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取代醌苯并恶嗪类似物
相关申请的交互参考
本专利权项范围是：U.S.临时申请60/461,271，备案于2003年4月7日；U.S.临时申请60/463,171，备案于2003年4月15日；U.S.临时申请60/519,535，备案于2003年11月12日；和U.S.临时申请60/532,727，备案于2003年12月23日。这些文档的内容以参考文献的形式收编于此。
发明领域
本发明涉及取代醌苯并恶嗪(quinobenzoxazines)类似物，以及这些化合物的使用方式。

背景
某些富嘌呤的核酸链中能够形成四聚体结构。在双链核酸中，某些富嘌呤链能够参与一个典型双螺旋结构和松散结构以及非B构型区之间的慢速平衡过程。这些松散结构和非B构型可以被称为“平行结构”。某些形式和对S1核酸酶消化的敏感性有关，这可以被称为“核酸酶超敏感元素”或“NHE。”四聚体是一种平行结构，某些NHE可能采用四聚体结构。大量间接证据提示，四聚体结构可能体内存在于基因组的某些特定区域，包括染色体的端粒端和癌基因调节区。(Han，et al.，Trends Pharm.Sci.(2000)21：136-142)。因而，DNA的四聚体形成区可以作为抗癌药物的分子靶点。
发明概述
本发明所描述的化合物通过与DNA的四聚体形成区相互作用，充当副作用较少的肿瘤抑制药物。这些化合物减少过度增殖基因的表达，被用于治疗癌症。此外，这些化合物也展示了抗菌或抗病毒活性，可以被用来治疗细菌和病毒感染。
本发明的不同实施例如下所述。本发明也包括符合结构式1的其它化合物，这些化合物可以具有从表1-3所列化合物上独立选择的任意取代基。因而，本发明不仅限于下述不同实施例的特定取代基组合。这些化合物具有结构通式：

以及它的药物允许盐，酯和前药。
在此V是H，卤素，或NR¹R²；
A是H，氟或NR¹₂；
Z是O，S，NR¹或CH₂；
U是OR²或NR¹R²；
X是OR²，NR¹R²，卤素，叠氮基(azido)或SR²；
n是1-3；
在此NR¹R²中的R¹和R²可以构成一个双边界或一个环型结构，每种结构均可被任意取代；
R¹是H或C_1-6烷基(C_1-6 alkyl)；
R²是H；或一个任意含有一个或多个非相邻杂原子(N，O和S)，并由一个碳环或杂环任意取代的C_1-10烷基(C_1-10 alkyl)或C_2-10烯基(C_2-10 alkenyl)；或R²是一个任意取代的杂环，芳基或杂芳基；
W由下列基团组成


