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1、(10)申请公布号 CN 102286526 A (43)申请公布日 2011.12.21 CN 102286526 A *CN102286526A* (21)申请号 201110231054.5 (22)申请日 2011.08.12 C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市钟灵街 50 号 (72)发明人 刁卫平 王述彬 刘金兵 潘宝贵 戈伟 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 (54) 发明名称 一种快速获得辣椒转基因植株的方法 (57) 摘。
2、要 一种快速获得辣椒转基因植株的方法， 该方 法包括取样 ； 农杆菌活化和侵染 ； 再生培养基和 筛选培养基制备 ； 未成熟胚接种和培养 ； 不定芽 形成和植株再。在短时间内即可高效地获得辣椒 转基因再生植株。本发明从农杆菌侵染未成熟胚 到再生植株的获得一般需要 7 周时间， 培养过程 中再生植株形成率最高可达 50%， 转基因植株阳 性率高达 80%。该发明中以未成熟胚为受体材料 进行农杆菌侵染、 接种培养后直接形成再生植株， 缩短了培养周期、 提高了培养效果和遗传转化效 率， 本发明若应用于基因功能验证和育种实践， 必 将大大加快辣椒基因功能组学的研究和育种实践 进展。 (51)Int.C。
3、l. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 CN 102286537 A1/1 页 2 1. 一种快速获得辣椒转基因植株的方法， 其特征在于包含下列步骤 ： 1） 取样 ： 在果实采摘期晴天从健壮植株上取自然成熟的红果 ； 2）农杆菌活化和侵染 ： 将含有目的基因的农杆菌 LBA4404 接种于含有 45mg/L 卡那 霉素及 45mg/L 利福平的 YEB 的固体培养基上， 27暗培养 2 天后， 挑单菌落接种至含有 45mg/L 卡那霉素及 45mg/L 利福平的 YEB 液体培养基中， 27， 250rpm 振荡培养。
4、至 OD600值 为0.406， 将菌液转入50mL离心管中， 4000rpm离心菌液后， 用等体积的无菌水悬浮菌液后 备用 ； 取 1） 中果实的种子， 取出未成熟胚转移至已准备好的农杆菌菌液中， 浸没 5 分钟 ； 3） 再生培养基和筛选培养基制备 ： 再生和筛选培养基所用基本培养基为 MS 培养基， 所用碳源为蔗糖， 凝固剂为琼脂 ； 再生培养基的组成成分为 MS+15mg/L 6-BA+3%wt 蔗糖 +0.8%wt琼脂， 筛选培养基的组成成分为MS+15mg/L 6-BA +3%wt蔗糖+0.8%wt琼脂+60mg/ L 卡那霉素 ； 4） 未成熟胚接种和培养 ： 将 2） 中侵染的。
5、未成熟胚在灭菌滤纸上沥干菌液后， 置于 3） 中 再生培养基上， 在 27黑暗条件下培养后用无菌水冲洗外植体， 转移到筛选培养基上黑暗 培养， 然后于光照度 2000lx、 光照时间 12h、 室温 27下继续培养， 每三角瓶放 30 个未成熟 胚 ； 5） 不定芽形成和植株再生 ： 接种后四周形成完整植株。 2. 根据权利要求 1 所述的获取辣椒转基因植株的方法， 其特征在于再生培养基和筛选 培养基制备过程中， 再生和筛选培养基组成中 BA 的浓度为 2mg/L 。 3. 根据权利要求 1 所述的获取辣椒转基因植株的方法， 其特征在于未成熟胚接种和培 养过程中， 将 2） 中侵染的未成熟胚在。
6、灭菌滤纸上沥干菌液后， 置于 3） 中再生培养基上， 先 在27黑暗条件下培养15天后用无菌水冲洗外植体， 转移到筛选培养基上黑暗培养510 天。 权 利 要 求 书 CN 102286526 A CN 102286537 A1/4 页 3 一种快速获得辣椒转基因植株的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域中转基因植株的获取方法， 尤其涉及一种通过农杆菌侵 染辣椒未成熟胚快速获得转基因植株的方法。 背景技术 0002 转基因技术是利用重组 DNA、 细胞组织培养或种质系统转化等技术， 将外源基因导 入植物细胞或组织， 使之定向重组遗传物质， 改良植物性状， 培育优质高产作物新品种。自。
