金孢子菌属纤维素酶及其使用方法 发明领域
本发明涉及中性和/或碱性纤维素酶及制备该纤维素酶的新方法。更具体地，本发明涉及金孢子菌属真菌以及特定的Chrysosporium lucknowense菌株生产的纤维素酶。本发明还涉及这些中性或碱性纤维素酶以及含纤维素酶组合物的工业应用。
发明背景
纤维织物如棉、亚麻、大麻、苎麻、铜纺(cupro)、lyocell、newcell、人造丝、富纤制成的衣物是非常普及的。其中特别令人感兴趣的衣物是棉或棉混合物制成的经靛蓝染色的粗斜纹布织物制成的牛仔裤。这些衣物通常由上浆并裁剪的衣料缝纫制得，由于有浆料组合物的存在，衣物较硬。在其它情况下，纤维或织物料卷在缝制成成品衣物前先用酶进行处理。在穿了一定时间后，衣物会变得较软，整体颜色减退，局部区域的颜色会发生变化。另外，在反复洗涤后，衣物将更为舒适，手感更软，外观更旧。在最近几年，这种舒适感、手感和外观正在逐渐流行。
产生这种舒适感、手感和外观的最普遍方法是，使衣物和纤维素酶以及浮石或其它研磨剂一起在大洗衣机中洗涤。浮石有助于软化织物，并能提供与织物穿很长时间后产生地相似褪色表面。然而，用浮石有几个缺点。例如，必须从加工衣物中手工除去浮石，因为浮石容易堆积在口袋内、衣服内面上、折缝中以及褶皱中。另外，浮石会对石洗机中电动机产生过载损坏，并堵塞机器排水通道和排水管路。加工和设备上的这些问题将大大提高制造成本和物品购买价格。
鉴于采用浮石时的问题，已经找到了在石洗过程中采用浮石或其它研磨剂的替换方案。一种替换方案涉及采用破坏织物中纤维素的酶处理方法(Geller，美国专利No.4,951,366；Olson美国专利No.4,832,864,4,912,056,Olson等，专利No.5,006,126,5,122,159和5,213,581,Christner等，美国专利No.4,943,530,Boegh等，美国专利No.4,788,682)。用水解酶(如纤维素酶)处理含纤维素织物以改善该织物的柔软度或手感的方法是本领域中已知的(Novo Brochure Cellulase SP227；Novo Brochure Cellozyme；Murata美国专利No.4,443,355；Parslow美国专利No.4,661,289；Tai美国专利No.4,479,881；Barbesgaard美国专利No.4,435,307；Browning英国专利No.1,368,599)。
本领域中已知的纤维素酶是水解纤维素(β-1,4-葡聚糖键)结果生成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的酶系统。纤维素酶组合物包括几种不同的酶组分，它们包括外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。而且，这类酶还可进一步分成单个的同工酶。
将结晶纤维素有效地转变成葡萄糖需要有完整的纤维素酶系统。通常，如果需要使纤维素底物完全水解，则纤维素酶混合物应含有β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶以及内切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶催化纤维素聚合物中葡萄糖单元间的β-1,4-糖苷键随机水解。该组分能水解可溶性纤维素衍生物(如羧甲基纤维素)，从而降低该溶液的粘度。该酶组分作用于聚合物的内部区域，导致聚合物平均链长度迅速降低，伴有还原性末端数目缓慢增加。纤维素聚合物的平均链长度迅速降低可从纤维素溶液粘度的降低得到证实。
在生产纤维素酶的菌株中，不同的纤维素酶对底物的特异性以及作用方式各不相同。例如，目前接受的真菌Trichoderma reesei纤维素酶的作用机理是内切葡聚糖酶活性首先断裂纤维素中低晶性区域中的内部β-1,4-糖苷键(Ruohnen L.等，＂Proceedings of Second Tricel Symposium on Trichoderma Reesei Cellulases andOther Hydrolases＂,(P.Sudminen和T.Reinkainen.编辑),Foundation forBiotechnology and Industrial Fermentation Research 8；(1993):87-96)。纤维二糖水解酶活性优先结合纤维素非还原末端的晶性区域，释放出初级产物纤维二糖。β-葡糖苷酶或纤维二糖酶活性则能作用于纤维寡糖如纤维二糖，并生成单一的产物葡萄糖。
纤维素酶产于真菌、细菌和其它微生物体中。真菌通常产生能降解结晶纤维素的完整的纤维素酶系统。例如，Trichoderma reesei能产生并分泌有效降解结晶纤维素所需的所有酶活性，即内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、纤维二糖酶(外切-1,4-β-D-葡聚糖酶)和1,4-β-D-葡聚糖酶或β-葡糖苷酶。真菌纤维素酶还有一个优点，即真菌内的纤维素酶很容易通过发酵过程来大量生产。
除了石洗方法外，在本领域中已知纤维素酶或其组分还用于各种工业纺织物应用。例如，纤维素酶可用于洗涤剂组合物中目的是提高组合物的清洁能力，用作软化剂，用来增亮、脱毛和其它用途。当这样使用时，纤维素酶会在洗涤时降解一部分纤维材料(如棉织物)，从而有利于清洁和/或软化织物。真菌纤维素酶中的内切葡聚糖酶组分也可用来提高洗涤剂组合物的清洁能力，用作软化剂，用于改善棉织物的手感等。然而，在洗涤剂组合物中采用木霉属、尤其是Trichodermalongibrachiatum产生的纤维素酶有一个问题。通常这些组分在酸性pH下有最高的活性，而大多数洗衣用洗涤剂组合物却是配制成在中性或碱性条件下使用。
采用纤维素酶的其它纺织物应用包括软化(Browning，英国专利No.1,368,599,Parslow，美国专利No.4,661,289,Tai美国专利No.4,479,881和Barbesgaard，美国专利No.4,435,307)、去原纤维作用(Gintis,D.Mead,E.J.,TextileResearch Journal,29,1959；Cooke,W.D.,Journal Of The Textile Research Institute,74,3,1983；Boegh，欧洲专利申请No.0220016)。纤维素酶也可与聚合剂联合用于加工程序以提供纤维颜色密度的局部变化。(WO/94/19528和WP/94/1529)。
在服装和纺织工业上，纤维素酶根据工作pH范围来分类。酸性纤维素酶通常在pH4.0至5.5及更低时、中性纤维素酶在pH5.5至7.5时、碱性纤维素酶在pH7.5至11.0时有活性峰值。一些酶组合物可能有较宽的工作范围。例如，中性/碱性纤维素酶可以在约40-60℃之间、在酸性、中性和碱性pH下工作。
酸性、中性和碱性纤维素酶通常用于粗斜纹布牛仔裤的“石洗”处理，它们可以和或不和表面活性剂、缓冲液、洗涤剂、抗再沉积剂、软化剂、浮石或其它研磨剂、漂白剂(如光学漂白剂)、酶或其它方式一起使用。如果不配制纤维素酶组合物和/或预先进行缓冲，则对于酸性纤维素酶来说，通常要用(例如)柠檬酸钠和柠檬酸缓冲液将pH调节至4.5-5.5之间，对于中性或碱性纤维素酶来说，要用(例如)磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液来调节pH至5.5-7.5。当工作pH在大约7.0-11.5内时，中性和碱性纤维素酶通常用作洗衣用洗涤剂的添加剂。在石洗应用中，典型的酸性纤维素酶通常使靛蓝染料有较大程度的背染(backstain)或再沉积，且织物强度的损失较高，而典型的中性和碱性纤维素酶却能提供较弱的磨蚀、较低的背染或再沉积，而且织物强度损失也较少。
中性/碱性纤维素酶是石洗工业最佳类型的纤维素酶，因为它们能产生比酸性纤维素酶(即木霉属)较弱的背染或再沉积，且强度损失较少。而且，中性/碱性纤维素酶与其酸性对应物不同，它们可在宽得多的pH范围内工作，并且能在石洗工业中较宽的pH范围(pH5.0-8.0)内保持相对更佳的洗涤性能。因此，中性/碱性纤维素酶有几个优点。首先，湿加工设备中的进料水通常在该pH范围内，因此对pH控制不需象酸性纤维素酶那样精确。这就使得石洗过程比采用酸性纤维素酶的过程更能耐受工作pH误差或疏忽，使得整个过程更能容许产生错误。其次，已知粗斜纹布织物是天然碱性的，因为在染色过程中采用了苛性碱。简单地洗涤粗斜纹布会将该苛性碱释放到洗涤水中，因此洗涤水的pH通常会增高。此碱性可能会中和洗涤缓冲液，但是pH增高对中性/碱性纤维素酶的影响不如对酸性纤维素酶那样严重，因为中性/碱性纤维素酶不仅可以在较高的pH下工作，而且还可以在较宽的pH范围内工作。
纤维素酶或纤维素酶组分(尤其是碱性和/或中性纤维素酶)在工业上的广泛应用提出了明确的需要，即需要能在中性和/或碱性pH条件下工作的纤维素酶。本发明提供了一种方法来生产在中性和/或碱性pH下有酶活性的中性/碱性纤维素酶以及含有该酶的组合物。
发明概述
本发明总体上涉及中性和/或碱性纤维素酶以及制备该酶的新方法。更具体地，本发明提供了一种从金孢子菌属、尤其是Chrysosporium lucknowense真菌来生产纤维素酶组合物的方法，其中纤维素酶组合物在中性和/或碱性pH下有酶活性。另外还提供了该纤维素酶组合物在工业上的应用。
本发明一方面涉及能生产中性和/或碱性纤维素酶组合物的金孢子菌属野生型和突变型真菌的分离和纯化培养物(尤其是Chrysosporium lucknowense-GARG27K菌株及其突变株)。
本发明另一方面提供了从金孢子菌属真菌来生产中性或碱性纤维素酶的培养条件。
在还有一个实例中，本发明提供了通过重组方法来从金孢子菌属真菌生产中性和/或碱性纤维素酶组合物的方法。
在本发明另一个例子中，提供了能产生中性和/或碱性纤维素酶的金孢子菌属真菌突变型菌株的生产和培养方法。
本发明另一个实例涉及编码金孢子菌属或其基因修饰菌株产生的纤维素酶组合物中酶的核酸序列。
另一个实例涉及从金孢子菌属或其基因修饰菌株产成的纤维素酶组合物中纯化和分离酶。
在本发明的还有一个实例中，提供了金孢子菌属产生的碱性和/或中性纤维素酶在纺织物中的应用(如软化、漂白和石洗过程、衣物染色、去原纤维作用或生物抛光(biopolish)、增亮(color brighten)和脱毛)中的使用方法。
本发明的另一个实例涉及洗涤制剂中包含了金孢子菌属纤维素酶的洗涤剂组合物。
本发明的另一个实例提供了纤维素酶组合物在农业、林产品、城市固体废物和其它来源的木质纤维素生物质糖化中的应用方法。
本发明的其它实例包括纤维素酶组合物在生产染料中的应用，和在生产用于生物漂白木浆和除去回收打印纸上油墨等其它化学物质中的应用。
发明详述
本文所用的术语“中性-碱性纤维素酶”指在大约为5.5及更高的pH值下保留显著酶活性的纤维素酶组合物。在一个较佳的实例中，本发明的中性和/或碱性纤维素酶组合物在大约pH5.5-7.5内、约40-60℃下有酶活性峰值。当酶活性峰值的pH低于约5.5时，中性-碱性纤维素酶组合物在pH约为6.0-7.0、约40-60℃下至少有约50％的最优酶活性。参照实施例，该活性可用RBBCMC酶、CMC酶、Cellazyme、内粘度(endoviscometric)或滤纸活性(FPA)来测定。因此，本发明的纤维素酶组合物在pH高于5.5下有适用的酶活性，因而此酶组合物可用于石洗、洗涤、去油墨或需要中性和/或碱性纤维素酶活性的其它应用中。
本发明涉及在中性或碱性pH下有高活性的纤维素酶组合物以及制备所述中性和碱性纤维素酶组合物的独特方法。本发明的中性/碱性纤维素酶组合物可从金孢子菌属各种类获得。在一个特别佳的实例中，本发明的纤维素酶组合物是从Chrysosporium lucknowense Garg27K(命名为分离物G1)中分离出来的，该菌株于1996年8月29日保藏在根据布达佩斯条约规定的国际保藏机构俄国科学院全俄微生物保藏中心(All-Russian Collection of Microorganisms of the Russian Academyof Sciences,Bakhrushina St.8:Moscow,Russia113184)，保藏号为VKMF-3500D。本发明的纤维素酶组合物是非常有利的，因为它们在中性和/或碱性pH下具有酶活性，从而为工业应用提供了有益的实施性能。
经CMC酶、RBBCMC酶、Cellazyme、内粘度或滤纸活性(FPA)试验测定，本发明的真菌菌株制得的纤维素酶组合物在大约pH5.0-12.0、40-60℃时表现出活性。在石洗过程的一个较佳实例中，纤维素酶组合物在pH5.5-7.0、约40-60℃下有最优活性。已经证明，本发明的中性和/或碱性纤维素酶在石洗应用试验(中性和碱性pH(即6.0,7.0和8.0)下)以及洗涤剂应用试验(pH为10.0或更高)中有良好的工作活性。
