二肽基肽酶－IV抑制剂的磷酸盐.pdf

4－氧代－4－[3－(三氟甲基)－5，6－二氢[1，2，4]三唑并[4，3－a]吡嗪－7(8H)基]－1－(2，4，5－三氟苯基)丁烷－2－胺的二氢磷酸盐是一种有效的二肽基肽酶－IV抑制剂，并且具有预防和/或治疗非胰岛素依赖型糖尿病(也称为II型糖尿病)的用途。本发明还涉及该二氢磷酸盐的结晶单水合物，以及它的制备方法、包含此新形式的药物组合物和用于治疗糖尿病、肥胖症和高血压的方法。

1.  结构式I的4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺的二氢磷酸盐：

或者其药学上可接受的水合物。

2.  结构式II的权利要求1的盐，其在*标记的手性中心具有(R)-构型


3.  结构式III的权利要求1的盐，其在*标记的手性中心具有(S)-构型


4.  如权利要求2所述的盐，其特征在于该盐为结晶单水合物。

5.  如权利要求4所述的单水合物，其特征在于从X射线粉末衍射图中获得的，光谱d间距7.42、5.48和3.96埃处的特征吸收谱带。

6.  如权利要求5所述的单水合物，其更进一步的特征在于从X射线粉末衍射图中获得的，光谱d间距6.30、4.75和4.48埃处的特征吸收谱带。

7.  如权利要求6所述的单水合物，其更进一步的特征在于从X射线粉末衍射图中获得的，光谱d间距5.85、5.21和3.52埃处的特征吸收谱带。

8.  如权利要求7所述的单水合物，其更进一步的特征在于具有图1的X射线粉末衍射图。

9.  如权利要求4所述的单水合物，其特征在于固态碳-13CPMAS核磁共振波谱在169.1、120.8和46.5ppm处显示有信号。

10.  如权利要求9所述的单水合物，其进一步特征在于固态碳-13CPMAS核磁共振波谱在159.0、150.9和40.7ppm处显示有信号。

11.  如权利要求10所述的单水合物，其更进一步的特征在于具有图2的固态碳-13CPMAS核磁共振波谱。

12.  所述权利要求4所述的单水合物，其特征在于固态氟-19MAS核磁共振波谱在-64.5、-114.7、-136.3和-146.2ppm处显示有信号。

13.  如权利要求12所述的单水合物，其更进一步的特征在于固态氟-19MAS核磁共振波谱在-96.5、-104.4、-106.3和-154.5ppm处显示有信号。

14.  如权利要求13所述的单水合物，其更进一步的特征在于具有图3的固态氟-19MAS核磁共振波谱。

15.  如权利要求4所述的单水合物，其特征在于具有图4的热重分析曲线。

16.  如权利要求4所述的单水合物，其特征在于具有图5的差示扫描量热曲线。

17.  如权利要求4所述的盐，其包括可检测量的所述结晶单水合物。

18.  如权利要求4所述的盐，其包括约5％～约100％按重量计的所述结晶单水合物。

19.  权利要求4的盐，其包括约10％～约100％按重量计的所述结晶单水合物。

20.  权利要求4的盐，其包括约25％～约100％按重量计的所述结晶单水合物。

21.  权利要求4的盐，其包括约50％～约100％按重量计的所述结晶单水合物。

22.  权利要求4的盐，其包括约75％～约100％按重量计的所述结晶单水合物。

23.  权利要求4的盐，其包括按重量计基本全部所述结晶单水合物。

24.  一种盐，其包括单质子化的4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺阳离子和二氢磷酸根阴离子。

25.  一种药物组合物，其包括预防或者治疗有效量的根据权利要求1的盐或者其药学上可接受的溶剂化物，并且与一种或多种药学上可接受的载体组合。

26.  一种药物组合物，其包括预防或者治疗有效量的根据权利要求4的盐或者其药学上可接受的溶剂化物，并且与一种或多种药学上可接受的载体组合。

27.  一种治疗II型糖尿病的方法，包括给药需要该治疗的患者治疗有效量的根据权利要求1的盐或者其药学上可接受的水合物。

28.  一种治疗II型糖尿病的方法，包括给药需要该治疗的患者治疗有效量的根据权利要求4的盐。

29.  一种制备权利要求1的盐的方法，包括在约25～约100℃的温度下，将在有机溶剂或者有机溶剂水溶液中的一当量4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺与大约一当量的磷酸接触的步骤。

30.  权利要求29的方法，其中所述有机溶剂为C₁～C₅直链或者支链链烷醇。

31.  权利要求1的盐在制造用于治疗II型糖尿病的药物中作为活性成分的用途。

32.  权利要求4的盐在制造用于治疗II型糖尿病的药物中作为活性成分的用途。

33.  适合于静脉内施用的权利要求25的药物组合物。

34.  根据权利要求29的方法制备的4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺的磷酸盐。

35.  一种制备权利要求4的结晶单水合物的方法，包括以下步骤：
(a)在25℃下，从异丙醇和水的混合物中结晶所述的权利要求1的二氢磷酸盐，使水的浓度超过6.8重量％；
(b)回收所得到的固相；和
(c)除去其中的溶剂。

