技术领域
本发明系关于人类神经干细胞。进一步来说，本发明提供一种自胎儿的羊水分离人类神经干细胞的方法，和所述经分离的人类神经干细胞的用途，其中所述的胎儿经诊断为罹患神经管缺陷。
背景技术
目前已发现于中枢神经系统(CNS)的神经干细胞(NSC)可同时具有自我更新和分化成大脑中每一种主要细胞类型的能力。自从在小鼠大脑中发现NSC在治疗神经退化病症上的潜在治疗用途后，NSC已成为深入研究的主题[1，2]。具体而言，NSC的移植可在损伤或病变的CNS中诱发细胞修复和恢复功能[3-6]。先前研究已证明植入CNS中的NSC不仅可形成新的神经元，亦可表现保护和营养因子并将其释放至受损区。
先前在成年哺乳动物CNS中发现NSC的来源包括海马颗粒下区和前脑腹侧的室管膜下区[7]。人类NSC通常系由夭折胎儿、死者大脑或手术样品中获得[7-9]。然而，此等样本的供体年龄、储存、存活率和潜在污染的变数使得其难以在医疗用途中使用[10]。其他的障碍包括：检体的取得来源有限、采集的技术困难和伦理问题。最后，于初级培养中，人类NSC的生长速度缓慢，对获得在临床应用上需要高数量细胞的需求造成严重限制。近年来已建立了一些永生的神经干/祖细胞株[11，12]，相较于典型的NSC，此等细胞株具有相对较高的增殖力，同时仍保持可分化成不同神经细胞类型的能力。然而，在建立此等细胞株的过程中使用了致癌基因和病毒感染，因此引发其在医疗目的应用中的风险疑虑。此外目前已有建立自多能性干细胞(诸如胚胎干细胞或诱导性多能性干细胞)的NSC[13-15]。虽然此等方法确实可引入新的NSC来源，但仍具有于群体中存留未分化细胞且因此形成畸胎瘤的可能性[16]。因此，若要将源自多能性干细胞的NSC应用于医疗用途，亦受到伦理问题、安全问题和不良效率的限制。
神经管缺陷(NTD)为神经管发育异常时最常见的缺陷，且其影响大约1/1000的怀孕者[17]。神经管系在胚胎发育期间形成且最终产生整个CNS。当神经管在任一端未完全闭合时，即会造成NTD。在人类中，最常见的NTD为无脑症和脊髓膜膨出。前者因神 经管的头端闭合失败造成，且其特征在于颅顶和大脑半球全部或部分不存在，而后者为尾部神经管和脊柱的缺陷性闭合[18-20]。无脑症导致大脑和颅骨的形成不完全，且因此致死。大多数患有脊髓膜膨出的个体具有多系统障碍和有限的寿命。超音波技术或母体血清α-胎儿蛋白含量的量测可在胎儿尚未出生前即侦测出NTD[21]。后续通常藉由量测羊水中α-胎儿蛋白和乙酰胆碱酯酶的含量来证实NTD的存在[22]。
羊水(AF)已知含有多种源于胎儿发育的细胞类型，且先前研究已证明多潜能干细胞可经由羊膜穿刺术而分离。这些来自AF所分离出的干细胞(AFSC)可表现一些多能性标志，且可在诱导条件下分化成间质或神经谱系的细胞[23-25]。虽然AFSC在体内与体外均展现神经潜能，但其仍缺乏一些典型的NSC特性，诸如NSC的生长特性、形态和形成神经球的潜力。迄今为止，尚无能够直接自任何物种的正常羊水样本中分离出NSC的报告。最近，则有文献报导可自胎儿患有NTD的怀孕大鼠的羊水中建立NSC[26]。
人类神经干细胞为研究神经系统发育与成人神经生成功能特别有价值的工具。NSC在治疗神经退化病症中亦具有极大治疗潜能。然而，人类NSC的当前来源因技术原因(诸如分离的难度和增殖所需的时间)而受限。因此，仍需要发展一种分离并建立人类神经干细胞的方法，其中所述人类神经干细胞可长时间扩展且不会损失干细胞特性。
发明内容
本发明一方面系关于一种自怀孕人类个体的羊水获得人类神经干细胞的方法，所述怀孕人类个体的胎儿经诊断为罹患神经管缺陷，其中所述经分离的人类神经干细胞可表现巢蛋白(Nestin)、Sox2、Musashi-1、和ATP结合匣G2(ATP-binding cassette G2，ABCG2)标志，但不表现SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和TRA-1-81。
本发明另一方面系关于一种经分离的人类神经干细胞或其衍生物，其系由根据本发明的方法获得。
本发明再一方面系关于一种医药组合物，其包含自本发明的方法获得的经分离的人类神经干细胞或其衍生物，和医药上可接受的载剂。
本发明又一方面系关于一种于有需要的哺乳动物中治疗神经状态的方法，其包含给予本发明的医药组合物至所述哺乳动物。
