合成金属取代的细菌叶绿素衍生物及其应用 【发明领域】
本发明涉及一种金属化的细菌叶绿素衍生物的制备方法和一些新地金属取代的细菌叶绿素衍生物，所述的金属化的细菌叶绿素衍生物既可用于体内的光动力治疗(PDT)和诊断，也可用于在体外光动力杀灭病毒和微生物。定义和简称
BChl＝细菌叶绿素(由下列通式I表示的含镁的7，8，17，18-四氢卟啉，其中M是Mg，R1是叶绿基或香叶基香叶基(geranylgeranyl)，R2是COOCH3，R3是H，R4在3位时为乙酰基而在8位时为乙基)。
BChl衍生物＝大环、中心金属原子和/或环周围处发生改变的BChl的衍生物，其中包括下列通式I、II、III和I’、II’、III’所示的衍生物。
BPhe＝细菌脱镁叶绿素a(其中中心Mg原子被两个氢原子取代的BChl)。
Chl＝叶绿素(大环的含镁17，18-二氢卟啉衍生物，所述大环是由四个吡咯环和一个等节环组成，其中，各环彼此共轭并且都与Mg原子相连)。叶绿素的结构式如通式I所示，其中R1是叶绿基，R2是COOCH3，R3是H，R4在3位时为乙烯基而在8位时为乙基。
[M]-BChl＝BChl衍生物，其中的中心Mg原子被金属M取代，而金属M将在下文具体说明。
PDT＝光动力疗法
Phe＝脱镁叶绿素a(中心Mg原子被两个H原子替代了的Chl)。
【发明背景】
在光合作用中，含镁的(细菌)叶绿素((B)Chl)及其游离碱、(细菌)脱镁叶绿素((B)Phe)都是必需的。它们作为天线色素和氧还色素能够确保反应中心内的光诱致电荷分离。这些色素还是极其有效的光敏剂，例如在光动力肿瘤疗法中作为光敏剂。
已证明卟啉在肿瘤组织中会发生蓄积，当照射肿瘤组织时，由于卟啉就地吸光，所以确定其荧光位置就成为肿瘤检测的一种方法。血卟啉的天然衍生物，即血卟啉衍生物或HPD可用于肿瘤检测和光动力疗法。一种十分有效的HPD物中含有聚集分子量(aggregate weight)大于10Kda的组成部分，该HPD还是US专利4,649,151的主题化合物。在有关皮肤疾病局部治疗的US专利4,753,958中以及Matthews等人于1988年发表的“含有例如细菌或病毒等感染生物的生物样品的灭菌方法”文章中都对HPD或其活性组成作了描述。
为使卟啉药物在疾病治疗和诊断中发挥出最大功效，人们已设计了数种卟啉的衍生物，其中，例如在四个吡咯环中配合一个中心金属原子，和/或进一步改变吡咯环周围的取代基，和/或大环二氢化后成为Chl衍生物(绿素类)或大环四氢化后成为BChl衍生物(细菌绿素类)。
在对卟啉和17，18-二氢卟啉系列进行的试验中，通过研究环状的四吡咯与金属(除Mg之外)形成的配合物，人们了解了它们的分光特性和氧还性质(Hynninen，1991)。与叶绿素相比，细菌叶绿素因其在近红外区内的强吸收谱带而显示出更显著的优越性，即，其强吸收谱带位于比叶绿素衍生物更长的波长区域内。但是，至今人们对具有除Mg之外的中心金属的细菌叶绿素的情况仍知之甚少。
PCT国际申请公开说明书WO90/12573(申请人Dougherty)中描述了细菌叶绿素-a或-b的衍生物或相应的细菌绿素类的衍生物，该细菌绿素类不含有中心金属原子，或所含中心金属原子是选自Mg2+、Sn2+和Zn2+的非顺磁性金属，并且其C-173-羧基与饱和或不饱和的含8-25个碳原子的烃基发生酯化反应，这些衍生物可被制成组合物，这类组合物可有效地参与到对非所需靶生物底物的破坏和损伤过程中，该方法包括：用有效量的上述衍生物使底物具有光敏性，然后，在该衍生物的吸收波长谱带内对底物进行照射并持续一段时间，直至有效地损伤和破坏该底物。另外，上述化合物还可被应用在光动力治疗和诊断中。应该注意，虽然细菌叶绿素-a或-b与Sn2+和Zn2+的配合物已在专利申请WO 90/12573的保护范围内，但是该专利申请说明书中既没有有关这些金属衍生物的具体说明，也没有公开任何它们的制备方法。
Losev等人在1990年时公开了[Pd]-BChl和[Cu]-BChl配合物的制备方法，即，BPhe在苯中和在氮气流中与Pd苄腈发生直接金属化反应，或BChl与CuCl2的甲醇浓溶液发生直接金属化反应。然而，该文献缺少有关这些金属配合物制备方法和特性的详细内容。并且，我们不能重复出Losev等人所述的[Pd]-BChl配合物制备方法。
在正常的释放条件下，即室温有氧和日光条件下，与例如血卟啉衍生物(HPD)相比，BChl部分很不稳定，同时它们的量子产额较低，以致无法形成三重态。但是，它们对生物氧化还原反应的可能的引发性、良好的光谱特性和体内易降解性使细菌叶绿素比其他化合物例如卟啉和叶绿素类具有更显著的优越性，上述特性既适合PDT治疗和诊断，也适于杀灭样品和活组织内的细胞、病毒和细菌。化学修饰作用能够进一步改善细菌叶绿素的特性，但是，由于缺乏制备该类修饰细菌叶绿素(Hynninern，1991)的适当方法，所以上述化学修饰作用受到了很大限制。
与本申请是同一申请人的欧洲专利申请0584552公开了新的Chl和BChl与氨基酸、肽和蛋白质形成的共轭物，这些共轭物可用于PDT治疗和诊断。其中的氨基酸、肽和蛋白质残基与Chl或BChl分子中的C-173-羧基直接或通过间隔基相连。制备这些共轭物的反应要在温和条件下进行，这样才能够使酸敏感性中心Mg原子保持稳定。此文献中还公开了叶绿素a-173-丝氨酸甲酯的Zn和Cu配合物，但没有描述金属化细菌叶绿素和它们的制备方法。
