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1、10申请公布号CN102086468A43申请公布日20110608CN102086468ACN102086468A21申请号201010175420522申请日20100518C12Q1/25200601C07D471/04200601C07D401/0420060171申请人小江生物技术有限公司地址164300黑龙江省黑河市爱辉区瑷珲对俄进出口加工基地72发明人陈小江陈林李大伟楼慧强74专利代理机构北京中恒高博知识产权代理有限公司11249代理人夏晏平54发明名称一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物及其筛选方法57摘要本发明公开了一种预防和治疗人乳头瘤病毒HPV感染类疾病的化合物的。
2、筛选方法，该方法采用结构计算机辅助药物设计，以人乳头瘤病毒E1解旋酶结构为基础进行筛选，得到能抑制E1的候选化合物；上述筛选方法具有方便、省时、高效的特点；本发明还公开了利用上述筛选方法得到的化合物，如曲伐沙星及其衍生物、加替沙星及其衍生物，这些人乳头瘤病毒E1解旋酶的抑制剂具有特异性高、针对性强的特点，有助于预防和治疗人乳头状瘤病毒感染，以及和HPV感染有关的疾病，如子宫颈癌和生殖器疣等疾病。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图4页CN102086471A1/1页21一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物的筛选方法，其特征在于，采用。
3、结构计算机辅助药物设计方法，以人乳头瘤病毒E1解旋酶结构为基础进行筛选，得到能抑制E1的候选化合物。2根据权利要求1所述的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物的筛选方法，其特征在于，所述的以人乳头瘤病毒E1解旋酶结构为基础包括A一个由原子坐标确定下来的E1蛋白分子结构和由E1形成的六聚体的结构；B一个由原子坐标确定下来的E1蛋白分子与ATP或ADP相结合的复合体结构；C一个E1蛋白单独的结构或与一个化合物或多肽结合的复合体结构。3根据权利要求2所述的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病化合物的筛选方法，其特征在于，还包括进一步的E1解旋酶功能检测，所述E1解旋酶功能检测方法采用电泳迁移率试验。。
4、4一种利用权利要求3的筛选方法得到的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物，其特征在于，所述化合物为曲伐沙星及其衍生物。5一种利用权利要求3的筛选方法得到的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物，其特征在于，所述化合物为加替沙星及其衍生物。6根据权利要求4或5所述的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物，其特征在于，所述人乳头瘤病毒感染类疾病包括子宫颈癌或尖锐湿疣。权利要求书CN102086468ACN102086471A1/8页3一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物及其筛选方法技术领域0001本发明涉及治疗和预防人乳头瘤病毒感染和子宫颈癌相关的领域，尤其在设计和使用的E1解旋酶。
5、抑制剂，以预防或治疗HPV相关宫颈癌和其他疾病。背景技术0002子宫颈癌CERVICALCANCER是世界范围内仅次于乳腺癌的威胁妇女生命健康的第二号杀手国际卫生组织资料，每年造成约超过30万成年女性因患子宫颈癌而死亡。目前已证实导致宫颈癌的病因是人乳头瘤病毒HUMANPAPILLOMAVIRUS，简称HPV的DNA致癌病毒的侵染所致。该病毒主要通过两性接触传染，专性侵染人体上皮细胞特别是生殖器官，部分病毒携带者在反复感染后表现出多种临床症状。女性受高危险型HPV16、HPV18等病毒感染后，小部分患者由最初的宫颈细胞学异常，发展成IIII的宫颈内皮细胞瘤样变CINIIII和浸润性宫颈癌变IC。