在此Q，Q¹，Q²和Q³是独立的CH或N；
Y是独立的O，CH，＝O或NR¹；
R⁵可以是稠环任意位置上的取代基；是被卤素，＝O或者一个或多个杂原子任意取代的H，OR²，C_1-6烷基(C_1-6 alkyl)，C_2-6烯基(C_2-6 alkenyl)；或者R⁵是一个无机取代基；或两个相邻的R⁵连接起来得到一个5-6元取代或非取代的碳环或杂环结构，这些结构可以任意稠合到另外一个取代或非取代的碳环或杂环上；
假定当X是吡咯烷基(pyrrolidinyl)，A是F，Z是O，以及W是萘基(naphthalenyl)或亚苯基(phenylene)时，U不是OR¹；
当X是F或吡咯烷基(pyrrolidinyl)；A是F；Z是O；以及W是亚苯基(phenylene)时，U不是吗啉基(morpholinyl)或2，4-二氟苯胺(2，4-difluoroaniline)；和
进一步假定如果U是OH，则W代表多稠芳环，X不是卤素；和X是NH₂，或不含N，或含有6个以上碳原子的取代基。
在上述分子式1中，A和X可以分别是卤素。例如，A和X可以分别是氟。
在上述分子式中，V可以是H。另外，V可以是NH₂或一个具有分子式NR¹-(CR¹₂)_n-NR³R⁴结构的化合物；
在此R¹和R³分别是H或C_1-6烷基(C_1-6 alkyl)；
n是1-6；并且
R⁴是H，由一个碳环或杂环任意取代的C_1-6烷基(C_1-6 alkyl)，或芳基(C_1-6alkyl)；在NR³R⁴基团中，R³和R⁴可以组成一个任意取代的环形结构。
在上述分子式1中，U和X可以分别是NR¹R²。例如，R¹是H且R²是一个C_1-10烷基(C_1-10 alkyl)，该烷基可以含有一个或多个杂原子，并由一个C_3-6环烷基(C_3-6 cycloalkyl)，芳基或一个含有一个或多个N，O或S的5-14元杂环任意取代。在另一个例子中，R¹是H且R²是一个芳基或一个含有一个或多个N，O或S的5-14元杂环，它可以被一个氨基或另一个杂环任意取代。在另一个例子中，NR¹R²中的R¹和R²组成一个含有一个或多个N，O或S的5-14元杂环。在特殊的例子里，NR¹R²是吗啉(morpholine)，硫代吗啉(thiomorpholine)，哌嗪(piperazine)，哌啶(piperidine)或二氮杂卓(diazepine)。
在上述分子式1中，U和X可以分别具有结构式
                NR¹-(CR¹₂)n-NR³R⁴             (2)
在此R¹和R³分别是H或C_1-6烷基(C_1-6 alkyl)；
n是1-6；并且
R⁴是H或一个任意含有一个或多个非相邻杂原子(N，O和S)，以及由一个或多个碳环或杂环任意取代的C_1-10烷基(C_1-10 alkyl)或C_2-10烯基(C_2-10alkenyl)；以及
在NR³R⁴中，R³和R⁴可以构成一个任意取代环。
在上述分子式2中，n可以是2-3。例如，NR³R⁴是一个脂肪胺，或胍基或它的一个互变异构体；或R³和R⁴可以任意构成一个含有一个或多个N，O或S的取代环。在特定的例子中，NR³R⁴是吗啉(morpholine)，硫代吗啉(thiomorpholine)，咪唑(imidazole)，吡咯烷(pyrrolidine)，哌嗪(piperazine)，吡啶(pyridine)或哌啶(piperidine)。
在上述分子式1中，X可以是NR¹R²；U符合分子式
                 NR¹-(CR¹₂)_n-NR³R⁴             (2)
在此R¹和R²如权利要求1所述；
R³是H或C_1-6烷基(C_1-6 alkyl)；
n是1-6；并且
R⁴是H或或一个任意含有一个或多个非相邻杂原子(N，O和S)，以及由一个或多个碳环或杂环任意取代的C_1-10烷基(C_1-10 alkyl)或C_2-10烯基(C_2-10alkenyl)；以及
在NR¹R²和NR³R⁴中，R¹和R²，及R³和R⁴可以分别独立地构成一个取代环。
在上述分子式中，X是NR¹R²，U符合分子式NR¹-(CR¹₂)_n-NR³R⁴(2)，NR¹R²中的R¹和R²，以及NR³R⁴中的R³和R⁴可以分别独立地构成一个含有一个或多个N，O或S的取代环。例如，X可以被氨基，氨基甲酸酯，一个含有一个或多个非相邻N，O或S的C_1-10烷基(C_1-10 alkyl)任意取代，以及被一个杂环，芳基或一个的饱和或不饱和杂环所任意取代。例如，X和NR³R⁴分别是吗啉(morpholine)，硫代吗啉(thiomorpholine)，咪唑(imidazole)，吡咯烷(pyrrolidine)，哌嗪(piperazine)，吡啶(pyridine)或哌啶(piperidine)。在一个例子中，X和NR³R⁴分别是吡咯烷(pyrrolidine)。在另一个例子中，X是由吡嗪(pyrazine)取代的吡咯烷(pyrrolidine)。在该例中，V是H；A是氟；和W是萘基(naphthalenyl)。
5-6杂元环的例子包括但不限于四氢呋喃(tetrahydrofuran)，1，3-二氧戊环(1，3-dioxolane)，2，3-二氢呋喃(2，3-dihydrofuran)，四氢吡喃(tetrahydropyran)，苯并呋喃(benzofuran)，异苯并呋喃(isobenzofuran)，1，3-二氢-异苯并呋喃(1，3-dihydro-isobenzofuran)，异恶唑(isoxazole)，4，5-二氢异恶唑(4，5-dihydroisoxazole)，哌啶(piperidine)，吡咯烷(pyrrolidine)，吡咯烷-2-酮(pyrrolidin-2-one)，吡咯(pyrrole)，吡啶(pyridine)，嘧啶(pyrimidine)，八氢-吡咯[3，4-b]吡啶(octahydro-pyrrolo[3，4-b]pyridine)，哌嗪(piperazine)，吡嗪(pyrazine)，吗啉(morpholine)，硫代吗啉(thiomorpholine)，咪唑(imidazole)，咪唑啉-2，4-二酮(imidazolidine-2，4-dione)，苯并咪唑(benzimidazole)，1，3-二氢苯并咪唑-2-酮(1，3-dihydrobenzimidazol-2-one)，吲哚(indole)，噻唑(thiazole)，苯并噻唑(benzothiazole)，噻二唑(thiadiazole)，噻吩(thiophene)，四氢噻吩1，1-二氧化物(tetrahydro-thiophene l，l-dioxide)，二氮杂卓(diazepine)，三唑(triazole)，胍(guanidine)，二氮杂二环[2.2.1]庚烷(diazabicyclo[2.2.1]heptane)，2，5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷(2，5-diazabicyclo[2.2.1]heptane)，和2，3，4，4a，9，9a-六氢-1H-β-咔啉(2，3，4，4a，9，9a-hexahydro-1H-β-carboline)。
在上述分子式1中，W可以是苯(benzene)，吡啶(pyridine)，联苯(biphenyl)，萘(naphthalene)，菲(phenanthrene)，喹啉(quinoline)，异喹啉(isoquinoline)，喹唑啉(quinazoline)，噌啉(cinnoline)，二氮杂萘(phthalazine)，喹喔啉(quinoxaline)，吲哚(indole)，苯并咪唑(benzimidazole)，苯并恶唑(benzoxazole)，苯并噻唑(benzthiazole)，苯并呋喃(benzofuran)，蒽酮(anthrone)，氧杂蒽酮(xanthone)，吖啶酮(acridone)，芴酮(fluorenone)，咔唑(carbazolyl)，嘧啶[4，3-b]呋喃(pyrimido[4，3-b]furan)，吡啶[4，3-b]吲哚(pyrido[4，3-b]indole)，吡啶[2，3-b]吲哚(pyrido[2，3-b]indole)，二苯并呋喃(dibenzofuran)，吖啶(acridine)或吖嗪(acridizine)。
在上述分子式1中，U可以是OR²，R²是由一个碳环或杂环任意取代的C_1-6烷基(C_1-6 alkyl)。
在上述分子式1中，每个取代基团可以被一个或多个卤素，OR²，NR¹R²，氨基甲酸酯，C_1-10烷基(C_1-10 alkyl)，C_2-10烯基(C_2-10 alkenyl)所任意取代，这些取代基又可以被卤素，＝O，芳基(aryl)或者一个或多个杂原子；无机取代基，芳基，碳环或杂环任意取代。
本发明涉及的化合物可以具有手性。此处提到的手性化合物是一种与其镜像不同的化合物，具有一个对映异构体。合成手性化合物和拆分对映异构体的外消旋混合物的方法为化学家所熟知。这些方法可以参阅，例如，March，“Advanced OrganicChemistry，”John Wiley and Sons，Inc.，New York，(1985)，该书也被作为本发明的参考文献。
本发明也包括了含有分子式1型化合物和一种药物允许赋型剂的药物合成物。
此外，本发明提供了改善细胞增殖紊乱的方法，该法通过给予受体有效剂量的符合分子式1的化合物，或它的一个药物合成物，来达到改善上述细胞增殖紊乱的目的。作为一个例子，细胞增殖紊乱可以是癌症。作为另一个例子，细胞增殖减少，或细胞凋亡被诱导。受体可以是人类或动物。
本发明还提供了减少细胞增殖或诱导细胞凋亡的方法，该法通过给予一个系统有效剂量的符合分子式1的化合物，或它的一个药物合成物，来达到使该系统削减细胞增殖或引导细胞凋亡的目地。该系统可以是一个细胞或组织。
本发明进一步提供了减少微生物效价的方法，该法通过给予一个系统有效剂量的符合分子式1的化合物，或它的一个药物合成物，来达到使该系统减少微生物效价的目的。该系统可以是一个细胞或组织。作为一个例子，微生物效价可以是病毒、细菌或真菌效价。
此外，本发明提供了减轻微生物感染的方法，该法通过给予受体有效剂量的符合分子式1的化合物，或它的一个药物合成物，来达到使该系统减轻微生物感染的目的。受体可以是人类或动物。作为一个例子，微生物感染可以是病毒，细菌或真菌。
图形说明
图1显示了在Ramos异种移植模型中，符合分子式1的一种化合物的抗肿瘤活性。
图2显示了在HCT 116细胞中，符合分子式1的一种化合物的抗肿瘤活性。
发明描述
本发明涉及符合分子式1的喹啉衍生物，以及它的药物允许盐，酯和前药。在特定的实施例中，这些化合物与DNA的四聚体形成区相互作用。本发明也涉及使用这些化合物治疗癌症，细菌和病毒感染的方法。
由于DNA的四聚体形成区是生物过程如癌基因转录的调节子，所以四聚体生物活性的调节物质可以被用于癌症治疗。可以和DNA的四聚体形成区相互作用的分子对于某些细胞增殖紊乱及相关情况有治疗作用。特别是，异常增加的癌基因表达能够引起细胞增殖紊乱，而四聚体结构通常下调癌基因表达。癌基因的例子可以是但不仅限于MYC，HIF，VEGF，ABL，TGF，PDGFA，MYB，SPARC，HUMTEL，HER，VAV，RET，H-RAS，EGF，SRC，BCL1，BCL2和其它技术人员所熟知的癌基因。
结合至DNA四聚体形成区的分子能够通过不同机制发挥生物作用。这些机制包括如稳定天然四聚体结构，通过阻断解链来抑制一个天然四聚体到双链DNA的转化，以及稳定具有四聚体脱稳性核苷酸取代基团的天然四聚体结构和其它序列特异性相互作用。因而，此处结合至DNA四聚体形成区的化合物可以作用于细胞，组织，或器官，达到下调癌基因转录及因此治疗细胞增殖紊乱的目的。此处使用的术语“治疗”和“治疗作用”是指降低或停止一种细胞的增殖速率(例如，减慢或终止肿瘤生长)或者减少增殖癌症细胞的数量(例如，消除部分或全部肿瘤)。
可以通过监测四聚体生物活性，判定一个细胞，组织或器官中能够形成四聚体的天然DNA的生物活性是否得到调控。DNA四聚体形成区的生物活性可以在细胞，组织或器官中监测，例如，可以通过检测分子和四聚体形成性DNA接触引起的基因转录增加或减少来达到监测目的。转录可以通过直接观察RNA转录本或观察由转录本翻译的多肽来检测，这都是专业人员熟知的方法。
可以和四聚体形成性DNA及四聚体形成性核酸相互作用的分子能够用于治疗多种细胞增殖紊乱。细胞增殖紊乱包括，例如，结肠直肠癌和造血系统肿瘤(即，累及造血源性增殖性/新生物细胞，例如来自骨髓，淋巴或红细胞系的细胞，及其前体细胞的疾病)。疾病可起于低分化急性白血病，例如成红细胞白血病和急性成巨核细胞白血病。其它的骨髓紊乱包括但不仅限于急性前髓细胞性白血病(APML)，急性髓细胞性白血病(AML)，和慢性髓细胞性白血病(CML)(Vaickus，Crit.Rev.in Oncol./Hemotol 11：267-297(1991)。淋巴恶性肿瘤包括，但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，包括B细胞系ALL和T细胞系ALL，慢性淋巴性白血病(CLL)，幼淋巴细胞性白血病(PLL)，毛细胞性白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。恶性淋巴瘤的其它形式还包括，但不限于非霍奇金淋巴瘤及其变型，外周T细胞淋巴瘤，成年T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，大颗粒淋巴细胞白血病(LGLL)，霍奇金病和Reed-Sternberg病。细胞增殖紊乱还包括结肠直肠，乳腺，肺，肝，胰腺，淋巴结，结肠，前列腺，脑，头颈，皮肤，肾和心脏的癌症。与DNA四聚体形成区相互作用的化合物还能够通过抑制受体的血管发生，而用于治疗癌症相关的过程和情况(如血管发生增加)。
本发明提供了一种减少细胞增殖或治疗或改善细胞增殖紊乱的方法，该法对具有能够形成四聚体的DNA的系统使用符合分子式1的化合物。这个系统可以是一组细胞或者一个或多个组织。在一个实施例中，该系统是需要治疗一种细胞增殖紊乱的受体(例如，一个哺乳动物如小鼠，大鼠，猴子或人类)。本发明还提供了一种治疗结肠直肠癌的方法，该法通过给予受体一定量能够和c-MYC四聚体形成区相互作用的化合物，来达到减少直肠癌细胞增殖的目的。此外，本发明也提供了一种抑制血管增生和选择性治疗血管增生相关性癌症的方法，该法通过给予受体一定量能够和血管内皮生长因子(VEGF)四聚体形成区相互作用的化合物，来达到减少血管增生和选择性治疗血管增生相关性癌症的目的。
本文使用的术语“烷基”是指一个含碳化合物，同时包括了含有一个或多个杂原子的化合物。术语“烷基”也包括了由一个或多个非干扰取代基所取代的化合物。非干扰取代基的例子包括，但不限于OR¹，氨基，酰胺基，卤素，＝O，芳基，杂环基团或无机取代基，以及其它不影响化合物活性的取代基。本文使用的术语“碳环”是指环上只含有碳原子的环型化合物。
本文使用的术语“杂环”是指一个含有杂原子的环型化合物，包括单环或双环。本文使用的术语“杂原子”是指除碳或氢原子外的任意原子，如氮，氧或硫。杂环化合物的例子包括但不限于环氧乙烷(oxirane)，氧杂环丁烷(oxetane)，吡喃(pyran)，四氢吡喃(tetrahydropyran)，二氧己环(dioxane)，内酯(lactones)，氮杂环丙烷(aziridine)，氮杂环丁烷(azetidine)，吡咯烷(pyrrolidine)，哌啶(piperidine)，吗啉(morpholine)，内酰胺(lactams)和四氢呋喃(tetrahydrofuran)。
本文使用的术语“双环化合物”是指一个具有共享一对桥碳原子的双环的化合物。双环化合物的例子包括，但不限于萘烷(decalin)，降莰烷(norbornane)，樟脑(camphor)和二氮杂双环[2.2.1]庚烷(diazabicyclo[2.2.1]heptane)。
本文使用的术语“杂芳基”或“杂芳环”是指一个芳香杂环。杂芳基的例子包括，但不限于呋喃(furan)，吡喃(pyrrole)，吡啶(pyridine)，嘧啶(pyrimidine)，咪唑(imidazole)或三唑(triazole)。
本文使用的术语“治疗”或“治疗作用”是指减少或终止一种细胞的增殖速率(例如减慢或终止肿瘤生长)或减少增殖性癌细胞的数量(例如，消除部分或全部肿瘤)。这些术语同样也被用于降低一个感染微生物的系统(即细胞，组织或受体)的微生物效价，减慢微生物繁殖速率，减少症状数量或微生物感染相关性症状的影响，和/或从系统中移除可检测量的微生物。微生物的例子包括，但不限于病毒，细菌和真菌。
可以与DNA四聚体形成区相互作用的化合物也能够被用来减少微生物感染，例如病毒感染。反转录病毒为G-四聚体靶向治疗提供了大量的潜在靶点。G-四聚体结构被认为是至少两种二级结构的功能元素，这些二级结构是由HIV的病毒RNA或DNA，二聚体连接结构(DLS)和中心DNA瓣(CDF)形成的。另外，可以采用分子内或分子间四聚体结构的DNA适配子(aptamer)能够抑制病毒复制。例如，DNA适配子能够通过靶向定位包膜糖蛋白(推定地)来抑制病毒复制。在另一个例子中，DNA适配子通过分别靶向定位HIV-整合酶来抑制病毒复制，提示天然四聚体结构和整合酶之间的相互作用。
二聚体连接结构对于所有反转录病毒都很常见，它通过两个病毒RNA序列的两个5’端之间的非共价相互作用，将病毒基因组的两个复本结合起来。在成熟病毒颗粒中，基因组二聚体和张口蛋白(gagprotein)有着稳定的联系。以HIV为例，这种非共价结合的起源可以追溯到一个98碱基对序列，该序列包含数个至少有两个连续鸟嘌呤的片段(例如，用于RNA二聚体体外形成的3’端)。可以观察到二聚体体外形成和稳定性具有阳离子(钾)的依赖性，以及一个反义序列不能够有效地二聚体化，这两种现象表明最可能的结合结构是一个分子间的G-四聚体。
在整合到宿主基因组之前，反转录病毒DNA和至少两个主要的病毒蛋白(整合酶和反转录酶)结合形成一个整合前复合物(PIC)，该复合物随后被转运到细胞核中。中心DNA瓣(CDF)指的是+链的99个碱基长度的单链尾部，出现于病毒双链DNA的近中心区域，它在PIC的核输入过程中起重要作用。CDF的寡核苷酸模拟物在无细胞系统中会形成分子间G-四聚体。
因而，可以识别四聚体形成区的化合物能够被用于稳定二聚体连接结构，从而阻止两条RNA链的解耦。而且，通过结合到CDF形成的四聚体结构上，和PIC核运输有关的蛋白识别和/或结合过程可以被中断。在这两种情况下，相对其它抗病毒疗法来说，本发明所涉及方法具有重要优点。目前的抗反转录病毒治疗(HAART)方法依靠联合使用针对HIV蛋白酶和整合酶的药物。多药疗法是为了使出现耐药性的几率最小。如果单独使用这些药物的话，一般会很快出现耐药性。这种快速耐药性的原因是反转录酶的失真性，这种失真性在每10,000个碱基对中引起大约一个突变。采用以病毒四聚体结构而不是以蛋白质为靶向的一个优点，是耐药性的发生缓慢或根本不发生。靶四聚体的一个点突变能够损害四聚体结构的完整性，从而导致病毒的非功能性复制。基于此种概念，可以使用单药疗法来替代目前使用的多药疗法，从而在降低治疗费用的同时消除有害的药物/药物相互作用。
本发明提供了降低系统内微生物效价的方法，该法通过给予一个具有天然DNA四聚体形成区的系统以有效剂量的符合分子式1的化合物，来达到使该系统减少微生物效价的目的。该系统可以是一个或多个细胞或组织。微生物效价的例子包括，但不限于病毒、细菌或真菌效价。作为一个具体的实施例，该系统可以是一个需要治疗病毒感染的受体(例如，一个哺乳动物如小鼠，大鼠，猴子或人类)。病毒感染的例子包括下列病毒引起的感染，如肝炎病毒(例如，乙型或丙型肝炎)，人体免疫缺乏病毒(HIV)，鼻病毒，带状疱疹病毒(VZV)，单纯疱疹病毒(例如，HSV-1或HSV-2)，巨细胞病毒(CMV)，牛痘病毒，流感病毒，脑炎病毒，汉坦病毒，虫媒病毒，西尼罗河病毒，人类乳头瘤病毒(HPV)，EB病毒和呼吸道合胞病毒。本发明还提供了治疗HIV感染的方法，该法通过给予一个受体以有效剂量的符合分子式1的化合物，来达到减轻HIV感染的目的。
识别能够结合至DNA四聚体形成区的化合物
此处所描述化合物是指能够结合至DNA的四聚体形成区的化合物。在含有或不含有这些化合物的系统中，此区域的生物活性(通常表达为“信号)不同。虽然在探测一个新分子的时候可以同时测量背景信号，但不要求在分析一个新分子的时候必须测量背景信号。
四聚体形成核酸序列的例子如表A所示：
                             表A

