技术领域
本发明涉及真菌多糖技术领域，尤其涉及一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法。
背景技术
陇南康县地处西秦岭南侧陇南山中，最高海拔2483m，最低海拔560m，垂直高差较大，具有明显的立体气候特点。复杂的地形、气候环境，造就了该地区亚热带向暖温带过渡气候，温和湿润，雨量充沛，自然资源十分丰富，拥有高等植物172科1000余种，活立木蓄积量800多万立方米，森林覆盖率高达60%以上，国家和省列珍贵树种28种，天麻、杜仲等野生药材576种，各种菌类96种，尤其是大型真菌中的珊瑚菌类。杯珊瑚菌，别名杯冠瑚菌，属非褶菌目、珊瑚菌科、杯珊瑚菌属，近白色或淡黄色、浅粉红色，柄纤细，顶端杯状。在我国主要分布于吉林、河北、河南、湖南、福建、陕西、四川、甘肃等省。杯珊瑚菌是我国珍贵的野生食用菌资源，具有很高的营养和药用价值。杯珊瑚菌多糖具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、增强免疫功能等多种生理活性。目前对杯珊瑚菌多糖的提取研究领域基本空白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、成本低、多糖得率高的杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤：
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5~10g葡萄糖和5~10g琼脂，使其pH值为6.0~8.0，在90~100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得；
⑵制备种子培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5~10g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在90~100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得；
⑶制备发酵培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5~10g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在90~100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得；
⑷真菌的发酵培养：接一环杯珊瑚菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28℃恒温培养4~10天后，置于4℃冰箱中，得到活化培养后的菌丝体；
⑸接一环所述活化培养后的菌丝体至装有10mL所述种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以100~200r/min的速率进行振荡培养4~10天，制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液；
⑹将所述菌种种子液按5~20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以100~200r/min的速率进行振荡培养4~10天，即得发酵液；所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min，得到菌丝体；所述菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于60℃下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末；所述发酵培养基在所述摇瓶中的装瓶量为10~30%；
⑺在所述菌丝体干粉末中按1g：10mL~30mL的料液比加入去离子水，在功率为100~300W的条件下超声提取10~30min后，在温度为80~95℃的条件下浸提次数1~3次，每次1~3h，合并提取液，得到多糖浸提液；
⑻将所述多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心10~20min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为60℃、真空度为0.06~0.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5~1/3，得到多糖浓缩液；
⑼在所述多糖浓缩液中按其体积的1/4加入Sevag试剂，充分混合搅拌20min，再用高速冷冻离心机以5000r/min离心20min除掉变性蛋白质，弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到所述上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液；
⑽将50~100mL所述多糖提取液以2~5mL/min的流速通过苯乙烯系大孔弱碱性阴树脂离子交换树脂床进行脱色，得到多糖流出液；
⑾在所述多糖流出液中按其体积的2~4倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4℃下静置24h，得到沉淀物A；
⑿将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r／min离心20min后，得到沉淀物B，该沉淀物B置于真空干燥箱内，经50℃真空干燥至恒重，即得多糖干品。
所述步骤⑷中杯珊瑚菌菌丝是指采集于陇南康县的杯珊瑚菌ArtomycespyxidatusKX320SH按常规方法经组织分离获得的杯珊瑚菌菌丝；所述杯珊瑚菌ArtomycespyxidatusKX320SH在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M2012112（保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2012年4月13日），其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086388。
所述步骤⑼中Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL：1mL混合而成的混合液。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用超声波辅助热水浸提法取代以往的单独水提，利用超声波空化产生的极大压力和刺激效应，加速了有效成分的释放、扩散及溶解，具有操作简单、提取效率高、时间短、不易破坏多糖的立体结构且多糖得率高等优点。
2、本发明整个过程中无需试剂和化学反应，不但设备简单，可操作性强，而且成本低。
具体实施方式
实施例1一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤：
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5g葡萄糖和5g琼脂，使其pH值为6.0~8.0，在90℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑵制备种子培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在90℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑶制备发酵培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在90℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑷真菌的发酵培养：接一环杯珊瑚菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28℃恒温培养4天后，置于4℃冰箱中，得到活化培养后的菌丝体。
其中：杯珊瑚菌菌丝是指采集于陇南康县的杯珊瑚菌ArtomycespyxidatusKX320SH按常规方法经组织分离获得的杯珊瑚菌菌丝；杯珊瑚菌ArtomycespyxidatusKX320SH在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M2012112（保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2012年4月13日），其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086388。
⑸接一环活化培养后的菌丝体至装有10mL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以100r/min的速率进行振荡培养4天，制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液。
⑹将菌种种子液按5%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以100r/min的速率进行振荡培养4天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min，得到菌丝体；菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于60℃下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
其中：发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为10%。
⑺在菌丝体干粉末中按1g：10mL的料液比加入去离子水，在功率为100W的条件下超声提取30min后，在温度为80℃的条件下浸提次数1次，每次1h，合并提取液，得到多糖浸提液。
