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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811089339.8 (22)申请日 2018.09.18 (71)申请人 中国水产科学研究院长江水产研究 所 地址 430223 湖北省武汉市东湖高新武大 园一路8号 (72)发明人 何勇凤杨德国朱永久吴兴兵 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种用于圆口铜鱼亲子鉴定的微卫星标记 方法 (57)摘要 本发明公开了。
2、一种用于圆口铜鱼亲子鉴定 的微卫星标记方法， 步骤是： (1)提取圆口铜鱼家 系样本DNA； (2)圆口铜鱼多态性微卫星引物的筛 选： 根据圆口铜鱼野生个体扩增效果， 从文献记 载的40对引物中筛选得到20对多态性微卫星引 物； (3)圆口铜鱼荧光标记微卫星PCR扩增和多重 毛细管电泳： 将筛选到的20对微卫星引物标记上 不同的荧光物质， 利用此荧光引物对圆口铜鱼家 系DNA样品进行降落PCR扩增， 对PCR扩增产物组 成多重组合进行毛细管电泳； (4)圆口铜鱼亲子 鉴定分析： 根据电泳结果， 读取亲本和子代的基 因型数据， 确定待测子代与亲本间的亲子关系。 方法易行、 简便， 为圆口铜鱼家系。
3、管理、 种群遗传 管理和增殖放流效果评估提供一种新的技术手 段。 权利要求书3页 说明书8页 附图2页 CN 108998547 A 2018.12.14 CN 108998547 A 1.一种用于圆口铜鱼亲子鉴定的微卫星标记方法， 其步骤是： (1)提取圆口铜鱼亲本和子代个体的DNA： 剪取圆口铜鱼亲本鳍条组织及子代全鱼个 体， 采用试剂盒提取样本基因组DNA， 置于-19-21保存备用； (2)圆口铜鱼多态性微卫星引物的筛选： 根据圆口铜鱼引物序列， 合成40对非荧光标记 引物， 通过对65尾圆口铜鱼野生个体进行PCR扩增， 筛选出条带清晰、 扩增稳定、 特异性强、 杂合度高的引物， 共筛。
4、选出20对圆口铜鱼微卫星引物： CG29、 CG14、 CG10、 CG27、 CG09、 YT10、 CG08、 MFW1、 CG05、 CG06、 YT07、 CG30、 CG23、 RM2、 CG12、 CCA90、 CG18、 YT03、 CG25、 CG17； (3)圆口铜鱼荧光标记微卫星PCR扩增和多重毛细管电泳： 将步骤(2)筛选得到的20对 微卫星引物中每对引物的正向引物的5 端标记上不同的荧光物质， 其中CG09、 YT10、 CG06、 YT07、 CG23、 RM2、 YT03的荧光物质为FAM， CG29、 CG27、 MFW1、 CG30、 CG25、 CG17的荧光。
5、物质为 HEX， CG14、 CG10、 CG08、 CCA90的荧光物质为ROX， CG05、 CG12、 CG18的荧光物质为TMR， 利用此 荧光引物对步骤(1)获得的DNA样品进行降落PCR扩增， 对PCR扩增产物进行不同浓度的稀 释， 组成多重组合， 在测序仪上进行毛细管电泳， 读取个体等位基因大小， 获取基因分型数 据； (4)圆口铜鱼亲子鉴定分析： 将步骤(3)获得的基因型数据转换成数字基因型格式， 利 用软件Cervus v.3.0对数据进行分析， 根据待测子代基因型和亲本基因型之间的相关性， 确定待测子代与亲本间的亲子关系。 2.根据权利要求1所述的一种用于圆口铜鱼亲子鉴定的。
6、微卫星标记方法， 其特征在于： 所述的圆口铜鱼微卫星引物序列、 荧光物质和多重毛细管电泳组合信息： 权利要求书 1/3 页 2 CN 108998547 A 2 权利要求书 2/3 页 3 CN 108998547 A 3 3.根据权利要求1所述的一种用于圆口铜鱼亲子鉴定的微卫星标记方法， 其特征在于： 所述的步骤(3)中降落PCR对圆口铜鱼家系样本进行微卫星标记扩增反应， 降落PCR扩增程 序中前10个循环使用6252touch down退火温度， 后22个循环使用52退火温度。 4.根据权利要求1所述的一种用于圆口铜鱼亲子鉴定的微卫星标记方法， 其特征在于： 所述的步骤(3)中多重毛细管电。