培养分解的纤维微生物以制备纤维素酶的发酵过程在该领域中是已知的。例如，纤维素酶系统可以通过固体或深层培养(包括固态、分批、补料分批和连续流动方法)来生产。从发酵肉汤中收获和纯化纤维素酶系统也可用本领域已知的方法来实现。纤维素酶组合物很容易从真菌培养物中分离获得(例如，通过离心或过滤步骤，并通过滤膜或中空纤维超滤设备来浓缩过滤物)。
用来生产本发明的纤维素酶组合物的真菌金孢子菌属菌株可根据本领域中已知的标准方法和条件来培育。在一个较佳的实例中，本发明的纤维素酶组合物是从C1菌株获得的。金孢子菌属C1菌株可在含无机盐、有机氮源(如蛋白胨、脱脂棉籽粉、玉米浆)、或酵母抽提物和碳源的培养基中生长。碳源例子包括(但不局限于)：葡萄糖、乳糖、蔗糖、纤维素或其它糖类。更佳的，真菌菌株在含有乳糖和蛋白胨或乳糖和酵母抽提物的培养基中生长。例如，发酵培养基可包含约0.3％-1.0％(较佳的约为0.5％-0.6％)的乳糖，约0.3％-1.0％(较佳的约为0.5％-0.6％)蛋白胨。真菌生长培养基中可采用的本领域已知的其它氮源和糖源包括(但不局限于)甜菜浆、大麦芽、麦糠和本领域中已知的其它物质。例如，可采用的甜菜浆浓缩物的浓度范围是大约15-30克/升(g/L)，较佳的是约20-25克/升；可采用的大麦芽的浓度范围是大约10-20克/升，较佳的是约14-16克/升；可采用的麦糠的浓度范围是大约3-8克/升，较佳的是约5-6克/升。在一个例子中是将C1菌株培养在旋转振荡摇瓶中含甜菜浆、大麦芽和麦糠的盐水培养基中。通过离心和超滤浓缩细胞培养液，从在生长培养基中培养约3至7天的真菌中分离获得纤维素酶组合物。
或者，可用常规发酵手段来大规模培养金孢子菌属培养物供商业应用。在这种情况下，发酵用于泛指任何控制的真菌培养情况。在大规模培养前，通常先培养所述生长培养物的种菌。接种培养基可以含有常规组分，其包括(但不局限于)碳源、有机氮源和无机盐。碳源可包括(但不局限于)葡萄糖、乳糖、甘油、和/或纤维素，其浓度约为0.5-200克/升，更佳的约为5-50克/升。有机氮源可包括(但不局限于)酵母抽提物、蛋白胨或脱脂棉籽粉，其浓度约为0.5-30克/升，更佳的为5-15克/升。无机盐可包括(但不局限于)磷酸钾(例如约0.01-10克/升)、硫酸镁(例如约0.01-3.0克/升)、硫酸亚铁(例如约0.001-10毫克/升)。
种菌培养物或起始培养物可通过本领域已知的方法来引发发酵罐的金孢子菌属生长。用于发酵的培养基可包括培养真菌的常规组分，其包括(但不局限于)纤维素、有机氮源、氯化镁和氯化钙。有机氮源的例子包括(但不局限于)蛋白胨或脱脂棉籽粉(如Pharmamedia)。
例如，培养基可包含约5-20克/升的蛋白胨或脱脂棉籽粉、约10-30克/升的纤维素、约0.03-0.06克/升的七水硫酸镁和约0.4-0.8克/升的二水氯化钙。
本领域技术人员应当理解，在发酵时应当维持发酵混合物的温度、加氧、pH和营养水平。例如，溶氧水平应维持在约为空气饱和度的10-60％(较佳的为空气饱和度的20-40％)。pH应维持在约5-8之间(较佳的约6.5-7.5，最佳的为6.9-7.1)，温度应维持在约25-40℃之间(更佳的约28-35℃)。原料液中可包含类似于发酵培养基的组分，但浓度较高，以使加入发酵培养基中时稀释最少。
根据本发明方法制得的纤维素酶组合物可用于需要纤维素酶活性、尤其是中性和/或碱性纤维素酶活性的其它各种场合。在本发明的一个实例中，中性和/或碱纤维素酶组合物可用于粗斜纹布牛仔裤的石洗过程。例如，石洗应用的较佳的pH范围为约5.5-7.5，最佳的约6-7。从金孢子菌属分离物中获得的中性和/或碱性纤维素酶组合物在或高于中性或碱性pH下有显著的酶活性。与采用酸性纤维素酶(如从Trichoderma reesei获得的纤维素酶)的传统过程相比，在中性和/或碱性pH下采用中性和/或碱性纤维素酶的石洗过程是特别有利的，因为它使衣物背染的水平较低，衣物强度损失较少，该过程中自然存在的水呈碱性。这些石洗过程使牛仔裤产生了非常希望的手感和外观。例如，每135g粗斜纹布可采用0.02-10g本文所述的纤维素酶制品47.0528。本领域技术人员知道怎样根据诸如纤维素酶活性和洗涤条件(包括但不局限于温度和pH)等因素来调节本发明制得的纤维素酶组合物的量或浓度。
在本发明的还有一个实例中，本发明的纤维素酶组合物可用来减少或消除纤维素由于加入洗涤剂组合物而产生的织物粗糙度。例如，较佳的洗涤剂组合物pH范围在大约8-12之间，最佳的约为pH10-11。本发明的纤维素酶组合物可在中性和/或碱性pH下用于洗涤剂组合物中。打算和本发明的纤维素酶组合物一起使用的洗涤剂组分包括本领域已知的任何洗涤剂组分。这些组分的例子包括(但不局限于)：洗涤剂、缓冲液、表面活性剂、漂白剂、软化剂、溶剂、固体成型剂、磨蚀剂、碱性物质、无机电解质、纤维素酶激活剂、抗氧化剂、助洗剂、硅酸盐、防腐剂和稳定剂，它们是本领域中已知的。本发明的洗涤剂组合物宜采用一种表面活性剂，包括用于洗涤剂组合物的熟知的阴离子型、非离子型和两性表面活性剂。除了纤维素酶组分和表面活性剂，本发明的洗涤剂组合物还含有一种或多种下列组分：酶，如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、氧化还原酶、过氧化酶和其它酶；阳离子表面活性剂和长链脂肪酸；助洗剂；抗再沉积剂；漂白剂；蓝化剂和荧光染料；结块抑制剂；抑制纤维素酶活性因子的掩蔽剂；纤维素酶激活剂；抗氧化剂；和增溶剂。此外，如果需要，本发明的洗涤剂组合物中还可使用香料、防腐剂、染料等。专利No4,435,307；4,443,355；4,661,289；4,479,881；5,120,463中列举了采用纤维素酶的洗涤剂组合物例子，它们均纳入本文作参考。
当用于本发明的洗涤剂基料是粉末形式时，它可以用任何已知制备方法(包括喷雾干燥法和/或造粒法)制得。造粒法是最佳的，因为与喷雾干燥产品相比，颗粒不会起尘。喷雾干燥方法获得的洗涤剂基料是中空的颗粒，它是通过将耐热组分(如表面活性剂和助洗剂)的水性浆料喷入热空间而获得。颗粒的大小约为50-2000微米。在喷雾干燥后，可以加入香料、酶、漂白剂、和/或无机碱性助洗剂。对于(例如)用喷雾干燥造粒法获得的高密度、颗粒状洗涤剂基料，在制得基料后，还可加入各种组分。当洗涤剂基料是液体时，它可以是均相溶液或非均相溶液。
本发明的纤维素酶组合物最好在碱性或中性pH下表现出高水平的活性，但在酸性pH下也能表现出酶活性。因此，包含本发明的纤维素酶的洗涤剂组合物可用于从酸性到碱性的较广的pH范围。
可采用这些纤维素酶组合物的其它纺织应用包括(但不局限于)：衣物染色应用，包括但不局限于粘胶丝的酶促丝光处理、生物抛光应用、酶促表面抛光；生物洗涤(织物材料的洗涤或清洗处理)、酶促微纤维化、酶促亚麻布、苎麻和大麻布的“棉布化”；Lyocel或Newcell处理(即来自Courtaulad的“TENCEL”)、铜纺和其它纤维素织物或衣物的处理，除去染色的纤维素底物中(如染色的棉布)的染料(Leisola & Linko-(1976)Analytical Biochemistry,v.70,p.592,Determination of The Solubilizing Activity Of A Cellulase Complex With DyedSubstrates；Blum和Stahl-Enzymic Degradation Of Cellulose Fibers；ShizuokaPrefectural Hamamatsu Textile Industrial Research Institue报告No.24(1985))、用作漂白剂使新的靛蓝染色的粗斜纹布显得陈旧(Fujikawa-日本专利申请公开号50-132269)，用来增强漂白剂的漂白作用(Suzuki-英国专利No.2094826)，以及用于酶促退浆和织物漂白的组合物的加工中(Windbichtler等，美国专利No.2,974,001)。Bhatawadekar(1983年5月)Journal ofthe Textile Association83-86页提供了另一个用纤维素酶进行酶促退浆的例子。
在其它工业实例中，纤维素酶组合物可用来糖化来自农业、林业产品、城市固体废物和其它来源的木质纤维素生物物质，通过发酵来生产燃料和其它化学物质，用来生物漂白木浆，以及用来对回收的打印纸脱墨，所有这些均可采用本领域技术人员熟知的方法来进行。
在本发明的其它实例中，可分离获得中性和碱性纤维素酶组合物的各种组分并单独使用。特定组分或富含某种纤维素酶组分的纤维素酶组合物可通过化学和物理方法从突变体中产生或分离获得，或可用基因工程方法来特别制得。纤维素酶系统可用本领域中认同的分离技术来纯化成分开的组分，这些分离技术包括在合适pH条件下的离子交换层析、亲和层析、体积排阻、层析等。例如，在离子交换层析中，可以通过pH梯度或盐梯度或两者来洗脱分离纤维素酶组分。这些分离是本领域技术人员从本文提供的说明获益后能够做到的。
一旦分级和分离获得纤维素酶组合物的各个酶组分，就可对蛋白进行部分测序或微测序，以设计出合成的DNA或探针来分离编码感兴趣酶蛋白的基因。通常，蛋白的氨基端序列用常规蛋白测序方法或自动测序仪(Ausubel等，(1987)“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley和Sons,New York,NewYork)来测定。另外，蛋白的其它区域可结合化学断裂或酶促断裂以及蛋白分离技术来进行测序。(Ausubel等，(1987)“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley和Sons,New York,New York)。本领域技术人员应能理解，合成的DNA克隆或探针可用于常规克隆技术，以分离出对应于金孢子菌属产生的中性/碱性纤维素酶组合物中的酶的基因。
本领域技术人员应能理解，由于DNA序列中的遗传密码变化有简并性，本发明获得的核酸序列在本领域中可以变化，但是仍能形成能编码纤维素酶组合物中酶组分的DNA序列。这种DNA序列在功能上等价于本发明的核酸序列，它们也被包括在本发明内。另外，与该核酸序列互补的、能在各种条件下与公开的核酸序列杂交的核酸序列也包括在本发明内。
本发明还包括编码本发明纤维素酶组合物中的酶的蛋白、肽或其类似物，那些蛋白或肽有与本发明的酶蛋白或肽基本相同的功能。这些蛋白或多肽包括(但不局限于)，蛋白片段或其取代、插入或缺失的突变体。本发明还包括与编码本发明纤维素酶组合物中的酶蛋白质基本上同源的蛋白或肽。术语“类似物”包括氨基酸残基序列基本上与该序列相同的多肽，特别是其中一个或多个残基被功能上类似的残基保守性取代并表现出本文所述蛋白功能的多肽。保守取代的例子包括一个非极性残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸)被另一个非极性残基取代，一个极性(亲水性)残基被另一个极性残基取代(例如精氨酸和赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺、苏氨酸和丝氨酸间的取代)，一个碱性残基(如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)被另一个碱性残基取代，或一个酸性残基(如天冬氨酸或谷氨酸)被另一个酸性残基取代。
本发明的蛋白或多肽还包括任何具有一个或多个插入残基和/或缺失残基的多肽，此多肽的序列包括在本发明的蛋白中，只要它们保留了必需的活性。
本发明还提供了一个重组DNA分子，该分子包含本发明分离的全部或部分核酸序列以及载体。适用于本发明的表达载体包含至少一个表达控制元件与核酸序列操作性相连。表达控制元件被插入载体中以控制和调节核酸序列的表达。表达控制元件的例子包括(但不局限于)：lac系统、λ噬菌体的操纵子和启动子区、酵母或其它真菌启动子。可采用的启动子例子包括(但不局限于)葡糖淀粉酶。其它较佳的或所需的操纵元件包括(但不局限于)：前导序列、终止密码子、聚腺苷酸化信号，和核酸序列在宿主系统中适当转录及随后的翻译所需的或较佳的任何其它序列。本领域技术人员应当理解，所需的或较佳的表达控制元件的正确组合取决于所选的宿主系统。还应理解，表达载体应含有表达载体(含有核酸序列)在宿主系统中转移和随后复制所必需的其它元件。这些元件的例子包括(但不局限于)，复制起点和可选择标记。本领域技术人员还应理解，这些载体可用常规方法来构建(Ausubel等，(1987)＂Current Protocols in Molecular Biology＂,John Wiley和Sons,New York,New York)或可从商业上购得。
本发明的另一方面涉及一种宿主生物，该宿主中插入了含有全部或部分核酸序列的重组表达载体。用本发明的核酸序列转化的宿主细胞包括真核细胞，如动物、植物或种子、昆虫或酵母细胞，以及原核细胞，如大肠杆菌或其它细菌。真菌宿主细胞的例子包括(但不局限于)曲霉属、木霉属、腐质霉属、青霉属或链孢霉属。携带基因载体导入细胞的方式包括(但不局限于)转化、显微注射、电穿孔、转导、或用DEAE-葡聚糖、脂质转染、磷酸钙或其它本领域技术人员已知的方法(Sambrook等，(1989)“Molecular Cloning,A Laboratory Manual”,Cold SpingHarbor Press,Plainview,New York)来转染。另外，可用本发明的核酸序列来转化金孢子菌属细胞，以通过金孢子菌属来扩增纤维素酶的产生。