6、C，最终发展成致命的子宫颈癌。0003HPV病毒在长期的进化中形成了上百种变异类型，其中HPV16、HPV18等13种高危险类型，已被确认能够导致宫颈癌症。部分低危险型HPV6、HPV11等病毒感染可导致男女两性生殖器官部位的尖锐湿疣。HPV除了直接导致宫颈癌，新的研究质料也提供了证据，HPV的感染很可能和支气管肺癌、直肠癌、口腔癌和皮肤癌等癌症有这紧密的关系。根据国际卫生组织WHO的有关资料，除了导致宫颈癌，HPV感染还可能和60的皮肤癌，60的食管癌，50的肺癌、50的乳腺癌、25的口腔癌等人类重大癌症的发病相关。0004目前国内外还没有任何有效的预防和治疗人乳头瘤病毒的化合物，主要是由于。
7、很难通过常规的手段如普遍撒网的大通量筛选等找到针对该病毒的具有特异性高的抑制剂化合物。而由于我们对人乳头瘤病侵染毒繁殖所必须的解旋酶的分子结构和分子机理的掌握和了解，我们可以通过对分子结构进行计算机的模拟和分析，并通过以结构为基础的分子对接用计算机对大分子库进行有效的筛选，从而能从几十万到上百万的分子库中很快的选出能结合目标蛋白的少数的化合物，从而通过试验筛选很快验证和确定具有对目标蛋白有高特异性的抑制功能的化合物。发明内容0005本发明的目的是针对现有技术中的上述缺陷，提出一种方便、省时、高效的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物的筛选方法，并提供了通过上述筛选方法筛选出来的特异性高、针。
8、对性强的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物，由其指出了其在预防和治疗HPV感染、子宫颈癌及尖锐湿疣等疾病上的应用。0006实现上述目的的技术方案如下0007一种预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物的筛选方法，采用结构计算机辅助药物设计方法，以人乳头瘤病毒E1解旋酶结构为基础进行筛选，得到能抑制E1的候选化合物。说明书CN102086468ACN102086471A2/8页40008进一步地，所述的以人乳头瘤病毒E1解旋酶结构为基础包括0009A一个由原子坐标确定下来的E1蛋白分子结构和由E1形成的六聚体的结构；0010B一个由原子坐标确定下来的E1蛋白分子与ATP或ADP相结合的复合。
9、体结构；0011C一个E1蛋白单独的结构或与一个化合物或多肽结合的复合体结构。0012进一步地，上述筛选方法还包括E1解旋酶功能检测，所述E1解旋酶功能检测方法采用电泳迁移率试验。0013本发明还提供了利用上述筛选方法得到的预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的化合物，所述化合物为曲伐沙星及其衍生物、加替沙星及其衍生物。0014进一步地，本发明所述的人乳头瘤病毒感染类疾病包括子宫颈癌或尖锐湿疣。0015即本发明主要是使用乳头瘤病毒E1解旋酶的三维分子结构，来设计和筛选特异对E1抑制剂，用于治疗和预防HPV感染及相关的宫颈癌和尖锐湿疣药物。本发明所述阐明了一个通过结构和计算分析设计，以及试验筛选的方。
10、法来找到针对E1分子靶点的有效抑制化合物。这些化合物结合在E1空间分子结构的不同的点，用于破坏E1自身的功能，阻断E1与DNA，与三磷酸腺苷，以及与E2的相互作用，所有这些都是E1对病毒基因组复制必不可少的功能。本发明提供了对抑制E1功能的抗HPV病毒分子药物的设计，筛选，识别和检测的方法，同时还提供对这类抑制剂化合物在预防和治疗病毒感染和癌症包括但不限于在HPV和宫颈癌和尖锐湿疣上使用这些化合物中的应用。0016本发明主要是基于以下原理进行相关化合物筛选的0017HPV是DNA病毒，病毒的基因是DNA。病毒进入人体上皮细胞后，其DNA基因必须在细胞内复制，才能完成病毒的繁殖和侵染，而病毒DN。
