一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方法、引物及其应用和试剂盒.pdf

《一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方法、引物及其应用和试剂盒.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方法、引物及其应用和试剂盒.pdf（15页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710356722.4 (22)申请日 2017.05.19 (71)申请人 河南大学 地址 475000 河南省开封市顺河回族区明 伦街85号 (72)发明人 万绍贵鲍登克杨琪 (74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理 事务所(普通合伙) 11371 代理人 李双艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合 征病毒的。

2、ddPCR方法、 引物及其应用和试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种用于绝对定量检测猪繁 殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方法、 引物及其应 用和试剂盒， 涉及生物检测技术领域。 本发明公 开的ddPCR方法将含有SEQIDNO:1所示的正向 引物和SEQIDNO:2所示的反向引物的PCR预混 液形成微滴， 并进行ddPCR。 本发明基于染料法， 可以实现对猪繁殖与呼吸综合征病毒的绝对定 量检测， 其具有特异性好、 灵敏度高、 操作简便等 特点。 权利要求书1页 说明书9页 序列表1页 附图3页 CN 107267664 A 2017.10.20 CN 107267664 A 1.一种用于绝对。

3、定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方法， 其特征在于， 其包 括： 将PCR预混液形成微滴， 并进行ddPCR反应； 其中， 所述PCR预混液含有SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引 物。 2.根据权利要求1所述的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方法， 其 特征在于， 所述正向引物和所述反向引物在所述PCR预混液中的浓度均为120-130nM。 3.根据权利要求2所述的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方法， 其 特征在于， 所述正向引物和所述反向引物在所述PCR预混液中的浓度均为124-126nM。 4.根据权利要。

4、求1-3中任一项所述的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的 ddPCR方法， 其特征在于， 所述ddPCR反应的退火温度为52-60。 5.根据权利要求1-3中任一项所述的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的 ddPCR方法， 其特征在于， 所述ddPCR反应的反应程序为： 94-96预变性4-6分钟； 94-96变 性8-10秒钟， 54-56退火28-32秒钟， 70-74延伸28-32秒钟， 共38-42个循环； 70-74总 延伸4-6分钟； 96-99， 8-12分钟。 6.一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物， 其特征在于， 其包括SEQ ID NO:1所示的正。

5、向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。 7.权利要求6所述的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物在猪繁殖与呼 吸综合征病毒的绝对定量检测中的应用。 8.权利要求6所述的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物在猪繁殖与呼 吸综合征病毒的早期诊断和/或防疫中的应用。 9.一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒， 其特征在于， 其包括权 利要求6所述的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物。 10.根据权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括： ddPCR Supermix、 ddH2O、 阳性标准品和微滴生成油中的一种或多种。 权利要求书 1。

6、/1 页 2 CN 107267664 A 2 一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方 法、 引物及其应用和试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及生物检测技术领域， 具体而言， 涉及一种用于绝对定量检测猪繁殖与 呼吸综合征病毒的ddPCR方法、 引物及其应用和试剂盒。 背景技术 0002 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus， PRRSV)感染可以引起猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)。 PRRS的。

7、主要特征症状是引起母猪的繁殖障碍(包括怀孕母 猪的流产， 产死胎、 木乃伊胎和弱仔等)及各个年龄段猪的间质性肺炎性呼吸障碍等。 该病 最早是1987年发现于美国， 1995年首次在我国出现， 此后在全国大部分省市蔓延， 目前已成 为危害我国养猪业的最重要传染病之一， 给我国养猪业造成了严重的经济损失。 特别是 2006年爆发的由Nsp2基因部分缺失的高致病性PRRSV变异株(Highly pathogenic PRRSV， HP-PRRSV)感染引起的以高热、 高发病率和高死亡率为特征的 “无名高热” ， 更是给我国养猪 业造成了十分惨重的损失。 及时、 准确地诊断该病， 是采取有效防控措施、。

8、 减少经济损失的 基础。 国际上根据PRRSV的分离地、 抗原性、 致病性和基因组的差异将PRRSV分为美洲型和欧 洲型， 而我国主要流行的为美洲型毒株。 目前， 我国流行的PRRSV又包括经典美洲株和高致 病性美洲株。 另外， PRRSV的病毒含量可以反应猪群的整体感染状况。 因此临床上急需一种 能够快速定量检测PRRSV的方法。 0003 传统的检测PRRSV的方法包括病毒的分离与鉴定、 病毒中和试验(virus neutralization test， VNT)、 免疫过氧化物酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay， IPMA)、 间接免疫荧光抗体实。