德国专利申请4121876公开了细菌叶绿素的C-132和C-173位的成酯衍生物，这些酯是在温和的条件下，通过快速的碱酯基转移反应而制得的，在反应中，等节环发生改变而中心金属Mg保持不变，该色素的吸收谱带在反应完成后移至800nm。该专利申请还提及了BChl衍生物与Zn或Ni形成的配合物，但是，该文献中既没有具体描述这些配合物，也没有公开它们的制备方法。
人们都希望能够制备新的用于PDT治疗的BChl的金属化的配合物，目的是保持或改善BChl类化合物的光学特性和生理特性，同时最大限度地增强它们的光敏能力，提高它们的化学稳定性，并且最大限度地延长它们的生理寿命。金属转移作用使BChl类的化学活性和稳定性发生了特定变化，而正是这些特定变化对其大环和周围取代基的新的修饰起着重要的作用，尤其是这些变化最大限度地改善BChl的转运、靶作用和生理寿命，同时也最大限度地降低其毒副作用。金属转移作用还可使激发态特性发生改变，其中包括改变三重产额和寿命、高激发态的可及度、以及细胞毒性氧物质的生成。
人们已经了解了数种改变卟啉中心金属原子的方法(参见Buchler，1975)。卟啉不仅易于制备，其化学特性也稳定，但是卟啉的光谱特性和生理性质并不理想。
人们对叶绿素的直接或间接金属化方法知之甚少。Strell和Urumow在1977年描述了[Cr]-Chl和[Mn]-Chl配合物，它们分别是[Cd]-Chl(脱金属的Chl衍生物与乙酸镉在甲醇或吡啶中发生反应得到的产物)与Cr++或Mn++在甲醇和氮气保护下经金属转移作用后生成的产物。该金属转移反应还适于制备叶绿素衍生物的Cu、Zn、Co和Pb配合物，但是不适于Fe3+、Ni和Mg。然而，由于Cu、Zn、Co和Pb配合物可通过直接金属化到Phe中而制得，因此，该方法仅有利于制备Cr和Mn配合物。作者Strell和Urumow还描述了Phe的丙酮溶液与乙酸镁在二甲基亚砜中进行直接金属化反应得到产物[Mg]-Chl配合物。
除Mg之外，有关含其他中心金属的细菌叶绿素的报导很少。现已知道，细菌叶绿素的金属化反应要比叶绿素的难得多，这是由于细菌叶绿素的金属化反应活性比叶绿素低，并且它的副反应活性较高。一种将Mg插入到细菌脱镁叶绿素a内的特定方法已被公开(Wasidlewsky，1977)。本发明的发明人曾试图采用Strell和Urumow等人描述的叶绿素衍生物直接金属化反应和金属转移反应来制备细菌叶绿素衍生物的金属配合物，但所有的尝试都没有成功。细菌脱镁叶绿素的直接金属化反应除与Cu和Zn反应外，不能用任何所试金属进行，否则生成了未反应的脱镁叶绿素与3-乙酰基-叶绿素a类的金属氧化产物的混合物。
发明概述
本发明发现，通过使用适当的金属盐和溶剂，并采用改进的Strell和Urumow等人公开的将叶绿素衍生物金属化的金属转移反应方法，能够制得细菌叶绿素衍生物的金属配合物。
因此，本发明涉及一种新的制备下式所示的合成金属化细菌叶绿素衍生物的方法：[M]-BChl
其中，
BChl代表脱金属化的天然或合成的细菌叶绿素衍生物的残基，该残基在其173上位带有-COOR1，其中R1为C1-C25的烃基，以及
M代表离子半径小于Cd(r≌95pm)的金属，该金属M可选自一组由包括Pd、Co、Ni、Cu、Zn和Mn在内的二价金属、包括Fe、Mn和Cr在内的三价金属、及包括Sn和Pt在内的四价金属组成的基团；该制备方法包括：
(i)在Ar气氛中，将溶解在二甲基甲酰胺中的如上定义的适当的在其173位带有-COOR1基团的细菌脱镁叶绿素衍生物与脱水乙酸镉反应，随后在还原条件下利用色谱法回收反应混合物中的[Cd]-BChl配合物；
(ii)在Ar气氛中，将所得的溶解在丙酮中的[Cd]-BChl配合物用适当的脱水金属M盐溶解，该金属M盐可选自金属M的氯化物、乙酸盐和乙酰丙酮酸盐；以及
(iii)自反应混合物中分离所需的金属化[M]-BChl衍生物。
在一种实施方案中，本发明方法用于制备通式I、II或III所示的金属化BChl衍生物：其中，R1为C1-C25的烃基；
R2为H、OH或COOR5，其中，R5是C1-C12烷基或C3-C12环烷基；
R3为H、OH或C1-C12烷基或烷氧基；
R4彼此独立地选自由乙烯基、乙基、乙酰基、1-羟乙基及其醚和酯组成的一组基团；和
M代表离子半径小于Cd(r≌95pm)的金属，该金属M可选自由包括Pd、Co、Ni、Cu、Zn和Mn在内的二价金属、包括Fe、Mn和Cr在内的三价金属、和包括Sn和Pt在内的四价金属组成的一组基团；
通过173位的酯基转移作用可从上述通式I、II和III所示[M]-BChl的衍生物制得其他衔生物，这样，在另一方面，本发明涉及通式I’、II’和III’所示化合物的制备方法：其中，R1’选自由下列定义组成的一组基团：
(i)C1-C25烃基，该烃基任选地被卤素、氧代(＝O)、OH、CHO、COOH或NH2取代，或该基团中间隔有一个或多个选自O、S和NH的杂原子，或被苯基环取代；
