制备头孢菌素衍生物的酶促方法 本发明涉及3-头孢菌素C衍生物的制备方法，本品用于制备β-内酰胺抗生素。具体地，本发明涉及制备3-乙酰氧基-甲基-7-氨基-头孢-3-烯-羧酸的3-硫醇化的衍生物的制备方法。
背景技术
所有用于治疗用途的头孢菌素C都是半合成的，且是通过对从产黄支顶孢菌(Acremonium chrysogenum)的发酵液得到的物质中的基本的β-内酰胺结构进行修饰而制备，或对用不同前体从产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的发酵液得到地产物进行化学转化后得到。
典型地，通过去除β-内酰胺环侧面的氨基脂肪链，将头孢菌素C[3-乙酰氧基甲基-7-(D-5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-头孢-3-烯-4-羧酸]转化成3-乙酰氧基甲基-7-氨基-头孢-3-烯-羧酸，通常称为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。将7-ACA纯化并结晶，然后用作为随后在7-和3-位进行结构修饰的起始物质。7-ACA是合成许多当前在生物制药工业中有价值的重的半合成头孢菌素抗生素所用的基础建构单元。
US 3,278,531；US 3,516,997；US 3,647,788；GB 1,400,804；GB 1,565,053和GB 1,566,515已公开了3-硫代甲基头孢菌素C衍生物。WO-A-9535020和EP 0846695记载了3’-硫代甲基戊二酰7-ACA衍生物的一些例子。
7-ACA是应用最广泛的与杂环的硫醇反应的中间体，因为它可以通过化学或酶方法以工业规模得到。在一些专利中已公开了这一点，包括US 3,502,665；US 3,954,745；US 3,516,997；US 3,979,383；US4,115,645；US 4,317,907；US 5,387,679；JP 55,139,327；EP 0167651和WO-A-9302085。
US 5,387,679记载了7-氨基头孢烷酸与2-巯基-5-甲基-1，3，4-噻二唑(MMTD)在有碳酸氢钠丙酮水溶液存在的条件下，在pH6-7的反应。达到约60-65％的收率。
在US 4,317,907中，当使用醋酸或硝基甲醇作为溶剂时，在有三氟化硼或三氟化硼乙醚合物的条件下，在无水介质中的上述反应的收率增加到约86％。然而纯度低，最高为80％，由于它含有未反应的7-ACA和降解产物。在WO-A-9302085中，在有二烷基碳酸酯三氟化物络合物和脂肪酸存在的条件下使用二烷基碳酸酯，收率增加到最大值为89％。然而，WO-A-9302085显示出与使用有毒和非常昂贵的气体例如BF3及处理含有硼化物和氟化硼(fluoroboride)的排放废物相关的问题。
头孢菌素C的脱酰作用，即去除7’-侧链，通常以化学方式进行，例如在有乙腈的条件下使用亚硝酰氯的甲酸溶液(US 3,367,933)。另一种脱酰方法包括保护氨基戊酸链的羧基基团，与五氯化磷在-55℃反应，随后在低温用水和甲醇的混合物水解(BE 718,824)。这些已知的方法通常必须在低温下进行，并需要使用昂贵而有毒的溶剂或试剂，所以它们会产生严重的环境问题。另外，由于β-内酰胺核的化学不稳定性和环的3与7位基团的反应性，必须采用特定的反应条件，使工业规模进行此方法变得复杂。
为克服制备7-ACA的化学途径的缺点，已有关于头孢菌素C的另外的酶裂解的记载。能够通过使用特定的头孢菌素酰基转移酶直接一步去除头孢菌素C侧面的7-氨基脂肪侧链(FR 2,241,557；US4,774,179；EP 283,248；WO-A-9512680；WO-A-9616174)。然而如专利US 5,296,358所述，这些方法经常不能重复，并具有低收率和长的反应时间的特点。那时未曾报道此技术(将头孢菌素C一步转化成7-ACA)的工业应用(Parmar et al，Crit.Rev.Biotechnol.18，1，1998)。
另一方面，从工业角度看，通过两个酶步骤将头孢菌素C转化成7-ACA是重要的。第一阶段包括使用不同来源的D-氨基酸氧化酶(E.C.1.4.3.3，下文表示为DAAO)(变异三角酵母(Trigonopsisvariabilis)，GB 1,272,769；纤细红酵母(Rhodotorula gracilis)，EP 0,517,200；或茄病镰孢(Fusarium solari)M-0718，EP 0,364,275)。在有分子氧的条件下，DAAO使头孢菌素C侧面的D-5-酰氨基-羧戊酰基链氧化，产生7β-(5-羧基-5-氧戊-酰氨基)-头孢-3-烯-羧酸(或α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸，下文表示为α-酮己二酰-7-ACA)和过氧化氢，它通过化学途径使α-酮己二酰-7-ACA去羧基成为7β-(4-羧基丁酰氨基)-头孢-3-烯-4-羧酸(或戊二酰-7-氨基头孢烷酸，下文称为GL-7-ACA)。
在第二阶段，使用针对GL-7-ACA的特定的酰基转移酶，戊二酰-7-ACA酰基转移酶(E.C.3.5.1.3)，例如在大肠杆菌E.coli中过量表达的假单胞菌属类微生物的酶(US 3,960,662，EP 0496993)，使GL-7-ACA脱酰基成为7-ACA。
此制备7-ACA的两步酶方法已经以工业规模被使用(Conlon etal.Biotechnol.Bioeng.46，510，1995)。
EP 0846695公开了制备3’-杂环硫代甲基头孢烷酸衍生物的对环境有益的另一种方法。在水性介质中戊二酰-7-ACA中3-位的化学亲核置换后采用戊二酰-7-ACA酰基转移酶对3’-戊二酰-7-ACA-衍生物进行酶转化。衍生物的数量约为65％，且不对环境产生影响。此过程可以定义为酶-化学-酶(ECE)过程，从溶解的头孢菌素C的生物转化过程分离产生GL-7-ACA后，使GL-7-ACA与杂环硫醇反应，并最终用GL-7-ACA酰基转移酶进行3-杂环硫代衍生物的酶反应。如WO-A-9535020所述，此方法的问题是需要分离具有高水溶性的GL-7-ACA，使此方法具有技术困难并且昂贵。
