一种半合成次卟啉衍生物及其冻干注射剂的制备方法 本发明属医药生产技术领域，具体涉及卟啉类光动力治疗新药的制备方法。
许德余等1989年发表了3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX(俗名为3-或8-血卟啉单甲醚)的合成(张浩、许德余：半合成血卟啉衍生物的合成及肿瘤光生物活性研究，中国医药工业杂志1989,20:60),随之又报道了3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX对动物移植瘤和体外培养人癌细胞的光动力杀伤作用[许德余、陈文晖、沈念慈：光动力治癌新药3-或8-血卟啉单甲醚，中国激光医学杂志1993,2:1；J.Military Med.College 1991,8:406]。
顾瑛等初步证明，3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX对食管癌和胃癌等具有可靠的临床疗效(顾瑛、李峻亨、许德余：新型光敏剂——血卟啉单甲醚临床应用的初步报道，中国激光医学杂志1993,2:235；Gu Yin,Li Jun-Heng,Xu De-Yu：A preliminary report of clinicalapplication of hematoporphyrin monomethyl ether in photodynamic therapyfor alimentary cancers.SPIE 1994,Vol.2371:385)。
近几年来中国人民解放军总医院激光科应用3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX激光光动力治疗鲜红斑痣，取得了良好的效果(顾瑛：血卟啉单甲醚用于新型光动力疗法治疗鲜红斑痣的综合研究，博士学位论文，2000年5月；中国激光医学杂志1993,2:154；1994,3:215)。
这些研究表明，3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX是一种有效的新型光动力治疗药物，作为单一的化合物，它首次克服了目前国内、外用于临床光动力治疗的混合卟啉制剂光敏素II或卟非姆钠(Photofrin II,Sodium Pofimer)和血卟啉衍生物(HematoporphyrrinDerivative,HpD)因组成不定和有效成分不明所造成的疗效不稳定及本身质量难以标准化的缺点。
尽管基础和临床研究都表明了3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX作为一种有良好发展前景的肿瘤和鲜红斑痣光动力治疗新药，但迄今尚无可行的生产工艺路线。
因此，本发明的目的在于提供一种生产单体光动力治疗新药3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX及其制剂的理想工艺，以利其产业化。
本发明提供的式(Ⅰ)所示次卟啉衍生物地制备方法其中，R为1-甲氧基乙基或1-羟乙基，其特征在于包括以下步骤：
(1)在光照下，将干燥的溴素滴加到二甲苯中生成溴化氢气体；
(2)于对苯二酚存在下在冰醋酸中，将氯化高铁原卟啉与溴化氢反应，生成3,8-二(1-溴乙基)-次卟啉IX二氢溴酸盐；
(3)3,8-二(1-溴乙基)-次卟啉IX二氢溴酸盐饱和冰醋酸溶液与甲醇/水混合液反应生成式(Ⅰ)化合物粗品；
(4)经色谱分离得到式(Ⅰ)化合物纯品。
本发明还提供式(Ⅰ)所示次卟啉衍生物冻干注射剂的制备方法(式中，R为1-甲氧基乙基或1-羟乙基)包括以下步骤：
(1)将式(Ⅰ)所示化合物以1∶50重量/体积比溶于新鲜注射用水配制的0.2NNaOH；
(2)用新鲜注射用水配制的0.2N HCl调节pH至7-7.5；
(3)用10％ NaCl注射液按下式作等渗调节：
V1=9V2-58Me.HCl/91…………………………(1)式中V1为所需10％NaCl注射液的毫升数；V2为调节等渗前溶液的毫升数；Me.HCl为调节溶液pH时加入的0.2N HCl毫克当量数。