11、A基因的复制必须要HPV病毒的解旋酶，E1蛋白，来打开病毒DNA双链。同时，HPVE1和HPVE2蛋白的结合和相互作用也对病毒DNA的复制起动有着关键的作用，因而，HPVE1和HPVE2也称DNA复制启动子。上述HPVE1蛋白的功能为ATP酶和DNA解旋酶；以六倍复合体的形式识别并结合在DNA复制的病毒起源点；它是病毒DNA复制所必须要的。HPVE2蛋白的功能为病毒基因转录的主要调节因子；以二聚物的形式与病毒转录引物结合；参与病毒DNA复制过程；与E1相互作用并使E1补充到病毒复制起源点。0018人乳头瘤病毒的复制，需要有几个不同的生物活性环节，包括病毒DNA由病毒的DNA解旋酶E1把DNA双。
12、链打开，并以此作为复制模板由细胞的酶聚合酶启动DNA复制引物。E1解旋酶的突变或E1酶的抑制化合物可导致病毒DNA复制失败，阻断病毒的复制，以达到预防和抑制HPV病毒的侵染，从而预防和治疗子宫颈癌的效果。0019人乳头瘤病毒E1解旋酶和人体细胞的解旋酶称MCM几乎没有氨基酸序列的保守性，MCM解旋酶是为人体细胞染色体的复制的酶。HPVE1和MCM在立体结构上有着根本的不同BREWSTERETAL，PNAS，2008。由于E1的解旋酶对HPV病毒的复制是必不可少的，而E1和MCM解旋酶的序列和结构都不同，这样，E1解旋酶提供了一个极好的特异性很高的防病毒的药物靶点。因为E1是针对病毒的高特异性分。
13、子靶，针对E1的药物可以帮助降低对人体细胞的毒性。0020由于解析出了HPVE1蛋白分子的晶体结构，我们能够通过分子结构的分析和建立分子结构模型来设计和开发E1酶的有效的抑制剂作为抗病毒和抗子宫癌的小分子药物。这些E1酶的有效小分子抑制剂同时也可作为分子工具，用来进一步研究解旋酶的功能和说明书CN102086468ACN102086471A3/8页5调控机制。0021到目前为止，尚无任何有效的药物来抑制人乳头状瘤HPV病毒的复制，侵染和繁殖。针对人乳头状瘤病毒E1的解旋酶的小分子药物，是一种全新的抑制HPV病毒复制的有效药物。根据在此显示的E1和核苷酸ATP和ADP复合体的原子结构模型，我们能。
14、够通过对结构模型的详细的计算分析，来帮助我们设计对E1解旋酶的小分子抑制剂，以便达到对E1本身活性的抑制，或对E1与DNA或与E2或其它DNA复制蛋白的相互结合的抑制，从而能有效地抑制HPV病毒的复制，可用于治疗HPV感染以及相关的子宫颈癌和尖锐湿疣等疾病。0022下面对本发明中涉及的结构计算机辅助药物设计的结构基础人乳头瘤病毒E1解旋酶结构作进一步的介绍0023本发明所指的人乳头状瘤病毒HPVE1蛋白是指包含50个或更多氨基酸的E1多肽序列，或更长的E1，包括全长E1蛋白，E1本身，或作为E1融合蛋白。0024一个同源蛋白的蛋白质，包括不是天然出现的蛋白质，并且有一个或几个氨基酸，但不局限于。
15、一个或几个氨基酸的不同或被删除例如，蛋白质截断的片段，或被插入倒，取代和/或衍生如糖基化，磷酸化，乙酰化，豆蔻酰化，异戊二烯化等。最好是一个具有特定同源蛋白质的氨基酸序列至少和一种天然蛋白质有约30的相似性。0025一个纯化的蛋白质，根据本发明，是一个已经从它的天然环境即已受人为操做过程，可以包括纯化或部分纯化的蛋白质，基因工程产生的蛋白质，或是合成产生的蛋白质。因此，“纯化”并不反映蛋白质纯化的何种程度。最好是一个纯化的蛋白质，尤其是其片段，使用基因工程产生的蛋白质，或是合成产生的蛋白质如果是一个较小的蛋白质肽。术语“片断”是指蛋白质的一部分。作为对人乳头状瘤病毒E1的结构数据分析的结果，这。
16、个蛋白质的各个部分的结构和功能特性对计算机辅助药物设计方法具有重要的价值。使用的人乳头状瘤病毒E1多肽蛋白部分片断的结构和功能来设计和筛选药物的方法是本发明的一部分。0026本发明所提到的人乳头状瘤病毒E1解旋酶，包括人乳头状瘤病毒HPV类型6，11，16，18，35，52，58和所有其他已知的HPV类型的E1解旋酶蛋白，以其一级结构例如，序列和二级结构，和三级结构的相似。换言之，包括任何一种HPV病毒的E1解旋酶以及具有相似的结构和功能的解旋酶。因此，人乳头状瘤病毒E1的病毒解旋酶蛋白，通过举例的方式，可以包括纯化，部分纯化，重组，突变/修饰，合成蛋白质多肽。0027本发明提供了HPVE1解。