另一个问题是酶仅可以重复使用少数周期。实际上记载的具有5-巯三唑和MMTD的周期不超过3个，结晶后MMTD的剩余量是2.8mg/ml。其它2个作为示例的硫醇类由于大量硫醇剩余在溶液中而仅使用一个周期。5-巯基-1-甲基四唑(MMTZ)或2，5-二氢-3-巯基-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪(TTZ)属于这种情况，它们在水中溶解度非常高，因而不能通过降低pH而去除。也记载了在头孢唑啉的酶合成中，MMTD的硫醇对从大肠杆菌CFC-04017得到的青霉素G酰胺酶的毒性作用(Wonet al，App.Biochem.Biotech.69，1，1998)。为克服此抑制作用，MMTD/7-ACA摩尔比减少到1.2∶1以延长酶的寿命。此低摩尔比降低了3-硫代衍生物的收率，避免使用其他已公开的3-被修饰的头孢菌素的化学-酶合成方法，在此建议使用D-氨基酸氧化酶-戊二酰-7-ACA酰基转移酶和与杂环硫醇的化学反应进行酶-酶-化学方法(EEC)(Jistiz et al.，J.Org.Chem.62，9099，1997)。
因此需要改进的3-头孢菌素C衍生物的制备方法。
发明概述
根据本发明，提供制备3-硫醇化的7-氨基头孢烷酸衍生物的酶反应方法，包括以下步骤：
将式I的3-硫醇化的头孢菌素C酶法转化成：
式II的3-硫醇化的-戊二酰-7-ACA，
并通过酶法使式II的化合物转化成式III的3-硫醇化的-7-ACA：
其中R是含有至少一个氮原子的杂环基团，且R1和R2都是H原子或其一是H原子，另一是酰基供体。
优选，通过以下步骤，式I的3-硫醇化的头孢菌素C转化成式II的3-硫醇化的-戊二酰-7-ACA：
在有分子氧的条件下使式I化合物与固定的D-氨基酸氧化酶反应；
从水性反应混合物中分离载体中的酶；并
加入过氧化氢使3-硫醇化的-α-酮己二酰头孢烷酸转化成式II化合物。
在本发明的一个实施方案中，式I化合物与固定的D-氨基酸氧化酶反应，反应条件为约2巴绝对压力，pH 6.0-8.0，温度20-30℃，反应时间0.5-3小时。
优选此方法包括用浓盐溶液洗涤载体中的酶，并向由此产生的溶液中加入过氧化氢-优选其数量等于30-50ppm。
最优选此方法包括从溶液中去除过量的过氧化氢的步骤，优选通过向溶液中加入催化剂而完成。
在本发明的一个实施方案中通过向溶液中加入过氧化氢酶去除过量的过氧化氢。优选通过使式II化合物与固定的戊二酰-7-ACA酰基转移酶接触，使式II化合物转化成式III化合物。最优选从式II化合物生成式III化合物的反应条件为：环境压力下，pH 6.0-8.5和20-35℃，在惰性气体中进行0.5-3小时。
在本发明的一个实施方案中，通过酸化反应介质使式III化合物沉淀，并随后洗涤和干燥这样形成的沉淀。
在本发明的另一个实施方案中，用适宜的交联剂将酶固定在适宜的固态载体上。优选酶为尺寸适于作为生物催化剂的晶体形式。最优选在保持酶分散在底物水溶液中的条件下进行酶处理。
在本发明的一个实施方案中，所述或每个酶处理在色谱柱上进行。
优选此方法包括为重复使用而回收酶的步骤。
在本发明的一个实施方案中，在酸性pH下进行式III化合物的结晶。
本发明的一个方面提供本发明的方法，其中式I的3-硫醇化的头孢菌素C形成式III的3-硫醇化的-7-ACA的酶转化在一步进行。
在本发明的一个实施方案中，式I化合物是固体或其无毒盐的形式。无毒的盐可以包括在头孢菌素C结晶中使用的对人无毒的阳离子，例如锌盐。
本发明也提供了制备头孢菌素C抗生素及其衍生物的方法，包括生成式III化合物和随后的酶反应。优选此抗生素选自以下物质中的任何一种或多种：头孢唑啉、头孢西酮、头孢哌酮、头孢孟多、头孢三嗪、头孢替安或头孢曲松。
在本发明的一个实施方案中，制备3-硫醇化的7-氨基头孢烷酸衍生物的酶方法包括以下步骤：
使头孢菌素C与具有通式IV的硫醇化的合物反应形成式I化合物
R-SH (IV)
其中R是含有至少一个氮原子的杂环，
然后，形成式I化合物后去除过量的式IV的硫醇。
优选通过吸附在阴离子交换树脂上去除过量的硫醇。最优选阴离子交换树脂是具有交联的丙烯酸共聚物结构的多微孔树脂。优选阴离子交换树脂含有8％交联，其中含有功能性的硫代烷基苯甲铵基团。此树脂可以采用盐酸盐、氢氧化物、磷酸盐或醋酸盐循环。
在本发明的一个实施方案中通过结晶去除过量的硫醇。优选在酸性pH下进行结晶。最优选通过结晶，然后吸附在阴离子交换树脂上去除过量的硫醇。
在本发明的一个实施方案中，头孢菌素C存在于水性介质中。
在本发明的另一个实施方案中，头孢菌素C是头孢菌素C浓溶液的形式，它从固体头孢菌素C得到，或从直接的或经过纯化的头孢菌素C发酵液得到。头孢菌素C可以为头孢菌素C浓溶液或浓缩的头孢菌素C发酵液。
在本发明的一个实施方案中，在pH 5.5-8.0，温度60℃-80℃的条件下反应1-12小时进行反应过程。优选反应在pH约6.0和温度约65℃进行反应。最优选硫醇化的合物的浓度为1-5mol/mol头孢菌素C。
R可以是含有至少一个氮原子及可选硫或氧原子的杂环基。优选R是选自以下任何一个或多个基团的杂环基：噻吩基、二唑基、四唑基、噻唑基、三嗪基、噁唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基，或它们的任何衍生物，优选5-甲基-1，3.4-噻二唑-2-基、1-甲基-1H-四唑-5-基或1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
在本发明的一个实施方案中，式I化合物是固体或其无毒盐的形式。
本发明提供了下式化合物：
其中R是通过本发明的方法得到的含有至少一个氮原子的杂环基团。
本发明还提供了下式化合物：
其中，在式I中，R是5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基。
本发明提供了具有下式的化合物：
其中，在I中，R是1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