二肽基肽酶-IV抑制剂的磷酸盐
技术领域
本发明涉及二肽基肽酶-IV抑制剂的具体盐。更具体而言，本发明涉及4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺的二氢磷酸盐，它是一种有效的二肽基肽酶-IV抑制剂。此新盐和它的结晶水合物可用于治疗和预防需要二肽基肽酶-IV抑制剂的疾病和状况，尤其是II型糖尿病、肥胖症和高血压。本发明更进一步涉及包括该二氢磷酸盐以及它的结晶水合物的药物组合物，该药物组合物可用于治疗II型糖尿病、肥胖症和高血压；以及制备该二氢磷酸盐、它的结晶水合物及其药物组合物的方法。
背景技术
抑制灭活葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)和胰高血糖素样肽1(GLP-1)的二肽基肽酶-IV(DP-IV)，代表了一种治疗和预防II型糖尿病(又名非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM))的新方法。DP-IV抑制剂对于治疗II型糖尿病的治疗潜力已进行了综述：C.F.Deacon和J.J.Holst，“Dipeptidyl peptidase IV inhibition as an approachto the treatment and prevention of Type 2 diabetes：a historicalperspective”，Biochem.Biophys.Res.Commun.，294：1-4(2000)；K.Augustyns等，“Dipeptidyl peptidase IV inhibitors as new therapeuticagents.for the treatment of Type 2 diabetes”，Expert.Opin Ther.Patents，13：499-510(2003)；和D.J.Drucker，“Therapeutic potentialof dipeptiyl peptidase IV inhibitors for the treatment of Type 2diabetes”，Expert.Opin.investig.Drugs，12：87-100(2003)。
转让给默克公司(Merck&Co.)的WO 03/004498(公开于2003年1月16日)描述了一类β-氨基四氢三唑并[4，3-a]吡嗪，它们是有效的DP-IV抑制剂，因此可用于治疗II型糖尿病。在WO 03/004498中具体公开的是4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺。此化合物药学上可接受的盐在一般意义上被包含在WO 03/004498的范围内。
然而，上述文献中没有具体公开4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺的新发现的一碱价二氢磷酸盐，其结构式I如下所示。
发明内容
本发明涉及二肽基肽酶-IV(DP-IV)抑制剂4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺的新的二氢磷酸盐，以及它的结晶水合物，尤其是结晶单水合物。在4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺的药物组合物的制备中，本发明的二氢磷酸盐和结晶水合物具有优越性，例如易于加工、处理和剂量给药。尤其是，它们显示出改善的物理和化学稳定性，例如对应力、高温和湿度的稳定性，以及改善的物理化学性质，例如溶解度和溶解速率，使得它们格外适用于多种药物剂型的生产。本发明还涉及包含此新盐和水合物的药物组合物以及将它们用作DP-IV抑制剂、尤其是用于预防或者治疗II型糖尿病、肥胖症和高血压的方法。
附图说明
图1是结构式II的二氢磷酸盐结晶单水合物的特征X射线衍射图。
图2是结构式II的二氢磷酸盐结晶单水合物的碳-13交叉极化魔角旋转(cross-polarization magic-angle spinning)(CPMAS)核磁共振(NMR)谱。
图3是结构式II的二氢磷酸盐结晶单水合物的氟-19魔角旋转(MAS)核磁共振(NMR)谱。
图4是结构式II的二氢磷酸盐结晶单水合物的典型热重分析(TGA)曲线。
图5是结构式II的二氢磷酸盐结晶单水合物的典型差示扫描量热法(DSC)曲线。
发明的详细描述
本发明提供了4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺的一种新单碱价二氢磷酸盐，如以下结构式I所示：

或其结晶水合物。本发明尤其提供了式I二氢磷酸盐的结晶单水合物。
本发明的二氢磷酸盐在*所示的产生立体构型的(stereogenic)碳原子上具有一个不对称中心，因此该二氢磷酸盐可以以外消旋物、外消旋混合物和单一对映异构体的形式存在，本发明包括所有异构形式。基本不含另一对映异构体的单一对映异构体，以及两个对映异构体的混合物，都包括在本发明范围内。
本发明的一个实施方案提供了(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺的二氢磷酸盐，其结构式II如下所示：

或其结晶水合物。
本发明的第二个实施方案提供了(2S)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺的二氢磷酸盐，其结构式III如下所示：