序列序列ID号来源TG₄AG₃TG₄AG₃TG₄AAGG    1    CMYCGGGGGGGGGGGGGCGGGGGCGGGGGCGGGGGAGGGGC    2    PDGF_AG₈ACGCG₃AGCTG₅AG₃CTTG₄CCAG₃CG₄CGCTTAG₅    3    PDGFNB/c-    sisAGGAAGGGGAGGGCCGGGGGGAGGTGGC    4    CABLAGGGGCGGGGCGGGGCGGGGGC    5    RETGGGAGGAAGGGGGCGGGAGCGGGGC    6    BCL-2GGGGGGCGGGGGCGGGCGCAGGGGGAGGGGGC    7    Cyclin    D1/BCL-1CGGGGCGGGGCGGGGGCGGGGGC    8    H-RASAGAGGAGGAGGAGGTCACGGAGGAGGAGGAGAAGGAGGAGGAGGAA    9    CMYB(GGA)₄    10    VAVAGAGAAGAGGGGAGGAGGAGGAGGAGAGGAGGAGGCGC    11    HMGA2GGAGGGGGAGGGG    12    CPIMAGGAGAAGGAGGAGGTGGAGGAGGAGG    13    HER2/neuAGGAGGAGGAGAATGCGAGGAGGAGGGAGGAGA    14    EGFRGGGGCGGGCCGGGGGCGGGGTCCCGGCGGGGCGGAG    15    VEGFCGGGAGGAGGAGGAAGGAGGAAGCGCG    16    CSRC
除了测定受试分子或受试核酸是否产生不同的信号之外，核酸和化合物之间相互作用的亲和力也可以被定量检测。可以比较每个相互作用的IC50，Kd或Ki阈值和IC50或Kd测量值，从而识别作为四聚体相互作用分子的受测分子或作为四聚体形成核酸的受试核酸。例如，经常采用10μM或更低，1μM或更低，以及100nM或更低作为IC50或Kd阈值。在另一个例子中，识别四聚体相互作用分子和四聚体形成核酸的阈值可以是10nM或更低，1nM或更低，100pM或更低和10pM或更低。
现有许多测定方法用于识别与DNA四聚体形成区有亲和性的化合物。在一些测定方法中，生物活性是结合至化合物的四聚体核酸，此结合程度被作为一种信号来测量。在其它测定方法中，生物活性是四聚体的聚合酶捕获功能，其捕获程度被作为一种信号来测量。在某些测定方法中，生物活性是转录，转录水平被作为一种信号来测量。在另一种测定方法中，生物活性是细胞死亡，所定量检测的是正在死亡细胞的数量。另外的测定方法监测癌细胞的增殖速率。测定方法的例子包括荧光结合测定法，凝胶迁移率变动测定法(参阅，例如Jin & Pike，Mol.Endocrinol.(1996)10：196-205)，聚合酶捕获测定法，转录报告测定法，癌细胞增殖测定法和细胞凋亡测定法(参阅，例如，Amersham Biosciences(Piscataway，New Jersey))。这些测定方法的实施例随后介绍。拓扑异构酶也能够被用于判定四聚体相互作用分子是否具有拓扑异构酶路径活性(参阅，例如，TopoGEN，Inc.(Columbus，Ohio))。
凝胶电泳迁移率变动测定法(EMSA)
EMSA可以用于判定一个核苷酸是否形成四聚体以及一个核苷序列是否呈四聚体脱稳态。EMSA如文献(Jin & Pike，Mol.Endocrinol.10：196-205(1996))所述进行，但有一些小的变动。通常而言，合成的单链寡核苷酸在[γ-³²p]ATP(1,000mCi/mmol，Amersham Life Science)的存在下，用T4-激酶在5′-端标记，然后通过一个交联葡聚糖凝胶柱纯化。随后，在含10mM Tris pH 7.5，100mM KCl，5mM二硫苏糖醇，0.1mM EDTA，5mM MgCl₂，10％甘油，0.05％ Nonedit P-40和0.1mg/ml poly(dI-dC)(Pharmacia)的缓冲液中，在有或没有不同浓度受试混合物的情况下孵育³²P-标记的寡核苷酸(～30,000cpm)。室温下孵育20分钟后，在0.25×Tris borate-EDTA缓冲液(0.25×TBE，1×TBE为89mM Tris-borate，pH 8.0，1mM EDTA)中的5％聚丙烯酰胺凝胶上进行结合反应。干燥凝胶，使用磷屏成像仪(phosphoimager)定量检测所有条带。
DMS甲基化保护测定法
化学足迹测定法用于确定四聚体结构。它通过测定一个核酸中的哪些核苷酸被阻止或不被阻止由修饰剂化学修饰，来确定四聚体结构。DMS甲基化测定法是一种化学足迹测定法。在这种测定法中，EMSA条带被分离出来，进行DMS诱导的解链。从电泳迁移率变动凝胶中分离每个重要条带，于4℃下在100mM KCl溶液(300μl)中浸泡6小时。过滤溶液(微离心)，进一步用0.1×TE中的100mM KCl将30,000cpm(每个反应)的DNA溶液稀释至总体积为70μl(每个反应)。加入1μl鲑鱼精子DNA(0.1μg/μl)后，将反应混合物在1μl DMS溶液(DMS∶乙醇；4∶1；v∶v)中孵育一段时间。每个反应用18μl终止缓冲液(b-巯基乙醇∶水∶NaOAc(3M)；1∶6∶7；v∶v∶v)淬火。在乙醇沉淀(两次)和哌啶裂解后，反应混合物在预备凝胶(16％)中分离并用磷屏成像仪观察。
聚合酶捕获测定法
捕获测定法包括模板核酸，它可由一个四聚体形成序列和一个引物核酸组成。该引物核酸杂交到四聚体形成序列的模板核酸5’端。引物通过聚合酶(例如Taq聚合酶)延长，它从引物开始沿着模板核酸延伸。在此测定法中，一个四聚体结构能够阻断或捕获酶的延伸，从而产生较短的转录片段。而且，捕获测定法可以在不同的温度(包括45℃和60℃)和不同的离子浓度下进行。
Taq聚合酶终止测定法如Han，et al.，Nucl.Acids Res.(1999)27：537-542所述，该法是Weitzmann et al.，J.Biol.Chem.(1996)271：20958-20964所用方法的改良。简单地说，将模板DNA(50nM)，Tris·HCl(50mM)，MgCl₂(10mM)，DTT(0.5mM)，EDTA(0.1mM)，BSA(60ng)和5’-端标记的四聚体核酸(～18nM)混合后，在90℃下加热5分钟，然后在30分钟内冷却至室温。向反应混合物中加入Taq聚合酶(1μl)，在稳定的温度下持续反应30分钟。在加入10μl终止缓冲液(甲酰胺(20ml)，1M NaOH(200μl)，0.5M EDTA(400μl)和10mg溴酚蓝)后，反应混合物在预备凝胶(12％)中分离并用磷屏成像仪观察。通过LifeTechnologies公司的双链DNA循环测序系统，进行腺嘌呤测序(由凝胶顶端的“A”显示)。模板链的一般序列是
TCCAACTATGTATAC-INSERT-TTAGCGACACGCAATTGCTATAGTGAGTCGTATTA，此处“INSERT”是指一个含有四聚体形成序列的核酸序列(参阅表A)。凝胶中迁移率慢的条带预示着四聚体的形成。
高通量聚合酶捕获测定法
本发明制定了一种高通量聚合酶捕获测定法。该法包括使一种模板核酸(经常是DNA)和一种引物(也经常是DNA)接触；使引物/模板复合物和此处描述的化合物(也被称为“受试化合物”)接触；然后使引物/模板复合物和一种聚合酶接触；最后分离产物。该测定法常包括使引物/模板复合混合物变性然后复性的步骤，这些步骤一般在受试分子加入系统之前进行。多测定法通常使用多种受试化合物浓度进行，以获得IC₅₀值等数据。反应产物常包括不同长度的延伸引物。当一个受试化合物和模板中的四聚体结构没有显著的相互作用时，引物经常延伸至模板末端。
当一个受试化合物和模板中的四聚体结构有显著的相互作用时，引物通常只延伸至模板中的四聚体结构处，不再延伸。因此，当一种受试化合物和模板中的四聚体结构相互作用时，反应混合物常含有至少两种反应产物，一种具有完全延伸的引物，一种具有不完全延伸的引物，这两种反应物各自分离。可以使用任何方便的分离手段分离产物，如质谱和毛细管电泳。
反应产物通过一个连接在引物上的可检测标签来识别。可检测标签可以非共价连接到引物的5’端上(例如，一个生物素分子共价连接到引物5’端，此引物端又和加入了一个可检测标签的抗生物素分子以非共价方式相连)。可检测标签可以在分析的任何阶段连接到引物上，有时候在将引物加入系统之前，引物延伸后，或在产物分离后。可检测标签一般通过一种方法共价连接到引物上，这种方法要根据可检测标签上化学基团的性质而选择。
有许多方法可用于可检测标签与核酸的共价连接，例如化学偶联一个丙烯胺衍生核苷酸到一个可检测标签的琥珀酰亚胺酯衍生物上，然后生成一个使用标签核苷酸的引物。(参阅，例如Nature Biotech(2000)18：345-348和网址info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/n_coupling.html)。一个间隔区(一般5-16个碳原子长)有时候被参入可检测标签与核苷之间。可以使用的可检测标签包括，但不限于放射性同位素(如¹²⁵I，¹³¹I，³⁵S，³²P，¹⁴C或³H)；光散射标签(如球状金或银标签；Genicon Sciences Corporation，San Diego，CA，美国专利号6,214,560)；酶或蛋白质标签(如GFP或过氧化物酶)；或其它的发色标签或染料。荧光标签(如氨基-甲基香豆素(AMCA)；二乙基氨甲基香豆素(DEAC)；瀑布蓝(CB)；异硫氰酸荧光素(FITC)；俄勒冈绿(OG)；Alexa 488(A488)；若丹明绿(RGr)；镧系螯合物(例如，铕)；羧基若丹明6G(R6G)；四甲基若丹明(TAMRA)；德州红(TxR)；Cy3；Cy3.5；Cy5，Cy5.5和羧萘荧光素(CNF)，地高辛(DIG)；和2，4-二硝基苯基(DNP))也是经常被使用的。其它萤光团和伴随物激发与发射波长在下列文献中有所叙述：Anantha，et al.，Biochemistry(1998)37：2709-2714和Qu& Chaires，Methods Enzymol(2000)321：353-369。
在一个实施例中，一个共价连接荧光标签的引物寡核苷酸与模板DNA接触。得到的复合物和受试化合物接触后，和能够延伸引物的聚合酶接触。随后，反应产物通过毛细管电泳分离和检测。一个较长的引物序列被用来和引物中不含有共价相连荧光团或不用毛细管电泳分离的情况作比较。在分离前的任意阶段加入脱氧核苷酸，一般在引物和模板DNA接触之时。在加入受试化合物前，模板DNA/引物复合物常经过变性(例如，通过增加系统温度)和随后复性(例如，通过对系统进行冷却)等操作。
下面是测定实施的具体例子。将一个5’-荧光标记的(FAM)引物(P45，15nM)和模板DNA(15nM)在含有10mM MgCl₂，0.1mM EDTA和0.1mM混合脱氧核苷酸三磷酸(dNTP’s)的Tris-HCL(15mM Tris，pH 7.5)缓冲液中混合。FAM-P45引物
(5’-6FAM-AGTCTGACTGACTGTACGTAGCTAATACGACTCACTATAGCAATT-3’)和模板DNA
(5’-TCCAACTATGTATACTGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGGTTAGCGACACGCAATTGCTATAGTGAGTCGTATTAGCTACGTACAGTCAGTCAGACT-3’)被合成且通过Applied Biosystems HPLC纯化。混合物在95℃下变性5分钟，在冷却至室温后，于37℃下孵育15分钟。
冷却到室温后，加入1mM KCl₂和受试化合物(不同浓度)，混合物在室温下孵育15分钟。然后加入10mM KCl和Taq DNA聚合酶(2.5U/反应，Promega)，在70℃下孵育30分钟以完成引物的延长。通过将1μl反应混合物加入到10μl Hi-Di甲酰胺混合物和0.25μl LIZ120 size standard，终止反应。Hi-Di甲酰胺和LIZ120 size standard购自Applied Biosystems。部分延长的四聚体捕获产物长度为61或62个碱基，全部延长产物长度为99个碱基。产物通过毛细管电泳分离和分析。毛细管电泳采用ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer进行。分析采用上述化合物进行，结果见表1。表1报告的μM浓度是测定中捕获50％的DNA时的浓度(即较短的部分延长DNA(捕获的DNA)和全部延长DNA的比例是1∶1)。
转录报告测定法
在转录报告测定法中，受试四聚体DNA被偶联到一个报告系统上，以使四聚体的形成和稳定作用能够调控报告信号。这种系统的一个例子是一个报告表达系统。在此系统中，一个多肽如荧光素酶或绿荧光蛋白(GFP)，通过一个可操作连接到潜在四聚体形成核酸上的基因表达，从而能够检测多肽的表达。本文中使用的术语“可操作连接”是指一个核苷酸序列，它由一个包含潜在四聚体形成核酸的序列调节。当一个序列作为四聚体DNA在相同或不同的核酸上时，该序列可以为可操作连接。下面要描述的是一个荧光素酶报告系统范例。在He，et al.，Science(1998)281：1509-1512中叙述了一种荧光素酶启动子测定法，它常被用来研究四聚体的形成。He，et al.(参考文献11)的文献阐明了本法所用的媒介。在本测定中，使用基于脂质体(lipofectamin)2000的系统(Invitrogen)来转染HeLa细胞。转染过程根据制造商的方法，使用0.1μg pRL-TK(Renilla荧光素酶报告质粒)和0.9μg四聚体形成质粒。根据制造商的方法，在一个96-孔平板中，使用双荧光素酶报告测定系统(Promega)分析萤火虫和海肾(Renilla)的荧光素酶活性。
