一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法及其应用.pdf

《一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法及其应用.pdf（12页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 101550434 B (45)授权公告日 2011.10.26 CN 101550434 B *CN101550434B* (21)申请号 200910130875.2 (22)申请日 2009.04.17 C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12Q 3/00(2006.01) (73)专利权人 中国海洋大学 地址 266100 山东省青岛市崂山区松岭路 238 号 (72)发明人 孔凡娜 茅云翔 杨惠 王莉 CN 100516213 A,2006.06.28, 阮小凤等 . 磁珠富集法分离柿微卫星标 记. 西北农林科技大。

2、学学报 .2008, 第 36 卷 ( 第 5 期 ), 胡则辉等 . 坛紫菜微卫星 DNA 序列的筛 选 .海洋科学 .2006,( 第 1 期 ), ZHENGHONG ZUO et al.Isolation and characterization of microsatellite loci from a commercial cultivar of Porphyra haitanensis.Molecular Ecology Notes .2007, 第 6 卷 ( 第 2 期 ), (54) 发明名称 一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法及其应 用 (57) 摘要 本发明属于分子生物学。

3、 DNA 标记技术与应用 领域， 具体涉及一种条斑紫菜微卫星标记的筛选 方法， 及利用这些标记进行种质资源遗传多样性 分析的方法， 从而为条斑紫菜的遗传结构分析、 种 质资源保护及分子标记辅助育种奠定基础。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张建兵 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 CN 101550434 B1/1 页 2 1. 一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法， 包括以下步骤 ： (1) 提取条斑紫菜丝状体基因组 DNA， 利用限制性内切酶 Hae III 和 Afa I 对基因组 DNA 进行酶切， 。

4、电泳检测回收 500-1500bp 大小的片段 ； 将所述的片段与 5 端磷酸化的接头 连接， 以上述连接产物为模板， 以接头中的短链为引物， 利用 PCR 方法进行富集 ； 所 述 的 接 头 序 列 第 一 链 为 5 TAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA3 ，第 二 链 为 5 CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3 ； 所述的短链序列为 5 CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3 ； (2) 利用生物素标记的 (GA)15为探针与上述 PCR 富集产物进行杂交， 在离心管内用平 衡过的Streptavidin Magnesphere磁珠对上述杂交混合物进行吸附。

5、， 吸附后将离心管置于 磁力架上， 去除杂交液， 对磁珠进行洗涤， 洗脱未结合到磁珠上的 DNA 片段 ； 将洗涤后的磁 珠悬浮于 TE 溶液中， 于 94-96变性， 使含有微卫星序列的 DNA 片段脱离磁珠， 迅速收集上 清， 离心得到含有微卫星序列的 DNA 片段 ； 以离心得到的 DNA 片段为模板， 以上述接头中的 短链为引物， 通过 PCR 方法进行富集， 构建含有微卫星序列的富集文库 ； (3)以含有15次GA重复的寡核苷酸序列为探针， 采用菌落原位杂交的方法筛选阳性克 隆 ； 将菌落原位杂交获得的阳性克隆进行测序， 筛选微卫星序列， 对含有重复单元的序列进 行分析， 设计引物序。

6、列， 获得微卫星标记 ； 所述的含有重复单元的序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 2. 一种用于条斑紫菜微卫星标记的含有重复单元的核酸分子， 其序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 权 利 要 求 书 CN 101550434 B1/9 页 3 一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法及其应用 技术领域 0001 本发明属于分子生物学 DNA 标记技术与应用领域， 具体涉及海洋经济藻类条斑紫 菜 (Porphyra yezoensis) 微卫星标记的筛选方法和应用。 背景技术 0002 条斑紫菜属于红藻门(Rphdophyta)原红藻纲(Protoflorideophyceae)红毛菜目。

7、 (Bangiales) 红毛菜科 (Bangiaceae) 紫菜属 (Porphyra)， 是我国紫菜主要养殖品种之一， 主要分布北方沿海， 具有极高的营养价值和经济价值。目前紫菜育种技术采用的仍然是传 统的选择育种、 诱变育种等方法， 使得紫菜养殖品种的遗传基础日益狭隘， 加之水环境的不 断恶化， 导致紫菜养殖过程中产量、 品质、 耐高温性、 抗病性均下降， 限制了我国紫菜养殖业 的发展。 因此加强对紫菜野生群体和栽培群体中遗传结构的研究对于了解紫菜种质的遗传 多样性、 监测育种过程中的遗传变异具有重要意义。 同时， 一个物种遗传结构的多样性也是 遗传育种的基础， 因此遗传结构分析将为保护。