(4)除菌、分装和冷冻干燥。
本发明的冻干注射剂制备方法中冷冻干燥于-20℃真空下进行。
下面对本发明的制备方法作详细描述。
本发明的式(Ⅰ)所示次卟啉衍生物制备方法中首先涉及关键中间体3,8-二(1-溴乙基)-次卟啉IX的合成，包括溴化氢的发生和氯化高铁原卟啉IX与溴化氢的加成反应。
(1)溴化氢的发生
反应原理：溴化氢系由干燥溴素在光照下与二甲苯分子中二个甲基上的氢原子发生置换反应所产生，反应如下式所示：
其中，所用的二甲苯可为工业混合二甲苯，光照可采用100-200W白炽灯。
(2)3,8-二(1-溴乙基)-次卟啉IX的合成
反应原理：3,8-二(1-溴乙基)-次卟啉Ⅸ系由氯化高铁原卟啉IX室温下在冰醋酸中与溴化氢加成而得。反应过程如下式所示：
反应中所用的冰醋酸可为工业冰醋酸。氯化高铁原卟啉IX的加料量可为0.01-10摩尔。
上述溴化氢发生过程中，二甲苯与溴置换反应生成的二-(三溴甲基)-苯系强刺激性有害物质。为保护环境卫生，本发明还提供二-(三溴甲基)-苯的无害化处理方法。即当二甲苯在光照下不能与溴进一步反应时，表明其苯环上的两个甲基已完成溴化，需要更换新的二甲苯才能继续产生溴化氢。此时，将二-[三-(1-溴甲基)]-甲苯与氢氧化钠乙醇混合物进行反应，生成苯二甲酸和溴化钠。反应可以下式表示：
本发明的式(Ⅰ)所示次卟啉衍生物制备方法中，从中间体合成式(Ⅰ)化合物粗品的反应原理如下：一定温度下，3,8-二-(1-溴乙基)-次卟啉IX氢溴酸盐冰醋酸饱和溶液按一定体积比与甲醇/水混合液反应，生成由3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX(即式(Ⅰ)化合物)、3,8-二-(1-甲氧乙基)-次卟啉IX(Ⅳ)和血卟啉IX(Ⅴ)组成的粗品。反应过程如下式所示：
该反应中，3,8-二(1-溴乙基)-次卟啉IX二氢溴酸盐饱和冰醋酸溶液与甲醇/水混合液的体积比为1∶3.5-1∶5.5，甲醇/水混合液中甲醇与水的体积比为3∶1-5∶1。反应温度为10-20℃。
制备式(Ⅰ)化合物粗品后，再进行碱溶酸析。碱溶的pH为≥12，放置时间≥10小时，酸析的pH为3.5-5。
该粗品经色谱分离得到-对3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX的位置异构体。
色谱分离采用硅胶柱，检测采用HPLC(Whatman ODS柱)和硅胶TLC，展开剂为甲醇-氯仿-甲酸10∶1∶0.1(V/V)；或乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸7∶3∶0.1(V/V)；或氯仿-甲醇-丙酮-甲酸10∶1∶1∶0.1(V/V)。较佳为甲醇-氯仿-甲酸10∶1∶0.1(V/V)。
本发明方法的工艺操作简便，反应原料廉价、易得，设备简单，既适于实验室小规模使用，也适于工业生产，且提供副产物溴苄化合物的无害化处理，有利于环境保护。
图1是本发明的一个优选实施方案中溴化氢加成反应的装置示意图。
以下用实施例对本发明作举例说明，这些实施例旨在阐述本发明的最佳实施方案。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本申请权利要求的范围内。
实施例1 3,8-二(1-溴乙基)-次卟啉IX的合成
(1)溴化氢的发生
将30L工业二甲苯置于带透明钢化玻璃顶盖和分别连接恒压液体滴加器和冷凝导气管的50L电加热耐酸搪玻璃反应锅中，将经浓硫酸干燥过的溴素20kg置于恒压液体滴加器中，紧贴透明钢化玻璃顶盖，等距离分装三只200W白炽灯，开通冷凝水，光照下由恒压液体滴加器缓缓滴入溴素，约3-5分钟后溴化氢即顺冷凝导气管放出。溴化氢气体经玻璃计泡器、无水氯化钙干燥管、固体石蜡有机溶剂吸收管、微量游离溴吸收装置及冰盐冷阱导入氯化高铁原卟啉IX溴化氢加成反应瓶。
(2)3,8-二(1-溴乙基)-次卟啉IX的合成
