两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基因连锁新标记的开发及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102154413 A (43)申请公布日 2011.08.17 CN 102154413 A *CN102154413A* (21)申请号 200910157263.2 (22)申请日 2009.07.06 CGMCC No.3160 2009.07.03 C12P 19/34(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院生物技术研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号 申请人 郭三堆 (72)发明人 郭三堆 侯思宇 张锐 (54) 发明名称 两个与陆地棉细胞质雄。

2、性不育恢复基因连锁 新标记的开发及应用 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 一 种 利 用 SSR 和 STS 技 术 筛选棉花细胞质雄性不育恢复基因连锁的 分子标记的方法和应用。包括步骤 ： a) 构建 (P30AY18R)P30B 回交群体 BC1F1代共 369 个 单株。育性分离比符合 1 1， 由一对显性基因控 制。 b)SDS-CTAB法提取(P30AY18R)P30B回交 群体 BC1F1代共 369 个单株叶片基因组 DNA。分别 构建可育和不育 DNA 混合池， 每个 DNA 混合池由 5 个单株构成。c)SSR 分析或 STS 分析， 并同收 SSR 或 STS 标记扩增的。

3、特异 DNA 片段测序。d) 数据分 析。本发明公开了两个与棉花细胞质雄性不育恢 复基因连锁的新标记， 所述分子标记具有 SEQ ID No.5 和 SEQ ID No.6 的核苷酸序列 ； 所述分子标 记的引物对具有 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 或 SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列。 另外， 本发明也公开了所述棉花细胞质雄性不育恢复基 因连锁分子标记在恢复系分子鉴定中的应用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 2 页 CN 102。

4、154414 A1/2 页 2 1.两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基因连锁新标记MGHES28和STSHY27的开发。 其 步骤包括 ： a). 构建 (P30AY18R)P30B 回交群体 BC1F1代共 369 个单株， 田间调查育性分离， 可 育株为 180 株， 不育株为 189 株， 卡方测验 (X2 0.11， P 0.95) 结果表明， 可育与不育分 离比例为 1 1， 完全符合一对显性基因控制的模型。 b).SDS-CTAB 法提取回交群体 BC1F1代共 369 个单株的棉花叶片基因组 DNA。构建可育 和不育 DNA 混合池， 每个混合池由 5 个单株构成。所有构建的可育和。

5、不育 DNA 混合池用于 SSR 和 STS 标记分析。 c).MGHES28 和 STSHY27 标记分析回交群体可育和不育 DNA 混合池， 进一步分析回交群 体中不育单株出现的重组体。MGHES28 和 STSHY27 标记扩增可育 DNA 混合池的特异 DNA 片 段回收测序。 d). 数据分析。 2. 两个新标记 MGHES28 和 STSHY27 应用于棉花恢复系的分子鉴定。 a) 提取不同棉花恢复系 (R1， R2， R3， R4 和 R5)、 保持系 (B1， B2， B3， B4 和 B5) 和不育系 (A1， A2， A3， A4 和 A5) 叶片基因组 DNA。 b) 以。

6、不同棉花恢复系 (R1， R2， R3， R4 和 R5)、 保持系 (B1， B2， B3， B4 和 B5) 和不育系 (A1， A2， A3， A4 和 A5) 叶片基因组 DNA 为模板， MGHES28 和 STSHY27 标记进行 PCR 扩增， 产 物分别在 5.0聚丙烯胺和 1.0的琼脂糖凝胶电泳检测。 c)MGHES28和STSHY27标记在恢复系中扩增的特异DNA片段可明显的区分恢复系、 保持 系和不育系。 3. 根据权利要求 1 的分子标记 MGHES28 引物， 其特征在于 ： 具有 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 的核苷酸序列。 4. 根据权利要求。

7、 1 的分子标记 STSHY28 引物， 其特征在于 ： 具有 SEQ ID No.3 和 SEQ ID No.4 的核苷酸序列。 5. 根据权利要求 1 或 2 或 3 的分子标记 MGHES28， 其特征在于 ： 具有 SEQ ID No.5 的核 苷酸序列。 6. 根据权利要求 1 或 2 或 4 的分子标记 STSHY27， 其特征在于 ： 具有 SEQ ID No.6 的核 苷酸序列。 7. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述分子标记具有 SEQ ID No.5 的核苷 酸序列。 8. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述分子标记具有 SEQ ID 。

