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1、(10)申请公布号 CN 103589665 A (43)申请公布日 2014.02.19 CN 103589665 A (21)申请号 201310504948.6 (22)申请日 2013.10.23 CCTCC NO: M 2013390 2013.09.04 C12N 1/20(2006.01) C12P 7/62(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18 号 (72)发明人 郑裕国 孙丽慧 朱斌斌 沈寅初 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 冷红。
2、梅 (54) 发明名称 庆笙红球菌及其在制备(S)-4-氯-3-羟基丁 酸乙酯中的应用 (57) 摘要 本发明提供了一株新的菌株庆笙红球菌 （Rhodococcus qingshengii） ZJB-12028， 以及该 菌株在微生物不对称还原 4- 氯乙酰乙酸乙酯制 备阿托伐他汀关键手性中间体 (S)-4- 氯 -3- 羟 基丁酸乙酯中的应用。该菌株保藏于中国典型 培养物保藏中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 邮 编 430072， 保藏日期 2013 年 9 月 4 日， 保藏编号 CCTCC NO:M2013390。该菌株稳定性好， 立体选择 性严格， 产物光学纯度高， 用于制。
3、备 (S)-CHBE 具 有反应条件温和、 环境友好等优点， 具有较高的工 业化应用潜力。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 (10)申请公布号 CN 103589665 A CN 103589665 A 1/1 页 2 1. 庆笙红球菌 （Rhodococcus qingshengii） ZJB-12028， 保藏于中国典型培养物保藏 中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 邮编 430072， 保藏日期 2013 年 9 。
4、月 4 日， 保藏编号 CCTCC NO:M2013390。 2.如权利要求1所述的庆笙红球菌ZJB-12028， 其特征在于其16S rDNA序列如SEQ ID No.1 所示。 3. 如权利要求 1 所述的庆笙红球菌 ZJB-12028 在微生物不对称还原 4- 氯乙酰乙酸乙 酯制备 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯中的应用。 4. 如权利要求 3 所述的应用， 其特征在于所述不对称还原在 pH4.0 9.0、 20 45 下进行。 权 利 要 求 书 CN 103589665 A 2 1/6 页 3 庆笙红球菌及其在制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应 用 （一） 技术领域 。
5、0001 本 发 明 涉 及 一 株 新 的 菌 株 庆 笙 红 球 菌 （Rhodococcus qingshengii） ZJB-12028， 以及该菌株在微生物不对称还原 4- 氯乙酰乙酸乙酯制备阿托伐他汀关键手性 中间体 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯中的应用。 （二） 背景技术 0002 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯 （Ethyl(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate,(S)-CHB E） 是一种重要的手性药物中间体， 可用于合成他汀类药物羟甲基戊二酰 CoA（HMG-CoA） 还原酶的竞争性抑制剂， 可以抑制肝脏中的胆固醇的合成， 从而降低。
6、血液中胆固醇的含量， 降低心脑血管疾病的发病机率， 其药物商品名立普妥 （阿托伐他汀钙） 是美国第一个年销量 超过一百亿美元的药物， 目前也是全球最高销量的药物。另外， (S)-CHBE 还可以转化生成 1， 4- 二氢吡啶类 - 阻滞剂， 后者是一种抗高血压药物的有效成分。因此， 制备光学活性 (S)-CHBE 备受研究者的关注。以下是 (S)-CHBE 分子结构式 ： 0003 0004 (S)-CHBE的制备方法可以分为外消旋体拆分法和不对称催化合成法。 由于外消旋 体拆分的方法制备效率不高， 理论收率仅为 50， 且产物的分离纯化困难， 因此， 对于外消 旋体的手性拆分制备(S)-CH。