7、 1983 年首例转基因植株诞生， 天然植物基因工程开始在人工控制下定向改良植物的遗传性 状。与常规育种方法相比， 它具有以下一些特点 ： 1） 不受亲缘关系的限制， 可实现动物、 植 物和微生物间遗传物质的交流， 从而充分利用自然界存在的各种遗传资源 ； 2） 有效地打破 有利基因和不利基因的连锁， 充分利用有用基因 ； 3） 加快育种进程， 缩短育种年限。 0003 自第一例转基因烟草问世以来， 植物转基因研究和应用发展迅速。到 1997 年为 止， 全世界转基因植物涉及到至少 35 科的 200 多个种。目前， 植株转基因已成为植物分子 生物学研究的强有力的实验手段 ； 更是基因克隆、 。
8、功能基因组研究必不可少的实验工具。 近 年来， 遗传转化方法不断创新， 已发表的植物转基因操作体系有近 10 种， 以转化系统的原 理大致可分为三类 ： 1） 农杆菌介导的基因转移 ； 2） 以原生质体、 细胞或组织为受体的直接 转移， 如电激、 微注射、 PEG 介导法 ； 3） 种质系统的基因转移， 如利用子房注射、 种胚、 体细胞 胚及花粉。目前应用最多的是根癌农杆菌介导的转基因方法， 迄今所获得的 200 多种转基 因植物中， 80% 以上是利用该方法获得的。截至 1999 年， 至少 30 个国家进行了总计 3 万次 以上的转基因作物的田间试验， 改良的经济性状有 10 多个 ； 已。
9、有大豆、 玉米、 棉花、 油菜、 番 茄、 马铃薯、 烟草、 西葫芦和蕃木瓜等 9 种作物的转基因品种投入了商业化生产， 取得了良 好的社会效益和经济效益。 0004 辣椒为茄科辣椒属蔬菜作物， 是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一。自从首次开 展辣椒组织培养工作以来， 国内外相继出现采用不同的辣椒外植体， 如子叶、 茎尖、 茎段、 叶 片、 下胚轴、 子叶柄、 花药及其原生质体等进行组织培养的报道。但辣椒组织培养具有很强 的基因型特异性， 再生效率不理想， 在多数试验中植株的再生周期长或分化频率低， 其不定 芽的生长能力较差， 有的甚至停留在芽诱导阶段而不能进一步生长， 这在很大程度上限制 了辣。
10、椒基因工程的研究进展。目前， 关于辣椒转基因工作研究主要集中遗传转化体系的建 立上， 但遗传转化过程仍存在一些主要问题限制了辣椒转基因技术在实际育种中的应用， 如 ： 培养周期长、 植株再生困难和遗传转化率低等。 因此， 如何建立成熟的遗传转化体系、 提 高遗传转化率是辣椒转基因工作中急需解决的一个难题。 发明内容 0005 技术问题 本发明的目的是提供一种通过农杆菌侵染辣椒未成熟胚快速获得转 基因植株的方法。该方法可用于新基因功能的验证以及优良转基因育种材料的获得， 也为 其他作物的转基因研究提供参考。 说 明 书 CN 102286526 A CN 102286537 A2/4 页 4 0。
11、006 技术方案 本发明提供了一种通过农杆菌侵染辣椒未成熟胚快速获得转基因植 株的方法。 其过程是对辣椒未成熟胚先进行农杆菌侵染， 再进行培养， 然后对获得的再生植 株进行 PCR 鉴定， 在短期内获得转基因植株。具体步骤如下 ： 1） 取样 ： 在果实采摘期晴天从健壮植株上取自然成熟的红果 （授粉后 4050 天） 。 0007 2）农杆菌活化和侵染 ： 将含有目的基因 （掌叶半夏凝集素基因 PPA， 基因全长 777bp） 的农杆菌 LBA4404 接种于含有 45mg/L 卡那霉素及 50mg/L 利福平的 YEB 的固体培养 基上， 27暗培养2d后， 挑单菌落接种至含有45mg/L卡。
12、那霉素及45mg/L利福平的YEB液体 培养基中， 27， 250rpm 振荡培养至 OD600值为 0.406， 将菌液转入 50mL 离心管中， 4000rpm 离心菌液后， 用等体积的无菌水悬浮菌液后备用。取 1） 中果实的种子， 用解剖刀将其一分 为二， 随后取出未成熟胚转移至已准备好的农杆菌菌液中， 浸没 5 分钟。 0008 3） 再生培养基 （R 培养基） 和筛选培养基 （S 培养基） 制备 ： R 和 S 培养基所用基 本培养基为 MS 培养基， 所用碳源为蔗糖， 凝固剂为琼脂。R 培养基的组成成分为 MS+2mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂， S培养基的组成成分为M。