⑻将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心10min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为60℃、真空度为0.06MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5，得到多糖浓缩液。
⑼在多糖浓缩液中按其体积的1/4加入Sevag试剂，充分混合搅拌20min，再用高速冷冻离心机以5000r/min离心20min除掉变性蛋白质，弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液；
其中：Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL：1mL混合而成的混合液。
⑽将50mL多糖提取液以2mL/min的流速通过苯乙烯系大孔弱碱性阴树脂离子交换树脂床进行脱色，得到多糖流出液。
该多糖流出液用紫外分光光度计在460nm波长测量其比色值，并按下式计算脱水率：
脱色率=[(脱色后的透色比-脱色前的透色比)/脱色后的透色比]*100%。
⑾在多糖流出液中按其体积的2倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4℃下静置24h，得到沉淀物A。
⑿将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r／min离心20min后，得到沉淀物B，该沉淀物B置于真空干燥箱内，经50℃真空干燥至恒重，即得多糖干品。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并按下式计算：
粗多糖含量(mg/g菌丝干重)=粗多糖总质量(mg)/菌丝体干粉末质量(g)。
实施例2一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤：
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入10g葡萄糖和10g琼脂，使其pH值为6.0~8.0，在100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑵制备种子培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入10g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑶制备发酵培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入10g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑷真菌的发酵培养：接一环杯珊瑚菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28℃恒温培养10天后，置于4℃冰箱中，得到活化培养后的菌丝体。
其中：杯珊瑚菌菌丝同实施例1。
⑸接一环活化培养后的菌丝体至装有10mL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以200r/min的速率进行振荡培养10天，制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液。
⑹将菌种种子液按20%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以200r/min的速率进行振荡培养10天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min，得到菌丝体；菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于60℃下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
其中：发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为30%。
⑺在菌丝体干粉末中按1g：30mL的料液比加入去离子水，在功率为300W的条件下超声提取10min后，在温度为95℃的条件下浸提次数3次，每次3h，合并提取液，得到多糖浸提液。
⑻将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心20min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为60℃、真空度为0.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/3，得到多糖浓缩液。
⑼在多糖浓缩液中按其体积的1/4加入Sevag试剂，充分混合搅拌20min，再用高速冷冻离心机以5000r/min离心20min除掉变性蛋白质，弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
其中：Sevag试剂同实施例1。
⑽将100mL多糖提取液以5mL/min的流速通过苯乙烯系大孔弱碱性阴树脂离子交换树脂床进行脱色，得到多糖流出液。
该多糖流出液用紫外分光光度计在460nm波长测量其比色值，并按实施例1中的公式计算脱水率。
⑾在多糖流出液中按其体积的4倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4℃下静置24h，得到沉淀物A。
⑿将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r／min离心20min后，得到沉淀物B，该沉淀物B置于真空干燥箱内，经50℃真空干燥至恒重，即得多糖干品。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并按实施例1中的公式计算。
实施例3一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤：
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入8g葡萄糖和8g琼脂，使其pH值为6.0~8.0，在95℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑵制备种子培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在95℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑶制备发酵培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在95℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑷真菌的发酵培养：接一环杯珊瑚菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28℃恒温培养7天后，置于4℃冰箱中，得到活化培养后的菌丝体。
其中：杯珊瑚菌菌丝同实施例1。
⑸接一环活化培养后的菌丝体至装有10mL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以150r/min的速率进行振荡培养7天，制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液。
⑹将菌种种子液按12%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以150r/min的速率进行振荡培养7天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min，得到菌丝体；菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于60℃下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
其中：发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为20%。
⑺在菌丝体干粉末中按1g：20mL的料液比加入去离子水，在功率为200W的条件下超声提取20min后，在温度为80~95℃的条件下浸提次数2次，每次2h，合并提取液，得到多糖浸提液。
⑻将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心15min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为60℃、真空度为0.07MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/4，得到多糖浓缩液。
⑼在多糖浓缩液中按其体积的1/4加入Sevag试剂，充分混合搅拌20min，再用高速冷冻离心机以5000r/min离心20min除掉变性蛋白质，弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
其中：Sevag试剂同实施例1。
⑽将75mL多糖提取液以3.5mL/min的流速通过苯乙烯系大孔弱碱性阴树脂离子交换树脂床进行脱色，得到多糖流出液。
该多糖流出液用紫外分光光度计在460nm波长测量其比色值，并按实施例1中的公式计算脱水率。
⑾在多糖流出液中按其体积的3倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4℃下静置24h，得到沉淀物A。
⑿将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r／min离心20min后，得到沉淀物B，该沉淀物B置于真空干燥箱内，经50℃真空干燥至恒重，即得多糖干品。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并按实施例1中的公式计算。