圆二色谱测定法
圆二色谱(CD)被用来决定其它分子是否与四聚体核酸相互作用。CD尤其适用于判定一个PNA或PNA-肽结合物能否和一个四聚体核酸体外杂交。37℃下，在含有10mM磷酸钾(pH 7.2)和10或250mM KCl的缓冲液中，将PNA探针加入到四聚体DNA(各5μM)。在相同的温度下静置5分钟，随后记录谱图。CD谱图在一台装备有热电控制单细胞夹的Jasco J-715分光偏振仪上记录。CD强度一般在220nm和320nm之间检测。产生只含有四聚体DNA，只含有PNA和含有PNA与四聚体DNA的对比谱图，以判定是否有相互作用(参阅Datta，etal.，JACS(2001)123：9612-9619)。谱图记录的是以100nm/分钟的速度八次扫描的平均值。
荧光结合测定法
荧光结合测定法的一个例子是一个包括四聚体核酸，信号分子和受试分子的系统。当结合到四聚体核酸上时，信号分子产生一个荧光信号(例如，N-甲基中卟啉IX(NMM))。当受试化合物和信号分子竞争结合到四聚体核酸上时，所产生的信号就会发生改变。当受试化合物存在或不存在时，信号的改变能够识别受试化合物是否为四聚体相互作用化合物。
50μl四聚体核酸或一种不能形成四聚体的核酸被加入到96-孔平板中。向其中加入不同浓度的受试化合物。测定通常在100μl 20mM HEPES缓冲液，pH 7.0，140mM NaCl和100mM KCl中进行。随后，加入50μl信号分子NMM，直至终浓度为3μM。NMM来自Frontier Scientific Inc，Logan，Utah。使用FluroStar2000荧光仪(BMG Labtechnologies，Durham，NC)，在激发波长420nm和发射波长660nm下测量荧光。荧光强度常作为受试化合物或四聚体定向核酸浓度的函数而绘制变化图，最大NMM荧光信号在没有这些分子的情况下测定。
细胞增殖测定法
在癌细胞增殖测定法中，细胞增殖速率通过加至细胞培养基中受试化合物浓度的函数评定。本法可使用任意癌细胞类型。在一个实施例中，结肠癌细胞在体外培养，受测化合物以不同浓度加入培养基。一个有用的结肠癌细胞系是colo320，它是美国国家卫生研究院保存的一种结肠腺癌细胞系，编号JCRB0225。使用这些细胞的参数可参阅网页cellbank.nihs.go.jp/cell/data/jcrb0225.htm。
化合物配方
本文所用术语“药物允许盐，酯和酰胺”包括，但不限于羧酸盐，氨基酸加成盐，化合物的酯和酰胺，及其两性离子形式，上述形式为技术人员所熟知，适于人类和动物使用。(参阅，例如，Gerge，S.M.，et al.，“Pharmaceutical Salts，”J.Pharm.Sci.(1977)66：1-19，在此并入参考文献中。)
本文叙述的任何适当的化合物配方可以被制备。当化合物的碱性或酸性足够强以形成稳定的无毒酸性或碱性盐时，化合物以盐的形式给药也许是合适的。药物允许盐的例子包括和能够形成生理允许阴离子的酸反应生成的有机酸盐，形成的生理允许阴离子包括如对甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐，丙二酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，安息香酸盐，抗坏血酸盐，α-酮戊二酸盐，α-甘油磷酸盐等。还可以形成适当的无机酸盐，包括盐酸盐，硫酸盐，硝酸盐，碳酸氢盐和碳酸盐。药物允许盐通过众所周知的标准程序制得，例如使一个足够量碱性化合物如胺和一种提供生理允许阴离子的适当酸反应。碱金属(例如，钠，钾或锂)或碱土金属(如钙)的羧酸盐也可以被制备。
一个化合物可以作为药用成分制成制剂，给需要治疗的哺乳动物宿主使用。在一个实施例中，哺乳动物宿主是人。任何合适的给药途径都可以使用，包括但不限于口服、肠外、静脉、肌肉、局部或皮下给药。
在一个实施例中，一个化合物同一种药用允许的赋形剂诸如一种惰性稀释剂或一种可吸收食用载体一起进行全身给药(例如，口服)。它们可以装入硬或软明胶胶囊，压成片剂，或直接放入患者的食物。对于口服治疗给药，活性成分需要和一种或多种赋形剂混合制成可吸收片剂，口含片剂，锭剂，胶囊，酏剂，混悬剂，糖浆剂，糯米纸囊剂及其它类似的剂型。这些混合物及制剂中应当含有至少0.1％的活性成分。混合物与制剂的比例可以在一次单位给药剂量的2～60％范围内灵活变化。在有药用活性的混合物里，活性成分的含量应达到有效治疗剂量水平。
片剂，锭剂，丸剂，胶囊剂及其它类似剂型要包含以下物质：可以加入粘合剂诸如西黄蓍胶，阿拉伯胶，玉米淀粉或明胶；赋形剂诸如磷酸二钙；崩解剂诸如玉米淀粉，马铃薯淀粉，褐藻酸等；润滑剂诸如硬脂酸镁；及甜味剂诸如蔗糖，果糖，乳糖或是阿斯巴甜或是香味剂诸如薄荷油，冬青油或樱桃味香料。当单位给药剂型是胶囊时，除以上物质外，它还应该包含液体吸附剂，例如植物油或聚乙二醇。还可以添加许多其它的物质来作为包衣或是来修饰固体制剂的物理形态。例如，片剂，丸剂或胶囊可以用明胶、蜂蜡、虫胶或蔗糖等包衣。糖浆剂或酏剂中应该包含有活性成分，蔗糖或果糖来作为甜味剂，尼泊金甲酯或丙酯作为防腐剂，着色剂及樱桃香精或桔子香精作为香味剂。在制备任何剂型中所用到的任何物质在使用剂量下都应该是适合药用的并且无毒的。此外，活性成分也可以制到缓释制剂及装置中。
活性成分也能够以静脉注射或腹腔注射的方式给药。活性成分或其盐的溶液可以制成缓冲溶液，通常是磷酸盐缓冲液，其中可混合有无毒的表面活性剂。分散剂可以在甘油，液体聚乙二醇，甘油醋酸酯，或是这些物质的混合物及油中来制备。在普通条件下贮存和使用，这些制剂中含有防腐剂来抑制微生物的生长。化合物有时候也可制备成含多种基质的配方，用于这些给药途径(例如脂质体或微粒体)。脂质体在U.S.Patent No.5,703,055(Felgner，et al.)及Gregoriadis，LiposomeTechnology vols.I to III(2nd ed.1993)中作为实例进行了描述。
适合于注射或输入给药的药物制剂可包括包含有活性成分的灭菌水溶液或分散剂或无菌粉末，这些活性成分要适合于即时制备无菌注射剂、输液或分散剂，也可以包入脂质体中。在所有的情况下，最终剂型应该是无菌，液体并且在生产和贮存条件下稳定。液体载体或溶媒可以是一个溶液或液体分散媒介，包括水，乙醇，多羟基化合物(如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇及类似物质)，植物油，无毒的甘油酯，及它们的合适的混合物。例如通过形成脂质体，或是在分散剂中保持粒径或使用表面活性剂，可以保持良好的流动性。防止微生物滋长可以通过采用各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，尼泊金类，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞及类似物。在许多情况下，最好能含有等渗调节剂，例如，糖，缓冲液或氯化钠。可以通过在制剂中使用一些延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶，延长注射成分的吸收。
无菌注射剂的制备是根据需要，把所需量的活性成分和上述各种辅料混合，然后进行过滤灭菌。在制备注射用无菌粉末的时候，首选方法就是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术会使活性成分和其它添加成分在制备的灭菌溶液中仍旧存在。
对于局部给药，这些化合物通常以液体形式应用。化合物通常是以混合物或配方的方式给药，同时要辅以皮肤能使用的载体，通常是液体或固体。用来把化合物传递到皮肤的有效治疗皮肤病的实例已经广为人知(参阅，例如，Jacquet et al.)。(U.S.Pat.No.4,608,392)，Geria(U.S.Pat.No.4,992,478)，Smith et al.(U.S.Pat.No.4,559,157)和Wortzman(U.S.Pat.No.4,820,508)。
化合物也可以和固体载体一起制成制剂，这些固体载体包括良好分散的固体诸如滑石粉，陶土，微晶纤维素，硅土，氧化铝及类似物。实用的液体载体包括水，乙醇，或乙二醇或水-乙醇/乙二醇混合物，在这些体系里，化合物能够达到有效水平的溶解或分散，同时可选择无毒的表面活性剂辅助。可以添加辅料诸如芳香剂及抗菌添加剂，以优化指定用途的性能。所制备的液体组分可以用作可吸收的药垫，浸渍绷带或其它敷料剂，或是用泵或气雾剂的喷雾器喷到患病部位。增稠剂诸如合成的聚合物，脂肪酸，脂肪酸盐或酯，脂肪醇，改性的纤维素或改性的矿物质，也可以同液体载体一起使用来制备易涂的软膏，凝胶剂，油膏，肥皂及类似物，以直接用于患者皮肤。
液体制剂中的化合物浓度通常大约为0.1wt％至wt25％(质量浓度)，有时为大约0.5wt％至wt10％。半固体或固体制剂诸如凝胶或散剂中的浓度则通常为0.1wt％至wt5％，有时约为0.5wt％至2.5wt％。含有化合物的混合物可以制成单位剂型，这可以根据制药企业所熟知的传统技术来制备。在常规条件下，这些技术包括将化合物和药用载体和/或赋形剂混合成液体形式，或良好分散的固体形式，或两者都有，然后根据需要可以将产物制成一定的形状。含有化合物的混合物可以制成任何剂型，例如片剂，胶囊，软胶囊，糖浆剂，软凝胶，栓剂，及灌肠剂。此混合物也可以制成水溶液，非水溶液或混合介质的混悬剂。水溶性混悬剂可进一步包含有一些可以增加粘稠度的物质，例如，羧甲基纤维素纳，山梨醇，和/或右旋糖苷。混悬剂中还可以包括一种或多种稳定剂。
化合物或其活性盐或衍生物在治疗中所需的含量不仅可以根据具体选择的盐来变化，而且可以根据给药途径、所治疾病的性质及患者的年龄和自身条件来变化，并且最终要靠巡诊医生或临床医生来判断。
一个有用的化合物剂型通常通过其在细胞或组织内的体外活性和/或动物体内的体内试验来进行评估。例如，由小鼠和其它动物的有效剂量推断人体剂量也被科学家所知(例如，U.S.Pat.No.4,938,949)。这个系统可用来判定一个化合物的LD₅₀(半数致死量)及ED₅₀(半数有效治疗量)。中毒剂量和治疗剂量的比值称为治疗指数，它可以表示为ED₅₀/LD₅₀。化合物的剂量通常在达到ED₅₀并且低毒或无毒的范围内波动。剂量的变化决定于给药的剂型和所采用的给药途径。对于此处任何方法所用的化合物，治疗有效剂量都可以通过细胞培养试验来初步估计。剂量通常要根据体外试验，按达到循环血液浓度范围达到IC₅₀来制订(即受试化合物的浓度达到对症状最大抑制的一半)，并且这种信息经常能更准确的判定用于人体的有效剂量。血药水平可以测定，例如，通过高效液相色谱法。
检测受体有效剂量的另外一个实例就是直接分析受体血浆中“游离”和“结合”的被测物质含量。这种分析手段可以利用由分子印记技术得到的模拟抗体和/或“生物传感器”。将化合物作为模板或“印记分子”，在可聚合单体与催化剂聚合前对其空间组织。随后除去印记分子，形成其中含有重复的化合物“负面镜像”，并且可以在生物分析条件下选择性重新结合分子的聚合物模板。(例如，Ansell，et al.，CurrentOpinion in Biotechnology(1996)7：89-94 and in Shea，Trends in Polymer Science(1994)2：166-173)。这种“印记”亲和模板可用配基结合分析检验，检验中固定的单克隆抗体成分可被适当的印记模板取代。(例如，Vlatakis，et al.，Nature(1993)361：645-647)。通过采用同位素标记，化合物的“游离”浓度可以很容易的监测并用于计算IC₅₀。这些“印记”亲和模板同样也可以被设计为含有荧光基团，其光子的发散性质会随着与化合物的局部或选择性结合而产生可测的变化。这些变化可以很容易的通过纤维光学装置进行实时检测，随后依据其IC₅₀使受体的剂量迅速达到最佳。关于“生物传感器”的一个实例在Kriz，et al.，Analytical Chemistry(1995)67：2142-2144中有所讨论。
典型的剂量包括每千克受体或样本重量数毫克或数微克化合物，例如，从每千克受体约1微克到约500毫克，从每千克受体约100微克到5毫克，或从每千克受体约1微克到50微克。众所周知，小分子物质的适当剂量在调整表达或活性方面取决于小分子物质的效力。当将一种或多种这些小分子物质给予动物时(例如，人类)，为调整此处所述一个多肽或核酸的表达或活性，医生、兽医或是研究人员都可能会首先开出一个相对较低的剂量，随后再增加剂量直到获得适当反应。此外，人们知道对于任何特定动物受体，特定的剂量水平都将取决于一系列因素，包括所用特定化合物的活性，受体年龄，体重，健康状况，性别及饮食，给药时间，给药途径，排泄速率，任何药物的联合使用，及表达或活性的调整程度。
下面的例子可以解释，但不限于本发明。
                            实施例
下面为合成取代醌苯并恶嗪类似物的典型过程。
                             例1
                  取代醌苯并恶嗪类似物的制备
取代醌苯并恶嗪类似物制备的常规合成方案如方案1所示。
                                 方案1