7、BE意义不大。 与拆分法相比较而言， 采用不对称合成(S)-CHBE 受到了更多的关注。以潜手性底物 4- 氯乙酰乙酸乙酯 （Ethyl4-chloroacetoacetate， COBE） 为原料， 不对称催化合成单一手性对映体(S)-CHBE可以解决拆分法获得(S)-CHBE中 的过程复杂， 单一对映体过量值低等问题， 同时由于底物 COBE 价格便宜， 容易合成， 因此不 对称合成法是最经济有效的合成 (S)-CHBE 方法。 0005 以 COBE 为原料不对称合成制备 (S)-CHBE， 可分为化学催化法和生物催化法两类。 化学催化法是采用手性的钌化合物 （例如 RuX2(S)-BI。
8、NAP） 作为催化剂不对称加氢还原， 产物的e.e.值可达97%以上， 但这种方法需要高压加氢， 对反应器要求较高， 而且所用催化 剂价格昂贵， 因此生产成本较高。 而采用的生物催化剂无需苛刻的反应条件， 也不需要昂贵 的催化剂， 因此有较好的应用前景。生物催化过程中， 采用纯酶催化需要添加昂贵的辅酶， 因此， 大规模的生产通常采用具备辅酶再生系统的微生物细胞作为催化剂。生物法羰基不 对称还原制备 (S)-CHBE 具有反应条件温和， 产物单一， 立体选择性高， 在未来的绿色化学 的发展过程中有重要的利用开发价值。 说 明 书 CN 103589665 A 3 2/6 页 4 （三） 发明内容。
9、 0006 本发明目的是提供一株新菌株庆笙红球菌 （Rhodococcus qingshengii） ZJB-12028， 及其在羰基不对称还原制备 (S)-CHBE 中的应用， 该菌株稳定性好， 立体选择性 严格， 产物光学纯度高。 0007 本发明采用的技术方案是 ： 0008 庆笙红球菌 （Rhodococcus qingshengii） ZJB-12028， 保藏于中国典型培养物保藏 中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 邮编 430072， 保藏日期 2013 年 9 月 4 日， 保藏编号 CCTCC NO:M2013390。 0009 该新菌株特征如下 ： 0010 菌落。
10、形态 ： 28条件下培养24h， 菌落呈圆形， 中央隆起呈凸镜状， 直径23mm， 乳 白色， 不透明， 表面光滑湿润， 边缘整齐， 略带锯齿状， 易挑起。 0011 生理生化特征 ： 革兰氏阳性， 接触酶阳性， 利用 APICoryne 自动微生物鉴定系统对 菌株进行了生理生化检测表明菌株 ZJB-12028 为红球菌属 （Rhodococcus） ， 具体特征见表 1。 0012 表 1 ： 菌株 ZJB-12028 的生理生化鉴定结果 0013 0014 Notes:+,positive;-,negative; 0015 16S rDNA 序列鉴定 ： 以提取到的细胞总 DNA 为模版，。
11、 利用通用引物 P1 和 P2 扩增 菌株的 16S rDNA 基因， 再将 PCR 产物进行 1% 的琼脂糖凝胶电泳。菌株 ZJB-12028 经 PCR 扩增获得一段长约为 1.5kb 的片段， 经测序确认该菌株 16S rDNA 的扩增产物实际长度为 1422bp， 序列如 SEQ ID No.1 所示 ： 0016 CATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCTTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGAT CTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCCTATCGCATG。
12、GTGGGTGGTG GAAAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACG GGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG GAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTT TCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTA。