在一个较佳的实例中，采用了在真菌细胞中起作用的表达载体。这些载体的例子包括(但不局限于)下述专利中描述的质粒，Ogawa；日本专利JP5095787A930420,Ozeki；日本专利JP7115976A950509,Murakami；日本专利JP3094690A910419,Ishida；日本专利JP3251175A911108,Uozumi；日本专利JP5268953A931019 DW9346 C12N-009/34 011pp,Gottschalk；德国专利DE3908813 A 900920 DW9039 000pp,Gysler；欧洲专利EP-683228A2951122DW9551C12n-015/60Eng041pp。较佳的是，将重组蛋白表达载体导入真菌细胞中，以保证对导入蛋白进行合适的加工和修饰。
在另一个实例中，可获得宿主细胞表达的重组蛋白作为粗制裂解物，或可通过本领域已知的蛋白纯化标准方法来纯化，这些标准方法包括示差沉淀、分子筛层析、离子交换层析、等电点聚焦、凝胶电泳、亲和层析和免疫亲和层析等。(Ausubel等，(1987)“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley和Sons,New York,New York)。在免疫亲和层析场合下，可使其通过一个层析柱来纯化重组蛋白，该柱含有的树脂其上结合了对感兴趣蛋白有特异性的抗体(Ausubel等，(1987)“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley和Sons,New York,New York)。
本发明的核酸序列全部或部分还可用作探针来分离其它属或株系中的其它同系物。在一个较佳的实例中，该核酸序列可用来筛选金孢子菌属文库；选择阳性克隆并测序。可以合成的基因文库的来源例子包括(但不局限于)金孢子菌属、曲霉属、青霉属、腐质霉属、头孢子菌属、木霉属或细菌如芽胞杆菌属。本领域技术人员能够理解，可采用合适的杂交条件来检测同系物。Sambrook等，(eds)(1989)＂Molecular Cloning A Laboratory Manual＂Cold Spring Harbor Press,Plainview,New York和Ausubel等，(1987)“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley和Sons,New York,New York中描述了核酸杂交、文库构建以及克隆技术的常规方法。
本发明还涉及金孢子菌属的突变型菌株，尤其是能产生中性和/或碱性纤维素酶的突变型菌株Chrysosporium lucknowense。DNA诱变和筛选突变株的方法是本领域技术人员所熟知的，它们包括各种化学和酶方法。这些方法的例子包括(但不局限于)将真菌暴露在紫外光(UV)、亚硝酸、N-甲基-N＇-硝基-N-亚硝基胍(NG)和4-硝基喹啉-N-氧化物(4NQO)下。(Leninger(1972)Biochemistry,Worth Publishers Inc.,NY；Jeffrey H.Miller(1972)＂Experiments in Molecular Genetics＂Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York)。较佳的方法包括UV和NG。例如，可通过UV诱变来获得能产生在中性和/或碱性pH下酶活性有所提高的纤维素酶组合物的金孢子菌属突变株。例如，通过使真菌孢子暴露在紫外光下约10-180秒(较佳的约45-90秒，最佳的约65-75秒)，可产生突变株。涉及NG的诱变可包括改变NG浓度和暴露时间。例如，约13-400毫克/升(mg/L)的NG可采用约15-20分钟的暴露时间。产生突变株的另一种方法包括采用分子生物学领域的技术。这些技术的例子包括(但不局限于)寡核苷酸定向诱变、接头扫描诱变或采用聚合酶链反应的寡核苷酸定向诱变(Ausubel(1987)CurrentProtocols in Molecular Biology)。
纤维素酶产生有所提高的突变型金孢子菌属克隆的选择或筛选也可采用常规方法。筛选突变株的选择标准包括(但不局限于)真菌克隆破坏纤维素酶的能力(可从生长在含纤维素培养基平板中的真菌使纤维素变澄清来看出)以及真菌克隆在含纤维素培养基中生长速度的提高。例如，在诱变后，用常规方法将真菌样品接种在含纤维素的琼脂平板上。可选出显示生长和纤维素清除有所提高的菌落(从分离物周围的培养基变澄清来看出)。然而，可采用纤维素变澄清的任何其它试验。一旦分离出突变株，可用常规方法来维持从突变株获得的原种或孢子。用该方法分离获得的突变株可在本文所述的条件下及用于金孢子菌属野生型菌株的条件下培养或发酵。可对突变株产生的纤维素酶组合物的单个酶组分进行部分测序或微测序，以便设计出合成残留来分离编码感兴趣酶蛋白的基因。因此，本发明涉及编码金孢子菌属突变株产生的纤维素酶的核酸序列以及酶本身。在本发明的另一个实例中，可对分离获得的突变株进行进一步诱变，并用本文上述方法筛选。
本发明还涉及具有所需金孢子菌属任何菌种和菌株的内切葡聚糖酶和/或纤维二糖水解酶活性的纤维素酶的生产、分离和纯化方法，其中纯化方法不受生物种类所限制。根据本发明，如此纯化或部分纯化获得的蛋白级分以及从其制得的酶在诸如石洗、增亮、脱毛和软化织物以及本领域熟知的其它应用中是非常有用的。这种纯化获得的酶制品适于用作洗涤剂以及用于此类应用的其它介质中的添加剂。这些以及其它使用方法对本领域技术人员来说是很容易明白的，这里不作详细的描述。然而，在下文实施例中提供了采用这些酶制品的典型方法。
本文中引用的所有书籍、专利或文章均纳入本文作参考。下列实施例描述了本发明的不同方面，但是它们决不是限制了本发明。所有百分数表示是重量百分数，所有溶剂混合物比例用体积比表示，除非另有特指。
材料和方法
酶试验。CMC酶试验以羧甲基纤维素作为酶底物来测定水解的初始速度，并定量分析根据Somogyi和Nelson的方法释放出的还原糖。Methods inEnzymology卷160A,102-104页中描述了该方法。根据Bioorganicheskayakhimia Vol.6,1225-1242页(内粘度试验)，用粘度计量法测定内切1,4-β-葡聚糖酶活性，以可溶性底物CMC粘度的降低速度表示。滤纸活性(FPA)或总纤维素活性采用滤纸作为底物，并估计从50mg滤纸样品中释放2毫克葡萄糖所需的活性。该试验根据生物技术委员会(Comminssion on Biotechnology)(IUPAC)的纤维素酶总活性或纤维素酶真实活性测定方法，其在Methods in Enzymology,Vol.160A,94-97页中有所描述。通过微晶纤维素水解时还原糖形成初始速度来估计微晶纤维素酶活性(如Bioresource Technology,Vol.52,119-124页中所述)。纤维二糖酶试验采用纤维二糖作为底物，测定释放的葡萄糖量(如Methods in Enzymology,Vol.160A,pp.111-112中所述)。β-葡糖苷酶活性试验用对-硝基苯-β-D-葡糖苷作为底物(Methods in Enzymology,Vol.160A,109-1100页)。用Lowry方法测定蛋白(根据Journal of Biological Chemistry,Vol.193,165-175页)。RBB-CMC酶试验是测定可溶性底物RBB-CMC(CMC，用Remazolbrilliant Blue来染色)释放出的染料，参照的试验可见Megazyme(Australia)Ltd.,Product Information Bulletin,1995年4月的。内切纤维素酶还可用Azurine交联的HE纤维素作为底物的Cellazyme试验来测定(见Megazyme Product Bulletin CEL,1996年1月)。
实施例1C1菌株的分离
从俄罗斯联邦的Sola Lake,Far East(俄罗斯太平洋沿岸，莫斯科以东约5000英里)的森林碱性土壤样品中分离出菌株。混合的土壤样品集自10处不同的地方。将1g每份样品转移到有100毫升无菌饮用水的烧瓶中，用超声分散器超声处理1分钟(0.44Amp,22KHz)。将悬液(1∶500稀释)接种到有含100毫克/升链霉素的Czapek培养基(pH5.5-6.0)的培养皿中。进行研究，一式三份。鉴定出不同的颜色形状和大小的菌落，以便进行第二次分离。在有Czapel培养基、麦芽琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂或Getchinson盐水培养基pH7.5(表2)的平板上进一步分离样品。使平板在约28℃下培育数天。在含有表1所示组分的纤维素琼脂板上选择纤维素酶产生株。如Methods in Enzymology卷160A中所述的方法制备非晶性纤维素。
表1纤维素琼脂板
组分 克/升 KH2PO4 1
KCl 0.1MgSO4·7H2O 0.3
NaCl 0.1 FeCl3 0.01 NaNO3 2.5非晶性纤维素 5
琼脂 15
pH 7.5
将平板培养在28℃下3-7天。在菌落周围形成亮而澄清的环表明有纤维素酶活性。选出具有显著纤维素酶活性的菌株(这里命名为C1)以作进一步研究。该菌株于1996年8月29日根据布达佩斯条约保藏在俄国科学院全俄微生物保藏中心(VKM)(英语简称为RCM,Bakhrushina St.8:Moscow,Russia,113184)中，保藏号为Chrysosporium lucknowenseGarg 27K,VKM-F3500D。
实施例2C1菌株的性质鉴定
使C1菌株在马铃薯葡萄糖琼脂上生长，7天后获得直径为55-60mm的菌落。C1菌落呈乳白色，表面呈绒毛状，中央稍稍凸起。菌落边缘平而薄，且有纤丝。菌落背侧呈亮奶油色。
菌丝体透明，稍稍分枝，平滑。菌丝壁薄。气生菌丝分开，形成2.0-3.0微米宽的孢子；基底菌丝无菌。
分生孢子为端生和侧生。未发现间生孢子。大多数孢子通过短茎或短侧枝与菌丝相连。孢子是分开但毗邻的。孢子透明，壁薄、呈卵形或棒状，并且是单细胞。它们的大小在直径为4-10微米。
C1菌株可以维持在麦芽抽提物琼脂(4℃)中，并且每隔6个月传代。也可维持在液氮中或冻干。C1菌株是单倍体，丝状，可生长在具有生长抑制剂(如牛胆汁(1.5％))的琼脂板上，并产生孢子。
实施例3C1菌株的分类
根据Sutton分类法(Van Dorschot,C.A.N.[1980]＂A revision of Chrysosporiumand allide genera＂,Studies in Mycology,No.20,Centraaddbureau voorSchimmelcultures,Baarn,The Netherlands,1-36页)，本发明的C1菌株属于丝状菌目、念珠菌科、金孢子菌属、Chrysosporium lucknowense种Garg1966。这一分类是根据C1菌株下列特征的观察结果来确定的：
1.丝状菌目的特征。在菌丝体上、分开的产孢子细胞上或不同的分生孢子柄上直接产生分生孢子。
2.念珠菌科的特征。分生孢子和分生孢子柄(如果存在的话)是透明或光亮色；分生孢子柄是单个或疏松的丛簇。
3.金孢子菌Corda133属的特征。菌落通常通常呈扩散，白色，有时带奶油色、淡棕色或黄色、毡状和/或粉末状。菌丝大部分是透明的，壁光滑，有不规则、或多或少常位分枝。能育的菌丝表现出较少的或没有分化。分生孢子是端生和侧生的，体殖产孢的(thallic)，均生长在菌丝上，无柄或有短突出或侧枝，亚透明或淡黄色，壁厚或壁薄，近球形，棒形，梨形，orobovoid，单细胞，很少有双细胞，平头。有时有间生孢子，它是单生的，偶尔是链状的，亚透明或淡黄色，较支持菌丝宽，通常是单细胞，两端平头。偶尔也存在厚壁孢子。
4.Chrysosporium lucknowense Garg1966种的特征。在Sabouraud葡萄糖琼脂上14天时获得菌落，直径为55mm，奶油色，毡状和绒毛状；稠密，高3-5mm；边缘清晰、规则且呈伞状；反面呈淡黄色至奶油色。菌丝透明，光滑，壁薄，分枝少。气生菌丝大多数是能育的，紧密分隔的，宽约1-3.5mm。深层菌丝不能育，宽约1-4.5mm，较薄的菌丝通常是扭曲的。分生孢子是端生和侧生的，大多数无柄或较短，通常有锥形突出或短侧枝。分生孢子是单个的，但是相互之间靠得很近，一个菌丝细胞上长有1-4个分生孢子，亚透明，壁相当薄且光滑，接近球状，同样呈棒状orobovoid，单细胞，2.5-11×1.5-6mm，基痕(basal scar)较宽(1-2mm)。没有间生分生孢子。没有厚壁孢子。