7、泳对圆口铜鱼微卫星PCR扩增产物进行不同荧光信号检测， 首先根据微卫星位点PCR扩增产物大小对其进行不同的荧光标记， 其次根据PCR扩增产物浓 度值对其进行稀释， 两两组合后进行毛细管电泳检测和基因分型。 权利要求书 3/3 页 4 CN 108998547 A 4 一种用于圆口铜鱼亲子鉴定的微卫星标记方法 技术领域 0001 本发明属于分子标记技术领域， 更具体涉及一种用于圆口铜鱼亲子鉴定的微卫星 标记方法。 背景技术 0002 圆口铜鱼(Coreius guichenoti(Sauvage et Dabry) ， 隶属于鲤形目 (Cypriniformes)、 鲤科(Cyprinidae)。
8、、 鮈亚科(Gobioninae)、 铜鱼属(Coreius)， 分布于长 江上游干流及雅砻江、 乌江等大型支流中， 是典型的河道洄游性鱼类和产漂流性卵鱼类。 圆 口铜鱼为长江上游特有鱼类， 也是重要的经济鱼类。 圆口铜鱼的产卵场仅发现于金沙江中 下游以及雅砻江干流下游， 随着长江上游水电开发的逐步实施， 不仅其完成生活史的通道 因筑坝截流而被阻断， 而且其产卵场环境有可能遭受毁灭性破坏。 同时， 由于长期的过度捕 捞， 无节制的资源掠夺， 圆口铜鱼种群资源呈现明显的下降趋势， 其物种生存与延续面临巨 大的威胁。 开展圆口铜鱼增殖放流是保护圆口铜鱼资源的重要手段。 目前， 已有多个水电工 程将。
9、圆口铜鱼列为增殖放流对象， 多家科研单位对圆口铜鱼人工驯养与繁殖技术开展攻关 研究， 并取得了突破性进展。 随着圆口铜鱼增殖放流逐步开展和人工养殖逐渐增多， 如何快 速有效地鉴别不同的圆口铜鱼家系及来源， 是高效评估圆口铜鱼增殖放流效果、 加强养殖 及自然种群遗传管理以防止近亲交配导致其种群遗传多样性下降的关键技术支撑。 0003 微卫星标记(simple sequence repeats,SSR)具有多态性高、 杂合度高、 稳定性 好、 遵循孟德尔分离定律、 共显性遗传等特点， 不仅是一种广泛应用的遗传学分子标记， 而 且由于方法简单、 结果可靠、 省时省力， 在亲子鉴定中得到了较多的应用。。
10、 但目前， 还没有将 微卫星标记应用于圆口铜鱼亲子鉴定的报道。 本发明旨在利用微卫星荧光标记建立圆口铜 鱼亲子鉴定技术， 为圆口铜鱼的家系管理、 种群遗传管理和增殖放流效果评估提供依据。 经 检索未发现一种用于圆口铜鱼亲子鉴定的微卫星标记方法被公开和使用。 发明内容 0004 本发明的目的是在于提供了一种用于圆口铜鱼亲子鉴定的微卫星标记方法， 方法 易行、 简便， 该方法可以为圆口铜鱼家系管理、 种群遗传管理和增殖放流效果评估提供一种 新的技术手段。 该技术方案中圆口铜鱼个体DNA提取可用酚-氯仿方法、 高盐法或其他基因 组DNA提取试剂盒替代。 0005 为了实现上述的目的， 本发明采用以下。
11、技术措施： 0006 一种用于圆口铜鱼亲子鉴定的微卫星标记方法， 其步骤是： 0007 (1)提取圆口铜鱼亲本和子代个体的DNA； 剪取圆口铜鱼亲本鳍条组织及子代全鱼 个体， 采用Omega Bio-Tek公司的Tissue DNA Kit(D3396)试剂盒提取样本基因组DNA， 置 于-19-21保存备用； 0008 (2)圆口铜鱼多态性微卫星引物的筛选： 根据现有文献记载的圆口铜鱼引物序列， 合成40对非荧光标记引物， 通过对65尾圆口铜鱼野生个体进行PCR扩增， 筛选出条带清晰、 说明书 1/8 页 5 CN 108998547 A 5 扩增稳定、 特异性强、 杂合度高的引物， 本发明。
12、共筛选出20对圆口铜鱼微卫星引物： CG29、 CG14、 CG10、 CG27、 CG09、 YT10、 CG08、 MFW1、 CG05、 CG06、 YT07、 CG30、 CG23、 RM2、 CG12、 CCA90、 CG18、 YT03、 CG25、 CG17； 0009 (3)圆口铜鱼荧光标记微卫星PCR扩增和多重毛细管电泳： 将步骤(2)筛选得到的 20对微卫星引物中每对引物的正向引物的5 端标记上不同的荧光物质， 其中CG09、 YT10、 CG06、 YT07、 CG23、 RM2、 YT03的荧光物质为FAM， CG29、 CG27、 MFW1、 CG30、 CG25、 。