8、No.6 的核苷 酸序列。 9. 用于 SSR 分析来获得与棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记 MGHES28 引物对， 其特征在于具有 SEQ ID No.1 或 SEQ ID No.2 的核苷酸序列。用于 STS 分析来获得与棉花 细胞质雄性不育恢复基因的分子标记STSHY27引物对， 其特征在于具有SEQ ID No.3或SEQ ID No.4 的核苷酸序列。 10. 根据权利要求 9 所述用来 SSR 分析获得棉花细胞质雄性不育恢复基因分子标记 MGHES28 引物对扩增的特异 DNA 片段。其特征在于 ： 所获得的分子标记引物对扩增的特异 DNA 片段具有 SEQ ID No.5 。

9、的核苷酸序列。 权 利 要 求 书 CN 102154413 A CN 102154414 A2/2 页 3 11. 根据权利要求 9 所述用来 STS 分析获得棉花细胞质雄性不育恢复基因分子标记 STSHY27 引物对扩增的特异 DNA 片段。其特征在于 ： 所获得的分子标记引物对扩增的特异 DNA 片段具有 SEQ ID No.6 的核苷酸序列。 权 利 要 求 书 CN 102154413 A CN 102154414 A1/9 页 4 两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基因连锁新标记的开发 及应用 0001 技术领域 本发明属于棉花育种领域， 涉及两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基 因连锁的。

10、新标记引物序列、 特异序列和制备技术及应用。利用这些引物序列和特异序列进 行棉花三系恢复基因的遗传鉴定、 分子遗传连锁图构建和棉花恢复基因分子标记辅助育 种， 本发明公开了两个标记引物序列及扩增 DNA 片段序列。 0002 背景技术 利用棉花细胞质雄性不育生产杂交种具有省工、 省时和成本低等优 点， 因此 “三系” 配套生产棉花杂交种已成为一种必然趋势。目前国内外已经选育出了哈 克尼西棉、 三裂棉、 异常棉、 亚洲棉和陆地棉等不育系， 其中哈克尼西棉、 三裂棉和陆地棉 的不育系实现了三系配套。已有研究表明哈克尼西棉不育胞质对杂种后代的产量有不利 影响， 在生产应用上没有取得实质性进展。200。

11、5 年， 本课题组首次研究培育出了第一个 国家审定的比常规抗虫棉增产 26.4的三系杂交抗虫棉新品种， 在生产上不但解决了棉 铃虫的危害， 而且促使棉花产量大幅度的提高。目前国内外报道了哈克尼西棉、 三裂棉、 104-7A 和晋 A 不育系恢复基因的遗传连锁的分子标记。Guo 等 (1998 年 ) 使用 RAPD-PCR 技术分析 (0-613-2RSimian3) 的 BC3回交群体中找到了一个与恢复基因紧密连锁的标记 OPV-15300， 并计算出与恢复基因的重组率为 13.02.57。Lan 等 (2001 年 ) 人同样也使 用了 RAPD-PCR 技术， 通过分析一对近等基因系 H。

12、AF277( 恢复系 ) 和 DELCOT277(CMS)， 发现 了 1 个与 Rf 连锁的 RAPD 标记 UBC6592， 其与 Rf 遗传距离为 2.3cM ； 这个标记克隆测序后被 定位到 RFLP 高密度图谱上， 连锁分析表明这个标记与 Rf 基因的遗传距离为 6.0cM。Liu 等 (2003 年 ) 使用 BSA 和 GRA 结合的方法， 对陆地棉细胞质不育系和恢复系杂交 F1 代自交后 的 F2 代群体进行 RAPD 和 SSR 筛选， 结果找到 3 个 SSR 标记和 2 个 RAPD 标记与 Rf1紧密连 锁， 但与恢复基因 Rf1没有共分离， 并使用非整倍体将 Rf1基。

