降解卤代烃的微生物及其应用 【技术领域】
本发明涉及被卤代烃污染的水或土壤的生物净化方法。
背景技术
最近，有机溶剂，尤其是卤代烃，在尖端工业中被大量用作清洁剂。由于人们越来越关注由这些物质或含这些物质的废水引起的地下水和土壤污染，有必要立即采取措施对付这种污染。
过去已作为对策使用的已知物理方法的实例包括，空气脱污法(airstripping method)，该方法的过程为翻挖土壤，使空气吹过土壤表面，以使卤代烃挥发，并用活性炭等吸附卤代烃；真空抽提法，该方法的过程为将污染的土壤灌入管子中，随后抽真空给土壤换气从而除去污染物。这些方法被认为也可用于地下水的脱污处理。
然而，这些方法的缺点是需要大量能量，如要鼓风。而且，前一种方法还有一个缺点是需要翻挖土壤，而后一种方法的另一个缺点是提取效率随着污染物浓度下降而降低，从而使得净化难以实现。另外，从防止空气污染等二次污染的观点看，为了将分离的污染物吸附至活性炭等上面，这些方法要求对它们进行脱毒。
另一方面，近年已进行了对所谓生物净化方法的研究，生物净化方法就是利用微生物使污染物有效地降解和脱毒。由于这些方法利用微生物的降解机制，与上述物理方法相比，它们无需大量的能量。它们也能够完全降解污染物和使之脱毒而不会引起二次污染。而且，即使污染物处于低浓度也可进行净化，从而使得脱污可以在原始发生地的广泛区域进行，并极有希望降低费用。
采用微生物净化污染土壤的方法的实例包括，固相处理法，该方法是将微生物与磷、氮等营养源混入翻挖的土壤中促进污染物的降解；泥浆处理法，该方法是将微生物与水和营养源混入翻挖地土壤中，以流体形式处理土壤，促进污染物的降解；原地处理法，该方法是将空气、营养源等注入污染土壤中，无需翻挖而促进土壤中存在的微生物降解污染物。
在上述生物处理方法中，固相处理法和泥浆处理法由于需要翻挖土壤，应用范围受到限制，处理和设备费用相对较高。
另一方面，原地处理法费用相对较低，并且可以对广泛区域进行处理。然而，其净化速率较慢，因为土壤微生物的绝对数量较少。在待处理化合物难以降解，尤其如为卤代烃时，土壤中有可能不存在能降解土壤污染物的微生物。在这种情况下，获取能够降解卤代烃的微生物并将它们接种至土壤中，使得净化速率提高，并且即使土壤中不存在能够降解污染物的微生物，土壤也可得以净化。
一种卤代烃污染物三氯乙烯(TCE)广泛用于IC工业、干洗等当中。它是一种特别重要的污染物，因为据报道它可致癌。降解TCE的微生物的已知实例包括甲烷同化微生物Methyrosinus tricosporium OB3(日本未审查专利出版号4-501667，日本未审查专利出版号5-212371)和Methyrosinus tricosporium TUKUBA(日本未审查专利出版号292274和日本未审查专利出版号3-292970)，
假单胞菌，如恶臭假单胞菌F1(日本未审查专利出版号6434499)；恶臭假单胞菌BH(Fujita等，“化学工程”39卷6期494-498页，1994)、恶臭假单胞菌UC-R5和UC-P2(日本未审查专利出版号62-84780)、恶臭假单胞菌KWI-9(日本未审查专利出版号6-70753)、门多萨假单胞菌KR-1(日本未审查专利出版号2-503866和5-502593)、洋葱假单胞菌G4(日本未审查专利出版号4-502277)和洋葱假单胞菌KK01(日本未审查专利出版号6-296711)以及其它微生物，如真养产碱菌JMP134(A.R.Harker，“应用与环境微生物学”56卷4期1179-1181页，1990)、真养产碱菌KS01(日本未审查专利出版号7-123976)和氨细菌Nitrosomonuseuropaea(D.Arciero等，“生物化学与生物物理研究通讯”159卷2期640-643页，1989)是已知的。