(ii)含羟基的氨基酸基团，或含羟基的肽基团，或其选自酯和氮被保护的衍生物的衍生物，其中，所述的该羟基化氨基酸或其衍生物是通过羟基与COO-基团相连；
(iii)通过如(i)所述的间隔基与COO-基团相连的如(ii)所述肽基团，其中所述的任选地被卤素、氧代(＝O)、OH、CHO、COOH或NH2取代的饱和或不饱和C1-C25烃基，或间隔有一个或多个选自O、S和NH的杂原子的该基团，或被苯环基取代的该基团，进一步被选自OH、COOH或NH2的端位官能团取代；和
(iv)细胞特异性配位体基团，该基团选自那些直接或通过如(i)所述间隔基与COO-基团相连的肽和蛋白质，其中，所述的任选地被卤素、氧代(＝O)、OH、CHO、COOH或NH2取代的，或间隔有一个或多个选自O、S和NH的杂原子，或被苯环基取代的饱和或不饱和C1-C25烃基可进一步被选自OH、COOH或NH2的端位官能团取代；
R2为H、OH或COOR5，其中的R5是C1-C12烷基或C3-C12环烷基；
R3为H、OH或C1-C12烷基或烷氧基；
R4彼此独立地选自由乙烯基、乙基、乙酰基、1-羟乙基及其醚和酯组成的一组基团；和
M代表离子半径小于Cd(r≌95pm)的金属，该金属M可选自由包括Pd、Co、Ni、Cu、Zn和Mn在内的二价金属、包括Fe、Mn和Cr在内的三价金属、和包括Sn和Pt在内的四价金属组成的一组基团；所述制备方法包括：
(i)将由在173位带有-COOR1基团的通式I、II或III所示细菌叶绿素的衍生物衍生的适当细菌脱镁叶绿素溶解在二甲基甲酰胺中，并在Ar气氛中与脱水乙酸Cd反应，然后，在还原条件下利用色谱法回收反应混合物中相应的[Cd]-BChl配合物；其中在-COOR1中，R1是C1-C25烃基；
(ii)将所得[Cd]-BChl配合物溶解在干燥丙酮中并与适当的脱水金属M盐在Ar气保护下反应，该金属M盐选自金属M的氯化物、乙酸盐或乙酰丙酮酸盐；和
(iii)将自上述反应混合物中回收得到的金属化[M]-BChl衍生物与具有通式R1’-OH的化合物在酯基转移反应条件下反应，得到其中R’1如上定义的上述通式I’、II’和III’所示的化合物。
在一个优选实施方案中，[M]-BChl衍生物是一种其中R1是叶绿基或香叶基香叶基，R2是COOCH3，R3是H，3位R4为乙酰基而8位R4为乙基，金属M是Pd、Co、Ni、Cu、Zn和Mn的[M]-BChl衍生物。在另一优选方案中，步骤(ii)所用的金属M盐是金属氯化物。
在另一个进一步实施方案中，反应步骤(i)和(ii)可合并为一步反应，即，细菌脱镁叶绿素衍生物与过量的适当脱水金属M盐(例如金属氯化物)在含有催化量脱水Cd盐(例如乙酸镉)存在下在二甲基甲酰胺或丙酮中反应。
另一方面，本发明还涉及新的如上述通式I’、II’和III’所示的金属化细菌叶绿素衍生物，但不包括R2为COOCH3，R3为H，3位R4为乙酰基且8位R4为乙基的，而R1为叶绿基或乙基同时M是Pd的或R1为叶绿基同时M是Cu的通式I化合物。
本发明中，新的如通式I’、II’和III’所示的金属细菌叶绿素可作为光敏治疗剂和光敏诊断剂，也可用于杀灭样本和活组织中的细胞、病毒和细菌，以及HPD领域中的其它已知用途和其它光敏剂。
附图简述
附图1：表示[Pd]-BChl-173-丝氨酰基甲酯([Pd]-BChl-Ser)和BChl-173-丝氨酰基甲酯(BChl-Ser)对金色链球菌的细菌悬浮液产生的光毒性。
附图2：表示[Pd]-BChl-Ser对培养基中掺杂有[3H]胸腺嘧啶的M2R黑素瘤细胞产生的光毒性。
发明详述
与卟啉和叶绿素相比，细菌叶绿素的直接金属化反应是困难的。本发明的方法通过对相应的[Cd]-BChl衍生物的金属转移作用制备出具有良好特性的作为光敏剂使用的金属化细菌叶绿素衍生物。
根据本发明，易于由乙酸盐/二甲基甲酰胺方法制得的[Cd]-BChl配合物可以在温和的反应条件下通过金属转移反应，得到高产率的其它金属配合物。该以[Cd]-BChl为前体物的金属转移作用的易反应性十分令人惊奇，并且其部分原因可能是由于Cd2+的离子半径(rM＝95μm)比Mg2+的(rM＝72μm)大。第二个影响因素是溶剂(丙酮)与所用金属抗衡离子(氯化物)之间的结合作用。在金属转移过程中，CdCl2和[M]-BChl之间达到一种可产生离析物的平衡，并且由于CdCl2在丙酮中的非常低溶解性使平衡向生成所需产物的方向移动。
本发明的一个实施方案中，R1基团是任何直链或支链的饱和或不饱和基团，其中包括：芳香基和烃基，优选含1-25碳原子的基团，例如烷基、链烯基、苯基，更优选含C1-C4原子的低级烷基，最优选乙基；或是由天然BChl化合物衍生的基团，例如香叶基香叶基(2，6-二甲基-2，6-辛二烯基)或叶绿基(2，6，10，14-四甲基十六-14-烯-16-基)；R1’或与上述R1定义相同，或是一个被卤素(选自F、Br、Cl和I)、OH、氧代(＝O)、CHO、COOH或NH2取代的这样的烃链，或是间隔有O、S或NH、优选O原子的这样一个任选被取代的烃链，例如R1’是含有4-10碳原子的寡聚氧化乙烯基二醇，优选五聚氧化乙烯二醇。当如本文定义的那样R1’作为肽或蛋白质的间隔基时，它可带有选自OH、COOH和NH2的端位官能团，通过这些端位官能团，肽或蛋白质与酯键或酰胺键相连。