本发明也提供了制备头孢菌素C抗生素及其衍生物的方法，包括生成上文定义的式I化合物，并随后对式I化合物进行酶反应。优选抗生素选自以下的任意一或多种：头孢唑啉、头孢西酮、头孢哌酮、头孢孟多、头孢三嗪、头孢替安和头孢曲松。
发明详述
我们已发现化学-酶-酶处理(CEE)提供了一种改进的制备3-头孢菌素C衍生物的方法，其中溶液中的头孢菌素C在酶切除7-位侧链前首先与杂环硫醇反应。
本发明的此方法可以如下表示：
第一阶段：在有氧气的条件下固定D-氨基酸氧化酶
第二阶段：固定的戊二酰-7-ACA-酰基转移酶
其中R是含有至少一个氮原子且有或无硫或氧原子的杂环，例如噻吩基、二唑基、三嗪基、三唑基、四唑基、噻唑基、噻二唑基、噻三唑基、噁唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基或在上述杂环结构的任何可能取代的位置取代的衍生物。
化合物I向3-硫醇化的戊二酰-7-ACA(化合物II)的酶转化在pH约为6.5-8.0的水溶液中进行，优选在pH 7.0。这避免了头孢烷酸化合物在高于8的pH水平不稳定性增加的问题。反应温度可以为15-35℃，通常固定在20℃。3-硫醇化的头孢菌素C衍生物的浓度可以在35-150mM之间变化。
分子氧作为氧化脱氨基作用的共底物。在适宜的机械搅拌下，它通过底部进气口以0.01-1vol/vol液体/分钟的流速喷射到反应溶液中，优选0.1vvm。对本领域的技术人员显而易见的是搅拌速度可以根据宽范围的设计参数和反应特性而改变。通常搅拌速度在20-500rpm范围内。生物反应器的设计优选为包含固定的结晶状酶的渗滤柱，在其中难于得到足够的氧传递，因此会减少3-硫醇化的戊二酰-7-ACA的最终收率。
根据操作条件，完成转化所需的时间大约为0.5-3小时，但通常为约1小时。
式I化合物向式II化合物的转化率高，通常为约98％，成品收率为95％。在反应结束时，反应溶液还含有一些未降解的式IV中间体，用外部的过氧化氢将其转化成式II化合物。另外，一些式II化合物可以保持结合于固定有酶的树脂上。
为降低这些潜在损失的影响，在过压下将反应器中的液体加入储液槽中，用100mM pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤酶。可以使用其他具有相似性质的缓冲溶液。缓冲洗涤液与反应溶液合并，然后用过氧化氢将此混合物滴定，在25℃经30-50分钟滴定，溶液中过氧化氢的终浓度为30-50ppm，优选35ppm，30分钟。
在进入下一步骤之前用适当的酶-例如过氧化氢酶，适当的还原剂-例如丙酮酸、碱性亚硫酸盐或任何其他适当的溶解的或固定形态的催化剂去除过量的H2O2。本发明优选用酶去除H2O2以保持终产品的质量和纯度。
通过以上处理，最终化合物(II)的收率为97-98％，比EP 0496993记载的将未修饰的头孢菌素C向戊二酰-7-ACA的转化高3％。
在转入装有适宜的湿的固定化的或结晶的戊二酰-7-ACA酰基转移酶制剂的第二生物反应器之前，用浓的有机或无机碱-例如氨水将H2O2滴定后的终溶液调整到pH约7.5-8.5，优选pH 8.0。商业可得的制剂，例如可以从Roche Molecular Biochemicals得到的制剂适于本发明的目的。用自动滴定仪向反应中滴加与上述相同的有机或无机碱使pH固定在约pH 8.0。操作温度可以为约15℃-25℃，优选20℃。根据操作条件，转化时间为0.5-2小时，但通常为约1小时。为避免酶制剂的微生物污染，伴随常规的搅拌，通过底部进气口以约0.01vol/vol/min的速度输入氮气流。
当测定发现3-硫醇化的戊二酰-7-ACA衍生物的转化不低于97％，或铵的消耗速率降低到初始消耗速率的2％时反应即完成，然后将溶液过滤，优选用100mM pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤固定有戊二酰-7-ACA酰基转移酶的树脂。
经过两个酶阶段后3-硫醇化的-7-ACA(化合物III)的收率为约94％。然后根据终产物的等电点，在酸性pH 1.7-约5.5条件下，用无机酸-例如盐酸、硫酸或磷酸，或使用这些酸中的任一种与适宜的有机溶剂以不同比例的组合，通过结晶将后一化合物从最终溶液中回收。
本发明的方法是新的并提供了好的总产品收率、更佳的质量(以颜色和纯度而言)、容易的分离、流程的连续操作和重复利用酶，而避免化学反应后酶因剩余杂环硫醇而中毒。
由于溶液中头孢菌素C首先与杂环硫醇反应，本发明的方法表现出优于已知的得到3-杂环硫醇化的-7-氨基头孢烷酸的三阶段法的意外的进步。对于直接得自发酵液的头孢菌素C的溶液，可以方便地做到这点。此方法因而避免了需要将头孢菌素C以金属盐方式结晶，并同时不再需要使用和回收有机溶剂。而且它降低了头孢菌素C整个回收过程的收率损失。因为在溶液中3取代的衍生物比母体头孢菌素C更稳定，整个发酵过程的收率进一步有效地增加。
高选择性地去除过量的硫醇允许制备非常高纯度的式I化合物，并且出现的杂环硫醇浓度非常低(＜0.2mg/ml)。此方法有一些重要的优势。它允许式I化合物作为酶处理的底物而不使酶中毒。结果酶可以重复使用。另外本方法不需要使用毒性溶剂，也不需要分离中间体因而提供了连续的流程。
采用强阴离子交换树脂Amberlite IRA-400(Rohm and Haas制造)的高选择性的去除步骤，使得到的式I化合物中有非常低水平的杂环硫醇(＜0.2mg/ml)。
通过加入形成水溶性盐的碱性化合物，例如碱性金属氢氧化物、氢氧化铵或优选碱性金属碳酸盐或碳酸氢盐，在水中溶解杂环硫醇和任何无毒的头孢菌素C盐，3’位亲核取代反应在水性介质中进行。一般地，除如上制备的盐外，可以在本发明的方法中使用头孢菌素C的和杂环硫醇的任何商业可得的盐而不改变本方法的基本原理。
在分离的或共同的反应容器中溶解杂环硫醇和头孢菌素C后，将两种底物混合在同一反应器中，在此之前或之后在pH 5.5-8.0将溶液加热到约60℃-80℃。
一旦反应开始，优选将温度和pH分别保持在约65℃和6.0，进行约1小时-4小时。
对于反应收率而言，杂环硫醇/头孢菌素C摩尔比是一个重要的变量，必须根据每种所用的杂环硫醇优化此摩尔比。摩尔比在1.0-4.0之间，优选摩尔比约为4。
发现保持这些摩尔比时，头孢菌素C保持相当稳定，仅有低的β-内酰胺环降解，而没有硫醇的头孢菌素C溶液，在80℃在40分钟内完全降解。