本发明更一方面系关于一种筛选药物候选物的方法，其中所述方法包含下列步骤：使自本发明的方法获得的经分离的人类神经干细胞与一药物候选物接触；和测定所述细胞的一或多个细胞状态，如经测定的一或多个细胞状态与未接触所述药物候选物的细胞的相同状态相比更好，则表示所述药物候选物具有治疗神经状态的潜力。
本发明另一方面系关于一种测试一药物候选物的细胞毒性的方法，其中所述方法包含下列步骤：使自本发明的方法获得的经分离的人类神经干细胞与一药物候选物接触；和测定所述细胞的一或多个细胞状态，如经测定的一或多个细胞状态与未接触所述药物候选物的细胞的相同状态相比更差，则表示所述药物候选物可能具有细胞毒性。
附图说明
图1A显示AF-NSC的培养物特性。在NeuroCultTM NS-A增殖培养基中初始接种羊水细胞后，神经样细胞开始附着至培养盘(左方组)。随后，此等细胞增殖且聚拢而形成悬浮初级神经球(右方组)。缩写：DIV：体外天数。
图1B显示AF-NSC的培养物特性。当神经球的分散为单细胞悬浮液后，所述细胞会持续分裂且再形成神经球。成熟AF-NSC衍生神经球在外表面含有典型的微突起结构(micro-spike)(右侧，黑色箭头)。比例尺：10μm。缩写：DIV：体外天数。
图1C显示AF-NSC的培养物特性。AF-NSC的倍增时间受接种密度影响。*：p＜0.05；**：p＜0.01。
图1D显示AF-NSC的培养物特性。长期体外培养物的AF-NSC细胞计数。由继代5开始，将两种不同AF-NSC细胞株用于此分析，且计算累积于每一继代的总细胞数目。两种AF-NSC细胞株(100和106)分别培养18和23继代。(黑正方形：AF-NSC细胞株#100；黑圆：AF-NSC细胞株#106)。
图2A显示NSC特异性标志在AF-NSC中的表现。免疫染色成熟神经球的共轭焦影像(第14天)显示特异性NSC标志的表现(巢蛋白、Musashi-1、和Sox2)。比例尺：20μm。
图2B显示NSC特异性标志在AF-NSC中的表现。以流式细胞仪测定较早和较晚继代数的AF-NSC中NSC特异性细胞标志的表现。点线：同源抗体对照；灰线：较早继代#(10-12)；黑线：较晚继代#(20-22)。缩写：SSEA：阶段特异性胚胎抗原；ABCG2：ATP结合匣子族G2；HLA：人类白细胞抗原。
图2C显示NSC特异性标志在AF-NSC中的表现。qPCR用于确定较早和较晚继代数的NSC特异性基因的mRNA含量。白条：较早继代#10；灰条：较晚继代#20。
图2D显示AF-NSC的端粒酶活性的量测。端粒酶的活性于不同培养时间下量测(继代#6、10和17)。三角形表示藉由热去活化处理的样本。缩写：N：阴性对照；P：阳性对照。
图3A显示AF-NSC的体外分化。AF-NSC系培养于神经分化培养基中，且藉由免疫 细胞化学诱发2天后侦测成熟神经元的标志。比例尺：20μm。缩写：DAPI：4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚。
图3B显示AF-NSC的体外分化。AF-NSC系培养于神经分化培养基中，且藉由免疫细胞化学诱发7天后侦测成熟神经元的标志。比例尺：20μm。缩写：DAPI：4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚。
图3C显示AF-NSC在体外分化后神经元标志基因的表现。以qPCR量测此等神经元标志的表现量。白条：未分化的细胞；灰条：第2天分化的细胞；黑条：第7天分化的细胞。*：p＜0.05；**：p＜0.01。
图4A显示AF-NSC会定向分化成星形胶质细胞、寡树突神经胶质细胞和多巴胺激导性神经元。AF-NSC系培养于特异性分化培养基中，且使用免疫染色特异性标志以证实星形胶质细胞(GFAP)、寡树突神经胶质细胞(O4)和多巴胺激导性神经元(TH和AADC)的存在。比例尺：20μm。缩写：GFAP：胶质原纤维酸性蛋白；TH：酪胺酸羟化酶；AADC：芳族L-胺基酸去羧酶；和DAPI：4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚。
图4B显示分化后AF-NSC的特异性标志的表现。以qPCR分析星形胶质细胞(GFAP)、寡树突神经胶质细胞(CNP，MBP和O2)(左方)和多巴胺激导性神经元(AADC，Pax2，Lmx-1b和Nurr-1)(右方)特异性标志的基因表现。白条：分化前；黑条：分化后。*：p＜0.05；**：p＜0.01。缩写：GFAP：胶质原纤维酸性蛋白。