17、旋酶与核苷酸复合物的三维结构的原子坐标。本发明也提供了根据这三维结构信息来确定能抑制该E1解旋酶的药物结合部位，包括阻止六聚体的形成，核苷酸的结合，及与HPVE2的相互作用。本发明还包括了特异针对E1的解旋酶抑制剂药物的筛选实验。0028本发明的一个体现，涉及到以结构为基础来鉴定抑制剂化合物，用于调节和抑制乳头状瘤病毒E1解旋酶在病毒复制中的作用。这种抑制化合物可以调节E1蛋白结合核苷酸或DNA的能力，或是与另一乳头状瘤病毒E2蛋白的结合能力。该方法是一个结构计算机辅助药物设计方法为基础，包括如下步骤1提供可以确定E1三维结构的原子坐标，包括此处所述的E1三维结构的原子坐标；及2通过对三维结构。
18、的分析计算机模拟来筛选出结合在某一个特定结构区域的抑制剂化合物。0029这里披露了合适的结构和模式结构可用以作对E1的药物设计。在结构为基础的说明书CN102086468ACN102086471A4/8页6药物设计方法的首选的目标结构，包括用任何建模方法产生的任何结构模型，如通过结构分子置换和同源序列的模型建立。0030根据本发明，首选的药物设计步骤从一个或多个化合物的数据库通过计算机筛选，根据E1三维结构来和化合物的数据库进行匹配和对接。如果由本发明的方法筛选确定合适的化合物后，可以直接合成和测试该化合物本对一个或多个人乳头瘤E1解旋酶的调节和抑制作用，以及和E1的结合的具体方式。0031本。
19、发明的以E1结构为基础的药物设计中的一个体现，是包括能根据E1单体或六聚体的结构来确定能与之结合化合物，此化合物能结合的条件之一是和结合部位有互补的形状。这种方法在此被称为“几何方法”。在一个几何方法中，内部自由度和相应的分子构象空间的局部极小值通过只考虑两个，刚体硬球的几何相互作用可以得到降低，其中一个刚体含有一个“口袋”或“沟”的位点用于结合第二个刚体及与之形状上互补的分子，如配体，或化合物。这种几何方法在KUNTZETAL，JMOLBIOL，VOL161，P269，1982中也有描述。用这种几何方法确定的化合物分子可以通过设计和修改，来以满足这些化合物在这个口袋或沟的结合位点具备化学互补。
20、性，形成如氢键，离子键，或范德华键等相互作用。0032根据本发明，使用本发明的方法测试合适的入选的化合物可包括蛋白质，多肽或其他有机分子和无机分子。合适的有机分子包括有机小分子。肽是指小分子量的化合物经水解产生两个或两个以上氨基酸。多肽是指两个或两个以上肽。首选治疗化合物的设计包括“L”和/或“D”氨基酸组成的肽，有机小分子，或同质或异质聚合物，包括直链或有支链聚合物。0033一个能结合E1并能调制调节，修改，上调，下调E1解旋酶的活性的候选化合物可通过本发明以上讨论的以结构为基础的筛选方法来确定。至于候选的化合物对E1蛋白靶点的实际结合能力可用在一些下面详细讨论的已知的技术来确定。一个“推定。
21、的化合物”是一个未经证实是否有调节抑制活性的化合物，至少对于这样一个化合物对E1的结合能力和/或调节生物活性来说。因此，一个公认的化合物库可使用这里讨论的以结构为基础的筛选鉴定方法，来筛选出可以结合并调节，甚至模仿其中的目标蛋白质或位点的一个或多个候选化合物。另外，一个能结合E1的目标蛋白候选化合物也可以使用以上讨论的结构为基础的药物设计来从头设计。0034本发明用以测试这些筛选出的化合物的实际效果可以包括基于细胞的检测和非基于细胞的检测。一个特别优选的非细胞为基础的检测，是电泳迁移率试验EMSA。更具体地说，电泳迁移率试验EMSA可以用来监测双链DNA是否在有ATP时被E1成功的解旋。可以利。