当头孢菌素C的水平低于初始量的2％时，将反应混合物冷却到约2℃-10℃，经过或不经过强无机酸-例如氢卤酸或含氧酸酸化到pH3.0-5.5，优选约5.2。
在一些情况下此酸化步骤导致杂环硫醇结晶，并有可能重复用于新反应。
将有或无酸化步骤的反应后产生的溶液，随后进行色谱法纯化。可以以工业规模使用不同的树脂和各种类型的色谱。
对一些树脂进行试验，基于吸附、亲水-疏水相互作用、阳离子交换和阴离子交换将其分为四类树脂。所有受试的以吸附为基础的树脂(Amberlite XAD-761，Amberlite 7HP，Amberlite 16 HP和AmberliteXAD-4)产生相似的结果，洗脱液含有22％-38％杂环硫醇。疏水-吸水相互作用树脂Sephadex LH-20不保留任何硫醇(＜5％)。用阳离子交换树脂AmberliteIRC-50、IR-120和IR-200发现了类似的情况。然而，发现阴离子交换树脂对杂环硫醇有最好的结合能力，对于弱阴离子交换树脂，范围为57-60％(Amberlite IRA-93)。
发现具有8％交联的含有三烷基苯甲基铵官能团的强多微孔(凝胶类型I)阴离子(碱性)交换树脂Amberlite IRA-400对杂环硫醇产生最高结合能力(92-98％)，而对3’-位杂环硫代甲基头孢菌素C衍生物有低的结合能力(2-15％，对于第一循环少于15％，对于以后的循环少于5％)。
这些多微孔树脂具有某些优势。它们不易碎，在操作中不需要当心，并有较高的负载容量。由于它们没有离散的孔，溶液离子通过粒子扩散而与交换位点相互作用。所述树脂的总交换能力约为1,4meq/ml。
意外地发现Amberlite IRA-400对头孢菌素C的3-杂环硫代甲基衍生物比对戊二酰-7-ACA和7-ACA的相同的衍生物有更小的结合能力。实际上用MMTD制备的戊二酰-7-ACA的3-杂环硫代甲基衍生物以76.3％的水平与柱结合。对用MMTD制备的7-ACA的3-杂环硫代甲基衍生物发现了同样的结果，它以92.7％的水平与柱结合。AmberliteIRA-400与这3种相关的β-内酰胺化合物的意外的表现看来是由于与戊二酰-7-ACA和7-ACA相比，头孢菌素C侧链5位出现可电离的氨基。
用本发明的方法去除杂环硫醇在工业规模方面具有特别的优势，因为可以将柱的洗脱液用于酶反应过程中，而无须分离被修饰的头孢菌素C，这在头孢菌素中间体领域代表一种新概念，其中杂质与柱结合，而β-内酰胺衍生物能简单地被水洗脱。
一旦将β-内酰胺衍生物洗脱(少于5％保持结合)，通常用1.5N的强无机酸使柱再生，例如含有可变量有机溶剂-优选10-20％乙腈的卤化氢。当硫醇在洗脱液中的浓度高于0.2mg/ml时，可以用3N HCl和40％乙腈进行强再生。或者可以依次用NaOH和HCl溶液进行再生。
当洗脱杂环硫醇后，将硫醇浓缩并再使用。在下一循环之前用去离子水清洗柱以去除过量的再生剂。第一柱床体积的清洗应使用再生所用的流速。其余以吸附流速进行。
已发现与未修饰的头孢菌素C相比，3-硫醇化的衍生物(TXC)是出乎意料的好的底物。本发明的方法因而提供了一种改进的和更经济的制备头孢菌素C衍生物的方法。
本发明方法的第二重要方面是以可重复利用的形式使用酶，或固定在固体载体上，或为大的稳定化结晶的形式。这后一需求对于产生以工业规模进行的方法是重要的。
本发明另一重要优势是在去除和回收过量的硫醇后易于将化学溶液转移到第一酶反应器中，并从此进入第二酶反应器。这使此方法能以单一液流连续进行，从头孢菌素C浓缩物或制备的分批的溶液形成3-硫醇化的-7-ACA衍生物，它与未改性的7-ACA相比易于结晶。
以下实施例意在说明本发明的一般原则而非对其限制。
实施例1-5说明从头孢菌素C生成式I的3-硫醇化的-7-ACA衍生物的制备方法。
实施例6-10说明通过形成式I的3-硫醇化的-戊二酰-7-ACA衍生物而制备式III的3-硫醇化的-7-ACA衍生物的方法。
实施例1：制备7-β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基硫代甲基)-3-头孢烯-4-羧酸(TDC)
向装有600ml去离子水的带玻璃线的反应器中加入31.73g(0.24摩尔)2-巯基-5-甲基-1，3，4-噻二唑(MMTD)，然后将反应器搅拌加热到约65℃。加入10g碳酸钠将混合物的pH调节到约6.0。
在一分离的有玻璃线的烧瓶中，在200mL水中溶解33.23g头孢菌素C的钠盐(75％游离酸，0.06摩尔)制备头孢菌素C钠盐的浓溶液(HPLC测定纯度98％)。当溶解MMTD后，加入头孢菌素C的浓溶液并在约65℃搅拌混合物240分钟，控制反应动力学直至头孢菌素C的浓度低于2％。发现以下反应动力学参数：时间(分钟)头孢菌素C(摩尔)TDC(摩尔)MMTD(摩尔)0 0.06 0.00 0.24120 0.01 0.039 0.20240 0.0012 0.042 0.195
然后将反应混合物冷却到约4℃，此时过量的MMTD开始结晶。伴随搅拌(150rpm)，用37％盐酸将pH酸化到pH 5.2然后缓慢搅拌(50rpm)60分钟使结晶完全。
过滤沉淀的MMTD并在35℃真空干燥。回收得到23g MMTD(HPLC测定纯度99％)，回收率约为95％。
滤液中(825ml)含有0.042摩尔TDC和0.016摩尔MMTD，用3M氨水将其调节到pH 7.25，加载到盐酸盐循环的Amberlite IRA-400柱上(柱床体积等于180ml)上，用去离子水以20ml/min的流速覆盖。加载后用去离子水(约100ml)洗脱，直至加载的TDC以94％的HPLC纯度达到97％的回收率。洗脱液的pH约为5.4，用3M氨水中和到7.0。剩余的MMTD为0.0009摩尔(＜0.2mg/ml)，少于降低pH结晶后剩余MMTD的6％。有此低水平MMTD(＜化学反应后生成MMTD的1％)，能进行TDC的酶反应。
通常用含10％乙腈的1.5M盐酸1L将柱再生，并用2升去离子水清洗去除过量的再生剂。当需要时(MMTD＞0.2mg/ml)，可以用有40％乙腈的3M盐酸1L对树脂进行强再生。