13、S+2mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂+60mg/ L 卡那霉素。 0009 4） 未成熟胚接种和培养 ： 将 2） 中侵染的未成熟胚在灭菌滤纸上沥干菌液后， 置于 3） 中 R 培养基上培养先在 27黑暗条件下培养 3 天后用无菌水冲洗数次外植体， 转移到筛 选培养基上， 黑暗培养 1 周， 后于光照度 2000lx、 光照时间 12h、 室温 27下继续培养， 每三 角瓶放 30 个未成熟胚。 0010 5） 不定芽形成和植株再生 ： 接种后一周， 可观察到未成熟胚膨大。继续培养三周 后， 可陆续观察到不定芽的出现， 随后形成根、 芽、 叶俱全的完整植株。 0011 6） 转基因。
14、植株的 PCR 鉴定 ： 以再生植株的叶片为材料提取基因组 DNA， 利用所转化 基因的序列设计特异引物对 DNA 进行扩增， 以质粒和水为对照。扩展条带的有无表示转基 因侵染成功与否。 0012 有益效果 1） 首次在辣椒转基因研究中利用未成熟胚为试材快速获得转基因再生植株。该发明 缩短了转基因接种再生培养时间， 提高了转化效率， 获得的转基因植株可用于新基因的功 能验证。同时， 获得的转基因植株可作为优异育种材料运用于育种实践。 0013 2） 辣椒 （Capsicum annuum L.） 属茄科辣椒属， 是一种被广泛种植的重要蔬菜作 物。然而， 由于辣椒遗传基础狭窄， 种质资源有限， 。
15、仅采用常规育种手段选育新品种不仅耗 时耗力、 效率低， 且难以使新品种在抗性和品质等方面有显著提高。 而利用本发明方法可快 速转基因植株， 不仅可以缩短转基因过程中遗传转化的培养时间， 提高转化效率， 短期内就 可以进行完成目的基因的功能验证， 而且可以提供新的种质资源， 使新株系在特定性状 （抗 性和品质） 等方面得到显著提高。应用本发明获得的转基因植株可作为育种材料直接用于 新品种的培育。 0014 3） 本发明是建立在以辣椒未成熟胚为试材进行转基因培养包括基因型、 取材时 期、 接种菌液浓度和时间以及培养基成分等系统研究工作基础上的。通过农杆菌侵染未成 熟胚获得转基因再生植株可以缩短培养。
16、时间、 提高转化效率。本发明从农杆菌侵染未成熟 胚到再生植株的获得一般需要 7 周时间， 培养过程中再生植株形成率最高可达 50%， 转基因 植株阳性率高达80%。 而未成熟胚具有取材方面、 结构简单、 基因型丰富等优点， 对未成熟胚 说 明 书 CN 102286526 A CN 102286537 A3/4 页 5 进行离体培养可以准确地研究植株再生条件， 以及可以快速获得多种基因型的转基因育种 材料。 同时， 通过农杆菌侵染未成熟胚培养可以进行优良辣椒无性系变异材料的筛选， 创制 新的种质资源， 扩大辣椒基因池。总之， 本方法具有坚实的理论依据， 科学性强、 方法简便， 易于操作和实际应。
17、用。 0015 附图说明 0016 图 1 利用未成熟胚进行辣椒转基因研究流程图 图 2实施例农杆菌侵染未成熟胚获得转基因植株。 A. 刚接种的辣椒未成熟胚 ； B 膨大的辣椒未成熟胚 ； C 不定芽形成 ； D. 根芽叶俱全的转基因再生植株 ； 图 3 实施例转基因植株 PCR 验证结果， 750bp 附近处有目的条带表示为转基因植 株。 0017 具体实施方式 0018 植物转基因技术在改善生物的抗性、 提高生物品质、 创造新种质或品种、 人类保健 和医药等方面具有较大应用前景。 生物技术作为辅助手段可以解决一些常规技术难以解决 的问题， 使农业出现一次新的产业革命。 转基因技术不受作物种。