8、和管理紫菜种质资源及遗传育种奠定基础。 微卫星序列(microsatellitesequences)， 又称简单重复序列(simple sequence repeats， SSRs)， 是指基因组中由 2 6 个核苷酸基本单位重复多次构成的一段 DNA 序列。微卫星标 记具有共显性、 可靠性、 高信息量和高多态性， 广泛分布于基因组不同位置等特点， 成为第 二代分子标记， 在遗传多样性分析、 遗传连锁图谱的构建及分子标记辅助育种被广泛应用。 近些年来海水养殖业的迅速发展， 分子标记辅助育种技术在海洋经济物种也相继使用， 但 在紫菜养殖和育种中却很少应用。 因此开发大量的紫菜微卫星标记对于研究紫。

9、菜种质资源 的遗传结构及加强分子标记辅助育种具有重要意义。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法， 及利用这些标记进 行种质资源遗传多样性分析的方法， 从而为条斑紫菜的遗传结构分析、 种质资源保护及分 子标记辅助育种奠定基础。 0004 为了实现上述的目的， 本发明采用以下技术方案 ： 0005 采取常规方法提取条斑紫菜丝状体基因组 DNA， 利用限制性内切酶 Hae III 和 Afa I 对基因组 DNA 进行酶切， 电泳检测回收 500-1500bp 大小的片段。将所述的片段 与 5端磷酸化的接头 ( 接头序列为第一链 5 TAGTCCGAATTCAA。

10、GCAAGAGCACA3 ； 第二链 5 CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3 ) 连接， 以上述连接产物为模板， 以接头中的短链 ( 序列为 5 CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3 ) 为引物， 利用 PCR 方法进行富集。 0006 利用生物素标记的 (GA)15为探针与上述 PCR 富集产物进行杂交， 在离心管内用平 衡过的Streptavidin Magnesphere磁珠对上述杂交混合物进行吸附， 吸附后将离心管置于 磁力架上， 去除杂交液， 对磁珠进行洗涤， 洗脱未结合到磁珠上的 DNA 片段。洗涤包括松弛 性洗涤和严谨性洗涤。 将松弛性和严谨性洗涤后的磁珠悬浮于。

11、TE溶液中， 于94-96变性， 使含有微卫星序列的DNA片段脱离磁珠， 迅速收集上清， 离心得到含有微卫星序列的DNA片 说 明 书 CN 101550434 B2/9 页 4 段。以离心得到的 DNA 片段为模板， 以上述接头中的短链为引物， 通过 PCR 方法进行富集， 构建含有微卫星序列的富集文库。 0007 以含有 15 次 GA 重复的寡核苷酸序列为探针， 采用菌落原位杂交的方法筛选阳性 克隆。将菌落原位杂交获得的阳性克隆进行测序， 筛选微卫星序列， 原则为两碱基重复 7 次 以上， 三碱基重复 5 次以上， 四碱基重复 4 次以上， 或者五碱基、 六碱基重复 3 次以上。对含 有。

12、重复单元的序列进行分析， 设计引物序列， 获得微卫星标记。 0008 利用上述获得的微卫星标记， 对群体内个体间进行遗传多样性的分析。 0009 有益效果 ： 0010 1. 本发明利用磁珠吸附法构建微卫星富集文库、 采用菌落原位杂交筛选含有微卫 星序列的阳性克隆， 通过两种杂交方法增加了阳性克隆的得率， 提高了微卫星序列获得的 可靠性。 0011 2. 本发明所得到的条斑紫菜微卫星序列来自于基因组 DNA， 含有的微卫星序列丰 富， 一次实验可以得到丰富的标记， 将为条斑紫菜种质资源鉴定和遗传多样性分析提供大 量的候选标记。 0012 3. 利用微卫星标记进行条斑紫菜的遗传多样性分析， 方法。

