(1)技术领域
本发明涉及一种检测核酸的等长双链特异性探针。
(2)背景技术
自1985年MuLlis等发明了聚合酶链式反应(PCR)以来，PCR技术已经广泛地应用于 核酸研究的各个领域，在临床诊断方面的应用也日益增多。但是PCR产物容易造成交叉污染， 从而可能导致假阳性结果，而且不能进行基因定量检测。1995年出现的实时荧光PCR技术 很好地解决了PCR的定量问题，闭管操作简化了步骤，很好地避免了PCR产物的交叉污染， 提高了检测的特异性。
目前的实时荧光PCR检测技术，可分为加入荧光染料嵌入DNA双链和加入荧光标记的探 针两种。前者无法区分特异和非特异PCR扩增，PCR扩增中引物二聚体的形成极大地降低了 检测的灵敏度，这些缺点限制了非探针型实时荧光PCR技术的实际应用。目前常用的探针包 括分子信标、TaqMan探针、蝎子引物等。由于存在探针识别，因此增加了实验的可靠性， 但是存在探针设计复杂，制造成本高等缺点。
(3)发明内容
本发明的目的在于提供一种实验设计简单、操作方便，能有效地保证实验特异性和灵敏 度的检测核酸的等长双链特异性探针。
检测核酸的等长双链特异性探针包括两条碱基数目相等且反向互补配对的寡核苷酸链， 其一端有2～6个碱基完全不匹配，两条链中的一条链上标记荧光剂，另一条链上标记淬灭 剂。
所说的等长双链特异性探针的两条链等长，一般设计为15～30个碱基，一般不超过30 个碱基。标记荧光剂的链与靶序列100％匹配。两条链的一个末端存在碱基完全不配对，完 全不匹配的碱基长度最好在2～10碱基之间。探针的退火温度一般在50～70℃之间。另外， 荧光剂和淬灭剂可以标记于探针的顶端，也可以标记在探针的中间位置，但是最好标记在同 一对互补的碱基上，只有这样才能达到最佳的淬灭效果。设计的探针内尽量避免DNA折叠和 二级结构。如果探针标记在探针的顶端，要避免在5’端使用G，如果荧光剂和淬灭剂标记 于探针的顶端，则其另一端的碱基设计为完全不配对。
两条寡核苷酸的反向互补使荧光剂和淬灭剂靠近，两者发生能量传递，荧光被淬灭，此 时探针不发荧光，在PCR反应过程中，变性的高温使探针两条链分开而发出荧光；退火阶段 若没有靶序列存在，探针重新形成双链结构而不发荧光。此时若有互补的靶序列扩增时，由 于探针的两条链末端有部分碱基完全不匹配，而靶序列与荧光剂标记链互补的碱基相对较 多，形成的结构更加稳定，因而探针的两条链分开，与靶序列形成更稳定的结构，荧光剂发 出荧光，没有结合的多余探针仍然保持双链结构。在延伸阶段由于温度升高，探针从靶序列 上解离，引物得以继续延伸，PCR反应继续进行。
等长双链特异性探针存在以下优点：
1.探针设计简单，几乎与普通PCR引物设计相同，实验成功率高；
2.探针制备简单，单条链上是单一荧光物质的修饰，相对比较简单，为防止PCR过程 中探针的延伸，必须在3’端进行磷酸化封闭；
3.特异性高，因为只有当靶序列与荧光剂标记链互补的碱基数大于荧光剂、淬灭剂分 别标记的双链的互补碱基数时，荧光剂标记链与靶序列结合才较稳定，从而提高核酸杂交分 析的反应特异性。如果靶序列发生突变或PCR产生了非特异扩增产物，等长双链特异性探针 将恢复双链状态，因而不发荧光。
(4)附图说明
图1为等长双链特异性探针在不同温度条件下荧光信号的变化。在图1中，横坐标为温 度T/℃，纵坐标为荧光强度F。
图2为O型口蹄疫等长双链荧光特异性探针实时荧光PCR检测。在图2中，横坐标为循 环数Cycle，纵坐标为荧光强度F。曲线1：O型口蹄役阳性；曲线2：阴性对照。
图3为两条探针结合时荧光信号的变化。在图3中，横坐标为时间t/min，纵坐标为荧 光强度F。曲线1：加与Fam标记探针不互补的3’端经淬灭剂Dabcyl标记的探针；曲线2： 加3’端经淬灭剂Dabcyl标记的与Fam标记探针反向互补的探针。
(5)具体实施方式
1.等长双链特异性探针在不同温度条件下的荧光信号的变化：