如图1所示，并列安装四个5L三颈圆底反应瓶1-4，反应瓶的三个口分别安装浸入式导气管1(导入溴化氢气体)、弯接管塞2(过量溴化氢气体出气口)和空心塞3(加料口)，与最后一个反应瓶相连的是氯化钙干燥管。第一个反应瓶通过浸入式导气管与溴化氢发生器相连，并依次通过弯接管塞与下一个反应瓶的浸入式导气管互相连接。每个反应瓶中分别加入工业冰醋酸3-4L。将溴化氢发生器产生的干燥溴化氢气体经浸入式导气管通入第一个反应瓶，待第一瓶冰醋酸接近饱和时由加料口加入80-120g干燥氯化高铁原卟啉IX和2-3g对苯二酚，继续通入溴化氢。待第二瓶冰醋酸接近饱和时，同前在该瓶加入80-120g干燥氯化高铁原卟啉IX和2g对苯二酚。继续通溴化氢直至第四瓶冰醋酸饱和后，同前加入氯化高铁原卟啉IX和对苯二酚，并取下第一瓶，然后在第四瓶后补接与之相同的另一反应瓶，继续保持四个反应瓶。将第一瓶中反应完成的3,8-二-(1-溴乙基)-次卟啉IX二氢溴酸盐冰醋酸饱和溶液分装于密闭耐酸容器中。每次都在第四瓶冰醋酸接近溴化氢饱和时，同前取下第一瓶和于末尾补接另一反应瓶。在最后一瓶冰醋酸中溴化氢接近饱和并加入氯化高铁原卟啉后，不断重复同一操作，直至达到需要合成的3,8-二(1-溴乙基)-次卟啉IX量。
(3)溴化氢发生反应废料的无害化处理
在溴化氢发生反应中，当二甲苯在光照下不能与溴进一步反应时，表明其苯环上的两个甲基已完成溴化，需要更换新的二甲苯才能继续产生溴化氢。此时将甲基上的氢原子已完全被溴所取代的二(三溴甲基)-甲苯由反应锅放料阀门缓缓放至置有过量氢氧化钠和工业乙醇混合物的另一反应锅中，搅拌反应，此时溴代二甲基苯与碱反应生成苯二甲酸和溴化钠，加适量水稀释后，过滤收集溴化钠沉淀，滤液加酸中和至pH3-4，过滤收集析出的苯二甲酸沉淀。所需氢氧化钠和工业乙醇量可根据产生溴化氢时在二甲苯中加入的溴量计算。
实施例2 3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX粗品的合成
在50L敞口单层耐酸搪玻璃反应锅中加入体积比为4∶1的甲醇/水混合液40L。搅拌下由液体滴加器缓缓滴入反应后放置两周以上的3,8-二-(1-溴乙基)-次卟啉IX氢溴酸盐冰醋酸饱和溶液10L，控制加料速度使反应混合物温度保持10-20℃。加毕后在上述温度下放置6小时。然后在冰冷却下，搅拌滴加10N NaOH至溶液呈强碱性(pH12以上)。放置一昼夜，滤去碱不溶物，滤液加醋酸中和至pH3.5-4.5，并加入3倍体积的水稀释，放置，待沉淀物自然分层，虹吸除去上层清液后，吸滤收集3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX和3,8-二-(1-甲氧乙基)-次卟啉IX的混合物深紫色沉淀，用水反复洗净、尽可能抽干。所得成品置低温冰箱中-20℃冷冻过夜。次日取出洗净、滤干后置干燥器中用P2O5减压干燥。所得粗品称重，为98克，收率85％。
将3,8-二(1-溴乙基)-次卟啉IX二氢溴酸盐饱和冰醋酸溶液与甲醇/水混合液的体积比在1∶3.5-1∶5.5的范围内变动，甲醇/水的体积比在3∶1-5∶1的范围内变动，并将放置时间改为2小时，重复进行如上实验，收率基本不变。
实施例3 3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX纯品的色谱分离
色谱分离条件：
色谱柱：60-120×800-1500mm上口为24-34标准磨口、流出端带3#耐酸玻璃滤板的玻璃管；
支持剂：200-300目层析硅胶；
展开剂：甲醇-氯仿-甲酸(10∶1∶0.1 V/V)；
温度：室温(包括四季)
流速：6-8ml/min
上样量：上样量：硅胶=2-4:100(W/W)；
操作步骤：硅胶H 200g借长颈漏斗缓缓充装于60×600mm层析柱、敲实。取血啉甲醚．5～6g与25g硅胶H研匀后铺于硅胶柱上层，并在其上层另加硅胶片0-25g，同前敲实。在柱的上口借标准口连接一20×800mm的玻管，由贮液瓶借2-3mm直径的塑料管将展开剂经上接玻管流入色谱柱，待溶剂前缘流尽后，分段收集由色谱柱流出的红色流份，并随时用薄板进行检测，当流出液TCL检测呈为Rf值0.58-0.71的单一斑点时，随即进行HPLC分析。留取和合并TCL检测于Rf值0.58-0.71单一斑点、HPLC分析保留时间7.08min的相对峰面积≥98％的流分，减压蒸干即得3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX纯品。