特别是洋葱假单胞菌KK01据报道可降解液体培养物中初始浓度为30ppm的TCE到15ppm，土壤中初始浓度为5ppm的TCE到1ppm(日本未审查专利出版号6-296711)。另外据报道真养产碱菌可降解液体培养物中浓度为50ppm的TCE至低于检测水平，土壤中浓度为低于检测水平的1ppm的TCE(日本未审查专利出版号7-123976)。
然而，测定这些微生物的降解能力时，降解均在极高细胞浓度(1×108细胞/毫升)下得以证实。考虑到该浓度在实际土壤环境中根本不存在，不能认为在各种情况下这些微生物的降解能力都强。因而使用微生物净化土壤时，这些微生物应具有充分的降解能力，并且能在特殊的土壤环境，如存在野生微生物时，表现该能力。另外，优选这些微生物对降解目标物TCE的耐受性高，并且它们也能降解二氯乙烯(DCE)，它是TCE的部分降解物。
【发明内容】
本发明的目的涉及有效降解卤代烃，尤其是高浓度TCE和DCE等的微生物，以及使用这些微生物对水或土壤进行净化的方法。
本发明提供能降解卤代烃、属于伯克霍尔德氏菌属的微生物，一些这样的微生物属于洋葱伯克霍尔德氏菌。这些微生物的实例包括伯克霍尔德氏菌N16-1(FERM BP-5504)、洋葱伯克霍尔德氏菌N15-1(FERM BP-5502)和洋葱伯克霍尔德氏菌N15-2(FERM BP-5503)。而且，本发明提供将上述微生物加入含卤代烃的水或土壤来净化水或土壤的方法。
本发明还有另一个特点就是将微生物激活剂与上述微生物一起加入。这些微生物能在2天内将100ppm三氯乙烯降解50％或更多，或在18小时内将30ppm三氯乙烯完全降解。
附图简述
图1示出实施例2中残留TCE的百分率随时间的变化。
图2示出实施例3中残留TCE的百分率随时间的变化。
图3示出实施例4中残留顺式-1，2-DCE的百分率随时间的变化。
图4示出实施例6中残留TCE的百分率。
图5示出实施例7中残留TCE的百分率。
详述
本发明的微生物应为属于伯克霍尔德氏菌属或属于洋葱伯克霍尔德氏菌的微生物，这些微生物的具体实例包括伯克霍尔德氏菌N16-1、洋葱伯克霍尔德氏菌N15-1和洋葱伯克霍尔德氏菌N15-2。这些微生物为由自然界(如河流和土壤)中新分离的菌株，它们的分离方法和分类特征将具体描述。这些菌株，即伯克霍尔德氏菌N16-1，洋葱伯克霍尔德氏菌N15-1和洋葱伯克霍尔德氏菌N15-2，于1996年4月12日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，保藏号分别为FERM BP-5504、FERM BP-5502和FERM BP-5503。
本发明的微生物可在含常用碳源、氮源以及必需的无机盐、维生素和其它痕量元素的培养基中培养。本发明的微生物优先同化的任何碳源均可使用。培养基中碳源浓度优选例如0.1到0.5g/L，但应根据碳源类型而有所变化。可以使用的氮源的实例包括有机氮源，如酵母提取物、蛋白胨和肉提取物，而无机氮源的实例包括铵盐和硝酸盐。
氮源浓度优选0.1到1.4g/L，但应根据具体类型而有所变化。无机盐的优选实例包括金属离子，如钾离子、钙离子、镁离子、二价铁离子、锰离子、钴离子和镍离子，以及阴离子，如氯离子、硫酸根离子和磷酸根离子。优选通气培养，振荡培养或大规模培养时优选通气并搅拌。培养温度为20到37℃，优选大约30℃。
另外，本发明涉及一种净化水或土壤的方法，其特征在于将上述微生物加入含卤代烃的水或土壤中。在该方法中，如上述方式培养的本发明的微生物应加入待处理的水或土壤中。这些微生物应以培养液或自培养液中分离的微生物的形式加入。另外，这些微生物也可吸附到分开的载体上之后再加入。