室温下，等长双链特异性探针形成稳定的双链结构，不发荧光，在50℃之前，荧光强 度基本保持不变，两条链没有变性，当温度高于50℃，荧光逐渐增强，说明两条链逐渐解 链，在60～70℃，荧光值迅速上升，说明解链加速，达到最大值后荧光趋于平缓，之后温 度过高会使荧光强度下降(参见图1)。
2.用等长双链特异性探针进行实时PCR反应监测：
等长双链特异性探针用于监测PCR反应，两条链的3’端都必须用磷酸基团进行封闭， 使其不能作为引物延伸。如果PCR反应过程中没有扩增序列，探针保持双链结构，不发荧光； 如果有扩增序列，由于荧光剂标记链与靶序列是100％匹配，PCR退火阶段探针的两条链分开， 荧光剂远离淬灭剂，探针发出荧光。随着延伸阶段温度的升高，探针从扩增片段上解离出来， 引物得以延伸，保证了PCR反应的顺利进行。通过在PCR反应过程的复性阶段检测荧光的变 化，可以在PCR的每个循环动态地检测目的片段的有无，并进行定量(参见图2)。
以下实施例将对本发明作进一步的说明：
实施例1：
两条探针结合时荧光信号的变化：
在20μL的反应体系中，加入2.5mM MgCl2，10×PCR缓冲液和5’端经Fam标记的探针 0.8μM，在室温下测定荧光强度2min，加3’端经淬灭剂Dabcyl标记的与上述Fam标记探 针反向互补的探针，另一管中加与Fam标记探针不互补的3’端经淬灭剂Dabcyl标记的探 针各1.0μM，每10s测定一次荧光强度(参见图3)。两探针由上海博亚公司合成，序列为： Fam-5’CCCTTCTCAGATCCCGAGTGTC3’；5’CTGTGTCGGGATCTGAGAAGGGG3’-Dabcyl；5’AACGC TGAAGGGCATCCTTAG 3’-Dubcyl。结果表明：在含标记荧光剂的体系中，只有加入了碱基序 列互补的标记淬灭剂的寡核苷酸链时，两条链才会发生复性反应，荧光被淬灭，而末端有2～ 6个碱基完全不匹配不影响复性反应。加入无关序列，由于两条链不能结合发生复性反应， 因而荧光无法被淬灭。
实施例2：
等长双链荧光特异性探针在不同温度下荧光强度的变化：
在20μL的反应体系中，加入2.5mM MgCl2，10×PCR缓冲液和5‘端经Fam标记的探针 0.2μM，3’端经淬灭剂Dabcyl标记的与上述Fam标记探针反向互补的探针0.25μM，两探 针由上海博亚公司合成，序列为：Fam-5’CCCTTCTCAGATCCCGAGTGT C3’；5’CTGTGTCGGGAT CTGAGAAGGGG 3’-Dabcyl；混合均匀后室温放置5min，待两条链充分复性后置于实时荧光 PCR仪上，从40℃开始，每隔5s升高1℃，每度均采集荧光信号。如图1所示，室温下， 等长双链特异性探针形成稳定的双链结构，不发荧光，在50℃之前，荧光强度基本保持不 变，两条链没有变性，当温度高于50℃，荧光逐渐增强，说明两条链逐渐解链，在60～70 ℃，荧光值迅速上升，说明解链加速，达到最大值后荧光趋于平缓，之后温度过高使荧光强 度下降。
实施例3：
等长双链荧光特异性探针用于O型口蹄疫实时荧光PCR检测：
采用Trizol法提取口蹄疫病毒的RNA，反转录成cDNA。
实时荧光PCR检测所用引物和探针均由上海博亚公司合成。引物序列为： 5’ACCAATCCAACGGCGTACCACAA3’；5’GTGGCTTTGATGGCACCGTAGTT3’
所用探针为等长双链荧光特异性探针，序列为：
FAM-5’ACTGTTTACAACGGGAACTGCAA 3’；
5’AACGTGTTCCCGTTGTAAACAGT 3’-DABCYL。
PCR反应总体积为20μL，内含2.5mM MgCl2，10×PCR缓冲液，1.8U Taq酶，250μM dNTP，引物总浓度均为0.4μM，Fam标记探针0.2μM，Dabcyl标记探针0.25μM，经94℃预 变性10min，再94℃变性30s，50℃30s，72℃30s，45个循环。荧光信号强度在退火阶段采 集。结果如图2所示。