在另一实施方案中，R1’是肽或蛋白质的含羟基的残基，例如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，或是含它们的肽，或是所述氨基酸或肽的衍生物，该衍生物选自它们的酯如烷基酯和它们的N-保护衍生物，其中N-保护基可是例如叔丁氧基、苄酯基或三苯甲基，并且所述的氨基酸或肽或其衍生物通过羟基与COO-基团相连。此类氨基酸衍生物的例子有丝氨酸甲酯、N-三苯甲基丝氨酸甲酯、苏氨酸甲酯、和N-叔丁氧基-苏氨酸甲酯，此类肽的例子有N-苄酯基-丝氨酰基-丝氨酸甲酯，所有这些物质都可按照EP 0584552中的方法制备。在最优选的方案中，[M]-BChl衍生物是用L-丝氨酸甲酯酯化了的[Pd]-BChl。
在另一实施方案中，R1’是选自肽和蛋白质的细胞特异性配位体的残基，作为非限定的例子是激素肽，例如促黑激素(促黑素)；以及抗体，例如免疫球蛋白和肿瘤特异性抗体。
还可采用脱金属的BChl衍生物的直接金属化反应来制备本发明通式I’所示的M为Zn或Cu的[M]-BChl衍生物，如下文实施例1-4所述。
一些细菌叶绿素的金属配合物很稳定，所以可用于对四吡咯环系周围进行进一步修饰，该修饰涉及剧烈条件例如使用乙酸或类似盐酸或硫酸的强无机酸。因此，通过上述配合物中的羟基例如31或132位羟基与适当的脂族酸或芳族酸、酰氯或氨基酸进行反应，可生成被烷基或芳基任选取代的酯类化合物；而通过与相应的脂族醇或芳族醇进行反应，可在同样位置上生成醚类化合物。31位(例如3-羟乙基-BChl衍生物)或132(例如132-OH-BChl衍生物)位带有羟基的化合物可通过一般方法得到(参见Struck等人，1992，和Hinninen，1991)。另外，天然存在的173位叶绿基和香叶基香叶基酯可在酸催化条件下与相应的醇发生酯基转移反应，生成其他的酯类化合物，例如，生成乙酯。其他种类的取代基可通过下列方法引入到大环上：通过Bchl a中的天然CO基团如3-乙酰基或化学引入的该类基团如酯化到C-173位上的酮醇的Wittig反应以及通过OH基团的氧化偶联在C-133位形成醚键或通过用羧酯对例如C-31、C-131、C-132位的OH的酸催化酯化反应。
或者，天然含镁BChl衍生物在脱金属反应前其四吡咯环体系的周围仍然可发生修饰反应。
通式II和III所示的BChl衍生物可得自于先前描述的相应的通式I所示的天然BChl衍生物(Struck，1990)。
本发明中的那些R1’为氨基酸、肽或蛋白质(例如抗体)的残基的化合物是在本发明所述金属转移反应后制备，该制备是通过在叶绿素酶作用下进行的酶促酯基转移反应，或者通过适当的细菌脱植基叶绿素(游离酸：BChl-173-COOH)与羟基化氨基酸、肽或蛋白质用二环己基碳化二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或4-二甲基氨基吡啶(DMAP)发生催化缩合反应，可参见EP 0584552，或者通过象天然BChl之类的Mg-配合物不能耐受的酸催化反应进行。
本发明的新的金属细菌叶绿素衍生物可作为治疗用光敏剂和诊断用光敏剂，还可用于杀灭样品和活组织内的细胞、病毒和细菌，以及HPD领域中其他已知用途和作为其他光敏剂。这些化合物十分有用，例如，在适当波长的光照射下，破坏体内或体外的肿瘤细胞或其他不正常细胞。据信，光活化能量传递给内源性氧，使其转化为单态氧，单态氧被认为与细胞毒性作用有关。另外，细菌叶绿素的光活化形式具有荧光，该荧光有助于确定肿瘤的位置或确定其他给予了金属化细菌叶绿素的位置。
可利用本发明所述的新细菌叶绿素衍生物治疗已知的适应症，适应症的例子包括：破坏实体瘤(solid tumor)中的肿瘤组织；溶解血管内斑(参见，例如美国专利4,512,762)；治疗局部性病症，例如痤疮、脚癣、疣、乳头状瘤和牛皮癣；以及，处理生物制品(例如，输血用的血液)中的感染物。
本发明所述金属细菌叶绿素衍生物可用本领域熟知的技术手段制成最终药物组合物而给予患者或施用到在体外的靶部位，所述技术手段例如总结在“Remington氏药物科学”，Mack出版公司，Easton，Penna.最新版。药物组合物可全身性给药，特别是注射，或局部施用。
在诊断领域中，金属细菌叶绿素衍生物可单独使用，或者用放射性同位素或本领域中已知的其它检测手段标记。
金属细菌叶绿素衍生物的给药量将依据已有的经验来确定，例如PDT治疗中使用其他卟啉所积累的经验，给药量还要根据作为活性组分选用的衍生物、待治疗病症、给药方式、患者的年龄和健康状况、医生的确诊结果来确定。
照射光的波长优选与金属细菌叶绿素光敏剂的最大吸收波长相匹配。适合于所有化合物的波长很容易根据它们的吸收光谱来确定。
除了体内应用，本发明的金属细菌叶绿素衍生物可作为体外用的治疗物质，杀灭有害的病毒或感染物例如有害细菌。例如，可用本发明化合物处理供将来输血用的血液和血浆并照射以达到灭菌效果。
因此，本发明还涉及包含通式I’、II’、III’所示的金属化的细菌叶绿素衍生物的药物组合物，这些药物组合物用于恶性肿瘤的光动力治疗和诊断，以及对细胞、细菌和病毒的光动力杀灭。