13、简单、 稳定性高、 重复性 强， 具有广泛的应用空间。 附图说明 0013 图 1 ： 引物 PYM2 在同一群体个体间的扩增情况 ( 每个群体 20 个个体 ) ； 0014 图 2 ： 引物 PYM6 在同一群体个体间的扩增情况 ( 每个群体 20 个个体 ) ； 0015 SEQ ID NO ： 1 为 P1 0016 SEQ ID NO ： 2 为 P2 0017 SEQ ID NO ： 3 为 P3 0018 SEQ ID NO ： 4 为 P4 0019 SEQ ID NO ： 5 为 P5 0020 SEQ ID NO ： 6 为 P6 0021 SEQ ID NO ： 7 为 。

14、P7 0022 SEQ ID NO ： 8 为 P8 0023 SEQ ID NO ： 9 为 P9 0024 SEQ ID NO ： 10 为 P10 具体实施方式 0025 1 利用磁珠吸附法构建微卫星富集文库 0026 采取常规方法提取条斑紫菜丝状体基因组 DNA， 取 10g， 利用限制性内切酶 Hae III 和 Afa I 对基因组 DNA 进行酶切， 在温度 37条件下酶切 12 小时， 电泳检测回收 500-1500bp 大小的片段。加上接头进行连接， 条件为 50ng 5 端磷酸化的接头 ( 接头序列 为第一链 5 TAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA3 ； 第。

15、二链 5 CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3 )、 1g 酶切片段、 20U T4ligase(New England BioLab， Inc.)、 2l ligase buffer(New England BioLab， Inc.)， 16连接 14 小时。以上述连接产物为模板， 以接头中的短链 ( 序列为 说 明 书 CN 101550434 B3/9 页 5 5 CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3 ) 为引物， 利用 PCR 方法进行富集， PCR 反应体系为 20l， 10mM Tris-HCl， 50mM KCl， 2.0mM Mg2+， 0.15mM dNTP，。

16、 15ng 引物， 1U Taq DNA 聚合酶。反应 程序为 94预变性 1min， 后 94 40s， 55 45s， 72 45s， 25 个循环， 最后 72延伸 5min。 将全部 PCR 产物加入 2 倍体积无水乙醇沉淀富集， 溶于 20l 无菌水中。 0027 利用生物素标记的 (GA)15为探针 ( 生物素标记的含有 15 次 GA 重复的寡核苷酸， 购自上海博尚生物公司 ) 与上述 PCR 富集产物进行杂交， 100l 杂交体系含有 1g PCR 产物， 50pmol(GA)15探针， 21l 20 x SSC( 在 800ml 水中溶解 175.3g NaCl 和 88.2。

17、g 柠檬 酸钠， 调节 pH 值为 7.0， 加水定容至 1L， 高压灭菌 )， 0.7l 10 (W/V)SDS(900ml 水中溶 解 100gSDS， 调节 pH 值为 7.2， 定容至 1L) ； 杂交条件为 95 5min 后， 降至 58 15min。利 用 Streptavidin Magnesphere 磁珠 ( 购自 Promega 公司， Z5481/2) 进行微卫星序列的吸 附， 在吸附前首先按下述方法对磁珠进行平衡， 200g 磁珠用 1ml TEN100 溶液 ( 含 100mM Tris-Cl， 1mM EDTA和100mM NaCl， pH值为7.5)洗涤三次， 。

18、后悬浮于40l TEN100中， 并加 入100ng鱼DNA。 将平衡过的40l磁珠对上述100l杂交混合物于离心管内进行吸附， 并 加入300l TEN100， 室温下温育30分钟。 温育结束后， 将离心管置于磁力架(购自Promega 公司， Z5331)上， 去除杂交液， 对磁珠进行洗涤， 洗脱未结合到磁珠上的DNA片段。 洗涤包含 松弛性洗涤和严谨性洗涤， 先松弛性洗涤再严谨性洗涤， 松弛性洗涤利用400l TEN100室 温下洗涤 3 次， 每次 5 分钟 ； 严谨性洗涤利用 400l 洗脱液 ( 含 0.2SSC 和 0.1 SDS) 室 温下洗涤3次， 每次5分钟。 将松弛性和严。

19、谨性洗涤后的磁珠悬浮于50l TE溶液(含10mM Tris-Cl 和 1mM EDTA， pH8.0) 中， 于 95变性 5min， 使含有微卫星序列的 DNA 片段脱离磁 珠， 迅速收集上清 ； 加入 0.15M NaOH 12l， 20-30min 后取上清， 加入 1.8l 1M HCl， 最后 加入TE溶液至终体积50l。 将50l产物中加2l DNAmate(购自Takara公司， D605A)、 50l 4M NH4AC、 100l 异丙醇， -20放置过夜， 离心得到含有微卫星序列的 DNA 片段。以 离心得到的 DNA 片段为模板， 通过 PCR 方法进行富集， 扩增体系为。