5.C1菌株的表述。菌落在马铃薯葡萄糖琼脂上7天时长至直径为55-60mm，呈白色-奶油色，毡状，中央高2-3mm；边缘清晰、规则、伞状；反面呈浅白色，奶油色。菌丝透明，光滑，壁薄，分枝少。气生菌丝能育，分开，宽2-3mm。深层菌丝不能育。分生孢子是端生和侧生的；无柄或在短侧枝上；没有；呈单个，但是相互之间靠得很近，透明，壁薄而平滑，接近球状，棒状或orobovoid状，单细胞，4-10mm，没有厚壁孢子。没有间生分生孢子。
结论。C1是Chrysosporium lucknowense Garg1966的一个菌株。为了方便起见，在本文中，将该菌株制备的纤维素酶称为“C1”或“C1纤维素酶”。
实施例4纤维素酶活性试验
使C1菌株在220rpm下转动的800毫升摇瓶中生长，并在28℃下培育。使C1菌株生长在含有5克/升不同营养物的盐水Getchinson培养基(见表2)(pH7.5)中，在一些情况下培养基中有2克/升微晶纤维素。每个烧瓶中加入100毫升培养基。
表2.摇瓶中的Getchinson培养基
克/升 KH2PO4 1
KCl 0.1MgSO4·7H2O 0.3
NaCl 0.1
FeCl3 0.01
NaNO3 2.5
葡萄糖与微晶纤维素、右旋糖与微晶纤维素、甘油与微晶纤维素、乳糖与微晶纤维素的组合致使生长非常缓慢，形成菌丝体的大聚集物，且没有纤维素酶活性(CMC酶试验)。结果显示在表3中。加入有机氮源(即蛋白胨、玉米浆或酵母抽提物)增强了生长和纤维素酶的产生，但不会产生菌丝体聚集。
乳糖和酵母抽提物使得C1纤维素酶产量最高。当用25克/升甜菜浆、15克/升大麦芽和5克/升麦糠代替乳糖和酵母抽提物时，可获得类似结果。
表3．碳源和氮源对C1的CMC酶活(摇瓶结果)的影响
底物 pH7.0时的CMC酶活(单位/毫升)
天数
3 5 7葡萄糖+纤维素 0 0 0右旋糖+纤维素 0 0 0甘油+纤维素 0 0 0乳糖+纤维素 0 0 0乳糖+玉米浆 0 0 0.9乳糖+蛋白胨 10.7 7.4 14.8乳糖+酵母抽提物 0 18.5 10.0纤维素+蛋白胨 0.3 1.2 1.6纤维素+玉米浆 1.9 2.8 5.5
实施例5石洗试验用纤维素酶的制备
1．摇瓶制备。使C1菌株在220rpm下转动的800毫升摇瓶中生长，并在28℃下培育数天。每个摇瓶中有100毫升生长培养基，其为含有25克/升甜菜浆、15GG大麦芽和5克/升麦糠的盐水Getchinson培养基(见表2)(pH7.5)。离心分离出细胞团块，将无细胞上清液冻干，并保藏以便进行进一步测试。通过这种方式制得C1纤维素酶制品#47.1.1至47.15.1。用相同方法制得C1制品#47.16.1，只是在离心后冻干前用10kDa截留膜来对无细胞上清液进行超滤。用相同方法，在摇瓶中用Getchinson培养基制得C1制品#47.18.1至47.22.1，只是用乳糖(0.5％w/v)和蛋白胨(0.5％w/v)代替甜菜浆、大麦芽和麦糠。离心分离出细胞团块，将无细胞的上清液冻干并保藏以作进一步测试。用与制品#47.1.1-47.15.1相同的方法在摇瓶中制得制品#47.1000,47.1001,47.2000&47.2001，只是它们用其它金孢子菌属菌株制得。具体的说，47.2001由Chrysosporium pannorum产生，47.2000由Chrysosporium pruinosum产生，47.1001由Chrysosporium keratinophilim产生，47.1000由Chrysosporium quenslandicum产生(见实施例8)。这些C1制品的蛋白含量和活性指纹列在表4中。
表4．C1制品和以及从其它金孢子菌属种类制得的制品#47.1000,47.1001, 47.2000&47.2001的蛋白含量和活性指纹(fingerprint)制品编号# 蛋白％ FPA, CMC酶， 内切(粘度) 微晶纤维 β-葡糖苷
FPU/g U/g U/g 素酶U/g 酶U/g47.1.1 22 13 170 120 23 13547.2.1 26 14 137 110 22 19047.3.1 15 19 140 128 18 19847.4.1 18 23 150 133 55 22047.5.1 16 20 179 120 71 18547.6.1 17 22 224 134 82 28047.7.1 8 4 78 123 10 2247.8.1 22 14 168 123 19 12447.9.1 28 15 204 174 23 15147.10.1 24 11 181 185 16 14747.11.1 28 16 234 191 25 26947.12.1 26 14 167 138 20 17847.13.1 25 9 137 110 13 14147.14.1 15 6 39 33 9 5947.15.1 14 6 95 44 10 7547.16.1 16 10 146 39 15 10747.17.1 7 3 100 34 5 2947.18.1 10 30 120 38 10 4247.19.1 14 4 28 10 4 1147.20.1 14 6 17 5 1 947.21.1 13 3 34 5 3 947.22.1 14 5 35 6 3 1047.1000 18 4 31 35 6 8947.1001 18 6 103 38 10 6647.2000 10 3 78 31 7 6747.2001 13 3 45 39 7 447.0325 50 155 4965 964 184 24847.0528 67 111 13500 1782 232 423
2．发酵罐生产。在10L“ANKUM-1M”发酵罐中，用Getchinson培养基、乳糖(0.5％w/v)、蛋白胨(0.5％w/v)和氯霉素(50mg/mL)生产C1纤维素酶。营养培养基最初体积为7.0L，发酵后的最终体积为7.3L。控制溶氧浓度(DO)、搅拌速度、通气水平、温度和pH。发酵采用批料操作。发酵温度控制在28℃。最初pH为7.5，以后则通过加入NH4OH(12％w/v)来维持。通气水平为4-5升/分钟，以400-500rpm搅拌。维持溶氧高于50％。每隔8小时取样(30ml)分析。在发酵最后，离心(10000g，室温，20分钟)分离出真菌生物物质，冻干培养过滤物，保藏以便进一步测试。结果列在表5中。以同样方法制得纤维素酶制品#47.17.1。表4中显示了该C1制品的蛋白含量和活性指纹。
表5．在10L发酵罐中生产C1纤维素酶
时间(小时) DO(％) 还原糖(克/升) CMC酶(U/mL)
0 100 4.8 0
8 90 4.7 0
16 54 4.4 0
24 66 1.2 4
32 70 0.4 10
40 73 0.3 11.5
48 70 0.1 5
56 70 0 1
3．C1制品#47.0325和47.0528的生产。用野生型C1菌株生产C1纤维素酶制品#47.0325，用从野生型C1菌株的改进型突变株生产47.0528。这些制品在如实施例13和15所述的条件下在发酵罐中生长。制品47.0325用批料发酵生产，47.0528用补料分批发酵程序生产。
4.腐质霉属野生型制品#14.22.1&14.23.1的生产。野生型Humicola grisea var.thermoidea制品#14.22.1用ATCC16453菌株生产，野生型Humicola insolens制品#14.23.1用ATCC16454菌株生产。用上述C1制品#47.1.1-#47.15.1的相同方法(摇瓶内的生产方法)，在摇瓶内制备这些腐质霉属野生型制品。
实施例6C1与其它中性纤维素酶的比较
将C1酶制品#47.0528的FPA、CMC酶和内切葡聚糖酶活性与商业上出售的Humicola insolens(Denimax XT)以及野生型ATCC腐质霉属(制品#14.22.1humicola grisea var.thermoidea(ATCC16453)&14.23.1Humicola insolen(ATCC16454))中性纤维素酶作比较。结果列在表6中。C1#47.0528的总活性明显高于野生型腐质霉属和商业上出售的Humicola insolen制品的中性纤维素酶。C-147.0528的特异性CMC酶和内切葡聚糖酶活性(每克干制品的单位或每克蛋白的单位)高于表6中列出的所有的测试腐质霉属制品。C-1#47.0528的特异性FPA高于腐质霉属野生型制品#14.22.1&14.23的特异性FPA，而稍稍低于商售产品Humicola insolen(Denimax XT)的特异性FPA。C1纤维素酶的pH和热稳定性与Denimax XT相似。
表6.C1与腐质霉属纤维素酶的比较
蛋白％ FPA CMC酶 内切(粘度) FPA CMC酶 内切(粘度)
单位/每克干制品 单位/每克蛋白C1(47.0528) 67 111 13,500 1782 165 20,115 2,655 腐质霉属 10 2 28 30 20 280 300 (#14.23.1) 腐质霉属 10 1 11 19 10 110 190 (#14.23.1)Denimax XT 13 25 450 99 192 3,460 761 (商售)(*)活性在pH5.0、50℃下测得。
实施例7pH和温度对C1 FPA的活性与稳定性以及CMC酶活性的影响
C1的FPA和CMC酶活性在约pH6-7、约50-60℃时表现出最优的稳定性和活性；对于CMC酶活性，最优pH约为6.5，最优温度约为55℃(见表8,9)。在pH8.0(50℃)时，CMC酶具有80％的活性，FPA有78％的活性；在pH9.0(50℃)时，CMC酶具有65％的活性，FPA有52％的活性(见表7)。
表7．50℃时pH对C1纤维素酶(47.19.1)的FPA和CMC酶活性的影响
pH(50℃) FPA(％) CMC酶(％) 4.0 50 60 4.5 68 70 5.0 75 78 5.5 80 80 6.0 92 90 6.5 100 100 7.0 95 95 7.5 90 92 8.0 78 80 8.5 60 75 9.0 52 65
FPA试验的培育时间为60分钟，CMC酶试验的培育时间为5分钟。
表8．pH7.0时温度对C1纤维素酶(#47.19.1)的FPA和CMC酶活性的影响
温度(℃) FPA(％) CMC酶(％) 40 45 50 45 60 55 50 70 65 55 100 400 60 70 60 65 40 30 70 20 25
FPA试验的培育时间为60分钟，CMC酶试验的培育时间为5分钟。
表9．50℃时C1纤维素酶(#47.19.1)的CMC酶稳定性 残留的CMC酶活性(％)时间(小时) pH5.1 pH7.2 pH7.7 pH8.5
0 100 100 100 100
0. 100 98 95 85
1 100 95 93 55
2 100 82 78 32
3 100 78 65 25
5 100 75 45 15
C1的CMC酶在最优pH和温度下表现出较高的稳定性：例如，在pH7.2和50℃下，CMC酶在1小时后有95％的活性，在5小时后有75％的活性；在pH7.7和50℃下，CMC酶在l小时后有93％的活性，在5小时后有45％的活性(见表9)。
实施例8在金孢子菌属同属其它菌株中证实有中性和或碱性纤维素酶活性/性能
测试金孢子菌属中各菌株生产纤维素酶的情况。这些菌株的全名和来源如下。
从美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,Maryland)获得的菌株包括：
1.ATCC44006Chrysosporium lucknowense
2.ATCC34151Chrysosporium pannorum
3.ATCC24782Chrysosporium pruinosum
从俄国微生物保藏中心(VKM)获得的菌株包括：
1.VKMF-2119Chrysosporium keratinophilum
2.VKMF-2875Chrysosporium keratinophilum
3.VKMF-2120Chrysosporium lobatum
4.VKMF-2121Chrysosporium merdarium
5.VKMF-2116Chrysosporium guenslandicum
6.VKMF-2117Chrysosporium guenslandicum
7.VKMF-2877Chrysosporium tropicum
在该研究中采用了两类生长培养基：培养基A-有甜菜浆、大麦芽和麦糠的Getchinson培养基；培养基B-有蛋白胨和乳糖的Getchinson培养基。培养基组成如表11所述。
表11摇瓶研究用培养基 培养基A 克/升 培养基B 克/升 K2HPO4 1 K2HPO4 1
KCl 0.1 KCl 0.1MgSO4·7H2O 0.3 MgSO4·7H2O 0.3 NaCl 0.1 NaCl 0.1 FeCl3 0.01 FeCl3 0.01 NaNO3 2.5 NaNO3 2.5 甜菜浆 25 乳糖 5 大麦芽 15 蛋白胨 5 麦糠 5 pH 7.5
pH 7.5
使菌株在220rpm、28℃下的摇瓶中生长。生长在培养基A中的每一菌株样品在培养6-7天后取出分析。生长在培养基B中的菌株样品在5天后取出。所有样品均在pH5和7下测定CMC酶活性。CMC酶试验的结果列于表12中。