22、用这种技术来评估在候选化合物的存在和缺席的时候E1解旋酶体外的功能变化。这种方法对筛选E1的解旋酶分子抑制剂非常有用。0035其他合适的检测衡量候选化合物结合的蛋白质的能力的方法，和/或衡量这些化合物能够影响蛋白质结合其它蛋白或配体的方法包括，免疫印迹，酶联免疫吸附法ELISA，放射免疫法RIA，免疫沉淀，表面等离子体共振，化学发光，荧光偏振，磷光，免疫组织化学分析，基质辅助激光解吸/电离时间飞行的MALDITOF质谱，MICROCYTOMETRY，基因芯片，显微镜，荧光激活细胞分选流式细胞仪和流式细胞仪。0036本发明的一个组成部分，是由上述方法鉴定出的化合物，通过对E1解旋酶的抑制说明书C。
23、N102086468ACN102086471A5/8页7作用，可用来预防或治疗HPV感染和子宫颈癌。这些化合物既可以通过本行业所知的传统的固相合成与制备。0037这项发明的范围不仅包括各种异构体可能存在，但也可能形成的各种异构体的混合物。0038本发明中的化合物在有碱性氨基时与酸形成盐，或在有酸性基团如羧酸膦酸时与碱形成盐。所有这些新产品的盐有利于分离和/或纯化。这类酸和碱的盐如是药学上可接受的话具有特别价值。医药上可以接受的酸类盐包括盐酸，草酸，硫酸，硝酸，苯磺酸，对甲苯磺酸，醋酸，马来酸，酒石酸等。药物使用基本盐类包括钠，钾，钙，镁的盐。0039除了用理性的基于结构的药物设计，其与E1结合。
24、的抑制剂可以通过上述的解旋酶功能检测来发现，也就是以测定某种化合物对解旋酶的抑制能力。用这种方式，我们已确定了一些能结合E1六聚体的化合物，并对E1六聚体解旋酶功能有抑制作用的化合物，包括曲伐沙星TROVAFLOXACIN与加替沙星GATIFLOXACIN。因此，本发明的一个方面是一种通过在为需要接受这种治疗哺乳动物上使用TRAVAFLOXACIN或GATIFLOXACIN及其衍生物来预防或治疗HPV感染和宫颈癌的方法。0040本发明的化合物可以用来为病人直接使用。较好的病人是一种动物，更好是哺乳动物，最好为人类。这种化合物可以通过各种形式和路线进行使用，例如，口头或肠外。肠外使用包括但不限于。
25、由下列使用路线静脉注射，肌肉注射，皮下注射，眼科，口腔和舌下；局部包括眼科，皮肤，眼，鼻和直肠通过充气和气溶胶吸入；腹腔和直肠系统性，生殖系统。0041医生将决定本治疗药物最合适的剂量用于预防或治疗目的，它会随特定的病人而定。医生通常会先从小剂量开始递增，直到达到最佳治疗效果的剂量。治疗剂量一般都可以从约01至约1000毫克/天，最好是从大约10到100毫克/天，或约01到50毫克/公斤体重量，最好每天约01至约20毫克/公斤体重的身体，可以在几个不同的剂量单位的使用。高剂量，在约2倍到4倍左右的剂量可用于口服使用。0042目前国内外还没有任何有效的预防和治疗人乳头瘤病毒的化合物。本发明的技术。
26、和成果可以用来找到和开发针对该病毒的具有特异性高的抑制剂化合物作为预防和治疗人乳头瘤的感染和其引起的疾病。与现有技术相比如普遍撒网的高劳力强度的大通量筛选，本发明具采用了现代蛋白分子结晶学，计算机对分子结构的模拟和分析和基于结构的分子对接，以及有效的试验测试系统的建立，从而能从几十万到上百万的分子库中很快的选出能结合目标蛋白的少数的化合物，并通过试验筛选很快验证和确定对目标蛋白有高特异性的抑制功能的化合物作为抗人乳头瘤的有效药物。附图说明0043图1为HPV35E1蛋白SUPERDEX200的洗脱峰不同部分的凝胶电泳图；0044图2为HPV35E1蛋白的SUPERDEX200柱层析图；0045。
27、图3为E1解旋酶的解旋双链DNA活性测试结果图；0046图4为E1解旋酶对ATP水解活性的检测结果图；0047图5为E1的分子结构图其中A为E1六聚体的侧视结构示意图；B为E1六聚体的俯视结构示意图；C为E1单体的N端结构域；D为E1单体的C端结构域；0048图6为根据结构进行计算机分子对接所得到的结果图其中A为曲伐沙星说明书CN102086468ACN102086471A6/8页8TROVAFLOXACIN对接在E1六聚体结构的结合部位图，B为加替沙星GATIFLOXACIN对接在E1六聚体结构的结合部位图；0049图7为候选化合物曲伐沙星的结构图；0050图8为候选化合物加替沙星的结构图；。
