇瑞香样品取样2.0kg粉碎到60目，以甲醇用超声提取3次，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至小体积，静置后滤除沉淀物，然后浓缩成浸膏；得浸膏46.5g。浸膏用适量乙酸乙酯溶解后用80g粗硅胶(80-100目)拌样，0.5kg的硅胶(160-200目)装柱进行硅胶柱层析，石油醚∶丙酮(1∶0→0∶1)梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分(纯石油醚、石油醚-丙酮10∶1、石油醚-丙酮5∶1、石油醚-丙酮2∶1、石油醚-丙酮1∶1、石油醚-丙酮1∶2、石油醚-丙酮1∶5、纯丙酮)，其中石油醚-丙酮(2∶1)洗脱部分5.22g用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以65％的甲醇为流动相，ZorbaxSB-C18(9.4×250mm，5μm)半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为280nm，每次进样50μL，收集21.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析再次分离，可得所述的新化合物。
实施例2
——化合物的鉴定
本发明化合物为白色无定形粉末；紫外光谱(溶剂为甲醇)，λmax(logε)：276(3.67)，210(5.57)nm；红外光谱(溴化钾压片)3427，2946，2857，1742，1654，1638，1535，1472，1447，1372，1219，1153，1092，1027，874cm-1；旋光(溶剂为甲醇)[α]D25.3+18.4(c 0.21)。
表-1化合物的1H和13C NMR数据(Pyridine-d5)
HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 453.1521[M+Na]+(计算值为453.1525)，结合1H和13C NMR谱(图-1和图-2，数据归属见表-1)给出其分子式C23H26O8，不饱和度为11。1H和13C NMR谱信号表明化合物中有一个乙酰基(δC169.9，21.2)，2个苯环(包括6个双键次甲基碳(δC112.9、113.5、114.9、116.6、121.4，123.1)，2个亚甲基(δC31.9、40.1)，1个氧化的亚甲基(δC71.2)，1个次甲基(δC44.2)，1个氧化的季炭(δC78.0)，1个酯羰基(δC179.5)，3个甲氧基(δC55.9、56.0，56.1)。本发明化合物的13C-NMR数据与已知化合物Wikstromol(图-4)比较表明两者非常相似，不同之处仅为本专利化合物中多了一组乙酰基信号，说明和已知化合物Wikstromol相比，本发明化合物多了一个乙酰基取代，经HMBC相关(图-5)证实本发明化合物中乙酰基取代在C-8位，而C-3、C-3’、C-4’位取代为甲氧基，C-4取代位为羟基；并近一步经过ROESY相关证实了本发明化合物的立体结构。至此，化合物的结构式最终被确定，命名为瑞香木脂素A(daphnelignan A)。
实施例3
——化合物抗氧化活性检测
抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50μg/mL为初筛浓度，测定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一块costar 96孔板，加入新鲜配制的DPPH甲醇溶液(6.5×105mol/L)190μL/孔，加入待测样品10μL/孔，空白孔加10μL生理盐水，充分混匀，用封板膜封板后室温下避光静置30分钟，于UV2401分光光度计上测定仪上测定各孔吸光度值，测定波长为517nm；样品对脂性自由基DPPH清除率按下式计算：
DPPH清除率(％)＝(A空白-A样品)/A空白×100％
A空白：空白对照组吸光度值；A样品：加样品组吸光度值。
样品平行5次检测，计算半数清除浓度IC50测定结果为10.16μg/L，表明化合物具有良好的抗氧化活性。
实施例4
——本发明化合物的抗HIV活性检测
1.HIV-1感染性滴定按Johnson & Byington所述方法改良进行滴定；按Reed&Muench方法计算病毒的TCID50(50％Tissue Culture InfectionDose)。
2.样品对C8166宿主细胞地细胞毒性检测
4×105/ml C8166细胞悬液100ul与待测化合物溶液混合，设三个重复孔。同时设置不含化合物的对照孔，温度37℃，5％CO2培养三天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800 ELISA仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CC50值(50％CytotoxicConcentration)，即对50％的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的化合物浓度。
3.样品对HIV-1IIIB诱导C8166细胞病变(CPE)的抑制试验
将8×105/mL C8166细胞50μL/孔接种到含有100μL/孔倍比稀释化合物的96孔细胞培养板上，然后加入50μL的HIV-1IIIB稀释上清(M.O.I.0.0016)。设三个重复孔。同时设置不含化合物的正常细胞对照孔。37℃，5％CO2培养三天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。EC50(50％Effective Concentration)为抑制合胞体形成50％时的化合物浓度。
4.样品对HIV感染细胞的保护作用试验
将8×105/ml MT4细胞50ul/孔接种到含有100μl/孔倍比稀释化合物的96孔细胞培养板上，培养板的一半孔加入50μl的HIV-1IIIB稀释(M.O.I.0.006)，另一半孔加入50μl培养基。每个浓度梯度2个重复孔，同时设置不含化合物的对照孔和空白对照孔，37℃、5％CO2培养，第三天每孔补加100μl新鲜培养基，第五天或第六天采用MTT比色法检测细胞存活率。ELx800 ELISA仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。用公式计算出化合物对正常细胞的毒性和对HIV-1IIIB感染细胞的保护作用。
5.计算公式
根据实验结果绘制剂量反应曲线，按Reed&Muench法计算出化合物抑制病毒的50％有效浓度(EC50)，50％抑制细胞生长浓度(CC50)及抗HIV-1活性的治疗指数TI值(Therapeutic index)为：TI＝CC50/EC50。
细胞生长存活率(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值×100
细胞生长抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100
HIV-1致细胞病变的抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100
感染细胞的保护率(％)＝
(实验孔OD值-阳性对照孔OD值)/(阴性对照孔OD值-阳性对照孔OD值)×100
6.实验结果
实验结果清楚地表明，该化合物显示出一定的抗HIV-1活性，其治疗指数为47.5，揭示了本发明的化合物在制备抗爱滋病的药物中有良好的应用前景。
*以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。