表12.金孢子菌属不同菌株的纤维素酶产量
菌株 培养基A(6天) 培养基A(7天) 培养基B(5天)
RS CMC酶 RS CMC酶 RS CMC酶
pH5 pH7 pH5 pH7 pH5 pH71.VKMF2117 2.7 0 0.46 2.6 0.00 0.00 2.3 0.21 0.092.VKMF2116 1.1 0.22 0.04 0.2 0.38 0.61 4.0 0.58 0.593.VKMF2121 1.9 0 0.57 1.1 0.25 0.10 2.5 0.25 0.094.ATCC24782 3.4 0.33 1.40 1.9 1.85 0.11 3.0 1.10 0.065.ATCC34151 1.0 1.54 0.90 0.9 0.17 0.20 4.3 0.81 0.906.ATCC44006 4.4 0.21 0.49 2.0 0.68 0.34 2.5 1.29 0.067.VKMF2119 4.1 0 0.08 2.7 0.29 0.00 3.8 0.95 0.048.VKMF2120 4.5 0 0.17 2.3 0.23 0.00 2.3 0.12 0.009.VKMF2875 1.6 0 1.01 1.7 0.00 0.00 3.8 1.95 0.0510.VKMF2877 2.4 0 0.03 0.8 0.22 0.00 5.0 0.43 0.0011.Cl(VKMF 2.9 1.70 1.65 nt nt nt 0.1 0.89 0.80
3500D)
RS=发酵最后发酵培养基中的还原糖浓度，克/升(Nelson-Somogi法)
pH5,pH7=测定发酵肉汤CMC酶活性的pH值
CMC酶活性用U/ml表示。
nt=未测试
在菌株ATCC34151 Chrysosporium pannorum、ATCC24782 Chrysosporiumpruinosum、VKMF-2875Chrysosporium keratinophilum、VKMF2116Chrysosporium guenslandicum例中，离心除去细胞团块，用10kDa截留膜将无细胞上清液从5升超滤浓缩成0.5升。然后冻干超滤浓缩物保藏以备测试。
采用下列编号#的纤维素酶干制品：
47.2001-ATCC34151 Chrysosporium pannorum
47.2000-ATCC 24782 Chrysosporium pruinosum
47.1001-VKMF-2875 Chrysosporium keratinophilum
47.1000-VKMF 2116 Chrysosporium guenslaandicum
这些制品的蛋白含量和活性指纹列在表4中。
实施例9石洗测试
A.用2L专用洗衣机测试。该系统评价了仅用少量酶获得的关于磨蚀和背染的石洗性能。
退浆。在家用洗衣机中，60℃、pH约5至6下，对40片粗斜纹布织物(每片30克，25×20cm)退浆20分钟，采用1∶6的织物：液体比(7.2L)和0.5克/升(3.6g)Sandoclean PC液(以平均有6摩尔环氧乙烷的乙氧基化脂肪醇为基的非离子型洗涤剂和润湿剂)，1克/升(7.2g)Simix 2UD(酸性缓冲多价螯合剂)和1克/升(7.2g)Bactosol TK液(高温稳定α淀粉酶)。20分钟后，排出液体，用液体比为1∶10的冷水(14L)洗涤织物片5分钟。在40℃下干燥织物片，并用作测定纤维素酶活性的可比较样品原料。
衣物片的纤维素酶处理在一洗衣机中进行，该洗衣机由直径为29cm的内筒组成，筒总体积为10.6升(筒以20rpm旋转，向左转5圈，再向右转5圈)。在纤维素酶处理前，用4个橡皮塞将每片织物缝在一起形成一个衣物袋，以确保机械作用主要发生在衣服的较深色外侧上。每个筒内装有一个袋子和额外的10个橡皮塞。
通常的洗涤条件是：30g退浆的粗斜纹布牛仔织物，纤维素酶在0.02M柠檬酸缓冲液中，50℃,60分钟，衣物∶液体比为1∶4。在纤维素酶处理后，用热水(50℃)洗涤袋5分钟(衣物：液体比为1∶20)，并干燥以作评价。
用各种C1纤维素酶制品、从金孢子菌属不同种类制得的其它纤维素酶制品、以及商用Novo Nordisk中性纤维素酶产品Denimax XT(美国专利4,435,307)和Ultra MG(WPO91/17243)来进行应用试验。建立这些应用试验用来评价C-1以及其它金孢子菌属种类的纤维素酶相对于Novo商售中性纤维素酶的石洗性能。该试验在中性和碱性pH条件(6.5,6.7,7.0和8.0)下进行。结果列于表13中。结果表明，用各种C1和其它金孢子菌属纤维素酶制品处理衣物的洗涤性能特点与商售中性纤维素酶Denimax XT和Denimax Ultra MG相似。当在中性和碱性pH条件下运作时，C1和其它金孢子菌属纤维素酶制品表现出优良的软化效果、优良的漂白/总体暗度减少、优良的磨蚀水平以及较低的背染值。数据颜色(Datacolor)测定根据样品的亮度(反射性)。将样品暴露在白光(2个脉冲闪光灯)下，用16个二极管检测400-700钠米之间的减少量。布前侧的反射数值越高则磨蚀越多。背侧的反射数值越高则背染程度越高。
表13.用专用2升洗衣机的酶洗涤(每次运行洗135g粗斜纹布) 酶 量 g ％OW G CMC酶 内切(粘度)℃液体比pH时间(分钟)缓冲液数据颜色磨蚀数据颜色背染 C-1 47.11.1 1.995 1.5 234 474 191 381 50 1∶11 7.2 60 0.02MP 13.1 1.8 Denimax XT 0.133 0.10 450 60 99 13 50 1∶11 7.0 60 0.02MP 13.1 2.4 C-1 47.12.1 2.100 1.5 167 338 138 290 50 1∶11 6.7 60 0.02MP 14.2 1.8 Denimax XT 0.420 0.30 450 182 99 42 50 1∶11 6.6 60 0.02MP 14.0 2.3 C-1 47.9.1 3.29 2.44 204 671 174 572 50 1∶11 6.7 60 0.02MP 17.1 1.8 C-1 47.16.1U 2.3 1.7 146 336 39 90 50 1∶11 6.7 60 0.02MP 16.2 2.3 47/1000.1 70 5.19 48 336 14 98 50 1∶11 6.5 60 0.02MP 12.9 2.1 47/2001.1 7.15 5.30 47 336 20 143 50 1∶11 6.5 60 0.02MP 14.7 1.7 Denimax UltraMG 0.132 0.10 134 18 243 32 50 1∶11 7.3 60 0.02MP 14.1 3.5 C-1 47.19.1 7.14 5.29 28 200 9 64 50 1∶11 6.5 60 0.02MP 14.7 1.9 C-1 47.0325 0.068 0.05 4965 338 964 66 50 1∶11 7.0 60 0.02MP 15.1 2.3 Denimax XT 1.0 0.74 450 450 99 99 50 1∶11 6.5 60 0.02MP 19.1 2.8 C-1 47.0528 0.08 0.05 4800 384 1782 143 50 1∶11 6.5 60 0.02MP 18.5 3.0 C-1 47.0325 0.136 0.10 4965 675 964 131 50 1∶11 6.0 60 0.02MP 18.3 3.8 C-1 47.0325 0.136 0.10 4965 675 964 131 50 1∶11 7.0 60 0.02MP 18.9 3.2 C-1 47.0325 0.136 0.10 4965 675 964 131 50 1∶11 8.0 60 0.02MP 16.7 2.5 腐质霉属 14.22.1 9.18 6.80 28 257 30 275 50 1∶11 6.7 60 0.02MP 14.9 1.3 腐质霉属 14.23.1 9.18 6.80 11 101 19 174 50 1∶11 6.7 60 0.02MP 12.5 1.5 T.reesei CP 0.30 0.22 9190 2737 2000 600 50 1∶11 4.8 60 0.02CA 17.5 8.0 空白 0.00 0.00 0 0 0 0 50 1∶11 6.5 60 0.02MP 9.1 n/a
0.02MP=磷酸盐缓冲系统
0.01CA=柠檬酸缓冲系统
T.reesei CP=产自Trichoderma reesei的酸性纤维素酶商业产品
数据颜色磨蚀=前面反射值，数值越高，磨蚀越多，空白值为9.1
数据颜色背染=背面反射值，数值越低，背染程度越低
％OWG=例如1％OWG指100英镑衣物用1英镑酶
B．35磅洗衣机测试。应用试验在35磅洗衣机上进行，35磅洗衣机牌号为Milnor，洗衣机RPM为30。载荷量为2400克(3件衣物)，所用衣物为Levi505牛仔裤。纤维素酶浴的水量为15升，液体比为6.25∶1(低)。其它纤维素酶浴的水量均为24升，液体比为10∶1(适中)。在纤维素酶浴时，采用的缓冲系统是MAP(磷酸二氢铵)和DAP(磷酸氢二铵)，以维持pH为6.7。试验4、5、6和7，在纤维素酶浴中加入非离子洗涤剂，已知在纤维素酶浴中加入洗涤剂有助于减少衣物上的背染。Zeke是退浆产品。SSCE是Superscour，一种非离子洗涤剂(Zeke和Super Scour,CPN International,Ltd.,Inc of Jupiter,Florida提供的专用于纺织物的商售化学产品)。这些试验中采用的洗涤配方的一个例子是下述试验2。
洗涤配方-试验2
(C-147.0528) 载荷(克)2400(3件衣物)织物：粗斜纹布配制时间： 1∶30 洗衣机：35#Milnor重量：14.5盎司开发者：步骤 操作时间(分钟)程度温度(F)化学物质 量％OWGpH 1 退浆 10中等150 Zeke 48克 2 2排水平衡 3 漂洗 2中等140 4排水平衡 5 漂洗 2中等130 6排水平衡 7 磨蚀 75低(15升)125 MAP 29克缓冲液6.7 DAP 10克 C-1 1.2克0.05 8排水平衡 9 洗涤 10中等160 SSCE 24克 1 10排水平衡 11 漂洗 3中等120 12排水平衡 13 漂洗 3中等100 14排水平衡 15 漂洗 3中等100 16排水平衡 17 脱水 2
在上述实施例以及商业应用中，本领域技术人员知道，在石洗过程中采用浮石可提高对衣物的总体石洗效果。
表14中的结果表明，C1纤维素酶制品#47.0325和#47.0528在衣物磨蚀总体水平上的效果更佳，并且在测试的其它商售中性纤维素酶产品的背染水平范围内。
表14.C-1纤维素酶制品47.0325&47.0528与商售中性纤维素酶Denimax XT&BTU202-318(含有Denimax XT)的比较试验 纤维素酶％ OWG 重量(g) 洗涤剂 T(°F) pH 时间(分钟)编号1 Denimax XT 0.50 12.0 无 130 6.7 752 C-1 47.0528 0.05 1.2 无 125 6.7 753 C-1 47.0325 0.10 2.4 无 125 6.7 754 Denimax XT 0.50 12.0 有 130 6.7 755 C-1 47.0528 0.05 1.2 有 125 6.7 756 C-1 47.0325 0.10 2.4 有 125 6.7 757 BTU202-318 2.50 60.0 有 130 SB 75
磨损 背染(最大到最小) (最小到最大) 试验5 试验4 试验6 试验5 试验2 试验6 试验3 试验3 试验4 试验1 试验1 试验2 试验7 试验7
表14的符号说明在1.0％OWG、160°F下，用Super Scour(非离子洗涤剂)清洗表14中所有试验5分钟。SB=自缓冲—商业产品“ROCKSOFT”BTU202-318，它含有Denimax XT、洗涤剂和缓冲系统以及其它添加剂，以有助于增强该商业产品的石洗性能。
C. 60升专用洗衣机测试。如2升洗衣机测试中所述的那样，对全部粗斜纹布衣物进行退浆。每一洗涤试验用一条牛仔裤(700克)和2.8升液体(织物：液体比为1∶4)。所有的牛仔裤来自同一染色批。它们预先用氧化方法洗涤15分钟，然后干燥。用配制的C1纤维素酶制品47.0325(每个试验用2.4克)和47.0528(一个试验中用1.5克，第二个试验中用1.0克)在中性pH下洗涤蓝色牛仔裤，将其与用Denimax XT(每个试验用12克)相似配方、以及其它两种商售中性纤维素酶Bactosol JE(用2.0％OWG)和BTU202-318(用2.0％OWG)(Bactosol JE和BTU202-318含有Denimax XT，缓冲液，洗涤剂和其它添加剂以增强它们的洗涤性能)在中性pH条件下洗涤的蓝牛仔裤直接比较。表15表明，所有三个C-1试验的蓝牛仔裤在获得的磨蚀程度以及衣物总体褪色上比三种商售中性纤维素酶产品更佳。6个试验中的蓝牛仔裤背染水平均非常佳，它们彼此非常相似，接近采用Novo中性纤维素酶Denimax XT时预计和观察到的效果。所有这三个C-1试验的背染水平均在表13所示的背染值范围内。在盲研究(blind study)中，由独立的四组人(每组有三人或三人以上)来评定这些试验，上表14中示出了这些试验成品衣物以及试验的评定结果。每组中的人员均是石洗领域专业技术人员。他们被要求按照下列次序来排列衣物：(1)按照整体磨损和褪色程度从最高到最低排列；和(2)按照背染程度从最低到最高排列(见表15)。