为进一步表征pH 5.0的TDC溶液，将其加载到Amberlite XAD-2吸附柱上，用水洗涤柱。水洗后，用水洗脱树脂，按每份25ml分级收集。将HPLC测定含98.5％TDC的流份低温干燥，然后进行分析：
对产物C17H20N5O6S3·2H2O(TDC)的元素分析，计算值：C 37.42；H 4.43；N 12.84；S 17.63；实测值：37.27；H 4.3；N 13.11；S 17.51。
1H-NMR(DMSO/DCl)(δppm)：1.57(m，2H，-CH2-)；1.63(m，2H，-CH2-)；2.18(m，2H，-CH2-)；2.64(s，3H，CH3)；3.55，373(J＝18Hz，2H，-CH2-)；3.83(t，1H，-CH-)；4.18-4.46(d，J＝13Hz，2H，-CH2-)；5.02(d，J＝3Hz，1H，C-6)；5.6(d，J＝3Hz，1H，C-7)。
实施例2对比实施例：用不同的柱制备7-β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基硫代甲基)-3-头孢烯-4-羧酸
如实施例1所述制备TDC衍生物并将含此物质的滤液加载到不同类的树脂上。
在柱使用的第一循环中用100ml水洗脱得到以下数据： 树脂 类型洗脱的TDC(％)洗脱的MMTD(％) Amberlite IRA-400 Diaion SA10A Amberlite IRA93 强阴离子交换树脂 强阴离子交换树脂 弱阴离子交换树脂 86 67 87 2 15 45 Amberlite IRC-50 Amberlite IRC-200 弱阳离子交换树脂 强阳离子交换树脂 93 73 92 98 Amberlite XAD-761 Amberlite XAD-7HP Amberlite XAD-16HP Amberlite XAD-4 Amberlite XAD-1180 吸附树脂 吸附树脂 吸附树脂 吸附树脂 吸附树脂 86 77 75 68 78 22 23 35 25 38 Sephadex LH-20 疏水-亲水性树脂 98.5 95
Amberlite IRA-400得到最好的结果。TDC的洗脱率高，而MMTD的洗脱率低。用其他阴离子交换柱也能洗脱更大量的MMTD。其他阴离子交换树脂显示与硫醇和TDC的高的双重结合。
实施例3：TDC对Amberlite IRA-400的特异性
按实施例1用戊二酰-7-ACA和7-ACA作为起始物质制备戊二酰-7-ACA衍生物(TDG)和7-ACA衍生物(7-TDA)。从Amberlite IRA-400的滤液得到以下数据：树脂洗脱液中的化合物洗脱的TDG或TDA(％)洗脱的MMTD(％)AmberliteIRA-400 TDG 23.7 3.0 TDA* 7.3 1.4
*在pH 7.8以避免TDA在柱中的沉淀。
与TDC相反，TDG和TDA显示结合保留在Amberlite IRA-400中，与MMTD相同。
实施例4：制备7-β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TZC)
向装有600ml去离子水的带玻璃线的反应器中加入28.16g(0.24摩尔)5-巯基-1-甲基四唑(MMTZ)，然后将反应器搅拌加热到约70℃。加入约12g碳酸钠将混合物的pH调节到约5.7-5.8。
在一分离的有玻璃线的烧瓶中，在200mL水中溶解33.23g头孢菌素C的钠盐(75％游离酸，0.06摩尔，HPLC测定纯度98％)制备头孢菌素C钠盐的浓溶液。当溶解MMTZ后，加入头孢菌素C的浓溶液并在约70℃搅拌混合物120分钟，控制反应的进行直至头孢菌素C的浓度低于3％。时间(分钟)头孢菌素C(摩尔)TZC(摩尔)MMTZ(摩尔) 0 0.06 0 0.24 120 0.0017 0.040 0.19
将反应混合物冷却到约4℃，但即使pH降低时，过量的MMTZ也不开始结晶。用3M氨水将含有衍生自MMTZ的0.04摩尔TZC衍生物和0.19摩尔MMTZ的溶液调节到pH 7.25，并加载到采用盐酸盐循环的Amberlite IRA-400柱上(柱床体积等于150ml)，用去离子水以20ml/min的流速覆盖。首次经过柱后，剩余的MMTZ高于初始量(0.032摩尔)的13％。
由于此原因，在上述相同的条件下将洗脱液加载到另一AmberliteIRA-400(柱床体积等于60ml)柱上以降低MMTZ的水平。
加载后用去离子水(约90ml)洗脱，直至加载的TZC以87％的HPLC纯度达到97％的回收率。流出液的pH约为5.4，用3M氨水中和到7.0。剩余的MMTZ浓度为0.0013摩尔，少于化学反应后得到MMTZ的1％。有如此低水平的MMTZ，能够进行衍生物的酶反应而不使酶中毒。
用含10％乙腈的1.5M盐酸1L将柱再生，并用2升去离子水清洗去除过量的再生剂。
实施例5：制备7-β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TTC)
向装有600ml去离子水的带玻璃线的反应器中加入37.96g(0.24摩尔)2，5-二氢-3-巯基-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪(以下称为TTZ)，然后将反应器搅拌加热到75℃。加入约12g碳酸钠将混合物的pH调节到约6.7。
在一分离的有玻璃线的烧瓶中，在200mL水中溶解33.23g头孢菌素C的钠盐(75％游离酸，0.06摩尔，HPLC测定纯度98％)制备头孢菌素C钠盐的浓溶液。当TTZ溶解后，加入头孢菌素C的浓溶液并在约75℃搅拌混合物75分钟，控制反应的动力学直至头孢菌素C的浓度低于2％。时间(分钟)头孢菌素C(摩尔)TTC(摩尔)TTZ(摩尔) 0 0.06 0 0.24 75 0.0011 0.036 0.19
将反应混合物冷却到约4℃，但即使pH降低时，过量的TTZ也不开始结晶。用3M氨水将含有0.036摩尔TTC和0.19摩尔TTZ的溶液调节到pH 7.25，并加载到采用盐酸盐循环的Amberlite IRA-400柱上(柱床体积等于209ml)，用去离子水以20ml/min的流速覆盖。首次经过柱后，剩余的TTZ为0.015摩尔。