9、验(indirect immunofluorescent antibody test， IFA)、 免疫组织化学技术(immunohistochemistry， IHC)、 酶联免疫吸附实验(enzyme- l i n k ed i m m u n o s o r be n t a s sa y ， E L I S A) 及 胶体 金免 疫 层析 技 术 (g o ld immunochromatography assay， GICA)等。 这些方法基本都非常耗时耗力而且敏感性较低， 不太适合临床上大批样本的检测。 随后发展起来的反转录PCR(reverse transcriptase pol。

10、ymerase chain reaction， RT-PCR)和荧光定量PCR(Real time RT-PCR)等分子生物学 技术与传统方法相比具有特异性强、 灵敏性高、 检测时间短及重复性好等优点。 但是这些方 法均是对病毒的定性或半定量检测， 而且实验结果判断依赖于检测人员丰富的经验， 在特 异性和敏感性上依旧存在一定局限性， 容易出现假阴性和假阳性结果。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR 方法。 0005 本发明的另一目的在于提供一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的 引物。 说明书 1/9 页 3 CN 107267。

11、664 A 3 0006 本发明的另一目的在于提供上述引物在猪繁殖与呼吸综合征病毒的绝对定量检 测中的应用。 0007 本发明的另一目的在于提供上述引物在猪繁殖与呼吸综合征病毒的早期诊断和/ 或防疫中的应用。 0008 本发明的另一目的在于提供一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的 试剂盒。 0009 本发明是这样实现的： 0010 一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方法， 其包括： 0011 将PCR预混液形成微滴， 并进行ddPCR反应； 0012 其中， 上述PCR预混液含有SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反 向引物。 0013。

12、 一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物， 其包括SEQ ID NO:1所 示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。 0014 上述用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物在猪繁殖与呼吸综合征 病毒的绝对定量检测中的应用。 0015 上述用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物在猪繁殖与呼吸综合征 病毒的早期诊断和/或防疫中的应用。 0016 一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒， 其包括上述用于绝对 定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物。 0017 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 0018 本发明提供的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。

13、的ddPCR方法， 其采用 SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物并基于染料法ddPCR技术对 PRRSV进行绝对定量检测， 其检测的灵敏度高于荧光定量PCR技术(10倍)； 而且本发明提供 的ddPCR方法可直接定量， 不用设置标准曲线， 根据检测结果可以直接确定待测样本中 PRRSV病毒的拷贝数， 极大的简化了操作步骤， 而且特异性好、 灵敏度高(最低可检测10个病 毒拷贝数)。 在临床上可以更加快速、 准确的实现对PRRSV感染的诊断， 同时还能对PRRSV病 毒含量进行绝对定量， 有利于进一步合理制定猪场的防控治疗措施。 附图说明 0019 为了更清。

14、楚地说明本发明实施例的技术方案， 下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍， 应当理解， 以下附图仅示出了本发明的某些实施例， 因此不应被看作是对 范围的限定， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这 些附图获得其他相关的附图。 0020 图1为本发明实施例4提供的ddPCR最佳退火温度的优化结果； 0021 图2为本发明实施例4提供的不同退火温度下每 L反应体系中阳性微滴数和每个 反应管中的总微滴数； 0022 图3为本发明实施例5提供的ddPCR最适引物浓度的优化结果； 0023 图4为本发明实施例6提供的ddPCR特异性检测的分析结果； 0024 。

15、图5为本发明实施例7提供的采用qRT-PCR检测PRRSV的标准曲线； 说明书 2/9 页 4 CN 107267664 A 4 0025 图6为本发明实施例7提供的qRT-PCR和ddPCR检测结果的相关性分析。 具体实施方式 0026 为使本发明实施例的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、 完整地描述。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造商建 议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市售购买获得的常规产 品。 0027 下面对本发明实施例的一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR 方法、 引物及其应用。