表15试验 酶 剂量 缓冲液 洗涤剂 磨损/褪色 背染试验A C-1 47.0528 1.5克 磷酸盐 有 ++++++ 5试验B C-1 47.0528 1.0克 磷酸盐 有 +++++ 2试验C C-1 47.0325 2.4克 磷酸盐 有 +++++ 4试验D Denimax XT 12.0克 磷酸盐 有 ++++ 3试验E BTU202-318 2.0％OWG 磷酸盐 有 +++ 6试验F Bactosol JE 2.0％OWG 柠檬酸盐 有 +++ 1
表15符号说明：
磨损/褪色-++++++(6个+)最佳，(大于等于++++(4个+)被认为是好的，与商售中性纤维素酶(如Denimax XT)相当)
背染-数字越小越好(判定所有牛仔裤均在用Novo的Denimax TX时所见背染程度的范围内)。与传统的酸性纤维素酶(如木霉属纤维素酶(见实施例13))相比，中性纤维素酶明显减少了背染。
％OWG-衣物重量的％，例如对于100英镑的干重牛仔裤，1％OWG指用1英镑酶。
D.光反射性。评价背染的另一个试验是测定经处理过的织物的光反射性。在洗涤处理的最后，用反射仪在两个不同的波长下分析牛仔裤样品：(1)680nm下检测到的信号越高(检测牛仔裤外部)，背染就越少；和(2)在420nm检测的信号越高(检测牛仔裤内部)，背染就越少。表16比较了粗斜纹布牛仔裤在用Novo Nordisk和Genencor International的商售纤维素酶和C-1制品#47.6.1处理后的反射值。
表16
酶 680nm 420nmDenimax L(中性纤维素酶，Novo) 23 20Primafast 100(酸性纤维素酶，Genencor) 20 13
C1 47.6.1(中性/碱性纤维素酶) 22 18
C1纤维素酶在680nm和420nm下的光反射值与Novo Nordisk的商业产品Denimax L(一种中性纤维素酶)相似，且明显优于Genencor的商业产品Primafast100(一种酸性纤维素酶)。
E.半工业洗衣机中的试验
试验#1
2条牛仔裤，重1343克
水比例为6∶1
pH5.5
温度54℃
酶：C1(制品#47.6.1)12克
(0.9％)
磨蚀时间90分钟
升降浴(drop bath)
用1％非离子洗涤剂66℃漂洗5分钟
升降浴
漂洗冷却
升降浴
用阳离子软化剂49℃软化5分钟
离心脱水并干燥
试验#2。进行上述试验#1的相同步骤，只是采用Denimax700T(2％OWG28.9克)酶，洗涤条件为pH7.0,54℃。
将C1纤维素酶与Denimax700T(Novo生产的一种中性纤维素酶商业产品)作比较。所有的牛仔裤来自同一染色批量。它们预先用氧化方法预洗15分钟，然后干燥。
与经Denimax700T纤维素酶处理过的牛仔裤相比，经C1纤维素酶制品#47.6.1处理的牛仔裤表现出稍低的磨损和较少的背染。
实施例10Cl纤维素酶作为洗衣房用洗涤剂的添加剂
A.棉花释放的污渍
用洗涤性能程序(wash-performance procedure)PW9406(Solvay)测试C1纤维素酶制品#47.9.1的洗涤性能。通过Delta反射％来测试从棉织物中释放出的污渍(油墨)。在有和没有碱性蛋白酶Opticlean L500的存在下，进行洗涤试验，比较C1纤维素酶制品(#47.9.1)与Novo Nordisk的纤维素酶0.7T。该试验的结果列于表17中。
C1纤维素酶和Humicola insolens的纤维素酶一样，在中性pH下颜色型洗涤剂中具有从油墨污染的棉中释放出污渍的性能。
表17.采用C1纤维素酶(*)的洗涤剂洗涤试验
测试的酶(pH7.0) CMC酶 反射值(％)
剂量(U/升) 1 2
纤维素酶0.7T 200 3.68 4.75
纤维素酶0.7T 500 2.68 4.07纤维素酶0.7T+5000DU/1(**) 200 2.07 3.13纤维素酶0.7T+5000DU/1(**) 500 2.08 3.22
C1#47.9.1 200 2.18 2.88
C1#47.9.1 500 2.77 3.72 C1#47.9.1+5000DU/l(**) 200 1.15 1.91 C1#47.9.1+5000DU/1(**) 500 2.81 3.30
无(对照) 无 0 0AADU=Du=Delft单位，Du/l=Defft单位/升(*)40℃下45分钟，在68℃干燥75分钟(**)碱性磷酸酶Opticlean L500
B.C1纤维素酶与丝氨酸蛋白酶在一起的稳定性
采用胰蛋白酶(3.2μM，来自牛胰腺，活性为10000-13000N-苄基-L-精氨酸乙酯(BAEE)/mg,Sigma T-8253)和α胰凝乳蛋白酶(8μM，来自牛胰腺，40-60U/mg,SigmaC-4129)作为丝氨酸蛋白酶。
使蛋白酶与C1纤维素酶在20℃、pH7.0下培育。胰凝乳蛋白酶在12小时内不减少C1活性，而胰蛋白酶则使C1活性稍稍降低(约20％)，见表18。
胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在pH4.5和7.0、50℃和57℃下不会明显改变C1CMC酶的稳定性，见表18。表18.蛋白酶对C1纤维素酶(#47.9.1)的CMC酶活性的影响蛋白酶 温度(℃) pH 培育时间(小时)保留的CMC酶活性(％)无(对照) 20 7.0 12 70+胰凝乳蛋白酶 20 7.0 12 70+胰蛋白酶 20 7.0 12 50无(对照) 50 4.5 3 100+胰凝乳蛋白酶 50 4.5 3 100+胰蛋白酶 50 4.5 3 100无(对照) 50 7.0 3 78+胰凝乳蛋白酶 50 7.0 3 60+胰蛋白酶 50 7.0 3 68无(对照 ) 57 4.5 3 62+胰凝乳蛋白酶 57 4.5 3 60+胰蛋白酶 57 4.5 3 62无(对照) 57 7.0 3 30+胰凝乳蛋白酶 57 7.0 3 30+胰蛋白酶 57 7.0 3 30
C.柠檬酸盐、EDTA、吐温-80和过硫酸盐对CMC酶活性的影响
从乙酸盐变为柠檬酸盐缓冲液(一种螯合剂)对C1 CMC酶活性没有影响(缓冲液摩尔浓度-0.1M,pH4.5,50和57℃)，见表19。
螯合剂EDTA(乙二胺四乙酸)(5mM)在pH4.5和50℃下不改变CMC酶活性。在pH4.5(57℃)和pH7.0(50℃)下时，它使CMC酶活性稍稍降低。在pH7.0和57℃下时，它使CMC酶活性稍有提高，见表19。
非离子洗涤剂吐温-80(3克/升，聚氧乙烯山梨聚糖醇单油酸酯)在pH4.5和7.0、50℃和57℃下不会改变C1 CMC酶的活性，见表19。
氧化剂过硫酸盐(3克/升)在pH4.5和7.0、50℃和57℃下不会改变C1的CMC酶活性，见表19。
C1 CMC酶能耐受丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)、螯合剂(EDTA、柠檬酸盐)、非离子洗涤剂(吐温-80)和氧化剂(过硫酸盐)。表19.柠檬酸盐、EDTA、吐温-80和过硫酸盐对C1纤维素酶(#47.9.1)活性的影响。培育时间-3时。影响物 浓度 温度(℃) pH 保留的CMC酶活性(％)无(对照) --- 50 4.5 100柠檬酸盐 0.1M 50 4.5 100EDTA 5mM 50 4.5 100吐温-80 3克/升 50 4.5 100过硫酸盐 3克/升 50 4.5 97无(对照) --- 57 4.5 62柠檬酸盐 0.1M 57 4.5 65EDTA 5mM 57 4.5 60吐温-80 3克/升 57 4.5 68过硫酸盐 3克/升 57 4.5 65无(对照) --- 50 7.0 78EDTA 5mM 50 7.0 50吐温-80 3克/升 50 7.0 52过硫酸盐 3克/升 50 7.0 50无(对照) --- 57 7.0 30EDTA 5mM 57 7.0 38吐温-80 3克/升 57 7.0 25过硫酸盐 3克/升 57 7.0 30
实施例11金孢子菌属不同株系产生的纤维素酶样品的石洗试验
金孢子菌属不同株系产生的制品#47.1000、47.1001、47.2000和47.2001用于洗涤试验，在2L专用洗衣机中pH6.5、50℃下洗涤135克退浆的粗斜纹布牛仔裤织物60分钟。每次试验的CMC酶活性总量恒定在336U/次。干燥后，用数据颜色测定方法来评价衣物的磨损和背染。结果列于表20中。结果表明，金孢子菌属不同株系产生的纤维素酶在中性pH下的洗涤性能(磨损与背染水平)与C-1种Chrysosporium lucknowense Garg1966产生的纤维素酶相似。表20.金孢子菌属不同株系的纤维素酶制品的石洗活性制品# 磨损(*) 背染(**)47.1000 12.3 1.647.1001 12.1 1.647.2000 14.2 1.747.2001 14.6 1.6(*)-布前面反射值，数值越高，磨损程度越高，空白值为9.1(**)-背面反射值，数值越高，背染程度越高
实施例12纤维素酶组分的纯化
1.选择C1样品以便纯化。鉴于C1纤维素酶制品47.11.1具有(ⅰ)较高的蛋白含量、(ⅱ)高的FPA和CMC酶活性(见表4)，选择#47.11.1以进一步纯化。
2.C1复合物组分的分离和纯化。第一步纯化步骤包括在DEAE-Toyopearl柱(TosoHaas,Japan)上进行离子交换层析。将干的C1纤维素酶制品(1.5g)溶解在15毫升0.01M钠-磷酸盐缓冲液(pH7)中。离心此溶液，用Acrylex P-2柱使上清液脱盐。然后使脱盐的样品在0.03M磷酸盐缓冲液(pH4.7)中上DEAE-Toyopearl柱(1.5×30cm)，吸附蛋白用流速为1毫升/分钟的0-0.2MNaCl梯度液洗脱。获得三组合并的级分一非结合(NB)级分在起始缓冲液中洗脱出来，级分Ⅰ和级分Ⅱ在0-0.2MNaCl梯度中洗脱出来。所有级分均具有分解纤维的活性。
3.蛋白级分的SDS-PAGE：在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，NB级分包括分子量从30到70kD的蛋白。级分Ⅰ包括分子量从25到100kD的蛋白，级分Ⅱ含有分子量从35到100kD的蛋白。SDS-PAGE采用变性条件、10％的分离凝胶(100×80×0.75mm)。试剂与试剂盒购自Bio-Rad(USA)。用25％三氯乙酸配的考马斯亮蓝R-250液进行蛋白质染色。
4.蛋白级分的IEF。在等电点聚焦(IEF)后，NB级分包括等电点(pI)为4.6-8.0的蛋白。级分Ⅰ含有pI值为3.2-5.5的蛋白，级分Ⅱ含有pI值为3.0-5.5的蛋白。在mini-IEF Model111(购自Bio-Rad)中用7％PAAG进行等电点聚焦。试剂和试剂盒购自Bio-Rad(USA)。用25％三氯乙酸配的考马斯亮蓝R-250液进行蛋白质染色。
5.蛋白级分的CMC酶活性的pH依赖性。表21表示C1纤维素酶的级分NB、Ⅰ和Ⅱ的CMC酶和RBB-CMC酶活性的pH依赖性。采用下列缓冲系统：乙酸盐缓冲液(pH4-5)、磷酸盐缓冲液(pH6-8)和碳酸盐缓冲液(pH8.5-10)。另外，还用了通用的缓冲体系，它由乙酸盐、硼酸盐和磷酸盐组成(pH4-10)。表21.pH对C1蛋白级分的CMC酶和RBB-CMC酶活性的影响CMC酶活性，50℃(％)pH NB级分 级分Ⅰ级分Ⅱ4.0 85 70 954.5 95 85 1005.0 100 90 955.5 90 100 906.0 80 90 806.5 70 85 807.0 65 85 807.5 60 35 758.0 50 60 608.5 45 50 509.0 30 45 409.5 10 40 32
RBB-CMC酶活性，50℃(％)pH NB级分 级分Ⅰ级分Ⅱ4.5 65 95 1005.0 100 100 955.5 95 100 906.0 95 95 906.5 80 87 907.0 80 85 877.5 60 65 858.0 50 60 708.5 45 60 609.0 30 50 409.5 10 40 32