                 (2’3’4’5′-四氟苯甲酰)-乙酸酯乙酯
        (Ethyl-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl)-ethanoate)

10-15℃下，将3.66g，21.5mmol的丙二酸钾(Potassium ethyl malonate)，2.44g，25.7mmol的MgCl₂和2.05g，20.3mmol的TEA在70ml乙腈中混合2.5小时。0℃时，将2.00g，10.3mmol 2，3，4，5-四氟苯甲酰氯(2，3，4，5-tetrafluorobenzoylchloride)加在10毫升乙腈中，15分钟后再次加入0.23g，2.3mmol的TEA。加热到室温后，将混合物搅拌16个小时。真空除去易挥发成分后，加入30ml的甲苯(Toluene)，然后真空除去。随后加入甲苯(60ml)，1.5M HCl(40ml)，确保温度不超过25℃。有机相用1.5M的HCl 25ml和25ml水各清洗两次，用MgSO₄干燥并且在真空下减为略带桔色的油([M+1]⁺265，98％)。
    2-(2’3’，4’，5′-四氟苯甲酰)-3-(二甲基氨基)-丙基-2-烯酸乙酯
(Ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(dimethylamino)-prop-2-enoate)

将0.61g，5.1mmol的二甲缩醛二甲基甲酰胺(Dimethyl acetal dimethylformamide)逐滴加入0.9g，3.41mmol的乙基(2’，3’，4’，5′-四氟苯甲酰)-乙酸酯(ethyl-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl)-ethanoate)，并在2ml醋酸酐(acetic anhydride)中通氩气溶解。30分钟后真空下除去溶剂，得到一定产量的桔色油状产物([M+1⁺]320)。
     1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶并[3，2，1-kl]-8-苯基-吩嗪-5-羧酸乙酯
                           (Ethyl
1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-phenyl-phenoxazine-5-carboxylate)

将3.4g，8.0mmol的2(2’，3’，4’，5′-四氟苯甲酰-)-3-(二甲基氨基)-丙基-2-烯酸乙酯(Ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(dimethylamino)-prop-2-enoate)和1.5g，8.0mmol的2-氨基-4-苯基-苯酚(2-amino-4-phenyl-phenol)置于20mlDMSO中，在60℃真空下搅拌30分钟。将5g的K2CO3和20ml的MeCN加入到混悬液中，加热至80℃至1小时。冷却至室温后，将混合物倾入稍微过量的稀硫酸中并过滤。产物为黄褐色固体([M+1]⁺420，65％)。
                                 例2
       1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶并[3，2，1-kl]-8-苯基-吩嗪-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-phenyl-phenoxazine-5-carboxylic acid)的
                               制备

将2.2g，5.3mmol的1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-苯基-吩嗪-5-羧酸乙酯(Ethyl1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-phenyl-phenoxazine-5-carboxylate)在20ml浓HCl和20ml醋酸中混合回流两小时。冷却到室温后，在反应混合物中加入40ml冰水，将得到的沉淀过滤，并用乙醚洗涤以得到产率为90％的黄褐色固体([M+1]⁺392)。
                                 例3
2-(2’3’4’，5′-四氟苯甲酰-)-3-(萘基-2”，3”-二氨基)-丙基-2-烯酸乙酯
(Ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(napthyl-2”，3”-diamino)-prop-2-enoate)
的制备

将溶有10.53g，33mmol的2-(2’，3’，4’，5′-四氟苯甲酰-)-3-(二甲基氨基)-丙基-2-烯酸乙酯
(Ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(dimethylamino)-prop-2-enoate)的50ml乙腈(acetonitrile)液加入150ml溶有5.22g，33mmol的2，3-二氨基萘(2，3-diaminonapthalene)的乙腈(acetonitrile)溶液中，并且在通氩气的条件下维持在50℃。3小时后，真空条件下除去挥发性成分，剩余物用硅胶干燥，再用条件为15％的乙酸乙酯/正己烷(EtOAc/Hexane)的色谱进行分离，得到55％产率的黄色产物([M+l]⁺433)。
                                例4
1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[g]-苯二嗪-5-羧酸乙酯
(Ethyl 1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[g]-phendiazine-5-carboxylate)
的制备

将600mg 1.4mmol的-2-(2’，3’，4’，5′-四氟苯甲酰-)-3-(萘酯-2”，3”二氨基)-丙基-2-烯酸乙酯(Ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(napthyl-2”，3”diamino)-prop-2-enoate)溶于500ml溶有K₂CO₃的DMF匀浆液中，100℃下剧烈搅拌此混合物1小时，随后冷却至室温。过滤除去K₂CO₃并且真空除去DMF，得到较高产率的黄棕色固体。([M+1]⁺393)。
                            例5
1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[g]-苯二嗪-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[g]-phendiazine-5-carboxylic acid)的制
备

将KOH溶液(1N，2.54ml，2.56mmol)加入到400ml溶有500mg，1.28mmol的1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[g]-苯二嗪-5-羧(1，2-difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[g]-phendiazine-5-carboxylate)的乙醇(ethanol)溶液中，回流加热。两小时后，将反应混合物冷却至室温，用HCl溶液(1N)调至中性。过滤得到黄色固体，产率89％。([M+1]⁺365)。
                               例6
        1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-苯二嗪-5-羧酸乙酯
(Ethyl 1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3.2.1-kl]-phenthiazine-5-carboxylate)的制
备
2-(2’，3’4’，5′-四氟苯甲酰-)-3-(N-氨基苯基二硫基)-丙基-2-烯酸乙酯
(Ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(N-aminobenzyldisulfide)-prop-2-enoate)

将10ml溶有17.7g，55.3mmol的2-(2’，3’，4’，5′-四氟苯甲酰-)-3-(二甲基氨基)-丙基-2-烯酸乙酯
(Ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(dimethylamino)-prop-2-enoate)的乙腈(acetonitrile)溶液加入到100ml溶有5.22g，33mmol的1，2-氨基苯硫酚二聚体(1，2-aminothiophenol dimer)的乙腈(acetonitrile)溶液中。3小时后，真空除去挥发性成分，剩余物用硅胶干燥，之后用1％的甲醇/二氯甲烷(MeOH/DCM)色谱分离，得到产率50％的黄色固体产物。([M+1]⁺523)。
        1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-苯二嗪-5-羧酸乙酯
(Ethyl 1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-phenthiazine-5-carboxylate)

将2.5g，3.2mmol的2-(2’，3’，4’，5′-四氟苯甲酰-)-3-(N-氨基苯基二硫基)-丙基-2-烯酸乙酯
(Ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(N-aminobenzyldisulfide)-prop-2-enoate)溶于120ml的二甲基甲酰胺(DMF)中，回流加热六小时。真空除去DMF，得到产率90％的黄色固体产物。([M+1]⁺360)。
                                   例7
            1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-苯二嗪-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-phenthiazine-5-carboxylic acid)的制备

将KOH溶液(1N，3.0，3.0mmol)加入到400ml溶有1000mg，2.5mmol的1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-苯二嗪-5-羧酸乙酯
(ethyl 1，2-difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-phenthiazine-5-carboxylate)的乙醇(ethanol)溶液中，回流加热。混合物反应两小时后，冷却至室温，随后用HCl溶液(1N)中和。过滤收集黄色固体产物，产率95％，([M+1]⁺332)
                                   例8
    5，6-二氟-9-羟基-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]嘧啶基[g]吩嗪-2-羧酸
(5，6-Difluoro-9-hydroxy-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]pyrimido[g]phenoxazine-2-carboxylic
acid)的制备
7-硝基喹唑啉-4，6-二醇(7-nitroquinazoline-4，6-diol)

将1.4g，6.3mmol的6-甲氧基-7-硝基-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(6-methoxy-7-nitro-3，4-dihydroquinazolin-4-one)加入到含有20ml，48％的水合HBr及20ml的AcOH的溶液中，再将混合物回流加热过夜。将得到的溶液蒸发干燥，得到残渣为苯酚粗品(1.2g，5.8mmol)，不需进一步纯化即可使用(M+1，208)。
7-氨基喹唑啉-4，6-二醇

将上面得到的粗品(1.0g，5.8mmol)用40ml水稀释，再加入3g氯化锡二水合物(Tin II chloride dihydrate)，在室温下搅拌反应。反应1小时后，用K₂CO₃处理至中性，再用EtOAc(3×50mL)萃取。将萃取的有机相合并，用硫酸钠干燥，真空除去溶剂得到1.0g，5.6mmol的氨基乙醇(amino alcohol)粗品(M+1，178)。
5，6-二氟-9-羟基-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]嘧啶基[g]吩嗪-2-羧酸乙酯(Ethyl；
5，6-difluoro-9-hydroxy-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]pyrimido[g]phenoxazine-2-carboxylate)

将1.0g，5.6mmol氨基酚(aminophenol)加入到3mL溶有2.2g，6.9mmol的四氟烯胺(tetrafluoroenamine)的DMSO溶液中，将反应混合物在60℃真空(旋转蒸发仪)下搅拌20分钟。然后将反应混合物冷却至室温，用200mL乙腈(acetonitrile)稀释再加入碳酸钾(potassium carbonate)。将混合物回流加热5小时，然后倾入稀醋酸/水溶液(HOAc/water)。固体产物通过真空抽过收集并干燥，得到1.3g，3.2mmol的棕黄色固体产物二氟酯(difluoroester)(M+1，412)。
5，6-二氟-9-羟基-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]嘧啶基[g]吩嗪-2-羧酸
(5，6-Difluoro-9-hydroxy-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]pyrimido[g]phenoxazine-2-carboxyl
ic acid)

将1.3g，3.2mmol的二氟酯(difluoroester)溶于20mL冰醋酸(glacialacetic acid)与12M盐酸(HCl)的1∶1混合物中回流30分钟。然后将混合物冷却至室温，倾入水中。真空抽滤并干燥收集固体产物，得到0.98g，2.5mmol的棕黄色固体二氟酸(difluoroacid)([M+1]⁺392)。
                                例9
2-(2-(乙氧羰基)-5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-9-基氧基)醋酸
(2-(2-(Ethoxycarbonyl)-5，6-difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazin-9-yloxy)aceti
c acid)的制备
         5，6-二氟-9-羟基-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2-羧酸乙酯
(Ethyl 5，6-difluoro-9-hydroxy-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2-carboxylate)

将2.5g，15.5mmol的2，4-盐酸二羟苯胺(2，4-dihydroxyaniline hydrochloride)加入到12mL溶有5.8g，18.2mmol的四氟烯胺(tetrafluoroenamine)的二甲基亚砜(DMSO)溶液中，将混合物在真空(旋转蒸发仪)下加热至60℃ 20分钟。将反应混合物用100mL乙腈(acetonitrile)稀释，再加入3g碳酸钾，然后将混合物回流过夜。将混合物冷却至室温，然后真空除去溶剂。加入轻微过量的2MHCl以迅速溶解碳酸盐，将得到的固体沉淀过滤并干燥，得到5.0g，13.9mmol的棕黄色固体二氟酯(difluoroester)(M+1,360)。
2-(2-(乙氧羰基)-5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-9-基氧基)醋酸
(2-(2-(Ethoxycarbonyl)-5，6-difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazin-9-yloxy)acet
ic acid)

将2.0g碳酸钾(potassium carbonate)加入到30mL溶有2.1g，5.8mmol的二氟酯(difluoroester)和2.0g，10.3mmol对丁基溴醋酸(tert-butylbromoacetate)的DMF溶液中，然后将混合物加热至60℃ 1小时。然后将反应冷却，并倾入500mL水中，用乙酸乙酯(ethyl acetate)(3×100mL)萃取，盐水冲洗，硫酸镁(magnesium sulfate)干燥，硅胶垫(30×50mm)过滤，乙酸乙酯洗提。真空下除去溶剂，将得到的物质加正己烷磨碎并干燥，得到2.8g，5.8mmol的棕黄色固体对丁酯(tert-butyl ester)。将物质溶于40mL四氟乙酸(trifluoroacetic acid)中，室温下搅拌30分钟。真空除去溶剂，得到2.4g，5.7mmol的棕黄色固体酸(M+1,418)。
                                例10
    9-(甲氧羰基)-5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2-羧酸
(9-(Carboxymethoxy)-5，6-difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2-carboxylic
acid)的制备

