紫杉烷衍生物，其制备方法以及含有它们的制剂 本发明涉及紫杉烷衍生物，这些衍生物以10-脱乙酰基-浆果赤霉素Ⅲ、14-羟基-10-脱乙酰基-浆果赤霉素Ⅲ、19-羟基-10-脱乙酰基-浆果赤霉素Ⅲ以及它们在C13的酯为原料，通过将各10-脱乙酰基衍生物与肼、羟胺或其衍生物反应制得。该新化合物含有涉及C7和C9碳的吡唑啉基团。在异丝氨酸链的C3’和NH功能基化了的C13酯对最常见的人肿瘤细胞系具有细胞毒性，并且具有体内抗癌活性。本发明的化合物是有效的细胞毒性剂，对于对已知的抗增殖剂有抗药性的细胞特别有活性，并且是这些细胞的很强的细胞程序性死亡诱导剂，这种活性对于肿瘤地治疗是非常重要的。
本发明的衍生物具有如下结构通式(1)
其中R1和R2是氢原子或R1是氢而R2是羟基、烷氧基或酰氧基，或R1和R2合在一起是下式的环状碳酸酯或环状硫代碳酸酯R3是氢或羟基；R4是氢或式(2)的异丝氨酸残基其中R5是C1-C5烷基或C2-C5链烯基或芳基，R6具有与R5相同的含义或是叔丁氧基。
芳基优选苯基。烷氧基优选甲氧基或乙氧基。酰氧基优选乙酰氧基。
式(1)化合物以式(3)的紫杉烷为原料其中的R1、R2、R3和R4如上所定义，通过将其与肼在醇、优选甲醇中反应而制得。
反应生成在C7为α和β的两种非对映体，可将其通过分级结晶或优选通过色谱例如用硅胶柱进行分离，用乙酸乙酯和己烷的混合物作为洗脱剂。在与肼的反应中，以大约8∶2的比例优先生成β异构体。因此，这两种异构体形式也是本发明的目的之一。该反应不仅可应用于浆果赤霉素Ⅲ或14-β-羟基-浆果赤霉素Ⅲ或通过与光气或硫光气在吡啶中反应而制得的相应的碳酸酯或硫代碳酸酯(意大利专利申请MI95A000533和MI95001022)，还可应用于已经在C13酯化了的产物，例如紫杉醇、三尖杉宁碱、docetoxal以及它们的半合成类似物。将上述产物用肼在甲醇中处理脱除C10的乙酸酯后，用乙酸铜氧化生成10-脱氢衍生物(参见以上引用的意大利专利申请)，通过用肼处理将其直接转变成相应的吡唑啉衍生物。在各步骤中，转化的收率几乎是定量的。该吡唑啉衍生物可直接使用，并且就细胞毒性而言，其活性与原料产物相当或更高。可通过催化氢化将得到的吡唑啉衍生物转变成二氢衍生物或可将其在氮上衍生化。
以举例的方式给出了某些制备的化合物的细胞毒性。表Ⅰ-化合物2、4、5、6、紫杉醇和docetaxal对正常卵巢细胞系和对阿霉素抗性的细胞系的IC50
IC50(nM)
MDA细胞系 MCF7-ADRr细胞系紫杉醇 2.4 2600Docetaxel 0.8 700实施例2的化合物 3.1 600实施例4的化合物 1.2 264实施例5的化合物 1.4 190实施例6的化合物 2.1 102
本发明的化合物包括优选的化合物，该化合物与紫杉醇和docetaxel相比，在C13的链上进行了修饰，其中苯基异丝氨酸的苯基被异丁基、异丁烯基或丙烯基取代。
可将本发明的化合物掺入常规的药物制剂中，例如活性成分在聚氧乙烯基化的蓖麻油中的溶液(该溶液中尤其不能含有金属阳离子，因其对活性成分的稳定性和细胞毒性均有不利影响)或含有其它赋形剂如聚山梨醇酯或磷脂(可形成脂质体)的制剂。此外，还可将本发明的化合物与环糊精寡聚体、特别是β和γ环糊精共研磨(co-ground)或与可药用的酸成盐以便以水溶液的形式给药。用以下实施例说明本发明。实施例110-脱乙酰基-10-脱氢-浆果赤霉素Ⅲ2-α或β-吡唑啉的合成