20、 25l， 10mM Tris-HCl， 50mM KCl， 2.0mM Mg2+， 0.2mM dNTP， 15ng接头引物(序列为5 CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3 )， 1U Taq DNA 聚合酶。反应程序为 94 30s， 55 30s， 72 45s， 25 个循环， 最后 72延伸 30min. 0028 以 pMD18-T 克隆载体试剂盒 ( 购自 Takara 公司， D101C) 为载体构建含有微卫星 序列的富集文库， 连接体系为 1l PCR 产物、 1l pMD18-T 载体、 5l 连接液 ( 试剂盒自 带 )、 3l H2O， 16连接过夜。将连接产物。

21、转化大肠杆菌 DH5 感受态， 37培养得到含有 微卫星序列的富集文库。 0029 2 菌落原位杂交法筛选含有微卫星序列阳性的克隆 0030 采用菌落原位杂交的方法筛选阳性克隆。具体如下 ： 0031 菌落转膜 ： 将上述转化后的菌落重新点阵排列于新的 LB 平板上， 接种密度为 300 个克隆 / 平板。将 NC 膜 (Hybond-N， Amersham Pharmacia Biotech) 剪成略小于平板内径 的圆形， 将其覆盖在长有菌落的平板上， 每个平板影印一张杂交膜， 等膜完全湿润后， 将膜 取出， 空气中干燥 10min 备用。将平板放入 37继续培养至重新长出菌落。将干燥好的膜。

22、 用裂解液 ( 含 1.5MNaCl 和 0.5MNaOH) 裂解 7min， 室温干燥 10min 后， 用中和液 ( 含 1.5M NaCl， 0.5MTris/HCl和1M EDTA)处理5min， 取出室温干燥10min后， 再用中和液浸泡5min， 取出晾干， 于 80中烘烤 2h 以固定探针。 说 明 书 CN 101550434 B4/9 页 6 0032 杂交 ： 0033 探针 ( 含有 15 次 GA 重复的寡核苷酸 ) 的标记采用 Amersham 公司的 Gene Images 3 -Oligolabelling Module 试剂盒。80l 的反应体系中包含以下成分，。

23、 100mol 探针， 1cacodylatebuffer 1l， 32U 末端转移酶， Fluorescent-11-dNTPs 5l， 37温浴 70 分钟。 0034 将烘烤好的 NC 膜放入杂交液 5SSC( 在 800ml 水中溶解 43.8gNaCl 和 22.0g 柠檬酸钠， 调节 pH 值为 7.0， 加水定容至 1L， 高压灭菌 )， 0.1 (W/V)SDS(900ml 水中溶解 10gSDS， 调节pH值为7.2， 定容至1L)， 稀释20倍的液体封阻(Liquid Block， 试剂盒提供)， 0.5 (W/V) 分子量为 500,000 的多聚硫酸葡聚糖 (Dextr。

24、an Sulphate， MW 500,000， 试剂 盒提供 ) 中 37预杂交半小时以上 ； 然后将杂交液去除， 重新加入杂交液和标记好的探 针， 杂交液按照NC膜面积的大小以0.125-0.25ml/cm2的量加入， 探针的浓度为5-10ng/mL， 37振荡过夜。 0035 洗膜 ： 0036 将NC膜放在洗脱液(5SSC， 0.5(W/V)SDS)中室温振荡洗脱2次， 每次5分钟。 然后在含有 1SSC( 在 800ml 水中溶解 8.8g NaCl 和 4.4g 柠檬酸钠， 调节 pH 值为 7.0， 加 水定容至 1L， 高压灭菌 )， 0.5 SDS 的洗脱液中 37水浴振荡洗。

25、脱 15 分钟， 含有 1SSC， 0.5 SDS 的洗脱液中 42水浴振荡洗脱 15 分钟。 0037 阳性信号的获得 ： 0038 将膜放入到 Detection Buffer I(0.15MNaCl， 0.1M Tris， pH 值为 7.5) 中 1 分钟， 迅速取出， 放入上述含有稀释20倍的液体封阻中封阻30分钟， 将膜转入到抗体液中反应30 分钟， 抗体液含有稀释 1000 倍的抗体 ( 试剂盒提供 )， 0.5 (W/V) 小牛血清， 0.4M NaCl， 0.1M Tirs-HCl(pH 值为 7.5)。取出膜在 Detection Buffer II(0.15M NaCl，。