13、因定位在第 4 条染色体的长臂 上。Zhang(2001 年 ) 使用 RAPD 标 记和 BSA 分析 CMS-D8 恢复系， 找到了与 Rf2紧密连锁的 标记 UBC1113000和 UBC188500， 遗传连锁分析 UBC188500与 Rf2的平均遗传距离为 2.9cM ； 并同 另外两个标记 UBC169700和 UBC6591500共同转化为 STS 标记。Feng C D 等 (2005 年 ) 使用 RAPD 和 BSA 技术分析 (B416RArk8518)Ark8518 群体 ( 恢复系 B416R 携带有 D2-2 染色 体组上恢复基因 Rf1)， 发现 3 个 RAP。

14、D 标记 UBC1471400， UBC607500和 UBC679700与 Rf1紧密连 锁， 其中 UBC169700和 UBC169800与 Rf1的遗传距离为 4.5cM， UBC6591500距离 Rf1为 2.7cM， 并 将其转化为 STS 标记。Yin 等 (2006 年 ) 在三个 BC1同交群体 ( 不育系亲本的遗传来源为 104-7A) 中筛选了 2250 对 SSR 引物， 找到 5 个新的与 Rf1基因紧密连锁的 SSR 标记， 并将 前人发表的 3 个 STS 标记整合构建了包含有 13 个与恢复基因相关标记的高精细分辨率遗 传图谱， 构建了恢复系的 BAC 文库，。

15、 使用这些标记为探针从 BAC 文库中筛选到 50 个克隆， 平 均每个克隆的插入片段大小为 120Kb， 并将遗传图谱和物理图谱紧密联系起来， 最终将 Rf1 基因定位在两个 BAC 克隆重叠区域的 100Kb 之间。Wang 等 (2007 年 ) 人使用 RAPD、 AFLP、 STS、 CAPS 和 SSR 标记技术分析了 (D8SG747)SG747 群体， 发现了三个新的 RAPD 标记 UBC352900、 UBC683500、 UBC722750和一个 SSR 标记 CIR179250， 并将 UBC722750转化为 CAPS 标记， 使用 PPR 基序设计的保守引物与 AF。

16、LP 组合测试回交群体得到一个 PPR-AFLP 标记与恢复基 说 明 书 CN 102154413 A CN 102154414 A2/9 页 5 因 Rf2连锁， 结合 9 个与 Rf2紧密连锁的分子标记构建了与 Rf2紧密连锁的遗传图谱 ； 由于 CIR179250与 Rf2紧密连锁， 同时又与 Rf1紧密连锁， 并推测 Rf1和 Rf2都定位与 D 亚染色体 组的 LGD08 连锁群上 ( 现命名为 D5 染色体 )。李朋波等 (2007 年 ) 人对晋 A 衍生的不育 系和恢复系组配的分离群体进行遗传和定位分析， 表明 晋 A 恢复基因在 F2和 BC1的分离 比例分别符合 3 1 。

17、和 1 1， 证明恢复基因由 1 对显性基因控制， 用 9 个 SSR 标记和 4 个 STS 标记构建了长度为 83.1cM 的遗传图谱， 将恢复基因 Rf1定位于第 19 染色体上 (LGD08) 与最近的标记 CM042 和 CIR179 分别相距 5.4cM 和 10.3cM。而本课题组自主选育的抗虫三 系杂交棉亲本 P30A 细胞质雄性不育系 ( 胞质来源于 104-7A) 和 Y18R 恢复系 ( 恢复基因来 源于 0-613-2R) 的遗传背景 均不同于前四者， 申请者首次构建了其恢复基因的遗传图谱， 从棉花微卫星数据库搜索单一 EST 序列侧翼 SSR 引物， 对棉花 (P30。

18、AY18R)P30B 回交群 体进行育性分析， Mapmaker 软件计算与恢复基因连锁的遗传距离， 获得与恢复基因紧密连 锁的新标记 MGHES28 ； 基于 BAC 克隆 HZ-170-M6 右末端序列设计 STS 引物， 长度为 505bp， 对 棉花 (P30AY18R)P30B 回交群体进行育性分析， Mapmaker 软件计算与恢复基因连锁的 遗传距离， 获得与恢复基因紧密连锁的新标记 STSHY27 ； 并将两个新标记应用于恢复基因 的分子鉴定。 0003 发明内容本发明的目的在于开发与抗虫三系杂交棉恢复基因紧密连锁新的分子 标记， 将该标记应用于构建恢复基因的遗传图谱和分子标记。