16、和试剂盒进行具体说明。 0028 微滴式数字化PCR(droplet digital PCR， ddPCR)是近年来发展起来的新一代PCR 技术， 其原理是通过无限稀释形成油包水的微滴， 从而将PCR反应分配至20000个纳升级别 的微滴中进行。 PCR反应结束后， 通过微滴分析仪检测每个微滴的荧光信号， 含有荧光信号 的微滴判为1， 没有荧光信号的微滴判读为0， 最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例， 计算得出靶分子的起始拷贝数。 与传统的定量PCR相比， ddPCR不需要建立标准曲线就能实 现靶分子的绝对定量检测， 而且具有特异性强、 灵敏度高(最低可检测单拷贝的靶分子)、 定 量准确等。

17、优点。 ddPCR已逐渐成为分子生物学研究中的重要工具， 并已经应用于产前诊断、 癌症早期诊断和多种疫病的定量检测等领域。 将ddPCR技术用于PRRSV的检测， 在临床上可 以更加快速、 准确的实现对PRRSV感染的诊断， 同时还能对PRRSV病毒含量进行绝对定量， 有 利于进一步合理制定猪场的防控治疗措施。 0029 一方面， 本发明提供了用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方法， 其包括以下步骤： 0030 (1)待测样品病毒RNA的提取及cDNA的合成 0031 上述待测样品可以为组织病料或临床血液样本、 也可以是病毒的细胞培养物。 0032 例如， 在本发明的一些实施方。

18、案中， 上述待测样品为病毒的细胞培养物， 例如为 PRRSV经典株BJ-4和PRRSV高致病性毒株HN07-1的Marc-145的细胞培养物。 0033 当上述待检样品为组织病料或细胞培养物时， 上述 “待测样品病毒RNA的提取” 可 为： 将上述待测样品进行研磨匀浆(细胞培养物不需要此过程)， 反复冻融3次； 将上述待测 样品于4离心机， 12000g离心5min； 抽取离心上清液， 采用商品化病毒RNA提取试剂盒进行 RNA提取， 同时利用反转录试剂盒进行cDNA的合成。 0034 当上述待测样品为血液或组织液等液体样品时， 上述 “待测样品病毒RNA的提取” 可为： 将上述待测样品室温静。

19、置1个小时后， 吸取上清于4离心机， 5000g离心5min； 抽取离 心上清液， 采用商品化病毒RNA提取试剂盒进行RNA提取， 同时利用反转录试剂盒进行cDNA 的合成。 0035 需要说明的， 在其他的实施例中， 也可以直接采用已经合成好的cDNA样品进行后 续的ddPCR反应， 本步骤为可选步骤， 可根据实际情况进行选择。 0036 (2)配置PCR预混液， 将PCR预混液形成微滴， 并进行ddPCR反应 0037 例如， 在本发明的一些实施方案中， 将PCR预混液加入至微滴发生卡中， 用微滴生 产油包裹PCR预混液， 制备出微滴， 然后将微滴转入96孔PCR板， 热封后于PCR仪中进。

20、行ddPCR 扩增反应。 说明书 3/9 页 5 CN 107267664 A 5 0038 其中， 上述PCR预混液含有SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反 向引物。 0039 进一步地， 在本发明的一些实施方案中， 上述正向引物和上述反向引物在上述PCR 预混液中的浓度均为120-130nM。 0040 优选地， 在本发明的一些实施方案中， 上述正向引物和上述反向引物在上述PCR预 混液中的浓度均为124-126nM。 更优选地， 上述正向引物和上述反向引物在上述PCR预混液 中的浓度均为125nM 0041 控制引物在合适的浓度范围内可降低反应体系中的本底。

21、信号， 有利于提高检测结 果的准确性。 将正向引物和反向引物在PCR预混液中的浓度控制为125nM， 可以使得ddPCR反 应体系中基础荧光值最低， 使得检测结果可读性强、 准确性高。 0042 需要说明的是， 上述PCR预混液还含有待测样品的cDNA模板以及ddPCR Supermix (含有荧光染料， 例如EvaGreen、 SYBR Green等可嵌入双链DNA的荧光染料)。 0043 优选地， 在本发明的一些实施方案中， PCR预混液由按如下成分比例配制得到： 2 EvaGreen ddPCR Supermix 10 L， 正向引物和反向引物各125nM， 待测样品的cDNA模板(模 。