13、CG17的荧光物 质为HEX， CG14、 CG10、 CG08、 CCA90的荧光物质为ROX， CG05、 CG12、 CG18的荧光物质为TMR， 利 用此荧光引物对步骤(1)获得的DNA样品进行降落PCR扩增， 对PCR扩增产物进行不同浓度的 稀释， 组成多重组合， 在测序仪上采用多重毛细管电泳方式对圆口铜鱼微卫星PCR扩增产物 进行不同荧光信号检测， 读取个体等位基因大小， 获取了基因分型数据。 请见表1： 圆口铜鱼 微卫星引物序列、 荧光物质和多重毛细管电泳组合信息。 0010 (4)圆口铜鱼亲子鉴定分析： 将步骤(3)获得的基因型数据转换成数字基因型格 式， 利用软件Cervus。
14、 v.3.0(Kalinowski et al.2007)对数据进行分析， 根据待测子代基因 型和亲本基因型之间的相关性， 确定待测子代与亲本间的亲子关系。 0011 通过上述四个步骤的技术措施： 最关键的步骤有两个， 分别是(1)采用降落PCR (touch down PCR)方式对圆口铜鱼家系样本进行微卫星标记扩增反应， 降落PCR扩增程序 中前10个循环使用6252touch down退火温度， 后22个循环使用52退火温度， 显著 且批量地提高了扩增效果； (2)采用多重毛细管电泳方式对圆口铜鱼微卫星PCR扩增产物进 行不同荧光信号检测， 首先根据微卫星位点PCR扩增产物大小对其进行不。
15、同的荧光标记， 其 次根据PCR扩增产物浓度值对其进行稀释， 两两组合后进行毛细管电泳检测和基因分型， 降 低了时间成本， 提高了检测效果， 避免了多种荧光信号间的干扰。 0012 本发明与现有技术相比， 具有以下优点和有益效果： 0013 (1)本发明利用荧光微卫星标记与多重毛细管电泳技术结合， 通过测序仪分型， 对 圆口铜鱼家系进行高通量个体识别和亲子关系分析； 0014 (2)本发明采用降落PCR(touch down PCR)方式对圆口铜鱼家系样本进行微卫星 标记扩增， 相比文献记载， 优化了退火温度的设置， 显著且批量地提高了扩增效果； 0015 (3)本发明一次毛细管电泳可以检测2。
16、个位点， 相对单位点检测， 效率提高了2倍， 费用下降为原来的二分之一左右， 相对多重PCR产物检测， 降低了时间成本， 提高了检测效 果， 避免了多种荧光信号间的干扰； 0016 (4)本发明的建立为圆口铜鱼家系管理、 种群遗传管理和增殖放流效果评估提供 了一种新的技术手段。 附图说明 0017 图1为引物CG05测序图(依次为亲本F1(基因型为182/187)、 亲本M1(基因型为176/ 182)、 子一代Z1-1(基因型为176/182)， 子一代两个等位基因分别来自父本和母本， 符合孟 德尔分离定律 0018 图2为引物RM2测序图(依次为亲本F1(基因型为131/147)、 亲本M。
17、1(基因型为135/ 135)、 子一代Z1-1(基因型为135/147)， 子一代两个等位基因分别来自父本和母本， 符合孟 德尔分离定律 说明书 2/8 页 6 CN 108998547 A 6 0019 图3为引物CG17测序图(依次为亲本F1(基因型为166/166)、 亲本M1(基因型为162/ 166)、 子一代Z1-1(基因型为162/166)， 子一代两个等位基因分别来自父本和母本， 符合孟 德尔分离定律 0020 图4为引物CG23测序图(依次为亲本F1(基因型为162/162)、 亲本M1(基因型为158/ 158)、 子一代Z1-1(基因型为158/162)， 子一代两个等。