或其结晶水合物。
更具体而言，本发明的二氢磷酸盐包括一摩尔当量单质子化的4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺阳离子，和一摩尔当量的二氢磷酸根(磷酸氢根(biphosphate))阴离子。
在本发明的另一个实施方案中，结构式I-III的二氢磷酸盐是结晶水合物。在该实施方案的一个类型中，结晶水合物是结晶单水合物。
本发明的另一个实施方案提供了结构式I-III的二氢磷酸盐药物，其中包括以可检测量存在的结晶单水合物。“药物”是指活性药物成分(“API”)。药物中结晶单水合物的量可以通过利用物理方法进行量化，例如X射线粉末衍射、固态氟-19魔角旋转(MAS)核磁共振光谱法、固态碳-13交叉极化魔角旋转(CPMAS)核磁共振光谱法、固态傅里叶变换红外光谱分析和拉曼光谱测定法。在该实施方案的一个类型中，在药物中存在约5％～约100％按重量计的结晶单水合物。在第二类型的该实施方案的中，在药物中存在约10％～约100％按重量计的结晶单水合物。在第三类型的该实施方案中，在药物中存在约25％～约100％按重量计地结晶单水合物。在第四类型的该实施方案中，在药物中存在约50％～约100％按重量计的结晶单水合物。在第五类型的该实施方案中，在药物中存在约75％～约100％按重量计的结晶单水合物。在第六类型的该实施方案中，基本上所有的二氢磷酸盐药物都是本发明的结晶单水合物，即二氢磷酸盐药物基本上是相纯(phase pure)单水合物。
在包含药理学活性成分的药物产品的制备中，本发明的二氢磷酸盐结晶显示出了优于游离碱和先前公开的盐酸盐(WO 03/004498)的制药学优势。尤其是，二氢磷酸盐结晶单水合物增强的化学和物理稳定性，构成了在制备包含药理学活性成分的固体药物剂型方面的有利性质。
显示出有效DP-IV抑制性质的本发明的二氢磷酸盐，尤其可用于预防或者治疗II型糖尿病、肥胖症和高血压。
本发明的另一方面提供了预防或者治疗需要DP-IV抑制剂的临床状况的方法，该方法包括给药需要上述预防或者治疗的患者预防或者治疗有效量的结构式I的二氢磷酸盐或其水合物，尤其是它的结晶单水合物。上述临床状况包括糖尿病(尤其是II型糖尿病)、高血糖症、胰岛素抗性和肥胖症。
本发明还提供了结构式I的二氢磷酸盐或其水合物(尤其是结晶单水合物)用于生产预防或者治疗需要DP-IV抑制剂的临床状态的药剂的用途。
本发明还提供了药物组合物，其中包括结构式I的二氢磷酸盐或其水合物，尤其是结晶单水合物，与一种或多种药学上可接受的载体或者赋形剂联合。在一个实施方案中，药物组合物包含与药学上可接受的赋形剂混合的治疗有效量的活性药物成分，其中活性药物成分包括可检测量的本发明结晶单水合物。在第二个实施方案中，药物组合物包含与药学上可接受的赋形剂混合的治疗有效量的活性药物成分，其中活性药物成分包括约5％～约100％按重量计的本发明结晶单水合物。在此第二实施方案的一个类型中，此类组合物中的活性药物成分包括约10％～约100％按重量计的结晶单水合物。在第二类型的此实施方案中，此类组合物中的活性药物成分包括约25％～约100％按重量计的结晶单水合物。在第三类型的此实施方案中，此类组合物中的活性药物成分包括约50％～约100％按重量计的结晶单水合物。在第四类型的此实施方案中，此类组合物中的活性药物成分包括约75％～约100％按重量计的结晶单水合物。在第五类型的此实施方案中，基本上所有的活性药物成分都是本发明的二氢磷酸盐结晶单水合物，即活性药物成分基本上是相纯二氢磷酸盐单水合物形式。
根据本发明的组合物可以适宜地为单位剂量形式，例如片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒、无菌溶液或者悬浮液、计量气雾剂或者流体喷雾剂、滴剂、安瓿、自注射器或者栓剂。组合物供口服、肠胃外、鼻内、舌下或者直肠给药使用，或者经吸入或者吹入法给药使用。根据本发明的组合物的制剂可以适宜地通过现有技术方法获得，例如，如雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)1995年第17版所述。
根据多种因素选择剂量方案，这些因素包括患者的类型、物种、年龄、体重、性别和医疗状况；待治疗的状况的严重程度；给药途径；和患者的肾功能和肝功能。普通熟练的医师、兽医或者临床医生可以容易地确定和开出预防、对抗或者阻止状况的发展所需要的药物的有效量。
当用来产生所述的作用时，本发明的口服剂量为每千克体重每天(mg/kg/day)约0.01mg～约100mg/kg/day，优选0.01～10mg/kg/day，和最优选0.1～5.0mg/kg/day。对于口服施用而言，组合物优选以片剂形式提供，其中包含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、200和500毫克的活性成分，根据待治疗的患者的症状调整剂量。药剂一般包含约0.01mg～约500mg活性成分，优选约1mg～约200mg活性成分。对于静脉注射给药，在恒速输注期间，最优选的剂量为约0.1～约10毫克/千克/分钟。有利的是，本发明的结晶形态可以以单一日剂量施用，或者可以将每日总剂量以每日两次、三次或者四次的分剂量形式施用。此外，本发明的结晶形态可以通过局部利用合适的鼻内载体以鼻内形式施用，或者通过利用那些本领域普通技术人员熟知的透皮皮肤贴片形式，经透皮途径施用。以透皮递送系统形式施用，施用剂量当然将持续整个给药方案而非间歇给药。
在本发明的方法中，本文详述的二氢磷酸盐和结晶水合物可以构成活性药物成分，而且一般与根据想要的施用形式适当选择的适宜的药物稀释剂、赋形剂或者载体(在此共同称为“载体”材料)混合，并按照常规的药物实践施用，所述施用形式即口服片剂、胶囊、酏剂、糖浆等等。
例如，对于以片剂或者胶囊形式口服施用而言，活性药物成分可以与可口服的、无毒的、药学上可接受的惰性载体组合，所述载体有例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨糖醇等等；对于以液态形式口服施用而言，活性药物成分可以与任何可口服的、无毒的、药学上可接受的惰性载体组合，所述惰性载体有例如乙醇、甘油、水等等。此外，当期望或者需要时，混合物中也可以加入合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖或者β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成树胶(例如金合欢胶、黄蓍胶或者海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等等。用于这些剂型的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原胶等等。
已经发现结构式I的二氢磷酸盐和结晶单水合物在水中具有高溶解度，这使得它特别适于制剂制备，尤其是需要相对浓的活性成分水溶液的鼻内和静脉内用制剂。已经发现，式I的二氢磷酸盐结晶单水合物在水中的溶解度约为72mg/mL。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种制备式I的二氢磷酸盐的方法，该方法包括使具下述结构式IV的4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺：