在DEAE-Toyopearl离子交换层析后，级分NB、Ⅰ和Ⅱ的CMC酶和RBB-CMC酶活性呈不对称的钟型pH曲线。级分NB的CMC酶活性在pH4.5-5.5处最高，在pH8.0处为最高活性的50％。级分NB的RBB-CMC酶活性在pH5.0-6.0处最高，在pH8.0处为最高活性的50％。级分Ⅰ的CMC酶活性在pH5.0-6.0处最高，在pH8.5处为最高活性的50％。级分Ⅰ的RBB-CMC酶活性在pH4.5-7.0处最高，在pH8.5处为最高活性的50％。级分Ⅱ的CMC酶活性在pH4.0-5.5处最高，在pH8.5处为最高活性的50％。级分Ⅱ的RBB-CMC酶活性在pH4.5-7.5处最高，在pH8.5处为最高活性的50％。
6.DEAE-Toyopearl层析后蛋白级分Ⅰ的CMC酶的稳定性。表22示出了DEAE-Toyopearl离子交换层析后在不同pH(5.2-8.7)、50℃下，级分Ⅰ暂时的CMC酶活性曲线。级分Ⅰ的CMC酶活性在pH5.2-7.2处最稳定(3小时后丧失约30％-45％的活性)。在pH7.7下，约1小时后丧失60％的活性，而在pH8.3和8.7下时，约0.5小时后丧失50％的活性。在pH8.3下，3小时后丧失100％的CMC酶活性，在pH8.7下，2小时后丧失100％的活性。表22.DEAE-Toyopearl层析后蛋白级分Ⅰ在50℃下的CMC酶活稳定性时间 残余的CMC酶活性(％)(小时) pH5.2 pH7.2 pH7.7 pH8.3 pH8.7
0 100 100 100 100 100 0.5 97 75 65 50 50
1 90 55 40 25 15
2 40 50 35 10 0
3 30 45 45 0 0
7.DEAE-Toyopearl离子交换层析后各级分的性能。用微晶纤维素作为底物的吸附试验表明，级分Ⅰ和Ⅱ不与结晶纤维素结合，而NB级分与微晶纤维素结合，分配系数为0.2L/g。表23中列出了级分NB、Ⅰ和Ⅱ对不同底物的特异性活性。所有这三个级分均有CMC酶、内切葡聚糖酶、微晶纤维素酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性，但是级分NB与级分Ⅰ和Ⅱ不同，它没有β-葡糖苷酶活性。级分NB、Ⅰ和ⅡD微量粗斜纹布洗涤测试表明，在pH7下级分Ⅰ和Ⅱ具有大致相等的活性，而级分NB的活性较低(根据微量粗斜纹布洗涤试验(Micro DenimWash test))。
表23.DEAE-Toyopearl离子交换层析后各级分的特异性活性
特异性活性，U/mg蛋白级分 CMC酶 内切葡 微晶纤维 β-葡糖苷 β-葡聚糖 木聚糖 微量粗斜纹布
聚糖酶 素酶 酶 酶 酶 洗涤试验NB 9.9 6.2 1.8 0.0 11.0 5.3 +Ⅰ 3.7 2.3 0.02 3.6 1.9 0.7 ++Ⅱ 0.8 0.2 0.02 0.02 1.2 0.04 ++
8.微量粗斜纹布洗涤试验。进行该试验采用20毫升有预定CMC酶活性水平的酶的缓冲溶液。在50℃、过度机械应力(磨损)条件下处理真实靛蓝粗斜纹布染色样布60分钟。根据样品干燥后的褪色程度的一组评分来评价纤维素酶性能。还可使用测定颜色的工具和软件。“+”号越多表示磨损越好。
9.在DEAE-Toyopreal离子交换层析后的级分Ⅰ蛋白的进一步纯化。对脱盐的级分Ⅰ(25ml,0.8克/升蛋白)进行Macro Prep Q离子交换层析。MacroPrep Q柱(1.5×10cm)用0.03M,pH4.7的乙酸缓冲液平衡，用0-0.1M NaCl浓度梯度洗脱吸附的蛋白。收集三级分Ⅰ.1,Ⅰ.2和Ⅰ.3。级分Ⅰ.2在pH7下表现出最高的微量粗斜纹布洗涤活性，而级分Ⅰ.3活性最低。SDS-PAGE结果显示，级分Ⅰ.1和Ⅰ.2的不同在于级分Ⅰ.2中有低分子量的蛋白(25kD)，而它可能有石洗活性。IEF测定表明，级分Ⅰ.1的pI为4.2。级分Ⅰ.1和Ⅰ.3的蛋白浓度非常低，不能作进一步的研究。因此，对级分Ⅰ.2进行进一步纯化。
下一步纯化涉及在Mono P柱上的层析聚焦。级分Ⅰ.2用0.03M,pH6.8的咪唑缓冲液平衡，然后上柱。用多缓冲液74(Polybuffer74)(1∶8,pH4.0)洗脱吸附的蛋白，发现其中蛋白和活性曲线有2个主要的峰。第一峰(称为峰A)显示出CMC酶特异性活性(2.5单位/毫克)低于峰B(3.6单位/毫克)。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表明峰A中有2个蛋白条带存在，较高分子量的蛋白条带对刚果红染色的CMC有活性。在非变性条件下发现峰B中有一条活性蛋白条带。SDS-PAGE数据显示，峰A包括2种主要蛋白(60kD和70kD)，峰B含有一种主要蛋白(25kD)和一种次要蛋白(27kD)。峰B中收集的级分称为25kD-内切C1，对其作进一步研究。表24示出了25kD-内切C1对不同底物的特异性活性。25kD-内切C1有CMC酶、RBB-CMC酶、内切葡聚糖酶、FPA、微晶纤维素酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性，但是它不呈现β-葡糖苷酶活性。这种不同活性的组合表明25kD-内切C1是内切葡聚糖酶。CMC酶和RBB-CMC酶活性最适pH约为6.0(表24)。25kD-内切C1具有高的石洗活性(根据采用棉布样片的微量粗斜纹布洗涤试验)(见表24)。
在从Mono P柱上洗脱峰A时，回收得到许多60kD比70kD蛋白比例不同的级分，尤其是主要包括60kD蛋白的级分(称为70(60)kD-C1)和主要为70kD蛋白的级分(称为70kD-内切C1)。表24中列出了这些级分对不同底物的特异性活性。从中可以看出，与70kD-内切C1级分(内切葡聚糖酶活性为2.8U/mg，微晶纤维素酶活性为0.18U/mg)相比，70(60)kD-C1级分具有较低的内切葡聚糖酶特异性活性(0.5U/mg)和较高的微晶纤维素酶特异性活性(0.31U/mg)，并且有非常低的β-葡糖苷酶活性。对FP、β-葡聚糖和木聚糖的特异性活性低(见表24)，且只形成了微晶纤维素水解产物纤维二糖。70(60)kD-C1级分的石洗活性(根据采用棉布样片的微量粗斜纹布洗涤试验)低(见表24)。这些数据表明DEAE-Toyopearl离子交换层析后级分Ⅰ的60kD蛋白可称作一种纤维二糖水解酶。70(60)kD-C1(对于CMC和RBB-CMC)的最适pH约为5.0(表24)。
70kD-内切C1有高的CMC酶、RBB-CMC酶、内切葡聚糖酶、FPA、β-葡聚糖酶和木聚糖酶特异性活性(表24)。70kD-内切C1也有相当高的石洗活性(根据采用棉布样片的微量粗斜纹布洗涤试验)(见表24)。DEAE-Toyopearl离子交换层析后的70kD-内切C1看来是一种内切葡聚糖酶。从表24中可以看出，70kD-内切C1的CMC酶和RBB-CMC酶活性的最适pH约为6.0。
10．DEAE-Toyopearl离子交换层析级分Ⅱ蛋白的进一步纯化。在DEAE-Toyopearl柱上用较长的0-0.2MNaCl梯度(时间为8小时以上)将DEAE层析获得的级分Ⅱ分成3个级分(分别为级分Ⅱ.1、Ⅱ.2和Ⅱ.3)。SDS-PAGE的结果显示，级分Ⅱ.1包括分子量为60kD和100kD的2种主要蛋白，级分Ⅱ.2包括35kD、60kD和100kD的3种主要蛋白，级分Ⅱ.3包括43kD和60kD的2种主要蛋白。级分Ⅱ.3显示出最高的CMC酶活性(10单位/毫克蛋白)，但是洗涤活性低(用亚微量粗斜纹布试验(sub-Micro denim Wash test)),CMC特异性活性为1单位/毫克。级分Ⅱ.2没有表现出任何洗涤活性(但是CMC酶活性为0.7单位/毫克)。因此，对级分Ⅱ.1和Ⅱ.3作进一步纯化。
表24．C1酶的性能pH 25kD内 70(60)kD 70kD内 60kD内 100 43kD内 60kD内
切 切 切(Ⅱ.1) kD(Ⅱ.1) 切(Ⅱ.3) 切(Ⅱ.3)
CMC酶活性(单位/毫克)5.0 4.6 1.10 3. 0.70 0.03 1.02 1.326.0 5.0 0.83 3.8 0.52 0 1.01 1.077.0 3.9 0.65 3.0 0.45 0 0.90 1.03
RBB-CMC酶(单位/毫克)5.0 8.2 0.12 1.5 0.90 0 0.82 1.216.0 8.8 0.10 2.7 0.84 0 0.75 1.147.0 6.6 0.07 2.4 0.68 0 0.73 1.12
FPA(单位/毫克)5.0 1.0 0.17 0.61 0.31 0 0.45 0.52
内切葡聚糖酶(粘度测定)(单位/毫克)5.0 2.26 0.50 2.8 0.21 0 0.15 0.27
微晶纤维素酶(单位/毫克)5.0 0.16 0.31 0.18 0.03 0 0.01 0.01
β-葡糖苷酶(单位/毫克)5.0 0 0.02 0.16 0.02 0 0.02 0
β-葡聚糖酶(单位/毫克)5.0 0.66 0.07 2.4 1.3 0 3.9 4.4
木聚糖酶(单位/毫克)5.0 0.40 0.16 0.50 0.06 0.01 0.07 0.01
微量粗斜纹布洗涤活性5.0 +++ - ++ nd nd nd nd7.0 +++ - ++ nd nd nd nd
亚微量粗斜纹布洗涤活性5.0 nd nd nd +++ - + +7.0 nd nd nd +++ - +++ ++ nd=未测定
11.亚微量粗斜纹布洗涤试验。在过度机械应力、50℃下，用2毫升缓冲酶溶液(2单位CMC酶活性)对真实靛蓝染色粗斜纹布进行该试验2小时。根据样品干燥后的褪色，用一组评分来评价纤维素酶的性能水平。
12.级分Ⅱ.1的纯化。将级分Ⅱ.1施加到用0.03M,pH4.75乙酸盐缓冲液平衡的Macro prep Q柱上，用NaCl梯度(0-0.3M)洗脱吸附的蛋白。获得两个蛋白峰，但只有第一个显示CMC酶活性。对第一峰物质进行SDS-PAGE，显示出60kD和100kD两个蛋白以均一状态分离。根据IEF数据，60kD和100kD蛋白具有约为3的酸性pI。表24中显示了60kD和100kD蛋白对不同底物的活性。发现60kD蛋白(称为60kD(Ⅱ.1)-内切C1)在pH5下具有内切葡聚糖酶、CMC酶、RBB-CMC酶、FPA和β-葡聚糖酶活性(如表24所示，分别为0.2,0.7,0.9,0.3和1.3单位/毫克蛋白)。微晶纤维素酶、β-葡糖苷酶和木聚糖酶活性相当低。这些活性的组合表明60kD(Ⅱ.1)-内切C1是内切葡聚糖酶。60kD(Ⅱ.1)-内切C1在pH5和pH7下也具有较高的洗涤活性(通过亚微量粗斜纹布洗涤试验)(见表24)。该蛋白的CMC酶和RBB-CMC酶活性的pH依赖性在pH4.0-4.5时有最高活性，pH6时保留了50％的最高CMC活性和85％的最高RBB-CMC活性，在pH9和10时两种活性均保留15-20％(见表25)。
级分Ⅱ.1的100kD蛋白(称为100kD(Ⅱ.1)蛋白)几乎没有纤维素酶活性(表24)。该蛋白仅仅有非常低的CMC酶(0.03单位/毫克)和木聚糖酶(0.008单位/毫克)活性，因此不能确定是溶纤维素的酶。根据亚微量粗斜纹布洗涤试验，100kD(Ⅱ.1)蛋白没有表现出任何石洗活性(表24)，并且在pH5或pH7下均没有蛋白酶活性。
13.级分Ⅱ.3的纯化。用Macro Prep Q层析还对级分Ⅱ.3进行了纯化。吸附的蛋白用0.2-0.6MNaCl梯度洗脱(起始缓冲液是0.03M乙酸盐，pH4.75)。在Macro Prep Q层析后对获得的级分进行SDS-PAGE，结果表明获得了均质形式的43kD和60kD蛋白。对这些蛋白进行等电点聚焦，显示出43kD和60kD蛋白的pI值约为3。43kD和60kD蛋白分别称为43kD(Ⅱ.3)-内切C1和60(kD)-内切C1。这些酶对不同底物的活性(见表24)表明它们有相似的CMC酶、FPA、微晶纤维素酶和木聚糖酶特异性活性。60kD(Ⅱ.3)-内切C1具有更高的特异性的RBB-CMC酶、内切葡聚糖酶和FPA活性(表24)。同时应强调的是，43kD(Ⅱ.3)-内切C1和60kD(Ⅱ.3)-内切C1在pH5下均只有非常小的石洗活性(采用亚微量粗斜纹布洗涤试验)。然而，43kD(Ⅱ.3)-内切C1和60kD(Ⅱ.3)-内切C1在pH7下有显著的石洗活性，同时，43kD(Ⅱ.3)-内切C1的石洗活性比60kD(Ⅱ.3)-内切C1更高。从表25中的pH依赖性可以看出，43kD(Ⅱ.3)-内切C1的CMC酶和RBB-CMC酶活性有较宽的最适pH(从pH4.5到8)。43kD(Ⅱ.3)-内切C1在pH9下有50％的最高CMC酶活性和70％的最高RBB-CMC酶活性，在pH10下有20％的最高CMC酶和RBB-CMC酶活性。相反，60kD(Ⅱ.3)-内切C1的CMC酶活性有较窄的最适pH(pH4-4.5)，而RBB-CMC酶活性有较宽的最适pH(从pH4到8)，在pH9时保留了30％的RBB-CMC酶活性。
应当注意，在本文公开的所有纯化蛋白例子中，分子量通过凝胶电泳(尤其是SDS-PAGE)来测定，用作标准品的是已知分子量的参照蛋白。由于所有分析采用这种方法，因此结果只是近似的，由于不同技术人员使用不同系列分子量标准品作为参照物采用不同的凝胶跑电泳，观察的分子量可能会有所变化。