19、辅助选育优良恢复系。利用该 标记有目的的发掘利用新的遗传基因资源， 拓宽恢复谱， 提高三系杂交棉优良基因的聚合 选择效率。为实现上述目的， 本发明设计以下技术措施 ： 0004 构建棉花 (P30AY18R)P30B 回交群体 BC1F1代共 369 个单株。田间调查育性分 离比例， 其中可育株为 180 株， 不育株为 189 株， 卡方测验表明 (X2 0.11， P 0.95)， 本材 料育性恢复基因由一对显性基因控制。 在此基础上申请者通过作图开发了两个新的与恢复 基因紧密连锁的分子标记 MGHES28 和 STSHY27， 可以准确的鉴定陆地棉细胞质雄性不育恢 复基因 Rf1。利用这。

20、两个新标记可用于分子标记辅助选育优良恢复系。 0005 1. 育性分离群体 DNA 混合池的构建 0006 提取棉花 (P30AY18R)P30B 回交群体 BC1F1代共 369 个单株基因组 DNA， 分别 构建不育 DNA 混合池和可育 DNA 混合池， 每个混合池由 5 个单株构成。 0007 2. 恢复基因分子标记的 PCR 引物设计 0008 申请人发明的陆地棉细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记 MGHES28 引物 序列分别为 SEQ IDNO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 ； STSHY27 引物序列分别为 SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 。

21、4。申请人所开发 的 MGHES28 标记扩增的特异 DNA 片段如序列 SEQ ID NO ： 5 所述， STSHY27 标记扩增的特异 DNA 片段如序列 SEQ ID NO ： 6 所述。 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ； 菌种保存名称 ： HZ-170-M6 ； 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路1号院， 中国科学院微生物研究所 ； 菌株分类命名 Escherichia coli ； 保藏日期 ： 2009 年 07 月 3 日 ； 保藏编号 ： CGMCCNo.3160。 0009 3.PCR 反应体系的建立 0010 EST-SSR 标记分析 0011 标。

22、准 PCR 反应体系为 20L， 组成如下 ： 0012 Template 1.0L 说 明 书 CN 102154413 A CN 102154414 A3/9 页 6 0013 10Taq buffer 2.0L 0014 dNTP(2.5mM) 1.6L 0015 Forward Primer(10M) 1.0L 0016 Reverse Primer(10M) 1.0L 0017 Taq 酶 (2.5U/L) 0.5L 0018 ddH2O 11.9L 0019 0020 Total 20L 0021 PCR 反应热循环程序为 ： 0022 1)94预变性 2min， 0023 2)9。

23、4变性 30s， 0024 3)55退火 30s， 0025 4)72延伸 30s， 0026 5)Go to step2， 35 cycle ； 0027 6)72延伸 7min。 0028 7)4保存 0029 STS 标记分析 0030 标准 PCR 反应体系为 20L， 组成如下 ： 0031 Template 1.0L 0032 10Taq buffer 2.0L 0033 dNTP(2.5mM) 1.6L 0034 Forward Primer(10M) 1.0L 0035 Reverse Primer(10M) 1.0L 0036 Taq 酶 (2.5U/L) 0.5L 0037。

24、 ddH2O 11.9L 0038 0039 Total 20L 0040 PCR 反应热循环程序为 ： 0041 1)94预变性 2min， 0042 2)94变性 30s， 0043 3)55退火 30s， 0044 4)72延伸 60s， 0045 5)Go to step2， 35 cycle 0046 6)72延伸 7min。 0047 7)4保存 0048 4. 扩增产物 DNA 片段检测 0049 1) 分别以可育 DNA 混合池和不育 DNA 混合池为模板， MGHES28 和 STSHY27 引物进 行 PCR 扩增， 产物分别在 5.0的聚丙烯胺胶和 1.0的琼脂糖胶上电泳。