与大约一当量的磷酸在适当的C₁～C₅链烷醇或者C₁～C₅链烷醇水溶液中反应，所述链烷醇为例如甲醇、乙醇、异丙醇(IPA)和异戊醇(IAA)。反应在约25℃～约80℃的温度下进行。可以将磷酸溶液加入到胺的溶液中，或者可以反向加入。通过用二氢磷酸盐C₁～C₅链烷醇水溶液按照如下所述方式进行结晶，得到二氢磷酸盐结晶单水合物。
结晶结构式I的二氢磷酸盐单水合物的一般方法：
(a)25℃下在乙醇/水系统中：
(1)结晶化合物I与乙醇和水的混合物，使水浓度超过31重量％，
(2)回收所得到的固相，和
(3)除去其中的溶剂。
(b)25℃下在异戊醇(IAA)/水系统中：
(1)结晶化合物I与异戊醇和水的混合物，使水的浓度超过2.9重量％；
(2)回收所得的固相；和
(3)除去其中的溶剂。
(c)40℃下在异戊醇/水系统中：
(1)结晶化合物I与异戊醇和水的混合物，使水的浓度超过3.6重量％；
(2)回收所得的固相；和
(3)除去其中的溶剂。
(d)60℃下在异戊醇/水系统中：
(1)结晶化合物I与异戊醇和水的混合物，使水的浓度超过4.5重量％；
(2)回收所得的固相；和
(3)除去其中的溶剂。
(e)25℃下在异丙醇(IPA)/水系统中：
(1)结晶化合物I与异丙醇和水的混合物，使水的浓度超过7.0重量％；
(2)回收所得的固相；和
(3)除去其中的溶剂。
(f)40℃下在IPA/水系统中：
(1)结晶化合物I与IPA和水的混合物，使水的浓度超过8.1重量％；
(2)回收所得的固相；和
(3)除去其中的溶剂。
(g)75℃下在IPA/水系统中：
(1)结晶化合物I与IPA和水的混合物，使水的浓度超过约20重量％；
(2)回收所得的固相；和
(3)除去其中的溶剂。
结构式IV的起始化合物可以通过下面方案1～3和实施例1详述的步骤制备。
在本发明的又一个方面中，本发明提供了一种治疗和/或预防需要DP-IV抑制剂的临床状况的方法，该方法包括给需要这样的预防或者治疗的患者施用预防或者治疗有效量的如上定义的式I的盐或其结晶水合物。
以下非限制实施例用来举例阐明本发明，不应理解为对本发明范围或者精神的限制。
在此描述的化合物可以以互变异构体例如酮-烯醇互变异构体形式存在。单一互变异构体以及互变异构体的混合物都包括在结构式I的化合物中。
术语“％对映异构体过量(％enantiomeric excess)”(缩写为“ee”)的意思是％主要对映异构体减去％次要对映异构体。因此，70％对映异构体过量对应于形成85％的一种对映异构体和15％的另一种对映异构体。术语“对映异构体过量”与术语“光学纯度”意义相同。
实施例

(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺二氢磷酸盐单水合物
3-(三氟甲基)-5，6，7，8-四氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪盐酸盐(1-4)的制备
                      方案1