28、0051图9为候选化合物曲伐沙星和加替沙星对E1解旋酶的抑制剂作用图。具体实施方式0052以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。所有百分比是按重量和所有溶剂混合比例是按体积，除非另有说明。0053实施例1人乳头瘤病毒HPVE1蛋白的制备和酶活性的测定0054一人乳头瘤病毒HPVE1蛋白的制备0055人乳头瘤病毒HPVE1蛋白的制备将以HPV35型的E1解旋酶为例。HPV35E1解旋酶的的表示和提纯是用大肠杆菌表达系统。用的质粒是PGEX2T为载体。诱导E1蛋白表达的条件是04MM的IPTG，16度，16小时。细胞破。
29、碎是在50MMTRISHCL，PH804度下，025MNACL，5MMEDTA，5MMDTT，5甘油，02NP40的溶液中，用法式破碎机或超声波机。细胞破碎物离心40000XG，上清液里的GSTE1用谷胱甘肽GLUTATHIONE以亲和层析的方法提出。GSTE1融合蛋白使用凝血酶切开，洗脱的E1蛋白用SUPERDEX200柱层析来提纯。如图1所示，经SUPERDEX200提纯后的E1蛋白有很高的纯度。纯化的E1蛋白在100MMHEPES，PH75，250MMNACL，5MMDTT，和5的甘油的溶液里浓缩后，在80度下保存。0056二六聚体聚合能力的检测0057六聚体的聚合是E1体现解旋酶功能的。
30、必备条件。E1单体分子形成六聚是用SUPERDEX200凝胶过滤色谱法。蛋白质2毫克/毫升，1MG总蛋白和1MMATP注入SUPERDEX200柱子上。如图2所示，HPV35E1蛋白在SUPERDEX200柱层析分析法中，形成六聚体和小部分单体，以六聚体和少量单体流出柱子。而化合物对六聚体形成的抑制作用可用此法检测。0058三解旋酶活性检测0059解旋酶活性的检测使用的底物是从两个互补链退火而成的。两条互补链的序列是DT44GCTCGTGCAGACGTCGAGGTGAGGACGAGCTCCTCGTGACCACGANDCGTGGTCACGAGGAGCTCGTCCTCACCTCGACGTCTGCA。
31、CGAGCDT44。DT44是指44个DT。此底物包括44核甘酸的两个单链DNA分叉尾巴和44个核苷酸的双链DNA，5末端有32P的放射标记。E1解旋酶活性检测是在65，60分钟，20微升含05NM双链DNA底物，75NME1蛋白单体，30NMTRISPH8，75MMNACL，50NM醋酸钾，10MMMGACETATE，5MMATP，1MMDTT和01毫克/毫升牛血清白蛋白。反应终止是用5UL含有100MMEDTA，05SDS，01二甲苯蓝，01溴酚蓝和50甘油。反应物经12聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用放射自显影法来检测和量化底物DNA的解旋程度，从而的出解旋酶的活性程度。如图3所示为E1解旋酶的。
32、解旋双链DNA活性测试结果，双链DNADSDNA底物被E1解旋酶解开成单链DNASSDNA产物，第15道E1蛋白浓度递减，第6道只有DSDAN底物，第7道DSDNA底物加热到100度。说明书CN102086468ACN102086471A7/8页90060四ATP酶活性测定0061E1解旋酶对ATP的水解用两种方法进行。第一中方法是参见GREENLEAFETAL，2008，没有同位素标记的ATP10500UM和10UM的32P标记的ATP3000CI/MMOL以及1UM的E1六聚体蛋白混合后在25度下反应30分钟，然后用薄版层析法检测ATP水解程度如图4所示。第二种方法是，使用ENZCHEK的。
33、检测试剂盒INVITROGEN公司，检测E1解旋酶对ATP的水解和磷释放。所有的反应进行解旋酶在65度进行，使用1NM的E1单体蛋白，502500M的ATP。所用的溶液是解旋酶活性测定的溶液相同。数据米氏MICHAELISMENTEN方程式来分析数据。如图4所示为E1解旋酶对ATP水解活性的检测，随着E1解旋酶浓度的增加，ATP被水解成ADP的量也越大。0062实施例2乳头瘤病毒E1解旋酶蛋白的结晶，分子结构模型和药物筛选0063一乳头瘤病毒E1解旋酶蛋白的结晶以牛乳头瘤病毒E1为例。此E1蛋白表达和分离提纯可用实例1所描述的进行。乳头瘤病毒E1蛋白结晶是用20MG/ML的蛋白浓度，在含有10。