22、板用量大于0ng， 小于200ng)， 补灭菌水至总体积20 L。 0044 当然， PCR预混液的体积可根据实际情况设置， 可以是10 L、 50 L、 100 L或者200 L 等， 其均属于本发明的保护范围。 0045 优选地， 在本发明的一些实施方案中， 上述ddPCR反应的退火温度为52-60； 更优 选地， 在本发明的一些实施方案中， 上述ddPCR反应的退火温度为54-56。 再优选地， 在本 发明的一些实施方案中， 上述ddPCR反应的退火温度为55。 0046 进一步地， 在本发明的一些实施方案中， 上述ddPCR反应的反应程序为： 94-96预 变性4-6分钟； 94-96。

23、变性8-10秒钟， 54-56退火28-32秒钟， 70-74延伸28-32秒钟， 共 38-42个循环； 70-74总延伸4-6分钟； 96-99， 8-12分钟。 0047 进一步地， 在本发明的一些实施方案中， 上述ddPCR反应的反应程序为： 95预变 性5分钟； 95变性10秒钟， 54-56退火30秒钟， 72延伸30秒钟， 共40个循环； 72总延伸 5分钟； 9810分钟， 结束反应。 0048 再进一步地， 在本发明的一些实施方案中， 上述ddPCR反应的反应程序为： 95预 变性5分钟； 95变性10秒钟， 55退火30秒钟， 72延伸30秒钟， 共40个循环； 72总延伸。

24、5 分钟； 9810分钟， 结束反应。 0049 (3)将扩增后的微滴放入微滴分析仪中， 用软件(例如QuantaSoft软件)进行检测 分析 0050 在本发明的一些实施方案中， 可以利用QuantaSoft软件进行数据分析， 计算样品 中病毒RNA的拷贝数。 0051 待测样本检测结果的判定方法为： 0052 (1)阳性： 标本检测结果1个拷贝； 0053 (2)阴性： 标本检测结果1拷贝。 0054 综上， 本发明提供的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方法， 基 于染料法数字PCR， 采用SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物并结 合。

25、ddPCR技术对PRRSV进行绝对定量检测， 其检测的灵敏度略高于荧光定量PCR技术(10倍)； 说明书 4/9 页 6 CN 107267664 A 6 而且本方法可直接定量， 不用设置标准曲线， 根据检测结果可以直接确定待测样本中PRRSV 病毒的拷贝数， 极大的简化了操作步骤， 而且特异性好、 灵敏度高(最低可检测10个病毒拷 贝数)。 在临床上可以更加快速、 准确的实现对PRRSV感染的诊断， 同时还能对PRRSV病毒含 量进行绝对定量， 有利于进一步合理制定猪场的防控治疗措施。 0055 另一方面， 本发明提供了一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引 物， 其包括SEQ ID。

26、 NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。 0056 另一方面， 本发明提供了上述用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物 在猪繁殖与呼吸综合征病毒的绝对定量检测中的应用。 0057 另一方面， 本发明提供了上述用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物 在猪繁殖与呼吸综合征病毒的早期诊断和/或防疫中的应用。 0058 本发明提供的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物具有特异性好、 灵敏度高的特点， 可应用于ddPCR平台对猪繁殖与呼吸综合征病毒进行定量检测， 以及用于 对猪繁殖与呼吸综合征病毒的早期诊断和/或防疫。 此外， 将该引物用于疫苗生产质量控制 中。

27、也属于本发明的保护范围； 另外， 本发明提供的引物也可以用于普通PCR平台进行猪繁殖 与呼吸综合征病毒的相关检测。 0059 另一方面， 本发明提供了一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂 盒， 其包括上述用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物。 0060 进一步地， 上述试剂盒还包括： ddPCR Supermix、 ddH2O、 猪繁殖与呼吸综合征病毒 cDNA阳性标准品和微滴生成油中的一种或多种。 0061 本发明提供的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒可以结合 ddPCR技术或普通PCR技术简单、 方便地对猪繁殖与呼吸综合征病毒进行定量检测， 且具有 特异性。