步骤A：双酰肼(1-1)的制备
肼(20.1g，在水中，35重量％，0.22mol)与310ml乙腈混合。用60分钟加入31.5g三氟乙酸乙酯(0.22mol)。内部温度从14℃升高到25℃。所得溶液在22～25℃下陈化60分钟。将溶液冷却至7℃。在低于16℃的温度下，用130分钟同时加入17.9g 50重量％NaOH水溶液(0.22mol)和25.3g氯乙酰氯(0.22mol)。反应完全后，在27～30℃和26～27汞真空中，真空蒸馏混合物以除去水和乙醇。蒸馏期间，缓缓加入720mL乙腈以保持体积恒定(大约500mL)。过滤浆液以除去氯化钠。用约100mL乙腈洗涤滤饼。除去溶剂得到双酰肼1-1(43.2g，产率96.5％，经HPLC测定其纯度为94.4面积％)。
¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ4.2(s，2H)，10.7(s，1H)，和11.6(s，1H)ppm。
¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d₆)：δ41.0，116.1(q，J＝362Hz)，155.8(q，J＝50Hz)，和165.4ppm。
步骤B：5-(三氟甲基)-2-(氯甲基)-1，3，4-噁二唑(1-2)的制备
将步骤A制备的双酰肼1-1(43.2g，0.21mol)在ACN(82mL)中的溶液冷却到5℃。加入(32.2g，0.21mol)磷酰氯，保持温度低于10℃。混合物加热到80℃，并且在此温度下陈化24小时，直至HPLC显示1-1的面积％小于2。在另一容器中，将260mL IPAc和250mL水进行混合并且冷却到0℃。将反应浆液置入冷却器(quench)中，保持内部温度低于10℃。加入之后，混合物剧烈搅拌30min，温度升高到室温并且分离水层。然后用215mL水，215mL 5重量％碳酸氢钠水溶液，最后用215mL 20重量％盐水溶液洗涤有机层。处理之后HPLC测定其产率为86～92％。在75～80mmHg，55℃下，通过蒸馏除去挥发物，得到一种油状物，在步骤C中该油可以直接使用而无需进一步纯化。另外，该产品可以通过蒸馏进行提纯得到1-2，产率为70～80％。
¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ4.8(s，2H)ppm。
¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)：δ32.1，115.8(q，J＝337Hz)，156.2(q，J＝50Hz)，和164.4ppm。
步骤C：N-[(2Z)-哌嗪-2-亚基(ylidene)]三氟乙酰肼(1-3)的制备
在冷却于-20℃的乙二胺(33.1g，0.55mol)甲醇(150mL)溶液中，加入步骤B中蒸馏的噁二唑1-2(29.8g，0.16mol)，同时保持内部温度为-20℃。加入完成后，所得浆液在-20℃下陈化1h。然后在其中添加乙醇(225mL)，并且将浆液缓缓升温至-5℃。在-5℃下保持60min后，过滤浆液，并且在-5℃下用乙醇(60mL)进行洗涤。得到脒1-3，一种白色固体，产率为72％(24.4g，经HPLC测定纯度为99.5面积重量％)。
¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ2.9(t，2H)，3.2(t，2H)，3.6(s，2H)，和8.3(b，1H)ppm。
¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d₆)：δ40.8，42.0，43.3，119.3(q，J＝350Hz)，154.2，和156.2(q，J＝38Hz)ppm。
步骤D：3-(三氟甲基)-5，6，7，8-四氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪盐酸盐(1-4)的制备
将在110mL甲醇中的脒1-3(27.3g，0.13mol)悬浮液升温至55℃。在此温度下，用15分钟加入37％盐酸(11.2mL，0.14mol)。加入过程中，全部固体都会溶解，形成澄清溶液。反应陈化30分钟。溶液冷却至20℃，并且在此温度陈化，直至形成种晶层(seed bed)(10分钟到1小时)。在20℃下，用1小时时间加入300mL MTBE。所得浆液冷却至2℃，陈化30分钟，过滤。固体用50mL乙醇∶MTBE(1∶3)进行洗涤，45℃下进行真空干燥。三唑1-4的产量是26.7g(经HPLC测定纯度为99.5面积重量％)。
¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ3.6(t，2H)，4.4(t，2H)，4.6(s，2H)，和10.6(b，2H)ppm；
¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d₆)：δ39.4，39.6，41.0，118.6(q，J＝325Hz)，142.9(q，J＝50Hz)，和148.8ppm。
                   方案2