重复几次实验，得到纯品量为1.5-2.2g(收率30-36％)，纯度大于或等于95％。
将展开剂改为乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸(7∶3∶0.1 V/V)，其余操作同上，重复几次实验，得到纯品量为1.45-2.0g(收率24-33％)，纯度大于或等于95％。
将展开剂改为氯仿-甲醇-丙酮-甲酸(10∶1∶1∶0.1 V/V)，其余操作同上，重复几次实验，得到纯品量为1.35-1.75g(收率22.5-29％)，纯度大于或等于95％。
检测标准：TCL结合HPLC分析，条件分别为：
TCL检测：
条件：
硅胶板的制备(1)硅胶G板：40g层析硅胶G(青岛海洋化工厂生产)加0.3％羧甲基纤维素(CMC)溶液100ml，搅匀后在载玻片上铺制成0.25mm厚的层析板。后者自然干燥后于100-110℃活化1h。(2)硅胶H板：33g层析硅胶H(青岛海洋化工厂生产)加0.6％CMC溶液100ml，搅匀后在载玻片上铺成0.25mm厚的薄板，待自然干燥后，于100-110℃活化1小时。
点样 点样量为1μl(含样品2μg)；
溶剂体系及展开方式 溶剂体系同前柱层分离，垂直展开；
检测标准 薄板上只呈现单一的玫红色斑点，其Rf值随检测时温度和展开距离约为0.58-0.71；
HPLC检测：
条件：
分离柱 Whatman ODS柱，46×250mm；
流动相 60％(V/V)四氢呋喃水溶液+10％0.2mol/L醋酸钠缓冲液；
柱温 20±1℃；
流速 1ml/分钟；
柱压 250巴；
检测波长 395nm
灵敏度 0.1AUFS；
记录纸速 2mm/分钟；
进样量 5μL(样品浓度为1mg/1mL)。
实施例4 临床用3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX冻干注射剂的制备方法
原料：将柱层析分离得到的3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX置于棕色无菌容器中密闭低温(-20℃)保存备用。临用前，将称准的原料置3#沙芯漏斗中，用无热源蒸馏水反复研洗，充分吸干后用于配制。
溶液(2％)的配制：将上述3，(或8)-(1-甲氧基乙基)-8，(或3)-(1-羟乙基)-次卟啉IX原料100克、甘露醇600克置于装有电动搅拌的无菌容器中，加入用新鲜注射用水配制的0.2N NaOH溶液3.5L，充分搅拌，待原料溶解完全(此时溶液pH≥12)，放置12小时以上(溶液pH保持12以上)，然后搅拌，加入用新鲜注射用水配制的0.2N HCl，调节溶液pH至7-7.5，然后用10％NaCl注射液按下列公式将溶液调节成等渗。
V1=9V2-58Me.HCl/91…………………………(1)式中V1为调节溶液成等渗所需的10％NaCl注射液的体积(毫升数)；V2为调节等渗前的溶液总体积(毫升数)；Me.HCl为调节溶液pH时加入的0.1N HCl毫克当量数。
式(1)的推导方法如下：
已知药液调节至等渗时，氯化钠的浓度为0.9％，在加入10％NaCl溶液调节等渗前，溶液中因调节pH加入HCl而生成了一部分NaCl，其数量相当于加入的HCl毫克当量数，即：Me.HCl×0.058(g)，调节等渗加入V1毫升10％NaCl(V1×0.1)g，故有下列等渗条件式：
Me.HCl×0.058+0.1×V1/V1+V2=0.9/100，或
5.8×Me.HCl+10V1=0.9V1+0.9V2，整理后得
10V1-0.9V1=0.9V2-5.8×Me.HCl，等式两端各乘以10消除小数，得
91V1=9V2-58Me.HCl，或V1=9V2-58Me.HCl/91
分装和冻干：上述配好的中性等渗溶液，用生理盐水稀释成所需的特定浓度后，加入甘露醇等支架剂，充分溶解，滤菌。无菌溶液按临床用药剂量要求，定量分装于10毫升玻瓶中，借冷冻干燥机于-20℃真空冷冻干燥，制成注射用冻干剂。