25、。 0050 2) 聚丙烯胺胶电泳电压为 2000V， 预电泳 30min， 上样 8L， 电泳时间 1h。琼脂糖 说 明 书 CN 102154413 A CN 102154414 A4/9 页 7 胶电泳电压为 120V， 时间为 1h。然后在凝胶成像系统上观察电泳结果。 0051 3) 将扩增 PCR 产物回收测序。 0052 5. 标记与恢复基因遗传距离的确定 0053 1) 以构建好的同交群体不育单株 DNA 为模板， MGHES28 和 STSHY27 引物检测重组 体个数。 0054 2)， 统计分析， Mapmaker 软件计算遗传重组距离。MGHES28 标记与恢复基因遗传距。

26、 离为 2.4cM。STSHY27 与恢复基因遗传距离为 2.1cM。 0055 6. 标记应用于不同恢复系、 保持系和不育系的鉴定 0056 1) 分别以不同恢复系、 保持系和不育系 DNA 为模板， MGHES28 和 STSHY27 引物进行 PCR 扩增。扩增产物分别在 5.0的聚丙烯胺胶和 1.0的琼脂糖胶上电泳。 0057 2) 聚丙烯胺胶电泳电压为 2000V， 预电泳 30min， 上样 8L， 电泳时间 1h。琼脂糖 胶电泳电压为 120V， 时间为 1h。然后在凝胶成像系统上观察电泳结果。 0058 具体实施方式 实施例 1 ： 总 DNA 的提取 0059 参考孙鑫等报道。

27、的 SDS-CTAB 法提取棉花总 DNA。 0060 1) 提取液配制 0061 1L 提取液含 ： Tris-HCl(PH8.0) 0.1M 0062 EDTA(PH8.0) 0.02M 0063 NaCl 1.5M 0064 PVP40(w/v) 2 0065 CTAB(w/v) 2 0066 以上溶液各自溶解后混合， 定容到 1L ； 临用前加 2 - 巯基乙醇。 0067 2) 称取 0.3g 幼嫩棉花叶片放入 2mL 离心管里， 加入钢珠， 液氮速冻后， 放置于 Genegrid 研磨仪上振荡 30s， 加入 1mL 预热 65提取缓冲液。颠倒混匀。 0068 3) 将溶液置于 6。

28、5水浴中 40min ； 加等体积氯仿异戊醇 (24 1， V/V) 振 荡混匀， 4离心机 12000rpm 离心 10min， 将上清转移到另一离心管中， 用氯仿异丙醇 (24 1， V/V) 再抽提一次， 离心收集上清 ； 0069 4) 加入 0.6 倍体积的冰预冷的异丙醇， 缓慢颠倒离心管混匀， 室温静置 30min。用 毛细管将絮状 DNA 挑出， 或者直接室温 12000rpm 离心 10min， 用 70的酒精洗涤 1-2 次， 再 用 100酒精洗涤 1 次， 室温干燥 DNA。 0070 5) 加 200L TE(10mM Tris-HCl， 1mM EDTA， PH8.0。

29、) 或者纯水 (ddH2O)， 室温放置 1 小时， 或者 65水浴使 DNA 完全溶解 ； 0071 6) 加入 20L 无 DNA 酶的 RNA 酶水 (10mg/mL)， 37保温 1 小时， 用等体积的酚 氯仿异戊醇 (25 24 1， V/V) 抽提 1 2 次， 将上清转移到另一个离心管中 ； 0072 7) 加 0.1 倍体积的 3M NaAc(PH5.2)， 2 倍体积的冰预冷的无水乙醇， 混匀后放置 5 分钟。缓缓水平转离心管 5 分钟， 此时将于界面处形成一团粘稠透明的絮状沉淀用毛细管 轻轻钩出， 转移到 1.5mL 的离心管中 ； 或者直接 12000rpm 离心 10m。