向10-脱乙酰基-10脱氢浆果赤霉素Ⅲ(1g,1.845mmol)的15ml甲醇悬浮液中加入11.7ml 10％的肼溶液(31.5mmol)。将该悬浮液回流，10分之后变为透明。通过硅胶TLC观察10-脱乙酰基-10脱氢浆果赤霉素Ⅲ的消失监控反应(氯仿-乙腈2∶1)。2小时后，将反应混合物用水稀释，用盐酸(100ml)调制酸性并用乙酸乙酯萃取。将有机相用硫酸钠干燥后浓缩至干。将残余物通过硅胶柱色谱纯化(40g硅胶，洗脱剂己烷-乙酸乙酯1∶1)。得到687mgβ吡唑啉和208mgα吡唑啉，它们具有如下物理化学和波谱学特征：β吡唑啉：m.p.195℃,MS+538,1H-NMR(CDCl3)H25.80 d J8.6,H3 3.16 d J8.6,H5 5.04 dd J9.5/4.5,H6a2.43 ddd J13.5/9.5/4.5,H6 2.20 dd J13.5/13.5/4.5,H74.20 ddd J15.5/4.5/3.0,H13 4.69,H14 2.34m,H16 1.23s,H17 1.15s,H18 1.66s,H19 1.50s,H20a 4.47d,J8.6,H20b 4.33 d J8.6,NH 6.44 brs,OH 2.33 brs/i,87brs,Ac 2.26s,Bz8.14 brd 6.7.α吡唑啉：m.p.219-222℃,Ms 538-,1H-NMR(CDCl3)H26.04 d J6.0,H3 3.71 d J6.0,H5 4.93 brd J2.5,H6 2.06td J14.0/14.0/2.5,6′1.85m,H7 4.39dd J14.0/4.2,H134.79,brdd J10.0/6.5,14a 2.46 dd J15.0/10.0,14b1.88dd J15.0/6.5,H16 1.33s,H17 1.23s,H18 1.74brs,H19 1.70s,H2O 4.38s,NH6.34 brs,OH2.63/2.00,Ac2.36s,Bz 8.12 brd,/.6.实施例210-脱乙酰基-10-脱氢-吡唑啉的合成
将400mg 10-脱氢紫杉醇(0.49mmol)溶于10ml甲醇，然后加入10摩尔当量的NH2NH2溶液(通过将1ml纯的NH2NH2用10ml甲醇稀释制得)(4.9mmol,1.5ml)。2小时后，将反应混合物用水和3ml稀盐酸稀释，然后用乙酸乙酯萃取。将有机相逆流洗涤，然后用硫酸钠干燥并蒸发至干。将残余物通过10g硅胶进行色谱分离，用已烷/乙酸乙酯1∶1混合物洗脱，回收含有紫杉醇β吡唑啉的馏份。得到250mg具有如下特征的化合物：m.p.190℃,MS 823(M+NH4)+以及1H-NMR和13C-NMR与结构相符。实施例310-脱氢-13-(N-Boc-苯基异丝氨酰基)-10-脱乙酰基浆果赤霉素Ⅲ的合成
将1g docetaxel溶于50ml无水甲醇，然后在搅拌下加入3.71g细磨的乙酸铜；将反应混合物室温搅拌6小时。滤除未溶解的乙酸铜并将溶液用水稀释，用乙酸乙酯萃取。将有机相用氨的稀溶液逆流洗涤，然后干燥并浓缩至干。以85％的收率得到淡黄色固体，为10-脱氢-13-(N-Boc-苯基异丝氨酰基)-10-脱乙酰基浆果赤霉素Ⅲ。M+801。实施例413-(N-Boc-苯基异丝氨酰基)-10-脱氢-10-脱乙酰基浆果赤霉素Ⅲ吡唑啉的合成