尽管加入的微生物的量根据微生物降解卤代烃的能力、待处理的水或土壤中卤代烃的量等而有所变化，但该量在105到109细胞/克之间。尽管处理所需的时间也根据使用的微生物降解卤代烃的能力、待处理的水或土壤中卤代烃的量和加入的微生物的量而有所不同，但它大约为1到10天。
另外本发明对水或土壤的净化方法涉及一种净化水或土壤的方法，该方法是将如上述的本发明的微生物接种被卤代烃污染的水或土壤并混合，以降解水或土壤中所含的卤代烃，并且上述对水或土壤的净化方法，其特征在于当在上述水或土壤中接种并混合上述微生物时，加入并混合至少一类微生物激活剂。在这种情况下，微生物激活剂具有激活微生物降解卤代烃能力的作用，并被称为诱导剂。可以使用的诱导剂的实例包括能被上述微生物同化和降解的化合物，优选的实例包括苯、甲苯、酚、甲酚和3-羟基苄醇。另外，除上述诱导剂外，N16-1还可使用环戊醇、己酸、反式-3-己酸和辛二酸。
可被本发明的方法降解的卤代烃的实例尤为氯代烃，如TCE、DCE和一氯乙烯。
尽管本发明的方法可用于前述的固相处理法和泥浆处理法，但也可不使用这些需要翻挖土壤的方法，而简单地通过加入和接种本发明的微生物至土壤或水中而进行净化。
实施例
下面通过实施例详细说明本发明。实施例1.微生物的分离与鉴定
本发明的微生物使用下述方法从一家化工厂厂区的土壤中筛选和分离。0.1g土壤样品接种至25ml螺口试管中的5ml NMS培养基或M9培养基。并且，加入500ppm酚和维生素混合液，随后盖上试管盖，按规定时间于30℃振荡培养。培养至培养基由于其中微生物的生长而变浑浊为止。传代培养10次后，将培养液适当稀释，用棉拭子接种加入1.5％琼脂的平板培养基以分离长出的微生物菌落。重复该步骤分离微生物。
表1
NMS培养基的成分(1升中)
MgSO4·7H2O 1.0g
CaCl2 0.01g
Na2HPO4·12H2O 0.717g
NH4Cl 0.6g
KH2PO4 0.272g
痕量元素溶液(pH6.8) 0.5ml
痕量元素溶液(1升中)
EDTA 500mg
FeSO4·7H2O 200mg
ZnSO4·7H2O 10mg
MnCl2·4H2O 3mg
H3BO3 30mg
CoCl2·6H2O 20mg
NiCl2·6H2O 2mg
CaCl2 1mg
Na2MoO4·2H2O 2mg
维生素混合液(1升中)
盐酸硫胺素 3mg
对氨基苯甲酸 13mg
腺嘌呤 1.0g
NAD 0.25g
维生素B12 10mg
二磷酸氯化硫胺素 100mg
分离的微生物在液体培养基中培养2天以后，1/100体积的培养液接种至含4ml NMS培养基的30ml小管中，培养基中加入有酚、0.02％的酵母提取物和1mM葡萄糖，随后加入10ppm TCE。用覆以特氟隆的隔膜盖和铝盖迅速密封小管，30℃振荡培养5天，用气相色谱分析小管中的气相。对这样选出的3株具有高水平TCE降解活性的微生物的形态和生理特性进行了研究。结果于表2中示出。
表2试验参数 试验结果
N15-1 N15-2 N16-1形态 杆状 杆状 杆状革兰氏染色 - - -芽胞 - - - 运动性 + + + 鞭毛 极生多鞭毛 极生多鞭毛 极生多鞭毛对氧气反应 需氧 需氧 需氧氧化酶 + + +触酶 + + +OF O O O菌落颜色色泽 NP NP NP荧光色素形成 - - -水溶性色素形成 - - -PHB积累 + + +裂解原儿茶酸 邻位型 邻位型 邻位型精氨酸双水解酶 - - - 40℃生长 + + -反硝化作用 - - -硝酸盐还原 + + -明胶液化 + + -淀粉水解 - - - 同化葡萄糖 + + +木糖 + + +鼠李糖 - - +乙酰丙酸 + + -甲基延胡索酸 - - -D-酒石酸 - - +2，3-丁二醇 + + -色胺 - - -醌型 Q-8 Q-8 Q-8胞内DNA GC含量 66 67 62(mol％)