28、好、 灵敏度高的特点。 0062 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。 0063 (1)主要仪器 0064 CFX96荧光定量PCR仪、 C1000梯度PCR扩增仪、 QX200微滴数字PCR仪、 DG8cartridge、 微滴生成仪、 PX1热封仪均为Bio-Rad公司。 NanoDrop 2000超微量分光光度 计为Thermo Fisher Scientific公司。 高速冷冻离心机； 常温离心机为Eppendorf公司。 0065 (2)材料和试剂 0066 TRIzol购于Invitrogen公司。 反转录试剂盒、 病毒RNA/DNA提取试剂盒、 SYBR RT-。

29、 PCR试剂盒均购于大连TaKaRa公司。 EvaGreen ddPCR Supermix、 Droplet generation oil for EvaGreen购于Bio-Rad公司。 0067 实施例1 0068 本实施例提供了一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方法， 其包括以下步骤： 0069 1.1待测样品病毒RNA的提取及cDNA的合成 0070 待测样品可以为组织病料或临床血液样本、 也可以是病毒的细胞培养物。 0071 当上述待检样品为组织病料或细胞培养物时， 可参考如下方法提取病毒RNA： 将待 测样品进行研磨匀浆(细胞培养物不需要此过程)， 反复冻融3次。

30、。 将待测样品于4离心机， 12000g离心5min。 抽取离心上清液， 采用商品化病毒RNA提取试剂盒进行RNA提取， 同时利用 说明书 5/9 页 7 CN 107267664 A 7 反转录试剂盒进行cDNA的合成。 0072 当上述待测样品为血液或组织液等液体样品时， 可参考如下方法提取病毒RNA： 将 待测样品室温静置1个小时后， 吸取上清于4离心机， 5000g离心5min。 抽取离心上清液， 采 用商品化病毒RNA提取试剂盒进行RNA提取， 同时利用反转录试剂盒进行cDNA的合成。 0073 1.2配置PCR预混液， 将PCR预混液形成微滴， 并进行ddPCR反应 0074 1.。

31、2.1 20 L的PCR预混液包括： 2EvaGreen ddPCR Supermix10 L， 正向引物(碱 基序列如SEQ ID NO:1所示)和反向引物(碱基序列如SEQ ID NO:2所示)各125nM， 待测样品 的cDNA模板(含量大于0ng， 小于200ng)， 补灭菌水至总体积20 L。 但需要说明的是， 在其他 的实施例中， 各引物的浓度可以是120、 122、 124、 126、 128、 130nM中的任意一种， 只要在120- 130nM的范围内即可。 0075 1.2.2将PCR预混液加入至微滴发生卡中制备微滴， 然后将微滴转入96孔PCR板， 热 封后于PCR仪中进。

32、行ddPCR扩增反应。 0076 1.2.3 ddPCR反应的反应程序为： 95预变性5分钟； 95变性10秒钟， 55退火30 秒钟， 72延伸30秒钟， 共40个循环； 72总延伸5分钟； 9810分钟， 结束反应。 但需要说明 的是， 在其他的实施例中， 退火温度也可以是52、 52.5、 53.6、 57.1、 58.7、 59.6 以及60中的任意一种， 只要在52-60的范围即可。 0077 1.3将扩增后的微滴放入微滴分析仪中， 进行检测分析 0078 利用QuantaSoft软件进行数据分析， 计算样品中病毒RNA的拷贝数。 待测样本检测 结果的判定方法为： 0079 (1)阳。

33、性： 标本检测结果1个拷贝； (2)阴性： 标本检测结果1拷贝。 0080 实施例2 0081 本实施例的提供了一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物， 其包 括其包括SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。 该引物针对美洲型 猪繁殖与呼吸综合征病毒设计， 适用于在ddPCR技术平台上定量检测猪繁殖与呼吸综合征 病毒。 0082 本发明实施例提供的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物具有特 异性好、 灵敏度高的特点， 可应用于ddPCR平台对猪繁殖与呼吸综合征病毒进行定量检测， 以及用于对猪繁殖与呼吸综合征病毒的早期诊断和/或防疫。 008。