26、 0.1M Tris， pH 值为 7.5) 中洗 3 次， 每次 5 分钟。 0039 处理完 NC 膜后， 将膜放入等量混合的 Detection Buffer I 和 II 中浸泡 1 分钟， 在暗室中压上X-胶片， 放入暗盒感光1h。 黑暗中将感光的光片取出， 在显影液(Koda)中浸 泡 10 分钟进行显影， 在定影液 (Koda) 中定影 10 分钟。用清水冲洗光片半个小时， 室温晾 干。 0040 将 X- 胶片、 硝酸纤维素膜、 平板三者进行对照， 在对应位置上挑出阳性克隆， 将阳 性菌落挑起， 37摇菌培养 8 小时。 0041 3 条斑紫菜微卫星序列的分析 0042 将菌落。

27、原位杂交获得的阳性克隆用 ABI3730 测序仪进行测序。利用常用的工具软 件进行分析， 如在线工具 SSRIT-Simple Sequence Repeat Identification Tool(http:/ www.gramene.org/db/searches/ssrtool) 进行微卫星序列筛选， 原则为两碱基重复 7 次以 上 ( 包括 7 次 )， 三碱基重复 5 次以上 ( 包括 5 次 )， 四碱基重复 4 次以上 ( 包括 4 次 )， 五 碱基及六碱基重复 3 次以上 ( 包括 3 次 )。分析发现其中 10 条含有重复序列次数载 10 次 以上的序列， 依次编号为 P1。

28、-P10。 0043 4 条斑紫菜微卫星标记引物的设计与优化 0044 对上述 10 条含有重复单元的序列进行分析， 利用引物设计软件 Primer Premier 5.0 和 DNAStar( 常用软件 ) 设计引物， 采用以下严谨度 ： 1) 引物长度为 18 25mer ； 2)GC 说 明 书 CN 101550434 B5/9 页 7 含量 40 60； 3)Tm 值大于 50； 4) 预期 PCR 产物长度为 100 300bp。引物由上海英 骏公司 (Invitrogen) 合成 ( 表 1)。 0045 引物退火温度的优化采用温度梯度 PCR 方法， 反应体系为 20l， 1P。

29、CR 缓冲液 (10mMTris-HCl， 50mM KCl， 2.0mM Mg2+)， dNTP各200M， 1.2mM的Mg2+， 微卫星正向引物和反 向引物各 0.2M， 模板 DNA 20 40ng， 1U Taq DNA 聚合酶， 用水补足到 20L。PCR 反应在 Thermo Electron 公司的 P2TM PCR 仪上进行， 94预变性 5min， 94变性 30s， 退火 30s， 退火温度依引物而异， 72延伸 50s， 30 个循环， 最后 72延伸 5min。 0046 表 1 0047 0048 5 利用微卫星标记分析条斑紫菜同一群体不同个体间的遗传多样性 004。

30、9 选用上述扩增带型清楚地的引物对同一群体 20 个个体进行遗传多样性的分析， 本具体实施方式以 PYM2 和 PYM6 为例。PCR 反应体系为 20l， 1PCR 缓冲液， dNTP 各 200M， 1.2mM 的 Mg2+， 微卫星正向引物和反向引物各 0.2M， 模板 DNA 20 40ng， 1U Taq DNA 聚合酶， 用水补足到 20L。PCR 反应在 Thermo Electron 公司的 P2TMPCR 仪上进行， 94预变性 5min， 94变性 30s， 退火 30s， 退火温度依引物而异， 72延伸 50s， 30 个循环， 最后 72延伸 5min。PCR 产物利用。

31、 10聚丙烯酰胺凝胶电泳 -EB 染色系统进行检测， 在凝 胶成像系统下观察记录成像结果 ( 图 1， 2)。利用常用的软件进行分析， 如 STATISTICA/w 说 明 书 CN 101550434 B6/9 页 8 5.0(StatSoft Software， Inc.， USA) 软件分析个体间遗传多样性。 0050 本发明获得的 10 个微卫星标记 ( 表 1)， 均可以在不同个体中进行扩增， 结果稳定 可靠， 可以用于群体遗传多样性分析。这充分证明本发明可以高效筛选条斑紫菜微卫星序 列， 从而获得大量微卫星标记。 0051 序列表 0052 中国海洋大学 0053 一种条斑紫菜微卫。