步骤A：4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-酮(2-3)的制备
将2，4，5-三氟苯乙酸(2-1)(150g，0.789mol)，梅尔德伦酸(Meldrum’s acid)(125g，0.868mol)和4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)(7.7g，0063mol)加入到一个5L三颈烧瓶中。在室温下，一次加入N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)(525mL)以溶解固体。在室温下，一次加入N，N-二异丙基乙胺(282mL，1.62mol)，在此期间保持温度低于40℃。用1～2小时滴加加入三甲基乙酰氯(107ml，0.868mol)，同时保持温度为0～5℃。在5℃下，反应混合物陈化1小时。在40～50℃下，一次加入三唑盐酸盐1-4(180g，0.789mol)。在70℃下，将反应溶液陈化几个小时。然后在20～45℃下，滴加加入5％碳酸氢钠水溶液(625ml)。在20～30℃下，在混合物中放入晶种并陈化1～2小时。然后用2～3小时再滴加525mL 5％碳酸氢钠水溶液。在室温下陈化数小时后，将浆液冷却至0～5℃，并且在过滤固体之前陈化1h。湿滤饼用20％DMAc水溶液(300mL)进行置换洗涤，然后再用20％DMAc水溶液(400mL)洗涤两次，最后用水(400mL)进行洗涤。在室温下抽吸干燥滤饼。最终产品2-3的分离产率是89％。
步骤B：(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁-2-烯-2-胺(2-4)的制备
在5L圆底烧瓶中加入甲醇(100mL)，酮酰胺2-3(200g)和醋酸铵(110.4g)。然后加入甲醇(180mL)和28％氨水(58.6mL)，在加入期间保持温度低于30℃。再在反应混合物中加入甲醇(100mL)。在回流温度下加热混合物并陈化2小时。将反应冷却至室温，然后在冰浴中冷却至约5℃。30分钟后，过滤并干燥固体，得到固体2-4(180g)；熔点271.2℃。
步骤C：(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[l，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺(2-5)的制备
在氮气气氛下，将氯化(1，5-环辛二烯)铑(I)二聚体{[Rh(cod)Cl]₂}(292mg，1.18mmol)和(R，S)t-butyl Josiphos(708mg，1.3mmol)加入到500ml烧瓶中。然后加入脱气MeOH(200mL)，并将混合物在室温下搅拌1小时。将烯胺酰胺2-4(118g，0.29mol)与MeOH(1L)一起加入到4L氢化器中。对浆液进行脱气。然后在氮气中将催化剂溶液转入氢化器。脱气三次之后，在50℃，200psi氢气下，将烯胺酰胺氢化13小时。经HPLC分析确定产率为93％，并且光学纯度为94％ee。
按照下述方式进一步提高光学纯度。浓缩来自氢化反应的甲醇溶液(在180mL MeOH中含18g)，并且将其转入甲基叔丁基醚(MTBE)(45mL)中。在此溶液中加入H₃PO₄水溶液(0.5M，95mL)。分层后，将3N NaOH(35mL)加入到水层中，然后用甲基叔丁基醚(180mL+100mL)进行萃取。浓缩甲基叔丁基醚溶液，然后将溶剂转入热甲苯(180mL，约75℃)中。然后将热甲苯溶液缓缓冷却至0℃(5～10小时)。经过滤分离得到晶体(13g，产率72％，98～99％ee)；熔点114.1～115.7℃。
¹H NMR(300MHz，CD₃CN)：δ7.26(m)，7.08(m)，4.90(s)，4.89(s)，4.14(m)，3.95(m)，3.40(m，2.68(m)，2.49(m)，1.40(bs)。
化合物2-5-以酰胺键旋转异构体形式存在。除非指明，主要和次要旋转异构体是一起的，因为碳-13信号不能很好地分辩：¹³C NMR(CD₃CN)：δ171.8，157.4(ddd，J_CF＝242.4，9.2，2.5Hz)，152.2(主要)，151.8(次要)，149.3(ddd；J_CF＝246.7，14.2，12.9Hz)，147.4(ddd，J_CF＝241.2，12.3，3.7Hz)，144.2(q，J_CF＝38.8Hz)，124.6(ddd，J_CF＝18.5，5.9，4.0Hz)，120.4(dd，J_CF＝19.1，6.2Hz)，119.8(q，J_CF＝268.9Hz)，106.2(dd，J_CF＝29.5，20.9Hz)，50.1，44.8，44.3(次要)，43.2(次要)，42.4，41.6(次要)，41.4，39.6，38.5(次要)，36.9.
游离碱结晶还可以按如下方式进行分离：
