3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B，它的工程菌株及应用 【技术领域】
本发明涉及一种大环内酯类化合物，生产化合物的工程菌株及该化合物的应用。
背景技术
红霉素及其衍生物是临床上广泛应用的一类抗生素。第一代红霉素易为酸降解及产生耐药性，已很少使用。通过化学修饰改造的第二代红霉素，如罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、地红霉素等可以克服第一代红霉素易被酸降解的不足，在临床上正被广泛应用，但却仍无法克服耐药性这一缺点。现在正在推向市场的第三代红霉素telithromycin是酮内酯类抗生素的典型代表，也是使用化学修饰对红霉素结构进行改造的。酮内酯类抗生素结构上的最大特点是在红霉素大环内酯的C-3位用羰基取代糖基。研究表明，酮内酯类抗生素不仅结构稳定，而且对许多耐药菌具有活性。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种可以作为酮内酯类抗生素——第三代红霉素前体物质的化合物3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B，它是结构式(I)的化合物。
该化合物可以由生物合成，也可以用化学方法合成。
本发明的第二个目的是提供—种能够产生上述结构式(I)化合物的糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)M1 CGMCC N0604。该菌株已于2001年8月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC № 0604。
化合物3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B经过生物及化学修饰后，即可成为酮内酯类抗生素，也就是第三代红霉素，因此该化合物在制备酮内酯类抗生素中将起到重要作用。
红霉素的生物合成途径已较清晰(张部昌，赵志虎，马清钧.红霉素生物合成的分子生物学.生物技术通讯，2001，12(2)151-160)，根据红霉素生物合成途径可以推断出，本发明的3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B生物合成途径如下：
此前已有报道(Xue Q，Ashley G，Hutchinson CR，et al.A multiplasmidapproach to preparing large libraries of polyketides.Proc Natl Acad Sci US A.1999，96(21)：11740-5；McDaniel R，Thamchaipenet A，Gustafsson C，et al.Multiple genetic modifications of the erythromycin polyketide synthase toproduce a library of novel“unnatural”natural products.Proc Natl Acad SciUSA.1999，96：1846-51)利用基因工程方法合成3-脱氧-3-羰基-6-脱氧-红霉内酯B，但均是利用链霉菌异源表达系统，宿主菌没有对内酯环进行进一步的修饰。本发明在红霉素生产菌中对红霉素基因进行改造，不仅合成了3-脱氧-3-羰基-6-脱氧-红霉内酯B，而且菌体内的羟化酶对其C-6位进一步氧化修饰，合成了自然界中从未发现的新地大环内酯类化合物3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B。
在用质谱检测糖多孢红霉菌M1发酵液时没有检测到3-脱氧-3-羰基-6-脱氧-红霉内酯B，而是3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B，说明糖多孢红霉菌中C-6位羟化酶对底物要求并不严格，可将3-脱氧-3-羰基-6-脱氧-红霉内酯B几乎全部氧化成3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B。
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
【附图说明】
图1为整合体的PCR鉴定。
图2为糖多孢红霉菌Z1发酵液对枯草杆菌的抑制试验。
图3为重组体的PCR鉴定。
图4为S erythraea M1提取液质谱图
【具体实施方式】
本发明实施例中所用的培养基、缓冲液和试剂如下：
LB培养基按Sambrook方法(Sambrook J，Frisch EF and Maniatis T.分子克隆实验指南(第二版) (金冬雁，黎孟枫等译).北京：科学出版社，1992)，TSB培养基按Hopwood方法(Hopwood DA，Bibb MJ，Chater KF et al.Genetic manipulation ofstretomyces：a laboratory manual.The John Innes Foundation，England，1985)，SGGP培养基、PEG3350-T缓冲液和改进P缓冲液按Yamamoto方法(Yamamoto H，MaurerKH and Hutchinson CR.Transformation of streptomyces erythraeus.J Antibiotics，1986，39(9)，1304-13)，R3M培养基按Summers方法(Summers RG，Donadio S，Staver MJ，et al.Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic geneclusterof Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamineproduction.Microbiology，1997，143(10)：3251-62)。