34、3 实施例3 0084 本实施例提供了一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒， 其包 括实施例5所述的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物。 0085 需要说明的是， 在其他的实施例中， 该试剂盒还可包括： ddPCR Supermix(含ddPCR 反应缓冲液、 dNTPs、 Taq酶、 荧光染料)、 ddH2O、 阳性标准品(含猪繁殖与呼吸综合征病毒 cDNA的质粒)和微滴生成油中的一种或多种。 0086 本发明实施例提供的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒可以 结合ddPCR技术或普通PCR技术简单、 方便地对猪繁殖与呼吸综合征病毒进行定量检测， 且 具有。

35、特异性好、 灵敏度高的特点。 0087 实施例4 0088 在ddPCR平台上优化PRRSV PCR反应的最佳退火温度。 说明书 6/9 页 8 CN 107267664 A 8 0089 (1)在ddPCR平台上配制如下ddPCR预混液： 2EvaGreen ddPCR Supermix 10 L， 正向引物(SEQ ID NO:1)和反向引物(SEQ ID NO:2)各200nM， 阳性质粒(105/ L， 含猪繁殖 与呼吸综合征病毒cDNA序列)1 L， 补灭菌水至总体积20 L。 共做8个重复孔。 0090 (2)在DG8cartridge上加入Droplet generation o。

36、il for EvaGreen(微滴生产 油)70 L； 然后利用微滴生成仪生成微滴； 将生成的微滴缓慢转入96孔板相应位置， 并用PX1 热封仪于180封膜5s。 0091 (3)将封好膜的96孔板转入C1000梯度PCR扩增仪中进行PCR扩增。 反应程序为： 95 预变性5分钟； 95变性10秒钟， 52-60(仪器自动分布8个温度梯度)退火30秒钟， 72 延伸30秒钟， 共40个循环； 72总延伸5分钟； 9810分钟结束反应。 0092 (4)PCR扩增结束后将96孔板放入QX200微滴数字PCR仪的微滴荧光检测仪进行荧 光检测， 根据每管反应体系中阳性荧光微滴的数量和阳性微滴与阴性。

37、微滴之间的差异确定 最佳退火温度。 结果如图1和图2所示(图中： 蓝色代表阳性微滴(positive)， 灰色代表阴性 微滴(negative)。 0093 图1和图2的结果显示， 在各个退火温度(52、 52.5、 53.6、 55.2、 57.1、 58.7、 59.6、 60)下均能产生大于10000的总微滴数， 符合分析要求。 虽然各个退火温 度下阳性微滴与阴性之间的差异相差不大， 但是在退火温度为55.2时的阳性微滴数明显 高于其他温度(如图2所示)， 由此确定采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行 ddPCR反应最佳的退火温度为55。 0094 实施例5 。

38、0095 在ddPCR平台上优化PRRSV PCR反应的最适引物浓度。 0096 为了进一步优化PCR反应的最适引物浓度， 在ddPCR平台上配制如下反应混合液： 2 EvaGreen ddPCR Supermix 10 L， 正向引物(SEQ ID NO:1)和反向引物(SEQ ID NO:2)各 (500nM、 250nM、 125nM)， 阳性质粒(104/ L)1 L， 补灭菌水至总体积20 L。 同一反应体系中， 正反向引物浓度相同。 0097 同时做相应无模板的空白对照(NTC)， 检验阴性微滴基础荧光值及反应体系的污 染情况。 根据每管反应体系阳性微滴与阴性微滴之间的差异及无模板。

39、阴性微滴的基础荧光 值确定最适引物浓度。 结果如3所示。 0098 图3的结果显示， 在三种引物浓度条件下阳性微滴数基本一致， 而在引物浓度为 125nM时阳性微滴与阴性微滴之间的差异最大， 且无模板阴性微滴的基础荧光值最低， 因此 确定各引物的最适浓度为125nM， 此时具有更低的本底信号， 有利于提高检测结果的准确 性。 0099 实施例6 0100 特异性检测 0101 为了验证实施例1提供的ddPCR方法在检测PRRSV中的特异性， 利用PRRSV的HN07-1 和BJ-4作为阳性模板， 用其他几种猪场中常见的病毒(CSFV、 PCV2、 PRV)的DNA或者反转录的 cDNA为模板进。