13、CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGTAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGTGAAAACC 说 明 书 CN 103589665 A 4 3/6 页 5 AGCAGCTCAACTGCTGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGC GGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAACGA AAGCGTGGGTAG。
14、CGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTCCTTC CACGGAATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAA TTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACA TATACCGGAAAGCTGCAGAGATGTGGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT 。
15、CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCGT AAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCAC ACATGCTACAATGGCCAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGG ATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCG。
16、GTGAATACGTT CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCTTAACCCCTTGTGGG AGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGAA 0017 所述菌株的16S rDNA序列与GenBank相关数据进行相似性分析发现， 该菌与庆笙 红球菌 （Rhodococcus qingshengii IARI-JR-58）（No.KF055006.1） 同源性最高 （homology， 100%/1422bps， based on16S rDNA） ， 因此结合细胞形态、。
17、 生理生化和分子生物学鉴定， 可确 定该菌株为庆笙红球菌 （Rhodococcus qingshengii） 。 0018 本发明所涉及的微生物是通过以下方法筛选得到的 ： 0019 （1） 称取从杭州及周边地区采集的土样1g加入到9ml0.85%的生理盐水中， 在涡流 振荡器上充分混匀。 取上清1ml， 加入到39ml富集培养基中， 28、 150rpm下培养72h， 然后 再取 1ml 培养基加入到 39ml 的富集培养基， 28、 150rpm 下培养 72h， 如此进行三轮富集。 富集培养基终浓度组成如下 ： 葡萄糖8g/L， 蛋白胨5g/L， 酵母膏5g/L， 牛肉膏4g/L， Na。
18、Cl4g/ L， 溶剂为水， 用 1.0mol/L 盐酸或 NaOH 溶液调节 pH 至 6.0 8.0。 0020 （2） 第三次富集培养液稀释后涂布到平板培养基上， 挑取单菌落至斜面保藏。 平板 培养基及斜面培养基为前述富集培养基中加入 15 20g/L 的琼脂。 0021 （3） 挑取的单菌落接种到发酵培养基， 发酵培养基终浓度组成如下 ： 葡萄糖 40g/ L， 酵母膏 20g/L， 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 5g/L， MgSO47H2O0.5g/L， NaCl4g/L， K2HPO40.5g/L， 溶剂为水， pH7.0（115下， 灭菌 30min） ； 28下， 摇瓶转速 。