为达到这些发明目的，药物组合物可通过常规方法制备和给药，例如，如美国专利4,649,151、4,753,958、5,256,840、5,238,940，欧洲专利申请0584552和PCT申请WO90/12573中所述的方法，上述文献引入本文作为参考。
本发明将利用下列非限定性实施例进行说明。实施例
在各实施例和表1中出现的起始化合物和得到的金属配合物将用下列符号代替：
1a-BPhe 1b-BPhe-132-OH
2a-[Pd]-BChl 2b-[Pd]-BChl-132-OH
3a-[Co]-BChl 3b-[Co]-BChl-132-OH
4a-[Ni]-BChl 4b-[Ni]-BChl-132-OH
5a-[Cu]-BChl 5b-[Cu]-BChl-132-OH
6a-[Zn]-BChl 6b-[Zn]-BChl-132-OH
7a-BChl 7b-BChl-132-OH
8a-[Cd]-BChl 8b-[Cd]-BChl-132-OH
9a-[Mn]-BChl 9b-[Mn]-BChl-132-OH材料和方法
(i)BChl的分离。BChl[化合物7a]按照Scherz和Parson，1984，Struck等人，1992，或Svec，1991方法从光合成细菌，例如Rhodobacter(Rb)sphaeroides菌或深红螺菌中分离出来的。BChl的纯化按照Omata和Murata，1983所述在DEAE-琼脂糖凝胶上进行。
(ii)132-羟基细菌叶绿素a[BChl-132-OH]的制备。BChl-132-OH[化合物7b]是R1为叶绿基、R2为COOCH3、R3为OH、3位R4为乙酰基而8位R4为乙基的通式I化合物，它是Bchl[7a]C-132位羟基化反应的产物，即，7a在甲醇中在4℃下避光储存5-7天后得到的产物(Struck和Scheer 1990)。另外，还可采用Schaber等人1984年公开的LiBr-方法，该方法的副产物很少。上述各方法中，产物的纯化采用了以甲苯/丙酮(9∶1 v∶v)作为洗脱剂来洗脱制备性(20×20cm2)硅胶板(硅胶60H，Merck)或硅胶柱的方法。将含本标题产物的绿蓝带(Rf～0.4)刮下，然后用丙酮将未反应的Bchl a从SiO2中萃取出来。
(iii)BChl和BChl-132-OH的脱金属反应。BPhe[化合物1a]和BPhe-132-OH[化合物1b]分别是通过BChl[化合物7a]和BChl-132-OH[化合物7b]的脱金属得到的，所用方法是Rosenbach-Belkin，1988公开的方法，使用少量乙酸(色素恰好能够溶解)。在立即发生的脱金属后，用N2气流将乙酸除去，回收固体产物BPhe和BPhe-132-OH。
(iv)叶绿素酶(Chlase)。从Melia azedarch L.China树叶中提取出叶绿素酶的丙酮粉末，如EP 0584552中所述。
(v)细胞培养。在37℃和8％ CO2的湿润气氛中，在含有pH为7.4的25mM HEPES、10％的胎牛血清、2mM谷酰胺、0.06mg/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基/F12中，进行M2R小鼠黑素瘤细胞的单层培养，所用方法如先前所述(Gerst等人，1986)。
(vi)细胞光毒性研究。在24孔微平皿中培养M2R小鼠黑素瘤细胞(1×105细胞/孔)，生长24小时后达到约2×105细胞/孔，约70-80％的细胞流动性。将[M]-BChl衍生物溶解在培养基中，并利用声处理将其分散。在培养基中将Photosan-3(市售HPD产品)稀释至最终的浓度。然后用无血清培养基代替上述培养基，其中的细胞与希望浓度的光敏剂在避光条件下进行培养。2小时后，在室温下自平皿底部照射细胞5分钟。再用含血清培养基代替无血清培养基，然后将培养平皿放回至培养箱中，继续培养24小时。细胞培养物中，细胞毒性效能可利用下列方法测定：(i)细胞形态的显微镜检法；(ii)细胞荧光显微术，该方法是在细胞经活体染色(碘化丙锭[PID][碘化2，7-二氨基-9-苯基-10-(二乙基氨基丙基)-菲啶鎓甲碘化物])处理后进行的，该活体染色可选择性地将被破坏细胞核染色；(iii)[3H]胸腺嘧啶掺杂法，该方法将在下文中具体描述。空白实验包括(1)避光条件下保存的未处理细胞；(2)光线下保存的未处理细胞；(3)在避光条件下保存的经药物处理细胞。
(vii)光源。照射光源是日常用的250W卤灯，该卤灯通过一个固定在玻璃支架上的10cm厚滤水器聚焦，该灯还装配有一个滤液器(叶绿素a在660nm的O.D.＝10.00)。在所有试验中，光量都调至45mW/cm2。
(viii)[3H]胸腺嘧啶的掺入。PDT后24h时，用1μCi/ml[3H]胸腺嘧啶将细胞培养物在37℃下脉冲2小时。然后，培养物用磷酸盐-缓冲盐水洗两次，并在4℃条件下，用冷却的7.5％三氯乙酸将该培养物处理30分钟。用乙醇洗涤两次。加入氢氧化钠(1N，300μl/孔)，平皿在37℃下保持10分钟。将100μl样品转移到闪烁管中，用100μl1N HCl中和，然后，其放射性是通过液体闪烁计数法测定的，计数是按照Chen等人1988年的方法在4ml(20∶8 v∶v)二甲苯闪烁剂lumax混合物中进行。实施例1：采用直接金属化方法制备[Zn]-BChl和[Zn]-BChl-132-OH