根据文献(N.R.Kreig和J.G.Holt，《伯杰氏系统细菌学手册》第1卷(1984)Williams & Wilkins；J.G.Holt，N.R.Krieg，P.H.A.Sneath，J.T.Staley和S.T.Williams《伯杰氏细菌学鉴定手册》第9版(1994)Williams & Wilkins；N.Zhao，C.Qu，E.Wang和W.Chen，“国际系统细菌学杂志”45卷600页(1995)；E.Yabuuti，Y.Kosako，H.Oyaizu，I.Yano，H.Hotta，Y.Hashimoto，T.Ezaki和M.Arakawa，“微生物学与免疫学”36卷1251页(1992))，利用上述结果对上述微生物进行了鉴定，一个菌株被鉴定为伯克霍尔德氏菌属的种类，而另两个菌株被鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌，并分别命名为N16-1、N15-1和N15-2。
如前所述，属于洋葱伯克霍尔德氏菌、降解TCE的已知微生物为G4(日本未审查专利出版号4-502277)和KK01(日本未审查专利出版号6-296711)。由表4可见N15-1和N15-2均具运动性，因而它们明显区别于不具运动性的G4。另外，G4和KK01被甲苯诱导，N15-1和N15-2不被甲苯诱导，因而它们也可据此参数明显地区分。另一方面，由于N16-1胞内DNA的GC含量为62mol％，与已知降解TCE的微生物恶臭伯克霍尔德氏菌、门多萨伯克霍尔德氏菌或洋葱伯克霍尔德氏菌(1992年以前被划入假单胞菌属)不同，它被鉴定为一种新的微生物。实施例2.在液体培养基中降解TCE
菌株N15-1、N15-2和N16-1均在加有500ppm酚和维生素混合液的NMS液体培养基中培养一天。离心收集微生物，随后重悬于4ml不含酚的同一培养基中。将30ml该悬液转入小管中，随后加入100ppm TCE，小管用覆以特氟隆的硅隔膜和铝盖迅速密封(微生物浓度108细胞/ml)。小管随后静置于30℃培养。按时以气相色谱分析气相。这些结果于图1中示出。每种微生物在5天内降解了液体培养基中超过70％的TCE。实施例3.在液体培养基中降解TCE
菌株N15-1、N15-2和N16-1均在加有0.2％酵母提取物和4mM葡萄糖的NMS液体培养基中培养1天。在小管中加入4ml加有0.02％酵母提取物、500ppm酚和1mM葡萄糖的NMS液体培养基，取上述培养液(微生物计数大约106细胞/毫升)各40μl接种。加入100ppm TCE，随后用覆以特氟隆的硅隔膜和铝盖迅速密封小管。小管于30℃振荡培养，以气相色谱按时对气相进行分析。结果于图2中示出。
每种微生物在10天内降解了培养液中超过60％的TCE。当将该降解能力与已知TCE降解微生物相比较时，只有两篇报道提到超过30ppm的TCE。其中，洋葱假单胞菌KK01(日本未审查专利出版号6-296711)据报道可在2天内降解30ppm TCE下降至大约15ppm(50％)，而真养产碱菌KS01据报道在细胞浓度为108细胞/毫升时，能在4天内降解50ppm TCE至低于气相色谱检测水平。相形之下，由于N151、N15-2和N16-1能降解浓度高达100ppm的TCE，而且每一细胞的降解能力也较高，因而除了在实际应用时能够适应较宽的污染浓度范围之外，还具有能够降低费用的优点，因为所需的微生物量大大减少了。实施例4.在液体培养基中降解DCE