30、in， 沉淀 DNA。 0073 8) 加 1mL70的酒精洗涤沉淀， 10000g 离心 10min， 去掉上清， 再用 70、 100的 酒精各洗沉淀一次， 在空气中使核酸沉淀干燥 ； 0074 9) 用 50L 的 TE 重新溶解沉淀， 于 -20或 -70贮存。 说 明 书 CN 102154413 A CN 102154414 A5/9 页 8 0075 实例 2 ： EST-SSR 标记分析 0076 育性分离群体 DNA 混合池的构建 0077 田间调查棉花 (P30AY18R)P30B 回交群体 BC1F1代共 369 个单株育性分离情 况， 分别挂牌标记可育株和不育株， 提取。

31、单株基因组 DNA， 分别构建不育和可育 DNA 混合池， 每个混合池由 5 个单株构成。所构建不育和可育 DNA 混合池用于 EST-SSR 分子标记分析。 0078 PCR 反应体系的建立和热循环程序 0079 主要参考 Yin 等方法。试验设计如下 ： 0080 标准 PCR 反应体系为 20L， 组成如下 ： 0081 Template 1.0L 0082 10Taq buffer 2.0L 0083 dNTP(2.5mM) 1.6L 0084 Forward Primer(10M) 1.0L 0085 Reverse Primer(10M) 1.0L 0086 Taq 酶 (2.5U。

32、/L) 0.5L 0087 ddH2O 11.9L 0088 0089 Total 20L 0090 PCR 反应热循环程序为 ： 0091 1)94预变性 2min， 0092 2)94变性 30s， 0093 3)55退火 30s， 0094 4)72延伸 30s， 0095 5)Go to step2， 35 cycle ； 0096 6)72延伸 7min。 0097 7)4保存 0098 引物的筛选 0099 从棉花微卫星数据库下载 98 对名称为 MGHES 的 EST-SSR 引物， 分别以棉花可育 DNA 和不育 DNA 混合池为模板进行 PCR 扩增， PCR 产物在 5.0。

33、的聚丙烯胺胶上电泳。聚 丙烯胺胶电泳电压为 2000V， 预电泳 30min， 上样 8L， 电泳时间 1h。琼脂糖胶电泳电压为 120V， 时间为 1h。然后在凝胶成像系统上观察电泳结果。 0100 回交群体 BC1F1分离群体的 EST-SSR 标记分析 0101 用在可育和不育 DNA 混合池中表现多态性的引物进行 BC1F1群体 369 个单株进行 PCR 扩增和聚丙烯胺凝胶电泳， 检测 BC1F1群体多态性。 0102 EST-SSR 引物扩增特异 DNA 片段的回收测序 0103 从聚丙酰胺胶切下 PCR 扩增的特异 DNA 片段， 用无菌枪头将胶捣碎， 加入 50L 无 菌 dd。

34、H2O 溶解于室温放置 1 天， 然后离心以沉淀胶块， 吸取上清液， 加入两倍体积无水乙醇 沉淀过夜。15000rpm 离心沉淀 DNA， 弃废液， 晾干 DNA， 加 10L 无菌 ddH2O 溶解， 取 1L 作 模板进行PCR扩增， 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后， 用DNA回收试剂盒回收DNA， 送北京中国 农科院重大工程开放实验室测序部测序。 说 明 书 CN 102154413 A CN 102154414 A6/9 页 9 0104 实例 3 ： STSHY27 标记分析 0105 育性分离群体 DNA 混合池的构建 0106 田间调查棉花 (P30AY18R)P30B 回交群体 B。

35、C1F1代共 369 个单株育性分离情 况， 分别挂牌标记可 育株和不育株， 提取单株基因组 DNA， 分别构建不育和可育 DNA 混合 池， 每个混合池由 5 个单株构成。所构建不育和可育 DNA 混合池用于 EST-SSR 分子标记分 析。 0107 PCR 反应体系的建立和热循环程序 0108 主要参考 Yin 等方法。试验设计如下 ： 0109 标准 PCR 反应体系为 20L， 组成如下 ： 0110 Template 1.0L 0111 10Taq buffer 2.0L 0112 dNTP(2.5mM) 1.6L 0113 Forward Primer(10M) 1.0L 011。