[Zn]-BChl(化合物6a)和[Zn]-BChl-132-OH(化合物6b)分别是用乙酸酯/乙酸或乙酸酯/二甲基甲酰胺方法通过BPhe(化合物1a)和BPhe-132-OH(化合物1b)直接金属化制备的。1a：乙酸酯/二甲基甲酰胺(DMF)方法
[Zn]-BChl和[Zn]-BChl-132-OH(6a，6b)可采用下述方法制备：在DMF中，将BPhe和BPhe-132-OH(1a，1b)(-70kM)分别与1000倍过量的无水Zn(OAc)2在110℃下回流60(75)分钟(若在163℃回流，反应时间减至5分钟)。对反应进行分光镜检查并使反应达到完全。产物的分离和纯化如在下文对Cd配合物8a、8b所述那样进行(产率：～80％)。1b：乙酸酯/乙酸方法
[Zn]-BChl和[Zn]-BChl-132-OH(6a，6b)还可通过下述方法制备：将1a，1b或7a，7b(～70μM)的冰乙酸溶液与250倍过量的无水Zn(OAc)2和50mM抗坏血酸钠在100℃下回流120分钟(30分钟)。在N2气流中蒸除乙酸，用乙醚萃取Zn配合物，并用装有BakerbondSilicaNP(颗粒大小10μm；孔径150)的制备性Moddol HPLC柱(250×25.4mm)纯化。用异丙醇(5％)、甲醇(5％)和正己烷(90％ v/v)作为洗脱剂等度洗脱(10ml/min)化合物6a，该化合物保留时间约为17分钟，纯化合物的收率约75％。化合物6b也是采用了与6a相同的HPLC溶剂混合物洗脱，但6b是在硅胶色谱柱上纯化，产率90-95％。实施例2：采用直接金属化方法制备[Zn]-BChl-3-乙烯基和[Zn]-BChl-3-乙烯基-132-OH
BPhe的其他衍生物可按照上述实施例1a中所述的乙酸酯/DMF方法进行金属化反应，但反应条件有略微改变。例如，将3-乙烯基-BPhe或3-乙烯基-132-羟基-BPhe与Zn(OAc)2在120℃下反应约40分钟，其他反应条件相同，得到本标题的金属化反应产物。实施例3：采用直接金属化反应制备[Zn]-BChl-132-脱甲酯基
按上面在实施例1b中所述的相同的反应条件可制得132-脱甲酯基-Bphe(或132-脱甲酯基-BChl)的Zn配合物，但反应时间为30分钟，同时反应温度为100℃；分离和纯化都与化合物6b相同。实施例4：采用直接金属化方法制备[Cu]-BChl、[Cu]-BChl-132-OH和[Cu]-BChl-132-脱甲酯基
[Cu]-BChl(5a)是由1a或7a(约70μM)的冰乙酸溶液与250倍过量的无水Cu2O和抗坏血酸钠(50mM)在100℃下回流15分钟后得到的。[Cu]-BChl-132-OH(5b)是由1b或7b(约70μM)的冰乙酸溶液与250倍过量的无水Cu2O和抗坏血酸钠(50mM)在室温下反应得到的。132-脱甲酯基-BPhe(132-脱甲酯基-BChl)的Cu衍生物是在相同于制备5b的反应条件下生成的。尽管使用了Cu2O，但各种情况下都还是形成了Cu配合物，这是由于残留的氧或歧化作用。分离和纯化的方法与实施例1b中由冰乙酸法制备Zn配合物时所述的相同，产率：分别是～75％(5a)，～90％(5b)，和～90％(132-脱甲酯基-BChl的Cu衍生物)。实施例5：直接对BPhe金属化来制备[Cd]-BChl
[Cd]-BChl是由约70μM的BPhe的二甲基甲酰胺溶液与300倍过量的无水Cd(OAc)2在130℃下回流40分钟得到的。对反应进行分光镜检测，使反应进行达到完全。利用粗产物在乙醚(DE)和NaHCO3-饱和水溶液中的分配来进行粗产物分离，产物是在还原条件下(混合有1.5％抗坏血酸钠)的硅胶中用洗脱剂甲苯/丙酮/三乙胺(88/10/2v/v/v)进行纯化的。反应和后处理在严格的Ar保护下进行的。机械性地取下含纯[Cd]-BChl的蓝带(Rf～0.7)，随后如上所述的处理粗产物那样用乙醚/水萃取。所得纯化合物可在下列所有金属转移反应中使用。化合物8a的光谱特性列在表1中。实施例6：通过[Cd]-BChl和[Cd]-BChl-132-OH的金属转移反应制备Pd、Co、Ni、Cu、Zn、Cd和Mn的[M]-BChl和[M]-BChl-132-OH配合物
制备[Pd]-BChl衍生物(2a)的方法是：在严格的Ar保护条件下，将在实施例5中制备的[Cd]-BChl(8a)溶解在干燥丙酮中(A770＝5cm-1，～50μM)，以避免C-7和C-8位发生失控氧化反应；经大约15分钟后，加入PdCl2(Merck，p.a.)(约30mg/100ml溶液)，反应混合物回流40分钟。接着用分光镜检测反应并且随后发生分光现象(在产物生成后QX-带从～590nm移至～530nm处)。如实施例5中萃取[Cd]-BChl时所述的那样用乙醚/水来萃取以分离基本上纯的产物。若需要，还可以如纯化[Cd]-BChl时所述那样用硅胶板进一步纯化。Pd-BChl(2a)的光谱特性在表1中列出。