18、位基因分别来自父本和母本， 符合孟 德尔分离定律 0021 图5为引物CCA90测序图(依次为亲本F1(基因型为205/209)、 亲本M1(基因型为 205/209)、 子一代Z1-1(基因型为205/205)， 子一代两个等位基因分别来自父本和母本， 符 合孟德尔分离定律 具体实施方式 0022 实施例1： 0023 下面结合实例， 对本发明作进一步说明。 0024 一种用于圆口铜鱼亲子鉴定的微卫星标记方法， 其步骤是： 0025 (1)提取圆口铜鱼亲本和子代个体的DNA： 采集8个家系样本(包括22尾真正亲本及 其子代297尾)， 同时选取20尾非亲本样本作为候选亲本， 其中8个家系样本。
19、包括5个全同胞 家系、 1个半同胞家系和2个混合家系。 采用无水乙醇保存圆口铜鱼亲本的鳍条组织及子代 刚孵化出膜的全鱼个体样本， 采用Omega Bio-Tek公司的Tissue DNA Kit(D3396)试剂盒提 取样本基因组DNA， 具体步骤如下： 选取圆口铜鱼鳍条或全鱼样本30mg左右， 经双蒸水洗涤 后放入1.5mL灭菌离心管中， 充分剪碎后加入200 L TL Buffer和25 L OB Protease Solution， 在55水浴锅中消化2-3h， 直至组织完全消化； 放入离心机， 以12000rpm速度离 心5min， 将上清液转移至新的1.5mL灭菌离心管中； 加入22。
20、0 L BL Buffer， 充分混匀， 在70 恒温水槽中培育10min； 加入220 L的无水乙醇， 充分混匀； 将HiBind DNA微柱插入2ml回 收管中， 将上述溶液全部转移至HiBind DNA微柱中， 以13800rpm速度离心1min， 弃滤液， 重 复使用回收管； 加入500 L HBC Buffer， 以13800rpm速度离心30s， 弃滤液和回收管； 将 HiBind DNA微柱插入新2ml回收管中， 加入700 L DNA Wash Buffer， 以13800rpm速度离心 30s， 弃滤液， 重复使用回收管； 加入700 L DNA Wash Buffer， 以。
21、13800rpm速度离心30s， 弃 滤液和回收管； 将HiBind DNA微柱插入新1.5mL灭菌离心管中， 加入50-100 L 70的 Elution Buffer， 室温(2025， 以下相同)下放置2min， 以13800rpm速度离心1min， 重复 使用1.5mL灭菌离心管； 加入50-100 L 70的Elution Buffer， 室温下放置2min， 以 13800rpm速度离心1min， 收集所有洗提后的DNA； 测定DNA浓度， 将样本置于-19或-20或-21 保存备用。 0026 (2)圆口铜鱼多态性微卫星引物的筛选： 根据现有文献记载的圆口铜鱼引物序列， 合成40。
22、对非荧光标记引物， 通过对65尾圆口铜鱼野生个体进行PCR扩增， 筛选出条带清晰、 扩增稳定、 特异性强、 杂合度高的引物。 其PCR反应体系为： 7.5 L 2Power Taq PCR MasterMix、 0.5 L模板基因组DNA(浓度50ng/ L)、 上下游引物各1 L(浓度10p)、 5 L ddH2O， PCR扩增程序为： 95预变性5min； 95变性30s， 6252touch down退火30s， 72延伸 30s， 进行10个循环； 95变性30s， 52退火30s， 72延伸30s， 进行22个循环； 最后72再 延伸20min。 取2 L PCR产物进行琼脂糖凝胶(。
23、1浓度)电泳， 检测PCR效果。 采用软件Cervus 说明书 3/8 页 7 CN 108998547 A 7 v.3.0(Kalinowski et al.2007)中Allele frequency analysis计算各微卫星标记的等位 基因数(Na)、 期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)。 本发明共筛选出20对可用圆口铜鱼微 卫星引物： CG29、 CG14、 CG10、 CG27、 CG09、 YT10、 CG08、 MFW1、 CG05、 CG06、 YT07、 CG30、 CG23、 RM2、 CG12、 CCA90、 CG18、 YT03、 CG25、 CG17。 有。