19、150rmp， 培养 24， 离心后悬浮于 磷酸缓冲液体系中， 加入 COBE 作为底物， 进行转化。 0022 （4） 用气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值 (ee) ： 0023 反应结束后， 转化液经离心分离去除菌体细胞， 上清液用等体积乙酸乙酯萃取， 有 机层用无水 Na2SO4脱水、 过滤后采用气相色谱法检测产物的对映体过量值和产率。 0024 非手性 GC 分析条件 ： HP-5 弱极性色谱柱 （30m0.32mm0.25m） ， 柱温 120， 保留 2.5min， 以 50 /min 程序升温至 165， 保持 1.2min。载气为氮气， 流量 1.0mL/min， 。
20、进样量1L， 分流比50 ： 1， 检测器温度为250， 进样口温度为230； 非手性色谱柱可以检 测底物 COBE 和产物 CHBE 的含量， 进一步计算反应的摩尔转化率。 0025 手性 GC 分析条件 ： BGB-174 手性毛细管气相色谱柱 （30m0.32mm0.25m） ， 柱 温110， 以0.5/min程序升温至125， 载气为氦气， 流量为1.0mL/min， 进样量1L， 分 流比 40 ： 1， 检测及进样口温度均为 220； 手性色谱柱可以检测 (S)-CHBE 和 (R)-CHBE 的含 量， 进一步计算产物的光学纯度 （对映体过量值， e.e.%） 。 说 明 书 。
21、CN 103589665 A 5 4/6 页 6 0026 本发明还涉及所述的庆笙红球菌 ZJB-12028 在微生物不对称还原 4- 氯乙酰乙酸 乙酯制备 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯中的应用。 0027 优选的， 所述不对称还原在 pH4.0 9.0、 20 45下进行， 更优选在 pH6.0 7.5、 28 35下进行。 0028 具体的， 所述的应用方法如下 ： 在以 Rhodococcus qingshengii ZJB-12028 发酵 培养获得的含酶湿菌体为催化剂、 以 COBE 为底物、 水或 pH4.0 9.0 缓冲溶液为溶剂所构 成的转化体系 a 中， 在 20 。
22、45下进行转化反应， 反应完全后， 将转化液后处理， 获得所述 (S)-CHBE。所述不对称还原涉及的化学反应如下 ： 0029 0030 具体的， 所述转化体系 a 中底物初始浓度为 10 3000mmol/L， 优选 50 1500mmol/L ； 转化体系 a 中含酶湿菌体添加量以菌体干重计为 10 250g/L， 优选 50 200g/L。 0031 进一步， 为实现辅酶的再生循环， 所述转化体系 a 中还可包括辅助底物， 由辅助底 物、 底物、 催化剂与 pH4.0 9.0 的缓冲液构成转化体系 b， 所述辅助底物为下列之一 ： 葡萄 糖、 果糖、 蔗糖、 麦芽糖、 甘露醇， 柠檬酸。
23、钠， 优选葡萄糖或果糖。 0032 具体的， 所述应用方法可如下 ： 以Rhodococcus qingshengii ZJB-12028发酵培养 获得的含酶湿菌体为催化剂， 以 COBE 为底物， 加入辅助底物， 与水或 pH4.0 9.0 缓冲溶液 构成的转化体系 b， 在 20 45下进行转化反应， 反应完全后， 将转化液后处理， 获得所述 (S)-CHBE ； 所述转化体系 b 中底物初始浓度为 10 3000mmol/L （优选 50 1500mmol/L） ， 含酶湿菌体添加量以菌体干重计为 10 250g/L（优选 50 200g/L） ， 辅助底物初始浓度 为1050g/L， 。
24、所述辅助底物为下列之一 ： 葡萄糖 （优选3050g/L） 、 果糖 （优选3050g/ L） 、 蔗糖 （优选 20 35g/L） 、 麦芽糖 （优选 30 50g/L） 、 甘露醇 （优选 30 50g/L） ， 柠檬酸 钠 （优选 30 50g/L） ， 优选为葡萄糖或果糖。 0033 所述转化反应是在2045下反应0.124h， 优选为2835反应0.54h。 0034 优选的， 所述转化液后处理的方法如下 ： 反应结束后， 将转化液离心， 去除菌体 细胞， 取上清液用等体积乙酸乙酯萃取， 取有机层用无水 Na2SO4脱水、 过滤， 滤液即为含 (S)-CHBE 的粗品， 将粗品分离纯。
25、化， 即得 (S)-CHBE。所述粗品分离纯化采用本领域公知的 技术进行， 通常为旋转蒸发和减压蒸馏。 0035 进一步， 所述转化体系a或转化体系b均是由蒸馏水、 磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓 冲液形成的 pH4.0 9.0 的反应体系。 0036 本发明的有益效果主要体现在 ： 提供了一种不对称还原制备 (S)-CHBE 的新菌株， 通过该菌株可制备阿托伐他汀的重要手性中间体(S)-CHBE， 该菌株稳定性好， 立体选 择性严格， 产物光学纯度高， 用于制备 (S)-CHBE 具有反应条件温和、 环境友好等优点， 具有 说 明 书 CN 103589665 A 6 5/6 页 7 较高的工业化。