按照相似的方法，[Pd]-BChl-132-OH(2b)通过[Cd]-BChl-132-OH金属转移反应制备，而BChl(化合物3a、4a、5a、6a、9a)和BChl-132-OH(化合物3b、4b、5b、6b、9b)的Co、Ni、Cu、Zn和Mn的配合物是由[Cd]-BChl和BChl-132-OH分别与相应的金属氯化物反应得到的。无水金属氯化物加入的量分别是10倍摩尔过量(Cu：5a，5b；Zn：6a，6b)、100倍摩尔过量(Co：3a，3b)、或类似Pd反应中加至饱和(Ni：3a，3b；Mn：9a，9b)。在25℃下，除Pd和Ni(约回流30-40分钟)外，反应快速进行，接着用分光镜检测反应。由于残留氧的存在，使少量C7-C8氧化产物生成(λmax～680nm)，但这可以通过加入抗坏血酸钠(饱和的)来抑制。产物的分离和纯化都按照与实施例5中对[Cd]-BChl所述的相同的方法进行。表1中列出了产物的光谱吸收性、荧光、1H-NMR和FAB-MS特性。UV/VIS吸收光谱是用PerkinElmer Lamda 2分光光度计记录的，荧光发射强度是在装有450W氙灯的Spex Fluorolog 221上测定，校准光电倍增管的灵敏度和激发能。荧光检测中的最大光密度＜0.1cm-1，空激发至1a，1b-9a，9b的QX-吸收带。圆二色散光谱(CD)在DichrographCD6(Jobin Yvon)上测定。FAB-MS是在带有Cs-枪的CH7a/SS质谱仪(Varian MAT)或FiniganMAT 9000仪测定的，其中，液体表面的电离是在间羟基苄基醇基体中进行的。1H-NMR谱是在AM360型的360MHz-Bruker上测定的。标准溶液为吡啶-d5，化学位移是以相对于内标物-四甲基硅的ppm浓度表示的。消光系数是根据中心金属的ICP/ICPMS-原子吸收谱(AAS)得到的；在燃烧前，1a，1b-9a，9b样品中的具有定量的光密度的溶剂首先要在石英管中蒸发，随后样品用浓硝酸处理使其中的金属能被完全释放。
表1.1a，1b-9a，9ba的光谱特性
吸收值b 发射波长c χM/rid FAB-MS化合物离子
λmax[nm](ε[10-3M-1cm-1]) λmax[nm] 分子质量
BY BX QX QY
356(113) 383(62.7) 525(28.3) 750(67.5) 7591a(+)e
362(92.3) 389(49.3) 532(26.2) 754(56.4)
331(18.1) 383(15.4) 529(6.0) 753(38.1) 764(755)2a(+) [3.44] 992(106Pd)
334(14.0) 388(11.5) 535(5.6) 763(25.5)
336(34.8) 388(27.1) 531(8.9) 766(63.7) -f3a(-) [3.21]g 945(59Co)
355(40.6) 386(27.5) 562(10.2) 767(56.3)
335(45.7) 390(30.4) 531(11.4) 779(63.0) -f4a(-)h [3.18] 944(58Ni)
366(49.2) 391(30.3) 598(16.1) 771(71.8)
2.86
342(53.3) 390(42.9) 538(14.5) 771(64.1) -f5a(-) [3.06] 949(63Cu)
358(44.7) 395(31.9) 573(12.2) 780(56.1)
353(58.9) 389(39.7) 558(18.0) 762(67.7) 782(772)6a(+) [2.48] 950(64Zn)
364(52.4) 390(31.7) 579(16.5) 773(57.1)
357(73.3) 390(48.0) 573(20.8) 771(91.0) 788(778)7a(+) 1.82 910(24Mg)
374(57.7) 未溶解 612(16.9) 781(76.0)
359(80.3) 389(53.5) 575(22.3) 761(88.3) 778(774)8a(+) 1.78 1000(114Cd)
386(65.6) 391(44.1) 593(19.4) 773(69.6)
362(71.8) 392(43.0) 587(18.0) 770(76.7) -f9a(-) 1.89 941(55Mn)
373(64.4) 未溶解 601(16.4) 780(66.0)a132-OH色素(1b-9b)的吸收和荧光光谱与它们各自的132-H母体化合物发生重叠，但其中除了QX吸收谱带(530-600nm范围)系统性地蓝移了约5nm。质谱总是向较高数值移动16个质量单位。所有波长都以[nm]为单位。
b在DE(上限)和吡啶(下限，斜体的)中，在298K时测定的吸收系数和消光系数(通过AAS测得)。
c298K(77K)时，DE/石油醚/异丙醇(5∶5∶2 v/v/v)中的荧光值
d按Buchler，1975公开的方法，六倍配位作用(方括号中的数据是四倍配位时的离子半径值)时的电负性(χm)和有效离子半径(rM在10-14m)。
e在吡啶-d5中的1H-NMR值；(+)：单峰，(-)：由顺磁性中心金属造成的大范围的线展宽。
f无荧光(Spex fluorolog 221)
hC2H3CN中的尖锐1H-NMR信号。实施例7：[Pd]-BChl和环周围修饰了的BChl类化合物通过金属转移反应制备相应的173-乙酯