18、间限制， 将控制某生物性状 的目的具有从生物中取出， 通过基因操作， 将其导入待改良的寄主细胞内并表达， 从而培育 出新品种。这一技术可大大提高育种效果， 加速育种进程， 丰富农作物的营养和功能， 延长 保质期， 去除过敏成分， 提高作物耐高温、 盐碱、 病害等抗逆性。 植株组织培养再生体系的建 立是进行基因遗传转化的基础。自从首次开展辣椒组织培养工作以来， 国内外相继出现采 用不同的辣椒外植体， 如子叶、 茎尖、 茎段、 叶片、 下胚轴、 子叶柄、 花药及其原生质体等进行 组织培养的报道。 但辣椒组织培养具有很强的基因型特异性， 再生效率不理想， 在多数试验 中植株的再生周期长或分化频率低，。
19、 其不定芽的生长能力较差， 有的甚至停留在芽诱导阶 段而不能进一步生长， 这在很大程度上限制了辣椒基因工程的研究进展。而利用未成熟胚 作为转基因受体材料具有再生能力强、 取材方便、 基因型丰富、 群体数量大等优点， 因此对 未成熟胚进行离体培养可以更好地控制遗传转化和植株再生条件， 快速获得多种基因型的 转基因材料， 以及容易获得体细胞无性系变异材料。 我们应用本发明的方法， 通过农杆菌侵 染辣椒未成熟胚可在短时间内获得了转基因再生植株。 0019 本实例就以辣椒未成熟为材料， 采用本发明方法通过农杆菌侵染未成熟胚在 50 天之内获得转基因再生植株。含有目的基因掌叶半夏凝集素基因 PPA 的农。
20、杆菌 LBA4404 可以从市面购得或采用经典分子生物学操作方法获取 （参见 Sambrook J,Fristsh E F,Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed.NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989） 。实施过程如下 ： 1） 取样 ： 在果实采摘期晴天从健壮植株上取自然成熟的红果， 授粉后 4050 天 ； 2） 农杆菌活化和侵染 ： 将含有目的基因 （掌叶半夏凝集素基因 PPA， 基因全长 777bp） 的 农杆菌LBA4404接种于含有45mg/L卡那霉素及。
21、45mg/L利福平的YEB的固体培养基上， 27 暗培养 2 天后， 挑单菌落接种至含有 45mg/L 卡那霉素及 45mg/L 利福平的 YEB 液体培养基 说 明 书 CN 102286526 A CN 102286537 A4/4 页 6 中， 27， 250rpm振荡培养至OD600值为0.406， 将菌液转入50mL离心管中， 4000rpm离心菌 液后， 用等体积的无菌水悬浮菌液后备用。取 1） 中果实的种子， 用解剖刀将其一分为二， 随 后取出未成熟胚转移至已准备好的农杆菌菌液中， 浸没 5 分钟 ； 3） 再生培养基 （R 培养基） 和筛选培养基 （S 培养基） 制备 ： R 。
22、和 S 培养基所用基本培养基 为MS培养基， 所用碳源为蔗糖， 凝固剂为琼脂。 R培养基的组成成分为MS+2mg/L 6-BA+3%wt 蔗糖 +0.8%wt 琼脂， S 培养基的组成成分为 MS+2mg/L 6-BA+3%wt 蔗糖 +0.8%wt 琼脂 +60mg/ L 卡那霉素 ； 4） 未成熟胚接种和培养 ： 将 2） 中侵染的未成熟胚在灭菌滤纸上沥干菌液后， 置于 3） 中 R 培养基上培养先在 27黑暗条件下培养 3 天后用无菌水冲洗数次外植体， 转移到筛选培 养基上， 黑暗培养 1 周， 后于光照度 2000lx、 光照时间 12h、 室温 27下继续培养， 每三角瓶 放 30 。
23、个未成熟胚 ； 5） 不定芽形成和植株再生 ： 接种后一周， 可观察到未成熟胚膨大。继续培养三周后， 可 陆续观察到不定芽的出现， 随后形成根、 芽、 叶俱全的完整植株 ； 6） 转基因植株的 PCR 鉴定 ： 以再生植株的叶片为材料提取基因组 DNA， 利用所转化基因 的序列设计特异引物对 DNA 进行扩增， 以质粒和水为对照。 说 明 书 CN 102286526 A CN 102286537 A1/3 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 102286526 A CN 102286537 A2/3 页 8 图 2 说 明 书 附 图 CN 102286526 A CN 102286537 A3/3 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 102286526 A 。