36、4 Reverse Primer(10M) 1.0L 0115 Taq 酶 (2.5U/L) 0.5L 0116 ddH2O 11.9L 0117 0118 Total 20L 0119 PCR 反应热循环程序为 ： 0120 1)94预变性 2min， 0121 2)94变性 30s， 0122 3)55退火 30s， 0123 4)72延伸 60s， 0124 5)Go to step2， 35 cycle ； 0125 6)72延伸 7min。 0126 7)4保存 0127 引物的筛选 0128 根据 5 个标记所筛选到的 21 个阳性 BAC 克隆末端序列设计 32 对 STS 引物。

37、， 扩增 片段大小在200600bp， 分别以棉花可育DNA和不育DNA混合池为模板进行PCR扩增， PCR 产物在 1.0的琼脂糖凝胶上电泳。电压为 100V， 电泳时间 1h。然后在凝胶成像系统上观 察电泳结果 ( 图 2)。 0129 回交群体 BC1F1分离群体的 STS 标记分析 0130 用在可育和不育 DNA 混合池中表现多态性的引物进行 BC1F1群体 369 个单株进行 PCR 扩增和聚丙烯胺凝胶电泳， 检测 BC1F1群体多态性。 0131 STS 引物扩增特异 DNA 片段的回收测序 0132 从琼脂糖凝胶切下 PCR 扩增特异 DNA 片段， 用 DNA 回收试剂盒回收。

38、 DNA， 送北京中 国农科院重大工程开放实验室测序部测序。 0133 实例 4 数据分析 0134 遗传分析 说 明 书 CN 102154413 A CN 102154414 A7/9 页 10 0135 共调查了配制 (P30AY18R)P30B 回交群体 369 个单株的育性， 其中 180 株为可 育， 记为 1 ； 189 株为不育， 记为 0。卡方测验分析， 群体分离比符合 1 1(X2 0.11， P 0.95)， 完全符合一对显性基因模型。 0136 遗传连锁分析 0137 1) 将两个标记对回交群体中 34 个可育和不育 DNA 混合池进行 PCR 扩增， 统计 重组体个数。

39、。MGHES28 标记分析回交群体中出现了 17 个重组体， 可育与不育的比例为 197 172， 符合 1 1 的分离比例。STSHY27 标记分析回交群体中出现了 13 个重组体， 可 育与不育的比例为 193 176， 符合 1 1 的分离比例。 0138 2) 将 MGHES28 和 STSHY27 标记分析回交群体中出现的特异带有无情况输入计算 机， 运行Mapmaker 软件， 计算两个标记与恢复基因的遗传距离。 结果.MGHES28标记与恢复 基因遗传距离为 2.4cM ； STSHY27 与恢复基因遗传距离为 2.1cM( 图 3)。 0139 实例 5 分子标记应用于不同恢复。

40、系、 保持系和不育系的鉴定 0140 1) 提取不同恢复系 (R1， R2， R3， R4， R5)、 保持系 (B1， B2， B3， B4， B5) 和不育系 (A1， A2， A3， A4， A5) 以及 Y18 恢复系 (P1) 和不育系 P30A(P2) 的基因组 DNA。 0141 2) 以不同恢复系 (R1， R2， R3， R4， R5)、 保持系 (B1， B2， B3， B4， B5) 和不育系 (A1， A2， A3， A4， A5) 的基因组 DNA 为模板， MGHES28 和 STSHY27 引物分别进行 PCR 扩增。扩增产 物分别在 5.0的聚丙烯胺胶和 1.0。

41、的琼脂糖胶上电泳。 0142 2) 聚丙烯胺胶电泳电压为 2000V， 预电泳 30min， 上样 8L， 电泳时间 1h。琼脂糖 胶电泳电压为 120V， 时间为 1h。然后在凝胶成像系统上观察电泳结果。 0143 3)PCR鉴定结果表明MGHES28和STSHY27引物扩增出特异条带的为恢复系， 未扩增 出的为保持系和不育系 ( 图 4 和图 5)。 附图说明 ： 0144 图 1 为 M ： DNA 标准分子量 ； 1F ： MGHES28 引物扩增可育 DNA 混合池 ； 1S 为 MGHES28 引物扩增不育 DNA 混合池 ； 箭头所指为特异带。 0145 图 2 为 M ： DN。