这种经纯化和部分纯化的酶制品非常适于用作洗涤剂、织物软化、脱毛、增亮和石洗组合物的组分。因此，根据本发明，上述分离和纯化的酶制品可用于这些应用。因此，在本文提及的石洗、织物软化、脱毛、增亮和清洁方法、以及在文献中已有描述的实现这些应用的典型方法中，很容易通过采用这些纯化的或部分纯化的酶制品和含有该酶制品作为主要组分或添加剂的组合物来实现这些过程的目的。在许多商用酶的文献中，可以知道在这些应用中采用其它或不同的经纯化或部分纯化的酶制品。表25．pH对C1纤维素酶的CMC酶和RBB-CMC酶活性的影响CMC酶活性，50℃(％)pH 60kD(Ⅱ.1)-内切 43kD(Ⅱ.3)-内切 kD(Ⅱ.3)-内切3.5 85 80 854.0 100 100 1005.0 65 100 856.0 50 100 707.0 45 90 658.0 25 70 459.0 17 30 3010.0 15 20 1011.0 15 5 5
RBB-CMC酶活性，40℃(％)pH 60kD(Ⅱ.1)-内切 43kD(Ⅱ.3)-内切 kD(Ⅱ.3)-内切3.5 85 85 804.0 100 100 1005.0 90 100 1006.0 85 95 957.0 70 90 908.0 50 80 859.0 20 70 7010.0 15 20 3011.0 15 15 15
应当理解，根据测定活性时所用底物的化学结构以及用来测定活性的具体测定方法，本文所述的中性和/或碱性纤维素酶可以有不同的酶活性。因此，经纯化或部分纯化的中性和/碱性纤维素酶将取决于所用的测定方法和底物而表现出不同的pH/活性。为了不混淆本实施例方法制得的基本上纯的纤维素酶的性能与活性天然特征，下面描述纯化级分的纤维素酶所测得的活性和性能。
在采用合适的底物时，本文制得的纯化或部分纯化的纤维素酶表现出内切葡聚糖酶和/或纤维二糖水解酶活性。因此，表现出有内切葡聚糖酶活性的纤维素酶制品均有约3-4.5的pI。更具体地，这些级分包括分子量和pI值如下的纤维素酶(内切葡聚糖酶)：MW约25kD(pI约4.0)、MW约70kD(pI约4.2)、MW约60kD(pI约3.0)和MW约43kD(pI约3.1)。这些纤维素酶级分还含有表现出纤维二糖水解酶活性的蛋白。更具体地，后者的MW约为60kD,pI约为4.2。
采用根据本发明的组合物和纯化酶的方法已公开在文献中，其中包括许多专利，这些公开内容均纳入本文作参考。它们中包括Clarkson(美国专利5,290,474)，它公开了纤维素酶以及包括表面活性剂和其它添加剂的含纤维素酶组合物的用途，它用于水洗介质、洗涤剂组合物、设计用以增强颜色保留和/或复原的介质，以及用来赋予(尤其对含棉织物)改善的柔软度和手感。本发明的纤维素酶和含纤维素酶组合物也可用于同一应用中，关于其具体描述在许多(如果不是全部)引用的文献中均有描述。另外，在Barbesgaard等(美国专利4,435,307)中也指出了纤维素酶和组合物在减少粗糙度或织物软化中的用途，该专利具体公开的是真菌纤维素酶(而不是金孢子菌属)在碱性pH范围内的用途，它包括各种添加剂，诸如与本发明的新纤维素酶和纤维素酶组合物结合使用来减少粗糙度或软化织物的那些添加剂，且用洗涤作为单一操作。本发明的纤维素酶和纤维素酶组合物同样使用，Barbesgaard关于这些应用的说明被特别结合入本文。另外，Boegh(欧洲专利0220016)具体公开了纤维素酶和纤维素酶组合物(非本发明的新的纤维素酶和纤维素酶组合物)在颜色增亮中的应用，该说明被特别结合人本文。
当然，本领域技术人员应能理解，本发明的新的纤维素酶和纤维素酶组合物非常适用于前述文献所公开的相同用途，因此不必再对这些用途作更详细地描述。然而，这些经纯化或部分纯化的酶以及含酶组合物还可用于纸或纸浆材料的去油墨和生物漂白，本领域技术人员很容易想到这些方法，尤其在他们回顾了本文的说明后。
实施例13．60升批料发酵罐中的C-1纤维素酶生产
1.接种制品
批料发酵的接种制品或起始培养物的制备如下。将1毫升C-1孢子培养物接种到两个烧瓶的每一个中，获得总共为2升的接种物。起始培养物在150rpm、30℃下培育56小时。
接种制品的培养基*K2HPO4 0.5 克/升MgSO4·7H2O 0.15KCl 0.05FeSO4·7H2O 0.007酵母抽提物(ohly KAT) 1.0蛋白胨(Hormel PSR5) 10.0乳糖 10.0葡萄糖 10.0
*用NaOH将接种培养基调至pH7.0，然后在121℃下对培养基高压蒸汽灭菌35分钟，两个6升挡板式烧瓶中各自含有1升培养基。
2．60升批料发酵罐中的纤维素酶生产(制品47.0325)
将如上制得的2升摇瓶接种培养物接种到60升发酵罐中的40升培养基中。发酵用培养基如下：
发酵培养基*K2HPO4 0.22 克/升KH2PO4 0.08 克/升(NH4)2SO4 4.0 克/升二水合柠檬酸三钠 4.0 克/升MgSO4·7H2O 0.03 克/升CaCl2·2H2O 0.4 克/升FeSO4.7H2O 0.5 毫克/升MnSO4·7H2O 0.5 毫克/升ZnSO4·7H2O 0.2 毫克/升CoCl2·6H2O 0.24 毫克/升乳糖 5.0 克/升酵母抽提物(ohly KAT) 0.05 克/升脱脂棉籽粉(Pharmamedia) 5.0 克/升纤维素(Signmacell50) 20.0 克/升pH 7.0
*40升培养基以去离子水配制，并经121℃灭菌45分钟。
在接种到发酵培养基中后，通过加入NH3和H2SO4使pH维持高于6.9并低于7.1。搅拌并按需通气，维持溶氧大于30％的饱和度，发酵罐培育64小时。
3.纤维素酶活性的回收
在大的布氏漏斗上用Whatman54号滤纸、以10克/升硅藻土503作为助滤剂，过滤除去发酵培养液中的悬浮固体。收集滤液，用10000MW截留中空纤维滤膜超滤浓缩纤维素酶。将浓缩物冻干。该干的浓缩物称为纤维素酶制品47.0325。该制品的活性列在表4中。
实施例14.用来产生C-1突变株的突变过程
用含有菌株C1孢芽形成培养基的Pridham琼脂板(4克/升酵母抽提物、10克/升麦芽抽提物、10克/升葡萄糖、15克/升琼脂)来制备孢子悬浮液。板中加入10毫升0.05％吐温80。将悬浮液转移到无菌螺帽盖试管中并高速旋涡振荡1分钟。然后使悬浮液过滤通过一个柱，除去菌丝体。对孢子计数，并稀释成每毫升水中有7×105个孢子。将10毫升孢子悬液转移到标准玻璃培养皿中。用720μW/cm2的Pen-Ray UV灯照射孢子75秒。在照射时，用无菌纸夹作为磁力搅拌棒轻微搅动孢子悬液。照射后，将孢子悬液转移到箔包裹的试管中，用水稀释，并置于暗处的下述NH4基本培养基中。在30℃下培育20天后，鉴定出菌落周围有大的纤维素澄清带的大菌落。
NH4基本培养基，pH7.5
1克/升K2HPO4
0.1克/升KCl
0.3克/升MgSO4·7H2O
0.1克/升NaCl
16毫克/升FeCl3·6H2O
1.92克/升(NH4)2SO4
15克/升Difco Noble琼脂
2.5克/升酸性膨胀纤维素(在高压蒸汽灭菌后以1.25％原料液加入)
0.5克/升脱氧胆酸钠(高压蒸汽灭菌后加入)
实施例15．C-1突变型纤维素酶在60升批次发酵罐中的生产(47.0528的制备)
1.接种物制备
如实施例13(部分1)所述制备用于补料批次发酵的起始培养物。
2．60升批次发酵的纤维素酶生产
将2升接种物接种到40升下述发酵培养基中：
发酵培养基*K2HPO4 0.44 克/升KH2PO4 0.16 克/升(NH4)2SO4 3.0 克/升二水合柠檬酸二钠 4.0 克/升MgSO4·7H2O 0.06 克/升CaCl2·2H2O 0.8 克/升FeSO4·7H2O 0.1 毫克/升MnSO4·7H2O 0.04 毫克/升ZnSO4·7H2O 0.04 毫克/升CoSO4·6H2O 0.048 毫克/升乳糖 5.0 克/升酵母抽提物(ohly KAT) 0.1 克/升脱脂棉籽粉(Pharmamedia) 10.0 克/升纤维素(Signmacell50) 20.0 克/升
*40升培养基以去离子水配制，并经121℃灭菌45分钟。
3.发酵条件
将pH维持在大约7.0左右，并通过加入NH3和H2SO4控制pH高于6.9并低于7.1。培育87小时，搅拌并按需通气，维持溶氧大于30％的饱和度。40小时时，以每5分钟5.0毫升的速度加入3.0升下述补料。
发酵用的补料液K2HPO4 0.88 克/升KH2PO4 0.32 克/升(NH4)2SO4 4.0 克/升二水合柠檬酸二钠 4.0 克/升MgSO4·7H2O 0.12 克/升CaCl2·2H2O 0.16 克/升FeSO4·7H2O 0.2 毫克/升MnSO4·7H2O 0.08 毫克/升ZnSO4·7H2O 0.08 毫克/升CoCl2·6H2O 0.096 毫克/升乳糖 20.0 克/升酵母抽提物(ohly KAT) 0.2 克/升Pharmamedia脱脂棉籽粉 20.0 克/升纤维素(Signmacell50) 20.0 克/升
4.纤维素酶活性的回收
在大的布氏漏斗上用Whatman54号滤纸、以10克/升硅藻土503作为助滤剂，过滤除去悬浮的固体。收集滤液，用10000MW截留中空纤维滤膜超滤浓缩纤维素酶。将浓缩物冻干。该干的浓缩物称为纤维素酶制品47.0528(活性列在表4中)。
实施例16用Cellazyme测定方法测定纤维素酶活性
用购自Megazyme(Aust)Pty.Ltd.,Sydney,NSW2101,Australia的Cellazyme C片剂和试剂盒来进行该试验。所用的底物cellazyme C片剂是商业上提供的Azurine交联的HE-纤维素(AZCL-纤维素)，它很容易使用。简言之，在玻璃试管(16×122mm)中，将0.025M乙酸盐缓冲液(pH4.5)中的酶制品0.5毫升等份(如果需要可稀释)平衡40℃5分钟。然后加Cellazyme C片剂(不搅拌)，开始测试反应。在40℃下放置整整10分钟后，加入Trizma Base溶液(10.0mL,2％w/v，购自Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)终止反应，然后旋涡振荡。使试管在室温下静置约5分钟，再次搅拌悬液，使其通过Whatman No.1(9cm)滤纸圈过滤，测定滤液在590nm下的吸光度。读取相对于空白的吸光度，该空白含有底物和酶，但是在加入cellazyme C片剂前先加Trizma Base到酶溶液中而制得。该悬液置于室温下而不是40℃下。各组测定采用一个空白，用该空白来对分光光度计调零。
在该试验中，一个单位酶活定义为在所定义的试验条件下每分钟释放1微摩尔葡萄糖还原糖等价物所需的酶量。然后参照标准曲线(样品曲线由试剂盒提供，但是很容易在试验室中制作，对于给定的一组实验如果采用不同的特定酶、酶稀释度和条件的话)，确定内切纤维素酶活性。
用该试验来测定我们自己的中性/碱性酶活性，我们发现内切纤维素酶活性(以pH7时的活性为100％计)为92.4％(pH6)、75.6％(pH5.0)、69.7％(pH4.0)。
实施例17脱毛和增亮(抗褪色)的洗涤剂洗涤试验
根据AATCC专题论文“Standardization of Home Laundry Test Conditions”(AATCC Technical Manual,1997(1995修订))，用正规的Kenmore家用顶装式洗衣机和Kenmore家用转笼烘燥机来进行试验。用三种不同的成人型红色短袜(88％棉、10％聚酯、2％莱克拉)作为试验用衣物(平罗纹编织、粗罗纹编织和蜂窝编织)。将短袜分为3组，每个种类在每组中的数量相同，将各类未洗涤衣物作为参照。每组的大致重量为1公斤。
在每次洗涤前准备下述洗涤剂样品：a)Cheer Triple Guard(在美国可以购得，通常在碱性pH下)用来证明Cheer中原来存在的纤维素酶的脱毛和保色性能，b)Cheer样品的热处理，使原来存在于洗涤剂中的所有酶灭活(以将Cheer的性能局限于其组分而不是酶的性能)。对于热灭活，将40克Cheer样品悬浮于200毫升水中，并在家用微波炉内高温(1000瓦)加热5分钟，最后温度达到95℃。然后，重复上述相同步骤(a)和(b)，但是在制品中加入5克C1(酶)。
每组的洗涤/干燥循环进行25次。在整个25次洗涤循环中，每组的洗涤采用1公斤衣物比20升洗涤液(洗衣机中的水面较低)，以及40克的上述一种洗涤剂制品。温度设定在热-热档，洗涤时间为30分钟，然后进行正规的高速离心。干燥机温度设定成高温，干燥周期持续45分钟。在25次洗涤后结束试验，由几组不同的本领域技术人员来评价衣物的脱毛和增亮情况。
过程概要如下：制品 原来Cheer中的酶的灭活 加入AARL的酶a.Cheer(完全) 无 无b.Cheer(没有酶) 有 无c.Cheer+C1 有 有(5克C1)
每一洗涤组的评价结果如下(其中所有3类短袜的评定相同)：
Cheer(完全) Cheer(酶灭活) Cheer+C1脱毛 ++++ - +++增亮 ++ - ++++
应当理解，本文所述的实施例和举例只是为了便于描述，本领域技术人员很容易根据这些描述来作各种改动或变化，这些变化也应视为包括在本发明的精神和权限以及所附权利要求的范围内。