制备Pd-细菌脱镁叶绿甲酯一酸(Bacterio pheophorbide)a的乙酯化合物的方法是：将[Pd]-BChl溶解在氯仿(1mg/ml)中，并加入含5％(v/v)硫酸的等体积乙醇溶液。混合物在Ar气保护下回流90分钟。然后，在Ar气保护下，[Pd]-BPhe(100mg)在含有50ml硫酸的乙醇/氯仿(1∶1 v/v)中回流2.5小时，使其发生酯基转移反应。随后，反应混合物用乙醚稀释，用10％碳酸氢钠水溶液洗涤数次。将有机相蒸发至干。在氮气下，在硅胶上采用制备TLC(薄层色谱法)法纯化，洗脱剂为含8％丙酮的甲苯溶液，移动较缓慢的两个带即是本标题化合物(Rf＝0.75)。二者的VIS：λmax[nm](相对强度)329(0.45)；385(0.39)；527(0.13)；755(0.1)。1H-NMR[ppm]：9.25，8.80，8.70(分别为单峰，1H，5-、10-、20-H)；4.55(q，1H，18-H)；4.45(d，1H，17-H)；4.10(q，2H，8-CH2CH3)；3.85(单峰，3H，132-CO2CH3)；3.7(d，1H，7-H)；3.6(q，3H，173-CH2CH3)3.50，3.32(各为单峰，3H，2-，12-CH3)；3.30(m，1H，8-H)；3.06(s，3H，3-COCH3)；304(d，3H，7-CH3)；2.65(2H，171-H2)；2.45(2H，172-H2)；1.75(d，3H，18-CH3)；1.65(t，3H，8CH2CH3)；1.38(t，3H，173-CH2CH3)；0.10和1.90(s，2H，2NH)。Pd-C37H40N4O6的FAB-MS理论值：742.38(M+1)，实测值：742.2(M+1)。
BChl衍生物的其他酸稳定的金属配合物，例如Ni、Cu、Zn的乙酯和其他种类的酯化合物都可按照类似的方法制备。
实施例8：[Pd]-BChl-173-丝氨酰甲酯[Pd]-BChl-173-L-Ser-OMe([Pd]-BChl-Ser)的制备
用叶绿素酶丙酮粉末将实施例6中得到的[Pd]-BChl与盐酸L-丝氨酸甲酯(Sigma)进行酶促酯基转移反应，生成本标题产物，此方法如在EP 0584552描述的那样进行，在此，缩写[Pd]-BChl-Ser是一种通式I’所示的化合物，其中的R1’是通过丝氨酸羟基与COO-相连的丝氨酰甲酯基团。
采用同样的酶促酯基转移方法，可以制备本发明其他金属配合物[M]-BChl的相应的173-丝氨酰甲酯，以及具有其他丝氨酸衍生物的[M]-BChl-172-酯；例如N-三苯甲基-丝氨酸甲酯和N-苄酯基丝氨酰基丝氨酸甲酯；或具有苏氨酸衍生物的酯例如N-叔丁氧基羰基苏氨酸甲酯，如EP 0584552所述。实施例9：[Pd]-BChl-Ser的体外光毒性
9a.细菌和病毒
光毒性分析试验包括了三个独立步骤：含有光敏剂的细菌溶液的培养、照射、及光毒性评估。
将新鲜金色链霉菌在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中的悬浮液与指定浓度的光敏剂[Pd]-BChl-Ser或BChl-Ser在避光条件下培养1小时，随后，通过离心和再悬浮于PBS的方法将其中的色素洗去。将洗涤后的细菌悬浮液照射5分钟，其中使用靶水平的垂直发射为1000 lux/cm2的自动(self-built)氙灯作为光源，还使用了滤液器(叶绿素a在660nm时的O.D.＝10.00)。光动力损伤是通过测定存活细菌来评估的：将照射过的细菌悬浮液的样品(30μl)置于3ml的脑心浸液(BHI)液体细菌培养基中，在37℃和振摇下培养2小时。在λ＝660nm下通过浊度值来测定细菌密度。
每一试验包括(a)一个试验组(经完全处理的细菌)和三个空白对照组；(b)不含有光敏剂的被照射过的细菌；(c)经光敏剂处理的未照射细菌；(d)未处理细菌(100％存活)。
如附图1所示，[Pd]-BChl-Ser的光毒性作用是与光敏剂浓度(LD50～0.6μM)相关的剂量依赖性作用，在避光条件下进行的试验中没有出现该毒性作用。在相同条件下的对比试验中，BChl-Ser所得的试验结果类似，仅其LD50有略微但无关紧要的降低。
采用枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)和采用单纯疱疹病毒1(HSV-1)的悬浮液和感染细胞来重复上述试验，得到类似的光毒性试验结果(未给出)9b.黑素瘤细胞
试验采用了上述(iv)和(viii)部分所述的材料和方法。将单层M2R细胞与指定浓度的[Pd]-BChl-Ser一起培养1小时，随后的光动力处理方法如上所述。利用[3H]胸腺嘧啶掺入法来分析光毒性作用经处理细胞和适当的空白对照物的存活率，如附图2所示。未处理细胞的存活率为100％。
从附图2中可看出，[Pd]-BChl-Ser的光毒性作用是与光敏剂浓度(LD50～0.05μM)相关的剂量依赖性作用，但在避光条件下进行的对照试验中没有出现该毒性作用。
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