42、A 标准分子量 ； F ： STSHY27 引物扩增可育 DNA 混合池 ； S ： STSHY27 引物 扩增不育 DNA 混合池 ； 箭头所指为特异带。 0146 图 3 为 MGHES28 和 STSHY27 标记与恢复基因的遗传图谱。MGHES28 标记与恢复基 因遗传距离为 2.4cM， STSHY27 与恢复基因遗传距离为 2.1cM。 0147 图 4 为 MGHES28 引物在恢复系衍生系、 保持系和不育系衍生系的扩增特征。M ： DNA 标准分子量 ； P1 ： 亲本恢复系 Y18 ； P2 ： 亲本不育系 P30A ； A1 A5 ： 5 个不育系衍生系 ； B1 B5 ：。

43、 不同保持系衍生系 ； R1 R5 ： 不同恢复系衍生系。箭头所指为特异带。 0148 图 5 为 STSHY27 引物在恢复系衍生系、 保持系和不育系衍生系的扩增特征。M ： DNA 标准分子量 ； P1 ： 亲本恢复系 Y18 ； P2 ： 亲本不育系 P30A ； A1 A5 ： 5 个不育系衍生系 ； B1 B5 ： 不同保持系衍生系 ； R1 R5 ： 不同恢复系衍生系。箭头所指为特异带。 0149 序列表 0150 中国农业科学院生物技术研究所 0151 棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记 MGHES28 正向引物 0152 6 说 明 书 CN 102154413 A CN 1。

44、02154414 A8/9 页 11 0153 PatentIn version 3.1 0154 1 0155 20 0156 DNA 0157 人工序列 0158 1 0159 cctgcaaacg ctattgatcc 0160 中国农业科学院生物技术研究所 0161 棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记 MGHES28 反向引物 0162 2 0163 20 0164 DNA 0165 人工序列 0166 2 0167 cccagactgg tgatgatgaa 0168 中国农业科学院生物技术研究所 0169 棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记 STSHY27 正向引物 0170 。

45、3 0171 20 0172 DNA 0173 人工序列 0174 3 0175 tcagcttcaa gtaccgagca 0176 中国农业科学院生物技术研究所 0177 棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记 STSHY27 反向引物 0178 4 0179 20 0180 DNA 0181 人工序列 0182 4 0183 aatagcccca tagccctagc 0184 中国农业科学院生物技术研究所 0185 MGHES28 引物扩增特异 DNA 片段 0186 5 0187 233 0188 DNA 0189 陆地棉恢复系 Y18R(Gossypium hirsutum) 019。

46、0 5 0191 cctgcaaacg ctattgatcc aaagcttaat atctcctgat cccgaactca attggccgag 60 说 明 书 CN 102154413 A CN 102154414 A9/9 页 12 0192 ttcagataca acaacaagtt caggattctg gttatgtatt gcagcaacca caattcgatc 120 0193 aacagcaaca accacaacag cagcagcagc agcagcagtt cttgcatgct ggctggtgca 180 0194 cctaggcatt acattcatca t。

47、caccagtct gggttcatca tcaccagtct ggg 233 0195 中国农业科学院生物技术研究所 0196 STSHY27 引物扩增特异 DNA 片段 0197 6 0198 505 0199 DNA 0200 陆地棉恢复系 Y18R(Gossypium hirsutum) 0201 6 0202 tcagcttcaa gtaccgagca acatcccata gttctagtgt actcagacaa ccacgatcca 60 0203 ttcctgtgtg tcgaagaaaa gctgtggcat caatatggta gtgatcagac ggtggacggt。

48、 120 0204 gaagatctat tgaagccttg ttcgaatctt taatttttta ttattgagat tttgaaggct 180 0205 tattgagaaa tctgaagtga aatttgagaa gaggaaaaga ggagtcattt ggtaatgaca 240 0206 attggccaga gaatgccatg aacgatagtg actagagtta tggaaaaaaa aaaaaagaaa 300 0207 aagggagaag aaaaaaaggg ataaagattc aacagatagt agcaaactta ctagtggctc 360 0208 tacgttggag gaacaaaatg ttcgtag。