26、应用潜力。 （四） 具体实施方式 0037 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0038 实施例 1 ： 菌株的筛选 0039 羰基还原酶产生菌的分离 ： 在9mL0.85%的生理盐水中加入1g土样， 在涡流振荡器 上充分混匀， 使成均匀的土壤悬液 ； 吸取 1.0mL 的土壤悬液接种于装有 39mL 富集培养基的 250mL 的三角瓶中， 置于 28， 150rmp 的摇床培养 72h， 等富集液出现浑浊后， 再吸取 1.0mL 转接到新鲜的富集培养基中， 继续培养 72h ； 如此进行三轮富集， 将富集培养液稀释多个梯 度后涂布到分离平板上， 。
27、获得单菌落 ； 0040 富集培养基组成如下 （终浓度） ： 葡萄糖 8g/L， 蛋白胨 5g/L， 酵母膏 5g/L， 牛肉膏 4g/L， NaCl4g/L， 以蒸馏水配制， 用 1.0mol 的盐酸或 NaOH 溶液调节 pH 至 7.0 ； 分离平板培 养基为前述富集培养基中加入 15g/L 的琼脂， 115灭菌 30min 后， 倒平板。 0041 挑取的单菌落接种到发酵培养基， 组成如下 （终浓度） ： 葡萄糖 40g/L， 酵母膏 20g/ L， 蛋白胨10g/L， 牛肉膏5g/L， MgSO4 7H2O0.5g/L， NaCl4g/L， K2HPO40.5g/L， pH7.0 （。
28、115下， 灭菌30min） 。 28下， 摇瓶转速150rmp， 培养24h， 离心后取菌体悬浮于磷酸缓冲液体系中， 加入COBE作为底物， 进行转化12h。 转化液经离心分离去除菌体细胞， 上清液通过乙酸乙酯 萃取、 无水Na2SO4脱水、 过滤， 采用气相色谱检测分析， 能将底物COBE转化生成(S)-CHBE的 菌株为目的菌株， 最终从中选择出一株立体选择性最高的菌株 （编号为ZJB-12028， 即CCTCC No ： M2013390） 做后续的菌种鉴定及转化。 0042 实施例 2 ： Rhodococcus qingshengii ZJB-12028 的发酵培养 0043 (1。
29、) 斜面培养 ： 将 Rhodococcus qingshengii ZJB-12028 接种于斜面培养基， 于 28下培养 24 小时， 获得斜面菌体。斜面培养基配方 ： 葡萄糖 8g/L， 蛋白胨 5g/L， 酵母膏 5g/L， 牛肉膏 4g/L， NaCl4g/L， 琼脂 20g/L， 以蒸馏水配制， 自然 pH。 0044 (2) 种子培养 ： 用接种环从斜面菌体挑取一环菌体接种于种子培养基， 28， 150r/min条件下培养24小时， 获得种子液。 种子培养基的配方为 ： 葡萄糖8g/L， 酵母膏5g/ L， 蛋白胨 5g/L， 牛肉膏 4g/L， NaCl4g/L， 蒸馏水配制，。
30、 初始 pH 为 6.0。 0045 (3)发酵培养 ： 将培养好的种子液按照2%的体积比接种到发酵培养基中， 在28、 摇床转数 150r/min 条件下培养 24 小时， 获得含菌细胞发酵液。将获得的含菌细胞发酵液 离心， 弃去上清液， 生理盐水洗涤两次后， 离心收集获得湿菌体， 菌体的产量为 8.7g/L（干 重计） 。发酵培养基的配方为 ： 葡萄糖 10g/L， 酵母膏 10g/L， 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 5g/L， MgSO47H2O0.5g/L， NaCl4g/L， K2HPO40.5g/L， 溶剂为水， 初始 pH 为 6.0。 0046 实施例 3 ： Rhodococ。
31、cus qingshengii ZJB-12028 的发酵培养 0047 发酵培养 ： 将按实施例步骤 （1） （2） 培养好的种子液按照 2% 的体积比接种到发 酵培养基中， 在 30、 摇床转数 150r/min 条件下培养 24 小时， 获得含菌细胞发酵液。将获 得的含菌细胞发酵液离心， 弃去上清液， 生理盐水洗涤两次后， 离心收集获得湿菌体， 菌体 的产量为 11.3g/L（干重计） 。发酵培养基的配方为 ： 葡萄糖 40g/L， 酵母膏 20g/L， 蛋白胨 10g/L， 牛肉膏 5g/L， MgSO4 7H2O0.5g/L， NaCl4g/L， K2HPO40.5g/L， 溶剂为水。