将2.4g，5.7mmol二氟酯(difluoroester)溶于40mL冰醋酸(glacial aceticacid)和12M盐酸(HCl)的1∶1混合物中，回流1小时。然后将混合物冷却至室温，倾入水中。然后将固体产物真空抽滤收集并干燥，得到2.0g，5.1mmol的棕黄色固体二氟酸(difluoroacid)(M+1,390)。
                                例11
1，2，3-三氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[g]-吩嗪-5-羧酸乙酯(Ethyl
1，2，3-trifluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[g]-phenoxazine-5-carboxylate)的制备

将3.5g，21.9mmol 3-氨基-2-萘酚(3-amino-2-naphthol)溶于12mL溶有8g，23.7mmol五氟烯胺(pentafluoroenamine)(制备过程与四氟烯胺(tetrafluoroenamine)类似)的DMSO溶液中，真空(旋转蒸发仪)下将混合物加热到60℃至两小时。将反应混合物用200mL乙腈(acetonitrile)稀释，再加入8.0g碳酸钾(potassium carbonate)，然后将混合物回流过夜。将混合物冷却至室温，真空除去溶剂。加入轻微过量的2M HCl以迅速溶解碳酸盐，将固体沉淀过滤并干燥，得到1.3g，3.2mmol的棕黄色固体二氟酯(difluoroester)(M+1,412)。
                                例12
       1，2，3-三氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[g]-吩嗪-5-羧酸
(1，2，3-Trifluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[g]-phenoxazine-5-carboxylic acid)的
制备

将1.3g，3.2mmol三氟酯(trifluoroester)溶于5mL醋酸(acetic acid)中，并加入5mL的12 M HCl，然后将反应混合物回流加热两小时。然后将混合物冷却至室温，倾入水中，真空抽滤收集并干燥固体产物，得到1.0g，2.6mmol的白色固体三氟酯(trifluoroacid)(M+1,384)。
                              例13
     1，-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[g]-吩嗪-5-羧酸乙酯
(Ethyl 1，2-difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[g]-phenoxazine-5-carboxylate)
的制备

室温下将10g，63mmol 3-氨基-2-萘酚(3-amino-2-naphthol)加入到100mL溶有30g，94mmol烯胺(enamine)的乙酸乙酯(ethyl acetate)溶液中，然后立即将混合物置于旋转蒸发仪中，在0℃下两个多小时后，(烧瓶上有冰形成)除去溶剂得到黄色固体。在此固体中加入200mL乙醚(ether)，将匀浆液过滤得到黄色固体。随后将固体溶于200mL DMF中，并加入16.5g，120mmol碳酸钾(potassium carbonate)，然后将混合物加热到90℃至1小时。将混合物冷却至室温，然后加入500mL水，将得到的固体过滤，水洗并干燥，得到12.2g，30.8mmol的棕黄色固体二氟酯(difluoroester)(M+1,394)。
                               例14
      1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[g]-吩嗪-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[g]-phenoxazine-5-carboxylic acid)的制
备

将5g，12.7mmol二氟酯(dfiluoroester)溶于50mL甲醇(methanol)中，再加入20mL浓HCl，然后将混合物回流12小时。将混合物冷却至室温，真空抽滤收集固体，并用甲醇洗涤，得到3.6g，9.9mmol的淡棕黄色粉末二氟酸(difluoroacid)(M+1,366)。
                               例15
       1-氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[g]-吩嗪-5-羧酸乙酯
(Ethyl 1-fluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[g]-phenoxazine-5-carboxylate)
的制备

室温下将5.0g，31.2mmol 3-氨基-2-萘酚(3-Amino-2-naphthol)加入到100mL溶有14g，46.3mmol烯胺(enamine)(制备类似于四氟烯胺)的乙酸乙酯(ethylacetate)溶液中，将混合物立即置于旋转蒸发仪，在0℃下两个多小时后，(烧瓶上有冰形成)除去溶剂得到黄色固体。在此固体中加入200mL甲醇(methanol)，将匀浆液过滤得到黄色固体。然后将固体溶于200mL乙腈(acetonitrile)中，再加入10.0g，72.5mmol碳酸钾(potassium carbonate)，然后将混合物加热到80℃至1小时。将混合物冷却至室温，加入500mL水，将得到的固体过滤，水洗并干燥，得到6.0g，16.0mmol的棕黄色固体氟酯(fluoroester)(M+1,376)。
                              例16
        1-氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[g]-吩嗪-5-羧酸
(1-Fluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[g]-phenoxazine-5-carboxylic acid)的制备

将6.0g，16.0mmol氟酯(fluoroester)溶于10mL醋酸(acetic acid)中，并加入10mL 12M HCl，将反应混合物回流加热两小时。然后将混合物冷却至室温，倾入水中，真空抽滤收集并干燥产物，得到4.8g，13.8mmol的白色固体氟酸(fluoroacid)(M+1,348)。
                               例17
        9-氯-5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2-羧酸乙酯
(Ethyl 9-chloro-5，6-difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2-carboxylate)
的制备

将5.0g，34.8mmol 5-氯-2-氨基苯酚(5-chloro-2-aminophenol)加入到200mL溶有14.4g，45.3mmol烯胺(enamine)的乙酸乙酯(ethyl acetate)溶液中，使用旋转蒸发仪真空旋蒸两小时除去溶剂，不加热。加入甲醇(Methanol)，将得到的酚烯胺(phenolic enamine)真空抽滤。将得到的7.0g固体溶于乙腈(acetonitrile)中加入碳酸钾(potassium carbonate)，将得到的混合物回流加热两小时。然后将混合物冷却至室温，倾入到稀HCl中。将得到的固体真空抽滤收集并干燥，得到5.0g，13.3mmol的淡黄色固体二氟酯(difluoroester)(M+1,378)。
                                例18
        9-氯-5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2-羧酸
(9-Chloro-5，6-difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2-carboxylic acid)的制
备

将5.0g，13.3mmol二氟酯(difluoroester)溶于45mL醋酸(acetic acid)中，再加入30mL 12M HCl，然后将反应混合物回流加热两小时。然后将混合物冷却至室温，倾入水中，真空抽滤收集并干燥，得到4.0g，10.6mmol的白色固体二氟酸(difluoroacid)(M+1,350)。
                                 例19
      10-氯-5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2-羧酸乙酯
                                (Ethyl
10-chloro-5，6-difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2-carboxylate)的制备

将5.0g，34.8mmol 4-氯-2-氨基酚(4-chloro-2-aminophenol)加入到200mL溶有14.4g，45.3mmol烯胺(enamine)的乙酸乙酯(ethyl acetate)溶液中，用旋转蒸发仪旋蒸两小时真空除去溶剂，不加热。加入甲醇(Methanol)，将得到的酚烯胺(phenolic enamine)真空抽滤。将得到的7.5g固体溶于乙腈(acetonitrile)中，然后加入碳酸钾(potassium carbonate)，并将得到的混合物回流加热两小时。然后将混合物冷却至室温，倾入稀HCl中。将得到的固体真空抽滤收集并干燥，得到5.0g，13.3mmol的淡黄色固体二氟酯(difluoroester)(M+1,378)。
                                例20
          10-氯-5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2-羧酸
(10-Chloro-5，6-difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2-carboxylic acid)的
制备

将2.5g二氟酯(difluoroester)溶于25mL醋酸(acetic acid)中，加入20mL 12 M HCl，然后将混合物回流加热两小时。然后将混合物冷却至室温，倾入水中，将得到的固体产物真空抽滤收集并干燥，得到2.0g，5.3mmol白色固体二氟酸(difluoroacid)(M+1,350)。
                            例21
       5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2-羧酸乙酯
(Ethyl 5，6-Difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2-carboxylate)的制备

室温下将1.9g，17.43mmol 2-氨基酚(2-aminophenol)加入到50mL溶有5.7g，17.9mmol烯胺(enamine)的乙酸乙酯(ethyl acetate)中，之后立即将混合物置于旋转蒸发仪中，在0℃下两个多小时后，(烧瓶上有冰形成)除去溶剂得到黄色固体。在此固体中加入25mL乙醚(ether)，再将匀浆液过滤得到黄色固体。然后将此固体溶于20mL DMF中，再加入2.9g，21mmol碳酸钾(potassiumcarbonate)，将混合物加热到90℃至1小时。将混合物冷却至室温，加入200mL水，将得到的固体过滤，水洗，干燥，得到2.9g，8.45mmol的棕黄色固体吩嗪(phenoxazine)(M+1,344)。
                                例22
          5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2-羧酸
(5，6-Difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2-carboxylic acid)的制备

将5.0g，14mmol二氟酯(difluoroester)溶于50mL甲醇(methanol)中，加入20mL浓HCl，将混合物回流两小时。将混合物冷却至室温，真空抽滤收集固体，用甲醇(methanol)冲洗，得到4.2g，13.3mmol的淡棕黄色粉末二氟酸(difluoroacid)，产率91％(M+1,316)。
                              例23
1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[h]-吩嗪-5-羧酸乙酯(Ethyl
1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[h]-phenoxazine-5-carboxylate)的制备

将5.0g，31.3mmol 1-氨基-2-萘酚(1-amino-2-naphthol)加入到200mL溶有14.0g，45.3mmol(enamine)烯胺的乙酸乙酯(ethyl acetate)溶液中，用旋转蒸发仪旋蒸两小时真空除去溶剂，不加热。加入甲醇(Methanol)，将得到的酚烯胺(phenolic enamine)真空抽滤。将固体溶于乙腈(acetonitrile)中，加入10g碳酸钾(potassium carbonate)，将混合物回流加热两小时。然后将混合物冷却至室温，倾入稀盐酸中。将得到的固体真空抽滤收集并干燥，得到5.0g，13.3mmol的淡黄色固体二氟酯(difluoroester)(M+1,376)。
                                例24
         1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[h]-吩嗪-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[h]-phenoxazine-5-carboxylic acid)的制
备

将5.5g二氟酯(difluoroester)溶于25mL醋酸(acetic acid)中，加入20mL 12 M HCl，将反应混合物回流加热两小时。然后将混合物冷却至室温，倾入水中，真空抽滤收集并干燥固体产物，得到5.0g，14.4mmol的白色固体二氟酸(difluoroacid)(M+1,348)。
                              例25
    1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[f]-吩嗪-5-羧酸乙酯
(Ethyl 1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[f]-phenoxazine-5-carboxylate)
的制备

将15.0g，93.8mmol 2-氨基-1-萘酚(2-amino-1-naphthol)加入到500mL溶有45g，141mmol烯胺(enamine)的乙酸乙酯(ethyl acetate)中，用旋转蒸发仪旋蒸两小时真空除去溶剂，不加热。加入甲醇(Methanol)，真空抽滤得到的酚烯胺(phenolic enamine)。将得到的固体溶于400mL乙腈(acetonitrile)中，加入25g碳酸钾(potassium carbonate)，将混合物回流加热2.5小时。然后将混合物冷却至室温，倾入稀HCl。将得到的固体真空抽滤收集并干燥，得到19.69g，50.1mmol的淡黄色固体二氟酯(difluoroester)(M+1,394)。
                                例26
        1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[f]-吩嗪-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[f]-phenoxazine-5-carboxylic acid)的制
备

将15.0g，38.1mmol二氟酯(difluoroester)溶于60mL醋酸(acetic acid)中，加入60mL 12 M HCl，然后将反应混合物回流加热两小时。然后将混合物冷却至室温，倾入水中，将固体产物真空抽滤收集并干燥，得到11.7g，32mmol的白色固体二氟酸(difluoroacid)(M+1,366)。
                               例27
1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[b]呋喃[2，3-g]-吩嗪-5-羧酸乙酯
(Ethyl
1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[b]furan[2，3-g]-phenoxazine-5-carboxylat
e)的制备
3-氨基二苯并呋喃-2-醇(3-Aminodibenzofuran-2-ol)

0℃时，用滴液漏斗将溶于CH₂Cl₂的200mL，1M BBr₃加到500mL溶有15g，70.4mmol二苯并呋喃(dibenzofuran)的一氯甲烷(methylene chloride)中。待滴加完毕，将混合物置于室温条件下1小时，然后用水冷却，随后加入40g碳酸钾(potassium carbonate)。真空抽滤重新得到固体，干燥，得到13.2g，199mmol的白色固体羟基二苯并呋喃(hydroxyl dibenzofuran)(M+1,200)。
1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[b]呋喃[2，3-g]-吩嗪-5-羧酸乙酯
(Ethyl
1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[b]furan[2，3-g]-phenoxazine-5-carboxylat
e)