34、0MMMESPH75，300MMKPO4PH75，190MMNACL，8PEG6K的溶液里，用悬滴气相扩散法，在18度的条件下进行。结晶的晶包常数为P212121，A133211，B179192，和C185350，G90。晶体衍射分辩率为31挨。0064二晶体结构分子模型0065E1的六聚体的总体结构0066如图5A、B所示，E1亚基组装成有一中央通道的同源六聚结构。从侧面看，六聚体环显示为两个不同直径的环，在顶部小环和底部大环。这两个层次的环六聚体的厚度大约是80埃。从顶部看，在六聚体环从六个点从较大的底部环中心辐射出去。0067六聚体的总体构象具有不对称的外观，不同亚基之间有不同空间距离。。
35、这些每个亚基之间存在着较大的底部是ATP的结合部位，亚基间ATP结合和水解驱动E1六聚体构象变化用来打开DNA双链或解旋。ATP具体的结合位点位于在较大底部的AAA的WALKERA域处。一个亚基贡献WALKERAGPPNTGKS和WALKERBAALVDD和传感器1VTSNI用来结合ATP的磷酸部分，而邻近的亚单位提供了一个精氨酸“手指”ARG538对ATP水解至关重要，传感器2LYS425和其他一些周边的氨基酸也参与结合和水解ATP。0068E1的单体结构0069在E1的单体结构中包含两个单独的结构域，较小的N端结构域和大C端的AAA域。N端的结构域全是螺旋，但C端的结构域有5个结构形成的对。
36、版，如图5C、D所示。整体结构非常象SV40大T抗原的结构LIELAL，NATURE，2003；GAIETAL，CELL，2004，有一个长的螺旋连接的N端域到C端域。在C端域，它包含了发夹结构，是位于六聚体中央通道里，对DNA结合和解旋起很重要的作用。0070三计算机模型药物筛选0071根据牛乳头瘤病毒E1的晶体结构，通过计算机模拟建立了人乳头瘤病毒16和18型E1解旋酶的结构模型，并以此结构模型，对小分子化学数据库进行计算机对接，以筛选出能结合E1的化合物。用这种方法，我们筛选出一些能结合在人乳头瘤16型E1上的化合物，其中两种候选化合物曲伐沙星和加替沙星TROVAFLOXACIN和GAT。
37、IFLOXACIN的结构如图7、8，所示它们结合在E1蛋白上的位点分别如图6A、B所示，两个分子对接的自由能分别是769KCAL/MOL和695KCAL/MOL。说明书CN102086468ACN102086471A8/8页100072四对E1活性抑制剂的检测0073基于结构和计算模拟筛选出的候选化合物曲伐沙星与加替沙星TROVAFLOXACIN和GATIFLOXACIN对E1解旋酶抑制剂作用用实样来检测，以测验这些化合物是否能抑制E1解开双链DNA底物的活性。如图9所示，曲伐沙星加在HPV16E1解旋酶反应混合物中，让反应进行60分钟，然后用凝胶电泳分析反应结果。曲伐沙星TROVAFLOXA。
38、CIN浓度使用为20UM，40UM，80UM，160UM。由图9可以看出，曲伐沙星TROVAFLOXACIN浓度以线性方式抑制E1双链DNA解旋成单链的功能。同样，加替沙星GATIFLOXACIN浓度的增加40UM，80UM，120UM，和240UM也对E1的解旋酶呈现出类似的线性抑制活性，不过其抑制作用没有曲伐沙星强烈。47道显示出TROVAFLOXACIN浓度增加对E1解旋酶功能抑制的增强。811道显示出GATIFLOXACIN浓度增加对E1解旋酶功能抑制的增强。0074最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN102086468ACN102086471A1/4页11图1图2图3说明书附图CN102086468ACN102086471A2/4页12图4图5说明书附图CN102086468ACN102086471A3/4页13图6图7图8说明书附图CN102086468ACN102086471A4/4页14图9说明书附图CN102086468A。