24、关圆口铜鱼微卫星引物序列、 遗传多样性指标 等信息， 请见表1； 0027 表1.圆口铜鱼微卫星引物序列、 荧光物质和多重毛细管电泳组合信息 0028 说明书 4/8 页 8 CN 108998547 A 8 0029 说明书 5/8 页 9 CN 108998547 A 9 0030 0031 (3)圆口铜鱼荧光标记微卫星PCR扩增和多重毛细管电泳： 将步骤(2)筛选得到的 20对微卫星引物中每对引物的正向引物的5 端标记上不同的荧光物质， 其中CG09、 YT10、 CG06、 YT07、 CG23、 RM2、 YT03的荧光物质为FAM， CG29、 CG27、 MFW1、 CG30、 。
25、CG25、 CG17的荧光物 质为HEX， CG14、 CG10、 CG08、 CCA90的荧光物质为ROX， CG05、 CG12、 CG18的荧光物质为TMR， 利 用此荧光引物对步骤(1)获得的圆口铜鱼家系DNA样品进行降落PCR扩增， 降落PCR扩增程序 为： 95预变性5min； 95变性30s， 6252touch down退火30s， 72延伸30s， 进行10 个循环； 95变性30s， 52退火30s， 72延伸30s， 进行22个循环； 最后72再延伸20min。 PCR结束后， 取2 LPCR扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳检测， 根据电泳检测结果进行浓度鉴 定， 根据浓度鉴定。
26、值对产物进行一定稀释， 组成二重组合(表1)， 最后各取1 L稀释PCR产物 加入到7 L含有荧光内标LIZ500的甲酰胺中， 使用测序仪ABI 3730XL对产物进行毛细管荧 光电泳检测和基因分型。 有关圆口铜鱼微卫星标记荧光物质和多重毛细管电泳组合信息， 请见表1。 0032 (4)圆口铜鱼亲子鉴定分析： 根据测序仪分型结果， 利用软件GeneMarker v.2.2.0 (Holland and Parson,2011)读取个体等位基因大小， 并加以人工校正， 将获得的基因型数 据转换成数字基因型矩阵。 采用软件Cervus v.3.0(Kalinowski et al.,2007)对基。
27、因型数 据进行等位基因频率分析、 模拟分析和亲子分析， 通过似然率检验待测子代基因型与亲本 基因型之间的相关性， 确定待测子代与亲本间的亲子关系。 结果显示， 当双亲基因型未知 时， 20个位点的累积排除概率(CE-1P)为0.999543730； 当已知单亲基因型时， 20个位点的累 积排除概率(CE-2P)为0.999998250； 当已知双亲基因型时， 20个位点的累积排除概率(CE- PP)为1.000000000。 圆口铜鱼20个微卫星位点遗传多样性和排除概率信息， 请见表2。 亲子 分析显示8个家系中297尾子代均能正确找到其父母本， 鉴定准确率为100， 所有个体的 LOD值均大。
28、于0， 置信度达到95的子一代个体数量占97.0。 圆口铜鱼部分子代个体的亲 子鉴定结果， 请见表3。 0033 表2.圆口铜鱼20个微卫星位点遗传多样性和排除概率信息 说明书 6/8 页 10 CN 108998547 A 10 0034 0035 注： NS表示不显著偏离(P0.05)， *表示极显著偏离(P0.001)， *表示显著偏 离(P0.01)， *表示显著偏离(P0.05) 0036 表3.圆口铜鱼部分子代个体的亲子鉴定结果 0037 说明书 7/8 页 11 CN 108998547 A 11 0038 0039 因此， 上述结果表明， 利用本发明建立的荧光微卫星标记方法能高效快捷地实现 圆口铜鱼的亲子鉴定分析， 鉴定准确率为100， 可满足圆口铜鱼家系管理、 种群遗传管理 和增殖放流效果评估的要求。 说明书 8/8 页 12 CN 108998547 A 12 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 13 CN 108998547 A 13 图4 图5 说明书附图 2/2 页 14 CN 108998547 A 14 。