32、星标记的筛选方法及其应用 0054 A 0055 10 0056 PatentIn version 3.1 0057 1 0058 600 0059 DNA 0060 条斑紫菜 0061 1 0062 ctcttgcttg aattcggact accaaatggc tgtggttaca gacctgttta aactcagcac 60 0063 tgggagaata ctgtcaacac taaaaataga ttaggaattt cagggcaaca ggtacttttt 120 0064 tttgtgtggc tataagcttg tgggatgaaa ataggatatc tgtcaa。

33、ggac atcaaaggga 180 0065 cagctgaaag tatattggac agaatcagta tactttactt agaaagaaag agagagccta 240 0066 tatcttacaa ttcatagctt taatggatac tttagtcaca aacaaaaaga agagagagag 300 0067 agagagaaag agaaagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 360 0068 agagagagag agtgagagaa ctgaatagcc tagcttgtat gataag。

34、ttgc catacactgc 420 0069 tcagaactgt ttaaaaaaaa aagtattggt ttaatgatta gttgttaatt taataataac 480 0070 actctgtata tgtaacaatt tgtattatgt gtttattgtg gagctgacta tacagactcc 540 0071 caagctcacc ttcctctgtc tcccactgtg taccctccct ttcatatttt gaaggctgaa 600 0072 2 0073 540 0074 DNA 0075 条斑紫菜 0076 2 0077 ctcttgct。

35、tg aattcggact acctcacttg ttttcttcca cggagatgca ttttttccac 60 0078 ttttcagact tttgctgtgg gtgagggagc gaagggttgt agcatcagtg gagaacacaa 120 0079 gtggctaaac tagatgacaa gcgcacggta cgtttgtacc cccgtctgca tgctttgcgg 180 0080 ttgtgtgtga aacaagtaaa cgcgggtaac tcctggacct cgctcgctct ctctctctct 240 0081 ctctctctc。

36、t ctctctctct ctctctctct ctctctctct ccctctctct ctgctgctgc 300 0082 tgcctggtct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctgccg 360 0083 ctgctgctgc cgggactttg tttgtctctt tggtttaggt tcagtgagcc caaaaggcgt 420 0084 tctgaaatga gcagagcttg tgggtgtgtt ttttccccca tggcggcttc tttgtctttg 480 0085 gtgcggggg。

37、t tgcccgggtg ttgcgaagca accagcggtg ggctgctttg tggttgttgt 540 说 明 书 CN 101550434 B7/9 页 9 0086 3 0087 480 0088 DNA 0089 条斑紫菜 0090 3 0091 ccataccctc ctcaatagca tgctccctcc ctaggtcagt cccagctagc agcaaaccac 60 0092 gcctctgcca atcgtacctc tctaccttcc tctcttgtgt cgtcctctcc ttgaagcgct 120 0093 gtgctctagt gtca。

38、ggtaca ccaaaaaaga gtgccttggg ctggaacatt cttgtgaaga 180 0094 agctccagct ctcatcctcc tcgtcactcc cttctagagg ctcatctcta ccctccaact 240 0095 cccacttctc tctctcctcc ctctctctgt cagccgaagc aattgcagtc tcctccaaac 300 0096 gactgaggaa cacatgggca tcctgcctag ctcctgcatc tgcattggcg cgaaggcgat 360 0097 ccaattcctc cttc。

39、atctca cgctcctgct ccgggatgtc attgtactct gagagatcag 420 0098 actctctcac atactcaggc agctggaaac tggtagctat gatgtcacct ttctcgttat 480 0099 4 0100 400 0101 DNA 0102 条斑紫菜 0103 4 0104 ctcttgcttg aattcggact acctcgaggc gaggagcgat aaggaggtga gaggcaatga 60 0105 gggataaggg gatggaaaga gagggagaga gttggggtga gagag。

40、agatg ggagagggag 120 0106 agatgggaga gagagagatg agagagggag agatgggaga gagagagatg ggagagggag 180 0107 agatgggaga gagagagatg ggagagggag agatgggaga gagagagatg ggagagggag 240 0108 agatgggaga gagagagatg ggagaggtgg gagagagaga tgggagagag agactcaatt 300 0109 aggagcacgt tagagacaat gcatgtggaa gaaggactac actga。