由于此原因，在上述相同的条件下将洗脱液加载到另一AmberliteIRA-400(柱床体积相同)柱上以降低TTZ的水平。
加载后用去离子水(约120ml)洗脱，直至加载的TTC以90％的HPLC纯度达到60％的回收率。流出液的pH约为5.4，用3M氨水中和到7.0。剩余的TTZ浓度为0.00096摩尔，少于化学反应后得到TTZ的1％。有如此低水平的TTZ，能够进行衍生物的酶反应而不使酶中毒。
用含10％乙腈的1.5M盐酸1L将柱再生，并用2升去离子水清洗去除过量的再生剂。
实施例6：合成7-氨基-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TDA)
从实施例1的强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400得到的滤液(925ml)，含有0.041摩尔7β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-头孢烷酸，以下称为TDC，有94.4％纯度(HPLC)及浓度低于0.2mg/mL的2-巯基-5-甲基-1，3，4-噻二唑(MMTD)，用3M氨水将其调节至pH7.0。
将TDC溶液输入1.5升搅拌反应器中，其中有82.5g(30.3Roche’s单位/g)能从Roche Molecular Biochemicals得到的按WO-A-9516773所述方法制备的湿的固定化的D-氨基酸氧化酶。
在20℃、400rpm进行转化，有氧气流在2巴的绝对压力下以0.1vol/vol/min的速度通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH7.0。
用HPLC控制转化，使用反相柱Nucleosil 120 3-C18 125×8×4mm，移动相为含有4％乙腈的20mM醋酸铵，pH5.5，流速为1ml/min，使用260nm检测器。在7.0分钟时出现TDC，α-酮己二酰-中间体在8.5分钟出现，TDG(3-硫醇化的戊二酰-7-ACA)在11.5分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果示于下表：TDC TDK TDG TDA副产物时间(分钟)转化[％]产量[％]产量[％]产量[％]产量[％] 0 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 10 30.20 2.04 25.49 0.00 0.30 100 98.49 2.94 94.69 0.00 0.86 H2O2滴定98.60.0097.710.000.89
当TDC转化高于98％时，停止反应，过滤去除反应溶液。剩余的生物催化剂用100mM pH 7.0的磷酸缓冲液100ml洗涤。后者加到第一滤液中。
为将剩余的α-酮己二酰-硫醇化的衍生物(TDK)转化成TDG，在25℃用1M过氧化氢滴定所得溶液30分钟使过氧化氢浓度达35ppm。用HPLC控制转化直至得到TDG的最大产量(见上表)。处理后的纯度为：TDG 92.65％，其他β-内酰胺7.34％。
加入10μl可溶的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)过氧化氢酶(650kU，从Roche Molecular Biochemicals得到)5分钟去除残余的过氧化氢。
用3M氨水将产生的TDG溶液调节到pH 8.0，并转移到1.5L搅拌反应器中，其中含有57.08g(87.6 Roche’s单位/g)湿的固定化的戊二酰-7-ACA酰基转移酶(能从Roche Molecular Biochemicals得到)。在以下条件下进行转化：20℃，250rpm，有氮气流在环境压力下以0.01vol/vol/min的流速通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH 8.0。用与D-AAO反应相同的HPLC条件控制转化。产物7-氨基-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-头孢烷酸的保留时间(以下称为TDA)为7.2分钟。
提取反应混合物中代表性的样品，所得结果示于下表： TDG TDA副产物时间(分钟)转化[％]产量[％]产量[％] 0 0.00 0.00 0.89 10 68.92 65.12 2.52 50 97.40 93.61 2.52
当TDG转化高于97％时，停止反应，过滤去除反应溶液。剩余的酶用100mM pH7.0的磷酸缓冲液100ml洗涤，使生物催化剂能够重新使用。后者加到滤液中，其中含有TDA，并冷却到10℃。用浓硫酸将pH调节到5.2，并在慢速搅拌下结晶60分钟。
将沉淀过滤，并依次用50％丙酮水溶液250ml和丙酮100ml洗涤，再次过滤，并在35℃真空干燥，得到13.91g(K.F.1.81％)基本纯的7-氨基-3-[(甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-头孢烷酸，HPLC纯度98.2％，且在420nm的透光度为87(用2％NaHCO3中1％的溶液测定；比色皿1cm)。
在此CEE过程中，从初始底物头孢菌素C溶液(24.92活性克游离酸(activity grams of free acid))开始制备TDA的总收率为64.6％。TDA
1H-NMR(DMSO/HCl)(δppm)：2.59(s，3H，-CH3)；3.68(宽峰，2H，-CH2-)；4.2-4.48(J＝13.2Hz，2H，-CH2-)；5.03(d，J＝4.8Hz，1H，C-6)；5.11(d，J＝4.8Hz，1H，C-7)。
元素分析：
对C11H12N4S3O3的计算值：C：38.36％；H：3.51％；S：27.93％；N：16.27％。
实测值：C：38.35％；H：3.4％；S：28.00％；N：16.04％。
实施例7：TDC溶液中出现的杂环硫醇对酶再生的影响