菌株N15-1、N15-2和N16-1均接种5ml补加有0.02％酵母提取物、500ppm酚和1mM葡萄糖的NMS液体培养基。30℃培养2天后，1/100体积的培养液被加入含4ml加有30ppm顺式-1，2-DCE的同样培养液的小管中，30℃培养5天。结果于图3中示出。三种菌株均可见降解超过99％的DCE。实施例5.降解期间温度的影响
菌株N15-1、N15-2和N16-1均接种5ml补加有0.02％酵母提取物、500ppm酚和1mM葡萄糖的NMS液体培养基中。30℃培养2天后，1/100体积的培养液被加入含4ml加有30ppm TCE的同样培养液的小管中，随后在16到30℃培养8天。对N16-1和N15-1来说，在各种温度TCE均被降解至低于检测水平。而对N15-2来说，尽管16℃时残留有大约30％的TCE，但在20℃或更高温度时，残余量低于检测水平。因而，这表明这些微生物能在土壤温度(15到20℃)下降解TCE。实施例6.降解期间pH的影响
菌株N15-1、N15-2和N16-1均接种5ml补加有0.02％酵母提取物、500ppm酚和1mM葡萄糖的M9液体培养基(pH7.0)。30℃培养2天后，1/100体积的培养液被加入含4ml培养基的小管中，培养基pH被调整为5-10，其中补加有30ppm TCE而不是酚，随后于30℃培养5天。N15-1、N15-2和N16-1在各种pH时均降解30ppm TCE至低于检测水平。另外，尽管N16-1的生长在pH7.4或更高时受到抑制，但它在pH5到7之间降解TCE至低于检测水平。实施例7.土壤中TCE降解试验
10g Andsols(样品取自Aichi prefecture并风干)加入体积为30ml的小管中，随后加入TCE至浓度为20ppm。菌株N15-1、N15-2和N16-1均接种20ml补加有0.02％酵母提取物、500ppm酚和1mM葡萄糖的NMS液体培养基。30℃振荡培养3天，通过离心由培养液中收集微生物细胞，细胞重悬于适当体积、不含酚的NMS培养基中，上述小管接种细胞的量为108到109细胞/克，加入悬液后水分含量为25％。用外罩覆以特氟隆包皮的螺旋盖盖住小管，振荡，小管于30℃温育7天。
称取10g土壤，置于带塞子的锥形瓶中，随后加入90ml以通过活性炭的空气充气的离子交换水、5ml磷酸和10ml正己烷。将烧瓶密闭后，在超声净化器中超声处理20分钟，随后于摇床上摇5分钟。之后，将水相和正己烷相转移至有盖比色杯中。将比色杯密封，进行超声处理，分离的正己烷相通过气相色谱分析。结果示于图4中。
初始浓度为10ppm的TCE在7天内降解了30％到50％。因而，本发明的微生物即使在天然环境中也具有降解能力。所以，通过将土壤与本发明的微生物和水接触有可能使污染的土壤净化。并且，该方法无需直接将酚等激活剂加入土壤中而使土壤净化。实施例8.土壤中的TCE降解试验
10g Andsols(样品取自Aichi prefecture并风干)置于体积为30ml的小管中，随后加入TCE至浓度为20ppm。菌株N15-1、N15-2和N16-1均接种20ml NMS液体培养基，培养基中补加有0.02％的酵母提取物、500ppm酚和1mM葡萄糖。随后于30℃振荡培养1天。
取出0.2ml该培养液，加入上述小管中，使得接种微生物的细胞量为106细胞/克，加入培养基后水分含量为40％，酚浓度为500ppm。用外罩覆以特氟隆包皮的螺旋盖盖住小管并振荡，培养液于30℃培养3个星期。结果示于图5中。40％到50％的TCE被降解，说明本发明的微生物即使在106细胞/克的低浓度下也能降解取自天然环境的土壤中的TCE。实施例9.激活剂对降解活性的诱导