将390mg 10-脱氢-13-(N-Boc-苯基异丝氨酰基)-10-脱乙酰基浆果赤霉素Ⅲ(0.49mmol)溶于10ml甲醇，然后加入10摩尔当量的NH2NH2溶液(通过将1ml纯的NH2NH2用10ml甲醇稀释制得)(4.9mmol,1.5ml)。2小时后，将反应混合物用水和3ml稀盐酸稀释，然后用乙酸乙酯萃取。将有机相逆流洗涤，然后用硫酸钠干燥并蒸发至干。将残余物通过10g硅胶进行色谱分离，用己烷/乙酸乙酯1∶1混合物洗脱，回收含有docetaxel β吡唑啉的馏份。得到280mg具有如下特征的化合物：m.p.190℃,MS 823(M+NH4)+以及1H-NMR和13C-NMR与结构相符。实施例513-(N-Boc-3’-异丁基)-异丝氨酰基-10-脱氢浆果赤霉素Ⅲ吡唑啉的合成
向100mg 13-(N-Boc-3’-异丁基)-异丝氨酰基-浆果赤霉素Ⅲ(0.12mmol)的2ml乙醇溶液中加入10摩尔当量新制备的10％肼的乙醇溶液(1.2mmol,0.38ml乙醇溶液)，然后以12小时的间隔分两次加入15摩尔当量肼。3天后，脱乙酰化反应结束，将混合物用水和2ml稀盐酸稀释，然后用乙酸乙酯萃取。将有机相用水洗至中性，然后干燥并浓缩至干。将残余物进行硅胶柱色谱，用乙酸乙酯/己烷4∶6混合物洗脱。得到67mg 13-(N-Boc-3’-异丁基)-异丝氨酰基-10-脱乙酰基-浆果赤霉素Ⅲ。
向57mg 13-(N-Boc-3’-异丁基)-异丝氨酰基-10-脱乙酰基-浆果赤霉素Ⅲ(0.07mmol)的3ml甲醇溶液中加入15摩尔当量的乙酸铜粉末，然后将反应混合物搅拌6小时。将反应混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取；将有机相用氨水洗涤，然后用水洗至中性并浓缩至干。将残余物溶于3ml甲醇，然后加入20摩尔当量10％肼的乙醇溶液。将反应混合物回流2小时，通过TLC监控反应，直至反应物消失。将反应混合物用水和稀盐酸稀释，然后用乙酸乙酯萃取。将有机相用水洗涤，干燥并浓缩至干；将残余物进行硅胶色谱，用己烷/乙酸乙酯1∶1洗脱。得到29.2mgβ吡唑啉和11mgα吡唑啉。实施例613-(N-Boc-苯基-异丝氨酰基)-1,14-碳酸酯-10-脱氢-10脱乙酰基-浆果赤霉素Ⅲ吡唑啉的合成
向100mg N-Boc-14-羟基紫杉醇1,14-碳酸酯(0.11mmol)的3ml甲醇溶液中加入10摩尔当量新制备的10％肼的乙醇溶液(1.12mmol,0.36ml乙醇溶液)。12小时后，再加入10摩尔当量(加入的总摩尔当量：20)。通过TLC(Ex-EtOAc 3∶7)监控反应。48小时后，将反应混合物用水和2ml稀盐酸稀释，用乙酸乙酯萃取(3次)，将有机相用盐水洗涤，干燥，过滤，蒸发并通过柱色谱分离(Ex-EtOAc 6∶4，然后是5∶5)得到30mg原料和40mg 10-脱乙酰基衍生物。
向40mg 10-脱乙酰基衍生物(0.05mmol)的3ml甲醇溶液中加入15摩尔当量的乙酸铜粉末(0.69mmo,138mg)。通过TLC(Ex-EtOAc 3∶7)监控反应，反应持续24小时。将反应混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取(3次)：将有机相依次用NH3∶H2O 1∶5溶液(2次)和盐水洗涤。将有机相蒸发，以几乎定量的收率得到淡黄色固体。
将用乙酸铜氧化的粗产物溶于2ml甲醇，然后加入20摩尔当量10％肼的乙醇溶液(0.8mmol,0.25ml乙醇溶液)。将反应混合物回流2小时，通过TLC(Ex-EtOAc 3∶7)监控反应，然后将反应混合物用水稀释，加入2-3ml稀盐酸并用乙酸乙酯萃取(3次)。将有机相用盐水洗涤，干燥，混合，过滤，蒸发并用Ex-EtOAc 6∶4/5∶5通过柱色谱分离，得到10.5mg吡唑啉(α和β的混合物)。