糖多孢红霉菌A226(Serythraea A226)菌株由中国医学科学院医药生物技术研究所菌种室提供，硫链丝菌肽(thiostrepton，Tsr)、PEG3350为Sigma公司产品，溶菌酶为Fluka公司产品，蛋白酶K为AMRESCO公司产品，PEG1000为MERCK-Schuchardt公司产品，TSB为DIFCO公司产品，限制性内切酶，T4 DNA连接酶为Biolab公司产品，pfu DNA聚合酶为上海生工公司产品，Taq DNA聚合酶为MBI公司产品，长片段DNA聚合酶(Expand Long Template PCR System)为Roche公司产品，DNA MarkerDL2,000为大连宝生物公司产品，质粒纯化试剂盒和PCR纯化试剂盒为Promega公司产品。
本发明实施例中所用的实验方法为：
大肠杆菌的培养、质粒酶切、连接、转化等按Sambrook方法(Sambrook J，FrischEF and Maniatis T.分子克隆实验指南(第二版)(金冬雁，黎孟枫等译).北京：科学出版社，1992)，质粒提取、PCR产物纯化按Promega产品说明书进行。
糖多孢红霉菌A226的培养和总DNA的提取按Hopwood方法(Hopwood DA，BibbMJ，Chater KFet al.Genetic manipulation of stretomyces：alaboratory manual.The JohnInnes Foundation，England，1985)进行。
糖多孢红霉菌A226原生质体制备和转化按Yamamoto方法(Yamamoto H，MaurerKH and Hutchinson CR.Transformation of streptomyces erythraeus.J Antibiotics，1986，39(9)，1304-13)和Summers方法(Summers RG，Donadio S，Staver MJ，et al.Sequencingand mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production.Microbiology，1997，143(10)：3251-62)进行。
发酵液的生物活性测定：过夜培养的枯草杆菌(B subtilis)PUB110涂布LB平皿，放上灭菌滤纸片，在滤纸上加10μl培养72 hrs的发酵液，放37℃恒温箱培养7hrs以上。
发酵液中红霉素及其衍生物的提取：50mlTSB发酵液的离心上清液用氨水调pH至9.0-9.5，乙酸乙酯萃取，水浴浓缩。
发酵液中3-脱氧-3-羰基-红霉内酯的质谱鉴定：按上述方法提取的糖多孢红霉菌M1发酵液用ZabsPec质谱仪检测。实施例1、pWHM2201质粒的构建
1、PCR引物的设计：为敲除红霉素合成基因中KR6酶域，根据文献CortesJ，Haydock SF，Roberts GA，et al.An unusually large multifunctional polypeptide in theerythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea.Nature，1990，348(6297)：176-8序列，在其两侧各扩增一个片段，片段间有20bp重叠。其引物为：片段1：正向：5’-TACGAATTCAGATCTCATGCGGCTCCTGGAGTCCGCAGTGGACG；反向：5’-CTCGAGGTCGCCGGTGGCCGGGCCCGCCGGCTCCCAGCTCGACTCG；片段2：正向：5’-CGAGTCGAGCTGGGAGCCGGCGGGCCCGGCCACCGGCGACCTCGAG；反向：5’-TTCAAGCTTCTGCAGTCATGAGTTCCCTCCGCCCAGCCAG。
再以片段1和片段2为模板，片段1正向引物和片段2反向引物为引物，合成无KR6的基因片段，整个DNA片段长约3.2kb。
2、PCR扩增条件
1)片段1和片段2的扩增A加样：总DNA模板5μl，DMSO 5μl，4×2.5mMdNTP 5μl，10×pfu DNA聚合酶缓冲液5μl，水10μl，2.5μM引物2×10μl，pfu DNA聚合酶1μl；B扩增条件：95℃ 5min，(94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 2min)×30，72℃ 7min；
2)重迭PCR扩增A加样：片段1和2模板各2.5μl，4×2.5mM dNTP 5μl，长片段DNA合成酶缓冲液5μl，水10μl，2.5μM引物(片段1正向和片段2反向)2×10μl，长片段DNA合成酶0.75μl；B扩增条件：95℃ 5min，(94℃ 1min，65℃ 1min，68℃5min)×30，68℃ 7min；
3、pUC2201克隆：重叠PCR扩增出所需DNA片段后，按博大公司产品说明书与pUC-T载体相连，转化大肠杆菌DH5α。在重迭PCR产物克隆到pUC-T载体后，对pUC2201外源基因的序列进行了部分序列分析鉴定，结果表明一个测序反应完成的500多个碱基与报道序列完全一致，表明以该序列构建的pWHM2201质粒可用作同源重组载体。
4、pWHM2201的构建：将pUC2201中外源DNA片段用EcoRI和HindIII酶切后连于pWHM3 EcoRI和HindIII酶切位点，并转化大肠杆菌DH5α。将从大肠杆菌DH5α抽提出来的pWHM2201质粒，转化大肠杆菌ET12567菌株，以制备无甲基化修饰质粒，用于糖多孢红霉菌的原生质体转化。
实施例2、染色体整合和染色体二次重组的PCR鉴定
1)根据tsr基因序列(Hopwood DA，Bibb MJ，Chater KF et al.Genetic manipulationofstretomyces：alaboratory manual.The John Innes Foundation，England，1985)设计鉴定引物为：正向：5’-CCTGAATTCATGACTGAGTTGGACACCATCGCA反向：5-TCTAAGCTTGGAAACGTTGAGAACTCGGTCTG。扩增出来的DNA片段长度774bp.