菌株N15-1、N15-2和N16-1均于30℃在5ml NMS液体培养基中培养2天，培养基中补加有0.2％酵母提取物和5mM葡萄糖。向小管中加入4ml NMS液体培养基，培养基中补加有0.02％酵母提取物、1mM葡萄糖和100ppm表4中所列的一种激活剂，随后以40μl上述每一种培养液(微生物计数为约106细胞/克)接种。向每一小管中加入30ppmTCE，随后用覆以特氟隆的硅隔膜和铝盖迅速密封小管。小管于30℃振荡培养5天，气相以气相色谱分析。结果示于表5中。表中数字表示加入微生物期间残余TCE浓度的百分比，未加入微生物时的TCE浓度为100％。结果示于以下表3中。
表3
化合物 微生物菌株
N16-1 N15-1 N15-2环己醇 8.6 57.4 64.1环戊醇 49.3 100 100邻氨基苯甲酸 13.3 105 107咖啡酸 52.6 96.7 102辛二酸 7.3 99.8 100马来酸 53.0 100 98.8延胡索酸 63.4 100 100琥珀酸 63.3 72.4 92.4丙二酸 45.2 100 100反-3-己酸 2.7 100 100己酸 8.3 100 100苯 0 98.8 97.3乙苯 28.7 98.4 101苄醇 0 71.9 72.5水杨苷 0 102 105烯丙基酚 0.5 100 102邻甲氧基苯酚 35.0 99.2 107甲苯 0 100 100苯甲醛 6.8 103 99.0对羟基苯甲酸 12.5 102 98.8
N15-1和N15-2被酚、甲苯和苯等芳香族化合物激活，这些化合物是已知的常规激活诱导剂，N15-1和N15-2也被非芳香族化合物环己醇激活。另外，琥珀酸也表现出激活这些微生物的能力。并且，N16-1也被环戊醇、邻氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸、辛二酸、反式-3-己酸以及己酸等直链羧酸激活。
并且，本发明的菌株N15-1、N15-2和N16-1与已知的洋葱伯克霍尔德氏菌KK01和G4的特性比较示于以下表4中。
表4
特性 洋葱伯克霍尔德氏菌 伯克霍尔德氏菌属
KK01 G4 N15-1，2 N16-1降解能力 30-＞15/2天 1-＞0.17/1天 100-＞40/2天 100-＞45/天，
机体数目未知 3×108细胞 108细胞 108细胞/毫升
/毫升 /毫升最大TCE浓度 30 2 100 100
(ppm)激活剂 甲苯、酚、 甲苯、酚 甲苯不激活 甲苯、甲酚
甲酚 甲酚 酚、甲酚、环己 环己醇、辛二酸
醇 其它运动性 + - + +
根据本发明，本发明的微生物能降解水或土壤中所含的高浓度卤代烃，如TCE和DCE，优选在至少一类激活剂和糖或其它营养物质存在下进行降解。
根据本发明中净化水或土壤的方法，除了具有生物技术的优势，如不需大量能量和防止产生二次污染之外，本发明的方法还能够在天然环境中工业化地有效净化卤代烃污染的水或土壤。实施例10.在液体培养中降解三氯乙烯
菌株N15-1、N15-2和N16-1分别在补加有0.2％酵母提取物和5mM葡萄糖的NMS液体培养基中培养1天。每一小管中加入4ml补加有0.02％酵母提取物、100ppm酚和1mM葡萄糖的NMS液体培养基，如上准备的40μl培养物接种小管(大约106细胞/毫升培养基)。向小管中加入三氯乙烯使其浓度为30ppm，小管以覆以特氟隆的硅塞子和铝盖封闭。小管于30℃振荡温育，小管中气相定期以气相色谱进行分析。结果，在18小时内三氯乙烯100％被降解。