32、， 初始 pH 为 7.0。 说 明 书 CN 103589665 A 7 6/6 页 8 0048 实施例 4 ： Rhodococcus qingshengii ZJB-12028 生物催化制备 (S)-CHBE 0049 发酵培养获得湿菌体， 过程如实施例 2。 0050 在转化瓶中加入 10mL 磷酸钠缓冲液 （pH7.0， 0.1M） ， 其中含有湿菌体 0.5g， 底物 COBE40mmol/L， 在28恒温水浴搅拌反应4小时。 反应结束后， 转化液经离心分离去除菌体 细胞， 上清液用等体积乙酸乙酯萃取， 有机层用无水 Na2SO4脱水、 过滤后气相色谱分析。产 物 (S)-CHB。
33、E 光学纯度 99%， 转化率为 23%。 0051 实施例 5 ： Rhodococcus qingshengii ZJB-12028 生物催化制备 (S)-CHBE 0052 发酵培养获得湿菌体， 过程如实施例 2。 0053 在转化瓶中加入 10mL 柠檬酸钠缓冲液 （pH6.0， 0.1M） ， 其中含有湿菌体 1.0g， 底物 COBE40mmol/L， 辅助底物葡萄糖为35g/L， 在30恒温水浴搅拌反应2小时。 反应结束后， 转 化液经离心分离去除菌体细胞， 上清液用等体积乙酸乙酯萃取， 有机层用无水 Na2SO4脱水、 过滤后气相色谱分析。产物 (S)-CHBE 光学纯度 99。
34、%， 转化率为 78%。 0054 实施例 6 ： Rhodococcus qingshengii ZJB-12028 生物催化制备 (S)-CHBE 0055 发酵培养获得湿菌体， 过程如实施例 3。 0056 在转化瓶中加入 10mL 磷酸钠缓冲液 （pH7.0， 0.1M） ， 其中含有湿菌体 0.5g， 底物 COBE40mmol/L， 辅助底物葡萄糖为35g/L， 在35恒温水浴搅拌反应2小时。 反应结束后， 转 化液经离心分离去除菌体细胞， 上清液用等体积乙酸乙酯萃取， 有机层用无水 Na2SO4脱水、 过滤后气相色谱分析。产物 (S)-CHBE 光学纯度 99%， 转化率为 45。
35、%。 0057 实施例 7 ： Rhodococcus qingshengii ZJB-12028 生物催化制备 (S)-CHBE 0058 湿菌体的制备同实施例 3。 0059 在转化瓶中加入 10mL 磷酸钠缓冲液 （pH7.5， 0.1M） ， 其中含有湿菌体 0.5g， 底物 COBE80mmol， 辅助底物葡萄糖为 35g/L， 在 30恒温水浴搅拌反应 2 小时。反应结束后， 转 化液经离心分离去除菌体细胞， 上清液用等体积乙酸乙酯萃取， 有机层用无水 Na2SO4脱水、 过滤后气相色谱分析。产物 (S)-CHBE 光学纯度 99%， 转化率为 48%。 0060 实施例 8 ： 。
36、Rhodococcus qingshengii ZJB-12028 生物催化制备 (S)-CHBE 0061 湿菌体的制备同实施例 3。在转化瓶中加入 10mL 磷酸钠缓冲液 （pH7.5， 0.1M） ， 其 中含有湿菌体 1.0g， 底物 COBE60mmol， 辅助底物果糖为 40g/L， 在 30恒温水浴搅拌反应 2 小时。反应结束后， 转化液经离心分离去除菌体细胞， 上清液用等体积乙酸乙酯萃取， 有机 层用无水 Na2SO4脱水、 过滤后气相色谱分析。产物 (S)-CHBE 光学纯度 99%， 转化率为 58%。 0062 实施例 9 ： Rhodococcus qingshengi。
37、i ZJB-12028 生物催化制备 (S)-CHBE 0063 湿菌体的制备同实施例 3。在转化瓶中加入 100mL 磷酸钠缓冲液 （pH7.5， 0.1M） ， 其中含有湿菌体 10g， 底物 COBE40mmol/L， 辅助底物葡萄糖为 40g/L， 在 30恒温水浴搅拌 反应 4 小时。反应结束后， 转化液在 8000rpm 离心 5 分钟， 有机层用无水 Na2SO4脱水、 过滤 后气相色谱分析。产物 (S)-CHBE 光学纯度 99%， 转化率为 82%。 说 明 书 CN 103589665 A 8 1/2 页 9 0001 序 列 表 CN 103589665 A 9 2/2 页 10 0002 序 列 表 CN 103589665 A 10 。