将12.0g，60mmol羟基二苯并呋喃(hydroxyldibenzofuran)加入到30mL溶有15.0g，47mmol四氟烯胺(tetrafluoroenamine)的DMSO溶液中，将混合物在真空(旋转蒸发仪)下加热到60℃至20分钟。然后将反应混合物用200mL乙腈(acetonitrile)稀释，加入17g碳酸钾(potassium carbonate)，再将混合物回流2.5小时。将混合物冷却至室温，真空除去溶剂。加入微过量的2M HCl迅速溶解碳酸盐，将固体沉淀过滤，干燥，得到15.0g，34.6mmol的棕黄色固体二氟酯(difluoroester)(M+1,434)。
                              例28
1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[b]呋喃[2，3-g]-吩嗪-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]benzo[b]furan[2，3-g]-phenoxazine-5-carboxylic
acid)的制备

将15.0g，34.6mmol二氟酯(difluoroester)溶于60mL醋酸(acetic acid)中，加入60mL 12 M HCl，将反应混合物回流加热两小时。然后将混合物冷却至室温，倾入水中，真空抽滤收集并干燥固体产物，得到13.7g，34mmol白色固体二氟酸(difluoroacid)(M+1,406)。
                              例29
2-(乙氧羰基)-5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-10-羧酸乙酯
(Ethyl
2-(ethoxycarbonyl)-5，6-difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-10-carboxylate)
的制备

将3.0g，19.6mmol 4-羟基-3-氨基安息香酸(4-hydroxy-3-amino benzoic acid)加入到25mL溶有7.0g，21.9mmol四氟烯胺(tetrafluoroenamine)的DMSO溶液中，将混合物在真空(旋转蒸发仪)下加热至60℃两小时。然后将反应混合物用200mL乙腈(acetonitrile)稀释，加入8.0g碳酸钾(potassium carbonate)，将混合物回流过夜。将混合物冷却至室温，真空除去溶剂。加入稍微过量的2MHCl以迅速溶解碳酸盐，将固体沉淀过量干燥，得到6.2g，16.0mmol的棕黄色固体二氟酯(difluoroester)(M+1,388)。
                             例30
    2-(乙氧羰基)-5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-10-羧酸
(2-(Ethoxycarbonyl)-5，6-difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-10-carboxylic
acid)的制备

将6.2g，16.0mmol二氟酯溶于25mL(difluoroester)醋酸(acetic acid)中，加入20mL 12 M HCl，将反应混合物回流加热两小时。然后将混合物冷却至室温，倾入水中，真空抽滤收集并干燥固体产物，得到5.3g，14.8mmol的白色固体二氟二酸(difluorodi-acid)(M+1,360)。
                            例31
5，6-二氟-10-硝基-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2-羧酸乙酯
(Ethyl 5，6-difluoro-10-nitro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2-carboxylate)
的制备

将溶有6.0g，18.7mmol烯胺(enamine)和3.5g，23.3mmol 2-氨基-4-萘酚的乙腈(acetonitrile)溶液加热至80℃ 15分钟。然后加入8.0g碳酸钾(Potassiumcarbonate)，将混合物回流加热过夜。然后将反应混合物趁热过滤，真空除去溶剂，得到5.0g，12.8mmol的粗品硝酸酯(nitroester)(M+1,389)。
                             例32
5，6-二氟-10-硝酸-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2-羧酸
(5，6-Difluoro-10-nitro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2-carboxylic acid)的制
备

将5.0g，12.8mmol粗品二氟酯(difluoroester)溶于25mL醋酸(acetic acid)中，加入20mL 12 M HCl，将反应混合物回流加热两小时。然后将反应混合物冷却至室温，倾入水中，真空抽滤收集并干燥固体产物，得到2.0g，5.5mmol的白色固体二氟酸(difluoroacid)(M+1,361)。
                             例33
     5，6-二氟-3-氧-10-苯基-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2-羧酸乙酯
                             (Ethyl
5，6-difluoro-3-oxo-10-phenyl-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2-carboxylate)的制备

将溶有5.4g，16.9mmol烯胺(enamine)和3.5g，18.9mmol 3-氨基-4-羟基联苯(3-amino-4-hydroxybiphenyl)的乙腈(acetonitrile)溶液加热至80℃ 90分钟。然后加入8.0g碳酸钾(Potassium carbonate)，将混合物回流加热过夜。然后将反应混合物趁热过滤，真空除去溶剂，得到3.9g，9.3mmol的粗品二氟酯(difluoroester)(M+1,420)。
                               例34
        5，6-二氟-3-氧-10-苯基-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2-羧酸
(5，6-Difluoro-3-oxo-10-phenyl-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2-carboxylic acid)的
                                制备

将3.6g，8.6mmol粗品二氟酯(difluoroester)溶于10mL醋酸(acetic acid)中，加入10mL 12 M HCl，将反应混合物回流加热两小时。然后将混合物冷却至室温，倾入水中，真空抽滤收集并干燥固体产物，得到2.6g，6.6mmol的白色固体二氟酸(difluoroacid)(M+1,392)。
                               例35
1，2-二氟-4-氧-4H-11-磺酸-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[h]-吩嗪-5-羧酸乙酯
                               (Ethyl
1，2-Difluoro-4-oxo-4H-11-sulfonic-acid-pyrido[3，2，1-kl]benzo[h]-phenoxazine-5-carboxy
                              late)的制备

将4.8g，20mmol 1-氨基-2-羟基-4-萘磺酸(1-amino-2-hydroxy-4-naphthalenesulfonic acid)加入到30mL溶有5.4g，16.9mmol四氟烯胺(tetrafluoroenamine)的DMSO中，将混合物在真空(旋转蒸发仪)下加热到60℃至两小时。在反应混合物中加入10.0g碳酸钾(potassiumcarbonate)，将混合物加热至60℃ 1小时。将混合物冷却至室温，加入稍微过量的2M HCl以迅速溶解碳酸盐(carbonate)。将水层转移到其它容器，剩余的有机层溶于100mL甲醇(methanol)，再用200mL乙酸乙酯(ethyl acetate)使其沉淀，将固体沉淀过滤干燥，得到3.1g，6.5mmol的棕色固体磺酸(sulfonic acid)(M+1,474)。
                               例36
1，2-二氟-4-氧-4H-11-磺酸基-吡啶基[3，2，1-kl]苯并[h]-吩嗪-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-11-sulfonic-pyrido[3，2，1-kl]benzo[h]-phenoxazine-5-carboxylic
                             acids)的制备

将1.5g，3.2mmol粗品二氟酯(difluoroester)溶于10mL醋酸(acetic acid)中，加入10mL 12 M HCl，将反应混合物回流加热30分钟。真空除去溶剂，得到1.1g，2.5mmol的棕色固体磺酸(sulfonic acid)(M+1,446)
                               例37
2-(乙氧羰基)-5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-9-羧酸
(2-(Ethoxycarbonyl)-5，6-difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-9-carboxylic
                            acid)的制备

将溶有5.2g，16.3mmol二氟烯胺(difluoroenamine)和4.0g，26.1mmol 4-氨基-3-羟基苯甲酸(4-amino-3-hydroxybenzoic acid)的DMSO溶液于室温下搅拌1.5小时。然后加入8g碳酸钾(Potassium carbonate)，将反应混合物真空下(旋转蒸发仪)搅拌1小时。然后将混合物加热至100℃ 1小时，再冷却到室温。然后将反应混合物倾入500mL 1 M H₂SO₄中，真空抽滤重新得到固体。将所得固体干燥，得到5.0g，12.9mmol的棕黄色固体粗品二氟酸(difluoroacid)(M+1,388)。
                               例38
        5，6-二氟-3-氧-3H-吡啶基[3，2，1-kl]吩嗪-2，9-二羧酸
(5，6-Difluoro-3-oxo-3H-pyrido[3，2，1-kl]phenoxazine-2，9-dicarboxylic acid)的制备

将5.0g，12.9mmol粗品二氟酯(difluoroester)溶于20mL醋酸(acetic acid)中，加入20mL 12 M HCl，将反应混合物回流加热1小时。将反应降至室温，加入水。真空抽滤得到固体，干燥过夜，得到1.9g，5.3mmol的棕黄色固体二酸(di-acid)(M+1,360)。
                               例39
        1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-芴酮-5-羧酸乙酯
(Ethyl 1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-fluorenone-5-carboxylate)的制备
3-硝基-2-羟基芴酮(3-Nitro-2-hydroxyfluorenone)

常温下，将100ml溶有3.52g，25.5mmol NO₂BF₄的乙腈(acetonitrile)溶液滴加到400ml溶有5g，25.5mmol 2-羟基芴酮(2-hydroxyfluorenone)的乙腈(acetonitrile)溶液中。然后将反应混合物冷却到0℃，再加入100ml水使杂质沉淀。过滤后，加入200ml水，将沉淀过滤得到红色固体，产率68％(M+1,242)。
3-氨基-2-羟基芴酮(3-amino-2-hydroxyfluorenone)

将含有1.6g，6.6mmol 3-硝基-2-羟基芴酮(3-nitro-2-hydroxyfluorenone)与3g，6.6mmol SnCl₂的100ml醋酸(acetic acid)-浓HCl等于1∶1的混合物中回流1小时。将混合物冷却至室温，加氨水(ammonium hydroxide)中和。用100ml乙酸乙酯(EtOAc)萃取3次后，合并的有机相用硫酸镁(magnesium sulfate)干燥，蒸干水分得到棕色固体产物，产率65％(M+1,212)。
      1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-芴酮-5-羧酸乙
      酯                       (Ethyl
1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-fluorenone-5-carboxylate

将50ml含有0.9g，4.26mmol 3-氨基-2-羟基芴酮(3-amino-2-hydroxyfluorenone)和1.36g，4.26mmol 2-(2’，3’，4’，5′-四氟苯甲酰-)-3-(二甲基氨)-丙基-2-烯酸乙酯
(ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(dimethylamino)-prop-2-enoate)的DMSO混合物在真空下加热18小时。将产物用乙酸乙酯/盐水(EtOAc/Brine)液萃取，将有机相合并，干燥得到红色固体产物。将固体溶于40ml含过量K₂CO₃的DMSO溶液中，加热到100℃至30分钟。冷却到室温后，加入30ml盐水，收集沉淀，得到黄色固体，两步产率为60％(M+1,446)。
                            例40
        1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-芴酮-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-fluorenone-5-carboxylic acid)的制备

将溶有1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-芴酮-5-羧酸乙酯(ethyl1，2-difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-fluorenone-5-carboxylate)的醋酸(aceticacid)与浓HCl各50ml，按1∶1混合的混合物回流加热两小时。冷却至室温后，加入50ml水，收集产物，得到黄色固体，产率94％(M+1，418)。
                                例41
    1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-蒽醌-5-羧酸乙酯(Ethyl
1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-anthraquinone-5-carboxylate)的制备

将约10ml DMSO，其中含有5.54g，23.2mmol 3-氨基-2-羟基蒽醌(3-amino-2-hydroxyanthraquinone)和8.7g，34.8mmol 2-(2’，3’，4’，5′-四氟苯甲酰-)-3-(二甲基氨基)-丙基-2-烯酸乙酯
(ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(dimethylamino)-prop-2-enoate)的混合物在真空下加热24小时。加入50ml水使产物沉淀。将固体置于真空干燥箱内干燥过夜，溶于40ml含有过量K₂CO₃的DMSO溶液中，加热至100℃ 30分钟。冷却至室温后，加入30ml盐水，将得到的黄色固体产物沉淀收集，两步产率60％(M+1,474)。
                                  例42
          1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-蒽醌-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-anthraquinone-5-carboxylic acid)的制备

将含有3.5g，6.8mmol 1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-蒽醌-5-羧酸乙酯(ethyl 1，2-difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-anthraquinonenone-5-carboxylate)的醋酸(acetic acid)与浓HCl各50ml按1∶1混合的混合物回流加热两小时。冷却至室温后，加入50ml水，收集产物得黄色固体，产率94％(M+1,446)。
                            例43
    1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-苯基-苯恶唑-5-羧酸乙酯
                            (Ethyl
1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-phenyl-phenoxazole-5-carboxylate)的制备
2-氨基(对叔丁氧羰基)-5-氨基对苯二酚(2-amino(t-butoxy carbonyl)-5-amino
hydroquinone)

在室温下，将20ml含有7.17g，33mmol的叔丁氧羰基酐(Boc anhydride)和17ml，99mmol DIEA的DMSO溶液滴加到搅拌下的7g，33mmol 1，4-二羟基-2，5-二氨基苯(1，4-dihydroxy-2，5-diaminobenzene)溶液中。搅拌18小时后，在乙酸乙酯和盐水中分离产物，将有机相合并，并用MgSO₄干燥。除去溶剂后，将剩余物过硅胶色谱柱，并用25-50％EtOAc正己烷(hexane)溶液洗提，得到纯净产物，产率45％(M+1,239)。
4-羟基-3-氨基(对叔丁氧羰基)-苯恶唑(4-hydroxy-3-amino(t-butoxy
carbonyl)-phenoxazole)