2)根据红霉素合成基因序列，在KR6酶域两侧选择PCR引物为：
正向：5‘-AACGTCTTCCCGGCGGCACC；
反向：5‘-GTCGAGGTAGGACCGGACCC。
KR6未去除的扩增片段长度为1，770bp，KR6去除的DNA扩增片段长度为1,239bp。
3)pWHM2201质粒和染色体同源重组：将糖多孢红霉菌A226制成原生质体后，用pWHM2201质粒转化，含30μg/ml Tsr的R3M培养基进行筛选。从转化子中挑130个菌落涂含Tsr的R3M斜面，有18个菌落可在Tsr斜面上正常生长。接种其中4个斜面进行液体培养提取总DNA，以Tsr引物进行PCR扩增，结果如图1所示，凝胶电泳均有明显的条带，表明pWHM2201质粒已整合到染色体上。
为了证明PCR产物的模板为基因组总DNA，而不是菌体中的游离质粒，提取质粒，凝胶电泳时未见质粒条带，以提取液为模板进行PCR扩增，也未见PCR条带。说明质粒已整合到染色体上，而不是在菌体中游离存在。
为了进一步确认pWHM2201质粒已整合到染色体上的红霉素合成基因位点，选取在含Tsr的R3M斜面上生长正常的一株菌株(Serythraea Z1)，接种含30μg/ml Tsr的5ml TSB摇管，同时接种糖多孢红霉菌A226于无Tsr的TSB摇管，30℃培养72hrs。在涂有枯草杆菌PUB110的LB平皿上加10μl发酵液。若pWHM2201质粒整合到了染色体上将破坏红霉素合成基因，使其不能够合成红霉素。如图2所示，对枯草杆菌PUB110抑制试验结果为：Z1转化体已不再抑制枯草杆菌的生长，说明pWHM2201质粒确已整合到红霉素生物合成基因位点。
实施例3、糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)M的筛选
将整合体糖多孢红霉菌Z1在无抗性R3M斜面上连续传两代后，制原生质体涂无抗性R3M平皿，从中挑取40个菌落各连续涂含Tsr的R3M斜面和无Tsr的R3M斜面。有8个菌落(S erythraea M1-M8)仅在无抗性的R3M斜面上生长。接种4个菌落(M1-M4)进行液体培养提取总DNA，以去除KR6鉴定引物进行PCR扩增。PCR产物约1.2kb(如图3所示)，表明染色体上KR6酶域已被敲除。得到糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)M1 CGMCC №0604。
实施例4、糖多孢红霉菌M发酵产物的鉴定
将糖多孢红霉菌M1的50ml发酵液用乙酸乙酯萃取，水浴浓缩后用ZabsPec质谱仪检测。如图4所示，3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B(3-deoxy-3-oxo-erythronolide B，DOEB)的各质子峰清晰可见：383.0m/z为[DOEB-H2O]H+，401.0m/z为[DOEB]H+，423.0m/z为[DOEB]Na+，439.0m/z为[DOEB]K+。因此断定，糖多孢红霉菌M1的发酵产物含3-去氧-3-羰基-红霉内酯B。