(a)在氢化步骤完成后的反应混合物中加入25重量％Ecosorb C-941。在氮气下搅拌混合物一小时，然后进行过滤。滤饼用2L/kg甲醇进行洗涤。游离碱的回收率为约95％，光学纯度为约95％ee。
(b)将游离碱的甲醇溶液浓缩到3.5～4.0L/kg容积(以加入的游离碱为基准)，然后将溶剂转入异丙醇(IPA)中，得到3.0L/kg IPA的最终容积。
(c)将浆液加热到40℃并在40℃陈化1小时，然后用2小时时间冷却至25℃。
(d)将庚烷(7L/kg)用7小时加入，然后在22～25℃下搅拌浆液12小时。过滤之前的上清液浓度为10～12mg/g。
(e)过滤浆液，并且用30％IPA/庚烷(2L/kg)洗涤固体。
(f)40℃下，在真空干燥箱中干燥固体。
(g)游离碱的光学纯度约为99％ee。
使用以下高效液相色谱(HPLC)条件来确定产物百分转化率：
柱：        Waters Symmetry C18，250mm×4.6mm
洗脱液：    溶剂A：0.1vol％ HClO₄/H₂O
            溶剂B：乙腈
梯度：      0min 75％A∶25％B
            10min 25％A∶75％B
            12.5min 25％A∶75％B
            15min 75％A∶25％B
流速：      1ml/min
注射体积：  10pL
紫外线检测：210nm
柱温：      40℃
保留时间：  化合物2-4：9.1min
            化合物2-5：5.4min
            tBu Josiphos：8.7min
使用以下高效液相色谱(HPLC)条件来确定光学纯度：
柱：        Chirapak，AD-H，250mm×4.6mm
洗脱液：    溶剂A：0.2vol.％二乙胺的庚烷溶液
            溶剂B：0.1vol％二乙胺的乙醇溶液
Isochratic运行时间：18min
流速：      0.7mL/min
注射体积：  7μL
紫外线检测：268nm
柱温：      35℃
保留时间：  (R)-胺2-5：13.8min
            (S)-胺2-5：11.2min   (2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-2-胺二氢磷酸盐单水合物
在配有悬挂式(overhead)搅拌器、加热套和热电偶的250mL圆底烧瓶中，加入31.5mL异丙醇(IPA)、13.5mL水、15.0g(36.9mmol)(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5三氟苯基)丁烷-2-胺游离碱和4.25g(36.9mmol)85％磷酸水溶液。将混合物加热到75℃。温度较低时形成稠密的白色沉淀，但是当温度达到75℃时这些沉淀就溶解了。将溶液冷却至68℃，然后在此温度下保持2小时。在此陈化期间形成固体浆层[溶液可以用0.5～5重量％的小粒度(高度研磨(alpinemilled))单水合物种晶]。然后以4℃/h的速度将浆液冷却至21℃，然后保持过夜。然后将105mL IPA加入到浆液中。1小时后过滤浆液并用45mL IPA洗涤(还可以用水/IPA溶液洗涤固相，以避免转换成其它晶形)。在空气中，在釉料(frit)上干燥固体。回收得到18.6g固体。经HPLC面积百分数测定，固体纯度大于99.8％(HPLC条件与上面给出的一样)。分离固体的粒径分布分析表明，平均PSD为80微米，95％的固体小于180微米。经X射线粉末衍射和热重分析表明，固体晶形为单水合物。
X射线粉末衍射分析广泛地用于表征分子结构、结晶度和多晶型现象。利用具有PW3040/60控制台的Philips Analytical X”Pert PRO X射线衍射系统，得到了结晶二氢磷酸盐单水合物的X射线粉末衍射图。PW3373/00陶瓷Cu LEF X射线管K-α射线用作源。
图1表示结构式II的二氢磷酸盐结晶单水合物形式的X射线衍射图。在对应d间距7.42、5.48和3.96埃处，单水合物显示出特征衍射峰。通过d间距6.30、4.75和4.48埃可以进一步表征单水合物。通过d间距5.85、5.21和3.52埃可以更进一步表征单水合物。
除上述X射线粉末衍射图之外，通过固态碳-13和氟-19核磁共振(NMR)谱，可以更进一步地表征结构式II的二氢磷酸盐结晶单水合物形式。在Bruker DSX 400WB核磁共振系统中，利用Bruker4mm双共振CPMAS探头，得到了固态碳-13核磁共振谱。碳-13核磁共振谱利用了具有可变振幅交叉极化的质子/碳-13交叉极化魔角旋转。样品在15.0kHz下进行旋转，在循环延迟为20秒下总共收集2048次扫描。在FT进行之前，对谱应用40Hz的谱线展宽。以TMS为标准物质，用甘氨酸的羰基碳(176.03p.p.m.)作为二级参比，记录化学位移。