将过量的次硫酸钠(Na hydrosulfite)加入到20ml含有4.69g，23.3mmol2-氨基(对叔丁氧羰基)-5-氨基对苯二酚(2-amino(t-butoxy carbonyl)-5-aminohydroquinone)的乙腈/水(acetonitrile/water)1∶1溶液中，将混合物室温下搅拌15分钟。真空下除去乙腈，水溶液用乙酸乙酯(EtOAc)20ml萃取3次。合并有机相，用MgSO₄干燥，真空下除去溶剂。剩余物用100ml纯原甲酸三乙酯(triethyl orthoformate)吸收，搅拌16小时，然后回流加热10分钟。随后冷却至室温，加入水使产物沉淀，产率83％(M+1,251)。
        4-羟基-2-氨基苯恶唑(4-hydroxy-2-amino phenoxazole)

将3g，12mmol 4-羟基-3-氨基(对叔丁氧羰基)-苯恶唑(4-Hydroxy-3-amino(t-butoxy carbonyl)-phenoxazole)溶于100ml纯TFA溶液中，室温下搅拌1小时。真空下除去三氟乙酸，得到最终产物为三氟乙酸盐(定量)(M-1,149)2-(2’，3’，4’，5′-四氟苯甲酰-)-3-(N-(4-羟基-2-氨基苯恶唑))-丙基-2-烯酸乙酯(Ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(N-(4-hydroxy-2-aminophenoxazole))-prop-2-enoate)

在真空下，将20ml含有10ml三乙胺(triethylamine)并溶有7.34g，23mmol 2-(2’，3’，4’，5′-四氟苯甲酰-)-3-(二甲基氨基)-丙基-2-乙酯(ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(dimethylamino)-prop-2-enoate)和3.45g，23mmol 2-氨基-4-苯基-苯酚(2-amino-4-phenyl-phenol)的乙酸乙酯(EtOAc)溶液用旋转蒸发仪搅拌3小时。真空除去乙酸乙酯(EtOAc)，剩余物过硅胶色谱柱，并用含有50％乙酸乙酯(EtOAc)的正己烷(hexane)溶液洗提，得到纯净产物，产率72％(M+1,425)。
    1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-苯基-苯恶唑-5-羧酸乙酯
(Ethyl 1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-phenyl-phenoxazole-5-carboxylate)

将50ml含有3.5g，8.25mmol 2-(2’，3’，4’，5′-四氟苯甲酰-)-3-(N-(4-羟基-2-氨基苯恶唑))-丙基-2-烯酸乙酯(ethyl-2-(2’，3’，4’，5′-tetrafluorobenzoyl-)-3-(N-(4-hydroxy-2-aminophenoxazole))-prop-2-enoate)及过量K₂CO₃的DMSO溶液加热至80℃ 10分钟。冷却至室温后，加入水形成沉淀，为黄色固体产物，产率82％(M+1,385)。
                                 例44
1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-(3’-羟基-4’-氨基苯基)-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-(3’-hydroxy-4’-amino phenyl)-5-carboxylic
acid)的制备

将溶有2.3g，6mmol 1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-苯基-苯恶唑-5-羧酸酯(ethyl
1，2-difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-phenyl-phenoxazole-5-carboxylate)的醋酸(acetic acid)∶浓HCl按1∶1混合的100ml混合溶液回流加热30分钟。冷却至室温后，真空除去挥发性成分，得到棕色固体产物，产率82％(M+1,347)。
                                例45
      1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-(硝基-吩嗪)-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-(nitro-phenoxazine)-5-carboxylic acid)的制
备
1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-(3’-羟基-4’-氨基-(N-2”-氟-4”-硝基苯
基)-苯基)-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-(3’-hydroxy-4’-amino-(N-2”-fluoro-4”-nitr
o phenyl)-phenyl)-5-carboxylic acid)

将含有0.5g，1.44mmol 1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-(3’-羟基-4’-氨基苯基)-5-羧酸(1，2-difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-(3’-hydroxy-4’-aminophenyl)-5-carboxylic acid)，0.5ml，4.3mmol 3，4-二氟-硝基苯(3，4-difluoro-nitrobenzene)和1ml DIEA的溶液置于50ml NMP中，加热至90℃ 30分钟。冷却到室温后，加入水使产物沉淀，过滤，产率63％(M+1,486)。
       1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-(硝基-吩嗪)-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-(nitro-phenoxazine)-5-carboxylic acid)

将50ml含有0.3g，0.6mmol 2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-(3’-羟基-4’-氨基苯基)-5-羧酸
(2-difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-(3’-hydroxy-4’-amino phenyl)-5-carboxylicacid)及过量K₂CO₃的DMSO溶液搅拌并加热至110℃ 1小时。冷却至室温后，加入3M HCl使产物沉淀，过滤，产率71％(M+1,465)。
                                例46
    1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-(氨基-吩嗪)-5-羧酸
(1，2-Difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，1-kl]-8-(amino-phenoxazine)-5-carboxylic acid)的
制备

将含有0.1g，0.2mmol 1，2-二氟-4-氧-4H-吡啶基[3，2，1-kl]-8-(硝基-吩嗪)-5-羧酸(1，2-difluoro-4-oxo-4H-pyrido[3，2，l-kl]-8-(nitro-phenoxazine)-5-carboxylicacid)和0.15g，0.6mmol氯化亚锡(Tin(II)chloride)的醋酸(acetic acid)∶浓HCl按1∶1混合的溶液50ml回流加热四小时。冷却至室温后，加入水使产物沉淀，过滤，产率72％(M+1,435)。
                               例47
取代醌苯并恶嗪(quinobenzoxazine)的氨基(amide)衍生物类似物的制备

室温下将0.5-2.0mmol胺(amines)NHR₁R₂加入到3.6mL含有0.5mmol氟酸(fluoroacid)的NMP系列溶液中。容器密封，置于90℃加热器上并持续搅拌1至两小时，直到反应能够用HPLC/MS方法分析检测。将反应混合物冷却至室温，加入20mL水。真空抽滤收集并真空干燥得到的沉淀。在使用1.0当量胺(amine)的情况下，得到的反应混合物会在下一步中使用，“不予改变”。得到的固体或溶液用2.5当量HBTU和3.6mL溶有DIEA的NMP处理，并在惰性环境中室温搅拌30分钟。将溶液加入到2.5当量胺(amines)NHR₃R₄中，在96孔平板(Whatman Uniplate，2mL)中反应两小时。然后加入50-100μL甲醇(Methanol)，将板过滤(Whatman Unifilter聚丙烯(Polypropylene))。得到的液体直接进入反相HPLC中进行色谱分析(Waters Xterra 19×50mm)，并大量直接收集(Micromass ZQ，Waters FCII)。小部分用于纯度分析(MS TIC，UV)并且用真空蒸发仪(Savant)干燥平均产量5-10mg。表1和2分别列出了典型的酯取代(ester-substituted)和胺取代(amide-substituted)的醌苯并恶嗪(quinobenzoxazines)类似物。
                               例48
                              抗癌数据
制成用于接种的两类异种移植模型，并稀释至浓度为50×10⁶个细胞/mL或100×10⁶个细胞/mL。取四至六周龄的裸鼠，注射0.1mL含5×10⁶和10×10⁶个细胞的细胞悬液。当肿瘤长至适当大小时，开始定量给予化合物。在全部治疗过程中，用测径器测量肿瘤的大小并检测体重。
化合物CX-3092(1204)和CX-1535(148)的抗癌活性见图1及图2，说明了其抗癌效果(延缓肿瘤增长)和较小的毒副作用(体重几无变化)。图1表明化合物494在Ramos细胞中的抗癌活性(所用模型是先天性儿童白血病)。图2表明化合物516在HCT-116细胞中的抗癌活性(所用模型是结肠直肠癌)。
                             例49
                  细胞增殖和/或细胞毒性分析
细胞培养
人宫颈上皮细胞(海拉细胞，HeLa cells)来自美国典型培养物收集中心(Manassas，VA)。在含5％ CO₂的37℃湿润环境下，细胞在添加了2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、1.5g/L NaHCO₃、50mg/L庆大霉素和10％小牛血清(Hyclone，美国)的MEM培养基上生长。
MTS测定
抗癌药物的抗增殖作用可由CellTiter 96 AQ_ueous assay(Promega，WI)测试仪检测，这种仪器通过比色法来检测存活细胞的数目。(参阅Wang，L.，et al.，Methods Cell Sci(1996)18：249-255)。
第0天，将细胞(4,500 cells/well)接种于96孔平板(Corning，NY)中(每孔100μl不含抗癌药物的培养基)。第1天，更换含不同浓度抗癌药物的培养基。在正常生长条件下孵育3天后(第4天)，用PBS缓冲液洗涤单细胞层一次。随后用每孔含100μl PBS缓冲液的96孔平板替换原培养基。在96孔板的每个孔中加入20μl MTS/PMS(20∶1)溶液，在含5％ CO₂的37℃湿润环境中孵育4小时。在490nm下的吸光率由FLUOstar Galaxy 96孔平板读数仪(BMG Labtechnologies，Germany)测出。μM浓度(MTS数据)在表1-2中给出。这个浓度是50％细胞抑制生长率时的抗癌药物浓度。IC₅₀大于5μM的化合物不予报告。
                              例50
                    细胞测定中的mRNA值检测
实时定量PCR(QPCR)方法常用于精确地探测同一个试管中靶基因c-myc和内源性对照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因拷贝数的变化。细胞(15,000cells/well)接种于96孔平板(Corning，NY)，在正常的生长条件下孵育过夜。次日，更换含有不同浓度抗癌药物的培养基，在含5％ CO₂的37℃湿润环境中孵育4小时。用RNeasy 96试剂盒(QIAGEN，CA)提取总RNA(tRNA)。总RNA浓度可由RiboGreen RNA定量试剂测得(Molecular Probes，OR)。
用50ng tRNA在25μl反应体系中进行反转录(RT)反应。其中每管含有1×TaqMan RT缓冲液，2.5uM随机六聚物，5.5mM MgCl₂，每种脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.5mM，30U MultiScribe反转录酶和10U RNA酶抑制剂。反转录反应体系在25℃下孵育10分钟，随后在48℃下进行反转录30分钟，在95℃下失活5分钟，而后置于4℃下保存。全部反转录试剂均购于Applied Biosystems，CA。
实时QPCR反应在含有5μl cDNA，1×通用型PCRMaster Mix试剂，1×c-myc预培养引物与探针装置，以及0.8×GAPDH预培养引物与探针装置的50μl反应体系里进行。由于Hela细胞中GAPDH基因含量相对丰富，因此将GAPDH引物和探针浓度调到一个合适值以得到同一个反应管内两个基因的准确阈循环(C_T)值。阈循环(C_T)值表明扩增目标数量的部分循环数达到一个固定的阈值。据此，GAPDH的扩增在它能限制c-myc扩增适用的普通反应物前被终止，导致GAPDH的ΔRn值减小，但不影响其C_T值，并且两个基因的扩增效果相同。ΔRn值代表标准仪器所检测的信号减去基线信号。ΔRn值在PCR中随扩增子拷贝数的增加而增加，直到反应达到平台期。
c-myc探针用6FAM^TM染色的-MGB标记，GAPDH探针用VIC^TM染色的-MGB标记。预培养在50℃下进行两分钟以激活AmpErase UNG酶，随后在95℃下保持10分钟以激活AmpliTaq DNA聚合酶。DNA扩增40个周期，在95℃下需要15秒，在60℃下需要1分钟。人类c-myc和GAPDH cDNA被扩增，检测并通过ABI Prism 7000序列探测系统(Applied Biosystems，CA)实时定量检测，此系统能同时检测6-FAM和VIC报告染体。
数据用ABI PRISM序列探测系统和Microsoft Excel来分析。通过标准曲线和比较C_T值的方法同时进行相关定量检测，两种方法得到的结果相等。C_T值中扩增图的循环数可以准确反应相对mRNA值。(参阅Heid，et al.，GenomeRes.(1996)6：986-994；Gibson，et al.，Genome Res.(1996)6：995-1001)。对每份cDNA样品进行三次QPCR反应，取三个C_T值的平均值。所有的试剂包括预培养引物和探针装置，从Applied Biosystems，CA购买。表1-2中列出的μM浓度(STOP数据)是50％抑制c-myc mRNA水平的浓度。IC₅₀大于5μM的化合物不予报告。
众所周知，前述的详细描述和附随的例子仅仅是说明，并不能作为本发明范畴的限制。对公开的实施例进行各种改变和修饰对专业人士显而易见。这些变化和修饰包括但不限于化学结构，取代，衍生，中间产物，合成，制剂和/或使用方法等，它们可以任意改变而不违背本发明的基本条件和范畴。在此收编参考的美国专利和出版物以供参考。