为显示在TDC的两步酶反应中剩余杂环硫醇的毒性作用，使用经过或不经过强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400的色谱法除杂环硫醇的TDC。结晶步骤后MMTD的水平为2.56mg/ml。在经过AmberliteIRA-400强阴离子交换树脂上的色谱步骤后，MMTD的量低于0.2mg/mL，少于初始所用MMTD的1％。
下表显示了不经过色谱步骤，D-氨基酸氧化酶时间如何在4个循环后增倍，然而当TDC中有痕量MMTD时，此时间在12个循环后保持相同(约100分钟)。 不经过色谱步骤循环D-氨基酸氧化酶戊二酰-7-ACA酰基转移酶时间(分钟)时间(分钟) 1 100 70 2 150 50 3 150 60 4 230 60 经过色谱步骤循环D-氨基酸氧化酶戊二酰-7-ACA酰基转移酶时间(分钟)时间(分钟) 1 90 60 2 90 60 3 100 50 4 90 50 5 100 50 6 90 50 7 100 50 8 100 50 9 100 50 10 100 50 11 100 50 12 100 50
对于第二酶戊二酰-7-ACA-酰基转移酶，似乎在第一反应之后产生和加入的过氧化氢破坏痕量的MMTD，在反应时间约为50分钟时保存其催化活性。
实施例8：合成7-氨基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TZA)
从实施例4的强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400得到的滤液(1000ml)，含有0.039摩尔纯度为91.3％(HPLC)的7-(5’-氨基己二酰二胺)-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TZC)的，并含有少于0.2mg/ml的5-巯基-1-甲基四唑(MMTZ)，用3M氨水将此滤液调节到pH7.25。
将TZC溶液加入1.5升搅拌反应器中，其中有82.5g(30.3 Roche’s单位/g)能从Roche Molecular Biochemicals得到的按WO-A-9516773公开的方法制备的湿的固定化的D-氨基酸氧化酶。
在20℃、400rpm进行转化，有氧气流在2巴的绝对压力下以0.1vol/vol/min的速度通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH 7.25。
用HPLC控制转化，使用反相柱Nucleosil 120 3-C18 125×8×4mm，移动相为含有4％乙腈的20mM醋酸铵，pH 5.5，流速为1ml/min，使用260nm检测器。在3.0分钟时出现TZC，α-酮己二酰-中间体在3.6分钟出现，TZG(3-硫醇化的戊二酰-7-ACA)在4.6分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果示于下表： TZC TZK TZG TZA副产物时间(分钟)转化[％]产量[％]产量[％]产量[％]产量[％] 0 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 10 73.98 6.49 66.02 0.00 0.30 35 100.00 4.26 91.28 0.00 2.12 H2O2滴定 100.00 0.00 98.17 0.00 1.83
当TZG转化高于99％时，停止反应，过滤去除反应溶液。剩余的生物催化剂用100mM pH 7.0的磷酸缓冲液100ml洗涤。后者加到最初的滤液中。
为将剩余的α-酮己二酰-硫醇化的衍生物(TZK)转化成TZG，将得到的溶液用1M过氧化氢在25℃滴定30分钟，使其中的过氧化氢浓度达35ppm。用HPLC控制反应(见上表)。处理后的纯度为：89.45％的TZG，10.55％的其他β-内酰胺。
加入10μl可溶的谷氨酸棒杆菌的过氧化氢酶(650kU，从RocheMolecular Biochemicals得到)5分钟去除残余的过氧化氢。
用3M氨水将产生的TZG溶液调节到pH 8.0，并转移到1.5L搅拌反应器中，其中含有57.08g(87.6 Roehe’s单位/g)湿的固定化的戊二酰-7-ACA酰基转移酶(能从Roche Molecular Biochemicals得到)。在以下条件下进行转化：20℃，250rpm，有氮气流在环境压力下以0.01vol/vol/min的流速通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH 8.0。用与D-AAO反应相同的HPLC条件控制转化。产物7-氨基-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(以下称为TZA)的保留时间为3.2分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果示于下表： TZK TZG TZA副产物时间(分钟)转化[％]转化[％]产量[％]产量[％] 0 0.00 0.00 0.00 1.83 10 0.00 73.08 69.72 3.36 45 0.00 100.00 95.12 4.88
当TZG转化高于99％时，停止反应，过滤去除反应溶液。剩余的酶用100mM pH 7.0的磷酸缓冲液100ml洗涤，使剩余催化剂可以重新使用。后者加到滤液中，其中含有TZA，并冷却到10℃。用浓硫酸将pH调节到5.2，并在慢速搅拌下结晶60分钟。
将沉淀过滤，并依次用50％丙酮水溶液250ml和丙酮100ml洗涤，再次过滤，并在35℃真空干燥，得到9.94g(K.F.1.4％)基本纯的7-氨基-3-[(甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-头孢烷酸，具有HPLC纯度96.60％。
在此ECC过程中，从初始底物头孢菌素C溶液(24.92活性克游离酸)开始制备TZA的总收率为48.05％。
TZA
1H-NMR(D2O/Na2CO3)(δppm)：3.45-3.78(J＝17.7Hz，2H，-CH2-)；4.01-4.3(J＝13.2Hz，2H，-CH2-)；4.03(s，3H，-CH3)；4.72(d，J＝4.8Hz，1H，C-6)；5.00(d，J＝4.8Hz，1H，C-7)。