41、acttg atgttcagga 360 0110 aggctctgaa tcatatcgcc tctcgttcat gcgacaatct 400 0111 5 0112 400 0113 DNA 0114 条斑紫菜 0115 5 0116 ctcttgcttg aattcggact accgttggtg gcgtggtggt aagttgtgca aacatgagat 60 0117 ggttattaat tgcttgtagt tctcagcggc tgctttcaga agagacaaac agtccagccg 120 0118 tccgtggatg gatacagacc ccagcatt。

42、tc gtatcctcac aaagaagtga gtcgtatgtg 180 0119 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 240 0120 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgttgtgtgc gcgtgcatga cgtccttaac acgaacagga 300 0121 taccatcgac tacgctgttg ttgtaatttg cggatcagta ccaaccatga tcatgattgg 360 0122 aatttgtgag tacttactca ggtcggtt。

43、ac aagcgacaaa 400 0123 6 0124 550 说 明 书 CN 101550434 B8/9 页 10 0125 DNA 0126 条斑紫菜 0127 6 0128 ctcttgcttg aattcggact accgatggga gaccactgga gcatccacta gcatcggtcg 60 0129 caccgactcc ggcaccagca ttgacccccc cccccttgtt ttagcccgtt tacagtttcg 120 0130 ttttgaataa atttacgttt gcattagata gaaggaagga acaattcaaa ca。

44、cacacaca 180 0131 cacacacaca caacacacac acacacacac acacacacgt gtgtgtgtgt tttttccaga 240 0132 atgttcttca catgcaaagc aaaatttgtg ctcaaggacc gaagaaatgg ttggagttga 300 0133 gctgagtcag gaagctttca aagtgtggct cgtagccgtg cgcaacaagc tttttcgcaa 360 0134 ctgcaaggga ttcgagaggc gcgacagttg actcaggcac tgttcggtgc aa。

45、cacgctag 420 0135 atgcggtaca aggtagctac ttttgcttct tttcttttct tgcttacaaa gggtacagca 480 0136 acacttgcac aggcgcgaac accctcaaca agcatccagc acgcaacgcc cagcagacct 540 0137 gtgtacaggt 550 0138 7 0139 550 0140 DNA 0141 条斑紫菜 0142 7 0143 ctcttgcttg aattcggact accactatgg atgcaggcgt gtgaatagtg gaataacatg 60 0。

46、144 cttttgagcg cgtccattct attctcagtc ctaccctata aacaataact aattagctaa 120 0145 caattgtatt ctcctattct aatgacctag tcaaatttac ttcattaatc ttaaataatt 180 0146 gtcgttatcc tatcttcgta ttgggttcgt gggggcacta caggtgagct tcaaacaatc 240 0147 ttcctctctc tctctctctc tccctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 300 0。

47、148 tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctcgctc 360 0149 tctctctctc tctctctgtc tctctgtctc tctctctctc tctctctgtg tatctcactc 420 0150 tatctctctc tctctctctc tctctgtatg tctctatcac tgtctctctg tttactgctg 480 0151 tctctctctt cctctgacac tggtgtgctg tctctcactt caactcttgt cgacctgtcg 540 0。

48、152 cactcacgcg 550 0153 8 0154 401 0155 DNA 0156 条斑紫菜 0157 8 0158 tctctatcac tgtctctctg tttactgctg tctctctctt cctctgacac tggtgtgctg 60 0159 tctctcactt caactcttgt cgacctgtcg cactcacgcg ctctatcagg ctatagaagt 120 0160 gtatctctct ctctctatct ctctctctcg cgcacagtct atcatgcggg aagagtatct 180 0161 ggtacgatct。

49、 gtgtagttac atactgaatg tctactcgaa cttactagtt gttagttgat 240 0162 atgatgtcgc gagagggaaa tgtgtatgaa taatgctagc aaaatgctga tagttatggt 300 0163 ataattacag ggcacttgaa tgttaggaat aatagaactg gctgaagcac acgtgaatcg 360 说 明 书 CN 101550434 B9/9 页 11 0164 aacaattgaa ctggtgctgt agaaacttgg tggccgagga t 401 0165 9 0166 668 0167 DNA 0168 条斑紫菜 0169 9 0170 ctcttgcttg aattcggact atgaatttgg actaccgata gaggttgcta cctgcagagg 60 0171。