40、行检测， 同时用PRRSV阴性模板和无模板对照来检测实施例1提供的ddPCR方 法的特异性。 结果如图4所示(图中： HN07-1代表HP-PRRSV， BJ-4代表经典PRRSV， PRRSV-代表 PRRSV阴性临床样本； CSFV+为猪瘟病毒、 PCV2+为猪圆环病毒II型、 PRV+为猪伪狂犬病毒； NTC为无模板对照)。 说明书 7/9 页 9 CN 107267664 A 9 0102 图4的结果显示， 只有在PRRSV的HN07-1和BJ-4阳性组产生了阳性微滴， 在其他病 毒阳性组(CSFV+、 PCV2+、 PRV+)， PRRSV阴性组(PRRSV-)和无模板对照组(NTC。

41、)均无阳性微滴 产生， 表明本发明实施例1提供的ddPCR方法具有较好的特异性， 可对PRRSV进行特异性检 测。 0103 实施例7 0104 灵敏度检测 0105 利用qRT-PCR和ddPCR分析不同PRRSV的拷贝数 0106 为了验证实施例1提供的ddPCR方法在检测PRRSV中的灵敏度， 利用实时荧光PCR技 术， 采用标准曲线方法， 对不同拷贝数的PRRSV进行相对定量。 同时利用实施例1提供的 ddPCR方法检测相同的PRRSV模板。 分别计算样品中PRRSV拷贝数。 结果图5(图中： A为BJ-4的 标准曲线， B为HN07-1的标准曲线)和表1所示。 0107 图5的结果显。

42、示， 采用qRT-PCR方法在102106copies/ L拷贝数范围内能达到较高 的扩增效率并呈现较好的线性(BJ-4的R20.9971， HN07-1的R20.9997)， 但在拷贝数低于 10copies/ L的PRRSV时， Cq值大于40(如表1)， 结果准确度降低。 0108 但是实施例1提供的ddPCR方法在低拷贝数(HN07-1为2.6101copies/ L， BJ-4为 10copies/ L)时仍能较好的检测出PRRSV， 且空白对照和阴性对照均未有阳性微滴(如表 1)， 说明实施例1提供的ddPCR方法具有较高的灵敏度， 比qRT-PCR方法高10倍。 0109 表1 。

43、0110 0111 对PRRSV的qRT-PCR和ddPCR结果进行相关性分析， 发现两者呈线性相关， 如图6所 示(图中： A为qRT-PCR和ddPCR检测BJ-4的相关性分析， B为qRT-PCR和ddPCR检测HN07-1的相 关性分析)， BJ-4和HN07-1的相关系数分别为0.99和0.982。 0112 以上检测结果证明了本发明的提供的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病 毒的ddPCR方法和引物(包括SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物) 说明书 8/9 页 10 CN 107267664 A 10 特异性好、 灵敏度高、 可直接定量PR。

44、RSV病毒拷贝数， 检测结果准确可靠。 0113 综上， 本发明实施例提供的用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR 方法、 引物和试剂盒， 其采用SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物 并基于染料法微滴式数字PCR技术对PRRSV进行绝对定量检测， 其检测的灵敏度高于荧光定 量PCR技术(10倍)； 此外， 本发明实施例提供的ddPCR方法可直接定量， 不用设置标准曲线， 根据检测结果可以直接确定待测样本中PRRSV病毒的拷贝数， 极大的简化了操作步骤， 而且 特异性好、 灵敏度高(最低可检测10个病毒拷贝数)。 在临床上可以更加快速、 准确的实。

45、现对 PRRSV感染的诊断， 可应用于在猪繁殖与呼吸综合征病毒的早期诊断、 防疫、 疫苗质量控制 等领域中， 同时还能对PRRSV病毒含量进行绝对定量， 有利于进一步合理制定猪场的防控治 疗措施。 0114 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 9/9 页 11 CN 107267664 A 11 SEQUENCE LISTING 河南大学 一种用于绝对定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ddPCR方法、 引物及其应 用和试剂盒 2 PatentIn version 3.5 1 20 DNA 人工序列 1 aaccagtcca gaggcaaggg 20 2 20 DNA 人工序列 2 gcaaactaaa ctccacagtg 20 序列表 1/1 页 12 CN 107267664 A 12 图1 图2 说明书附图 1/3 页 13 CN 107267664 A 13 图3 图4 说明书附图 2/3 页 14 CN 107267664 A 14 图5 图6 说明书附图 3/3 页 15 CN 107267664 A 15 。