实施例9：TZC溶液中出现的杂环硫醇对酶再生的影响
为显示在TZC的两步酶反应中剩余杂环硫醇的毒性作用，使用经过或不经过强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400色谱法除杂环硫醇的TZC。化学反应后MMTZ的水平为27.6mg/ml。经过在AmberliteIRA-400强阴离子交换树脂上的色谱步骤后，MMTZ的量为0.2mg/mL，少于所用MMTZ的1％。
下表显示了不经过两个色谱步骤，D-氨基酸氧化酶时间如何在2个循环中有些增加，而显著地影响戊二酰-7-ACA酰基转移酶，使它在第二个循环中不能完成第二个反应。 不经过色谱步骤循环D-氨基酸氧化酶戊二酰-7-ACA酰基转移酶时间(分钟)时间(分钟) 1 100＞110 2 120＞＞110 经过色谱步骤循环D-氨基酸氧化酶戊二酰-7-ACA酰基转移酶时间(分钟)时间(分钟) 1 45 45 2 35 45 3 35 40 4 40 48 5 45 48
然而，有色谱步骤的循环的时间，在上表中显示两种酶在5个循环中都保持大致相同。这清楚地显示去除硫醇对酶稳定性的必要性。
实施例10：制备7-氨基-3-[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(TTA)
从实施例5的强阴离子交换树脂AmberliteIRA-400得到的滤液(1000ml)，含有0.032摩尔纯度为88％(HPLC)的7β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-头孢烷酸(以下称为TTC)，并含有少于0.2mg/ml的2，5-二氢-3-巯基-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪(TTZ)，用3M氨水将此滤液调节到pH 7.25。
将TTC溶液加入1.5升搅拌反应器中，其中有82.5g(30.3 Roche’s单位/g)能从Roche Molecular Biochemicals得到的按WO95/16773公开的方法制备的湿的固定化的D-氨基酸氧化酶。
在20℃、400rpm进行转化，有氧气流在2巴的绝对压力下以0.1vol/vol/min的速度通过底部进气口。借助自动滴定仪用3M氨水将pH滴定到pH 7.25。
用HPLC控制转化，使用反相柱Nucleosil 100-5 C18 250×8×4.6mm，移动相为10mM四丁基铵硫酸氢盐和15mM磷酸二氢钾中的25％甲醇溶液，流速为1ml/min。使用260nm检测器。TTC在4.3分钟出现，α-酮己二酰-中间体在6.8分钟出现，3-硫醇化的戊二酰-7-ACA(TTG)在8.2分钟。
提取反应混合物中除酶以外的代表性的样品，所得结果示于下表： TTC TTK TTG TTA副产物时间(分钟)转化[％]产量[％]产量[％]产量[％]产量[％] 0 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 40 75.43 1.80 66.67 0.00 5.21 90 97.60 2.67 88.54 0.00 6.39 H2O2滴定 97.60 0 90.96 0.00 6.5
当TTC转化高于97％时，停止反应，过滤去除反应溶液。剩余的生物催化剂用100mM pH 7.0的磷酸缓冲液100ml洗涤。后者加到最初的滤液中。
为将剩余的α-酮己二酰-硫醇化的衍生物(TTK)转化成TTG，将得到的溶液用1M过氧化氢在25℃滴定30分钟，使其中的过氧化氢浓度达35ppm。用HPLC控制反应(见上表)。处理后的纯度为：80.77％TTG，19.23％的其他β-内酰胺。
加入10μl可溶的谷氨酸棒杆菌的过氧化氢酶(650kU，从RocheMolecular Biochemicals得到)5分钟去除残余的过氧化氢。
用3M氨水将产生的TTG溶液调节到pH 8.0，并转移到1.5L搅拌反应器中，其中含有57.08g(87.6 Roche’s单位/g)湿的固定化的戊二酰-7-ACA酰基转移酶(能从Roche Molecular Biochemicals得到)。在以下条件下进行转化：20℃，250rpm，有氮气流在环境压力下以0.01vol/vol/min的流速通过底部进气口。借助自动滴定仪用氨水将pH滴定到pH 8.0。
用与D-AA0反应相同的HPLC条件控制转化。产物7-(5’-氨基己二酰二胺)-3-[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-头孢烷酸的保留时间(以下称为TTA)为5.2分钟。
提取反应混合物的代表性的样品，所得结果示于下表： TTK TTG TTA副产物时间(分钟)转化[％]转化[％]产量[％]产量[％] 0 0 0.00 0.00 6.39 10 0 94.33 84.49 7.13 50 0 100.00 89.09 7.64
当TTG转化高于99％时，停止反应，过滤去除反应溶液。剩余的酶用pH 7.0的磷酸缓冲液100ml洗涤，使生物催化剂可以重新使用。后者加到滤液中，其中含有TTA，并冷却到10℃。用浓盐酸将pH调节到4.2，并在慢速搅拌下结晶60分钟。
将沉淀过滤，并依次用50％丙酮水溶液250ml和丙酮100ml洗涤，再次过滤，并在40℃真空干燥，得到8.53g(K.F.5.95％)基本纯的7-(5’-氨基己二酰二胺)-3-[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-头孢烷酸，HPLC纯度为98.28％。
在此ECC过程中，从初始的头孢菌素C溶液(24.92活性克游离酸)开始制备TTA的总收率为40.01％。
TTA
1H-NMR(D2O/Na2CO3)(δppm)：3.43-3.7(J＝17.7Hz，2H，-CH2-)；3.63(s，3H，-CH3)；4.02-4.33(J＝13.8Hz，2H，-CH2-)；4.73(d，J＝4.5Hz，1H，C-6)；5.02(d，J＝4.5Hz，1H，C-7).
本发明不仅局限于上述具体实施方案，而可以在细节上有所改变。