在Bruker DSX 400WB核磁共振系统中，利用Bruker 4mmCPMAS探头，得到了固态氟-19核磁共振谱。核磁共振谱使用了简单脉冲-获得脉冲程序。使样品在15.0kHz下进行旋转，在循环延迟为30秒下总共收集16次扫描。使用聚酰亚胺树脂(vespel)端帽以最小化氟的背景。在FT进行之前，对谱应用100Hz的谱线展宽。用聚四氟乙烯(teflon)作为外部二级参比，记录化学位移，指定聚四氟乙烯的化学位移为-122ppm。
图2表示结构式II的二氢磷酸盐结晶单水合物形式的固态碳-13CPMAS核磁共振谱。该单水合物形式显示出特征信号，化学位移值为169.1、120.8和46.5p.p.m。通过化学位移值为159.0、150.9和40.7ppm的信号可以进一步表征该单水合物形式。
图3表示结构式II的二氢磷酸盐结晶单水合物形式的固态氟-19MAS核磁共振谱。该单水合物形式显示出特征信号，化学位移值为-64.5、-114.7、-136.3和-146.2p.p.m。通过化学位移值为-96.5、-104.4、-106.3和-154.5ppm的信号可以进一步表征该单水合物形式。
图4表示结构式II的二氢磷酸盐结晶单水合物形式的特征热重分析(TGA)曲线。使用Perkin Elmer型TGA 7或者其它同类仪器。在氮气流下，并且加热速率为10℃/min下进行试验，加热到最高温度为大约250℃。自动配衡平衡后，将5～20mg样品加入到铂盘中，使加热炉温度上升，加热程序开始。由仪器自动收集重量/温度数据。通过选择仪器软件中的ΔY函数，和选择要计算重量损失的温度之间的温度，进行结果分析。记录重量损失，直至分解/蒸发开始。TGA表明，从室温到约250℃重量损失约为3.3647％。
图5表示结构式II的二氢磷酸盐结晶单水合物形式的特征差示扫描量热(DSC)曲线。使用TA仪器DSC 2910或者其它同类仪器。称量2～6mg样品置入开口盘中。然后将此盘卷曲并置于量热器室的样品位置。将空盘置于参比位置。将量热器室关闭，并使氮气流通过此室。设置加热程序加热样品，加热速率为10℃/min，直至温度为约250℃。开始加热程序。当运行完成时，用包含在系统软件中的DSC分析程序对数据进行分析。对基线温度点之间的熔化吸热进行积分，这些温度点都超过和低于观察到吸热的温度范围。记录的数据是起始温度、峰值温度和焓。
本发明的结晶二氢磷酸盐单水合物具有至少约5％的具有上述X射线粉末衍射、氟-19MAS核磁共振、碳-13CPMAS核磁共振和DSC物理特性的形式的相纯度。在一个实施方案中，相纯度为至少约10％的具有上述固态物理特性的形式。在第二个实施方案中，相纯度为至少约25％的具有上述固态物理特性的形式。在第三个实施方案中，相纯度为至少约50％的具有上述固态物理特性的形式。在第四个实施方案中，相纯度为至少约75％的具有上述固态物理特性的形式。在第五个实施方案中，相纯度为至少约90％的具有上述固态物理特性的形式。在第六个实施方案中，结晶二氢磷酸盐单水合物基本上为相纯的具有上述固态物理特性的形式。术语“相纯度”是指通过本申请所述的固态物理方法测定的，关于具体结晶或者无定形形式的二氢磷酸盐单水合物的固态纯度。
发现结晶二氢磷酸盐单水合物在环境条件下是稳定的。发现如果在极干噪氮气流中加热至高于40℃，将转换成脱水单水合物。在环境条件下脱水单水合物将重新变成单水合物。
药物组合物实施例：
1)直接压片法：
通过直接压片法将二氢磷酸盐单水合物配制成片剂。100mg效能片剂，由以下成分组成：128.4mg活性成分，127.8mg微晶纤维素，127.8mg甘露醇(或者127.8mg磷酸二钙)，8mg交联羧甲基纤维素钠，8mg硬脂酸镁和16mg欧巴代白(Opadry white)(专卖包衣材料，由Colorcon，West Point，PA制造)。活性成分、微晶纤维素、甘露醇(或者磷酸二钙)和交联羧甲基纤维素首先进行混合，然后将混合物用硬脂酸镁进行润滑并压制成片剂。然后片剂包衣欧巴代白薄膜。
2)碾压法：
通过碾压法将二氢磷酸盐单水合物配制成片剂。100mg效能片剂，由以下成分组成：128.4mg活性成分，45mg微晶纤维素，111.6mg磷酸二钙，6mg交联羧甲基纤维素钠，9mg硬脂酸镁和12mg欧巴代白(专卖包衣材料，由Colorcon，West Point，PA制造)。活性成分、微晶纤维素、磷酸二钙和交联羧甲基纤维素首先进行混合，然后将混合物用三分之一总量的硬脂酸镁进行润滑并碾压成带状物。然后研磨这些带状物，然后将所得颗粒用余量硬脂酸镁进行润滑并挤压成片剂。然后将片剂包衣欧巴代白薄膜。
3)静脉注射的(i.v.)含水制剂定义为：在pH值4.5±0.2下，在10mM乙酸钠/0.8％盐水溶液中的式I的二氢磷酸盐单水合物。为了得到浓度为4.0mg/mL的制剂，将800mg NaCl溶解于80mL水中，然后加入57.5μL冰醋酸，然后再加入512mg二氢磷酸盐单水合物。用0.1N NaOH溶液将pH值调节为4.5±0.2。用水将最终容积调节为100mL。通过将50.0mL 4.0mg/mL的溶液用空白对照剂稀释到100.0mL，可以得到2.0mg/mL的溶液。通过将25.0mL 4.0mg/mL的溶液用空白对照剂稀释到100.0mL，可以得到1.0mg/mL的溶液。