图5A显示将AF-NSC移植入MCAO缺血性中风大鼠中具有治疗效果。移植AF-NSC后，缺血性中风大鼠经历旋杆测试。黑条：健康对照；白条：假注射(仅注射不含AF-NSC细胞的培养液)对照；灰条：MCAO后的AF-NSC移植。
图5B显示将AF-NSC移植入MCAO缺血性中风大鼠中具有治疗效果。移植AF-NSC后，缺血性中风大鼠经历握力测试。黑条：健康对照；白条：假注射(仅注射不含AF-NSC细胞的培养液)对照；灰条：MCAO后的AF-NSC移植。
图5C显示将AF-NSC移植入MCAO缺血性中风大鼠中具有治疗效果。AF-NSC移植4周后，藉由TTC的定量半球形损伤区。
图5D显示将AF-NSC移植入MCAO缺血性中风大鼠中具有治疗效果。顶部：免疫组织化学显示巢蛋白(绿色)在注射区域中表现。底部：此区域的较高放大率显示经移植的AF-NSC在受损区中共表现巢蛋白(绿色)和人类细胞核(human Nuclei)(红色，箭头)。比例尺：50μm。
图6显示此研究中建立的4个AF-NSC细胞株的核型。所有4个AF-NSC细胞株皆具有正常核型，包括一个46XX且三个46XY。
具体实施方式
参考以下对本发明的各态样、实例、和伴随相关描述和表格的详细描述，可更容易地了解本发明。除非另外特别地指出，本文中所使用的所有用语(包含技术和科学用语)与本领域的技术人员所通常理解者具有相同意义。应进一步了解者，如通常使用字典中所定义的用语应解释为与其在相关领域的上下文中一致，且不解释为在理想化或过于正式的意义，除非于本文中明确地如此定义。另应了解者，本文所用的术语仅用于描述特定态样的目的而不意欲用于限制性本发明的范畴。
必须指出，除非上下文另外清楚规定，否则如本说明书和随附申请专利范围中所用的单数形式“一”和“所述”包括复数个所指标的物。因此，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
范围在本文中通常表述为“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表述此类范围时，一态样为包括一个特定值和/或至另一个特定值的范围。类似地，当值藉由使用字“约”表述为近似值时，应了解特定值可形成另一态样。另外应了解，每一范围的各端点皆有显著性，一端点与另一端点既有相关性，亦彼此独立。本文所用的术语“约”的范围为±20％；优选为±10％，更优选为±5％。
本发明揭示分离和繁殖人类神经干细胞(NSC)的方法，所述NSC系获自一胎儿的羊水，而所述的胎儿经诊断为罹患神经管缺陷(NTD)。这些羊水源性神经干细胞(AF-NSC)会形成神经球，并可于体外进行长时间的扩增。此外，他们表现NSC特异性标志，包含巢蛋白、Sox2、Musashi-1和、ATP结合匣G2(ABCG2)，且亦会显现端粒酶活性。当于体外经诱导分化后，羊水源性神经干细胞会显现典型的型态模式并表现与神经元、星形胶质细胞、寡树突神经胶质细胞和多巴胺激导性神经元一致的特异性标志。再者，羊水源性干细胞可移植至动物中来治疗神经状态。
因此，本发明提供一种获得经分离的人类神经干细胞的方法，其包含：
(a)由获自怀孕人类个体的羊水中收集细胞，所述怀孕个体的胎儿经诊断为罹患神经管缺陷(NTD)；
(b)以培养基培养所述细胞；和
(c)自所述培养基分离人类神经干细胞，
其中所述经分离的人类神经干细胞会表现巢蛋白(Nestin)、Sox2、Musashi-1、和ATP结合匣G2(ABCG2)标志，且会显现端粒酶活性，但不会表现SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和TRA-1-81。
神经干细胞为一种未分化的神经细胞，其可经诱导而增殖。神经干细胞具有自我维持的能力，其意指每次细胞分裂，其子细胞仍为一干细胞。因此，本文中所使用的“神经干细胞”乙词，在适当情况下，应了解为可包含真正的干细胞和神经祖细胞(neural progenitor cell)。
根据本发明，神经管缺陷包含，但不限于为无脑(anencephaly)和脊髓膜膨出(myelomeningocele)。更特定言的，神经管缺陷为无脑。
本发明的步骤(a)，所述细胞可经由任何本领域的已知方法而收集。例如，可将羊水离心和/或过滤。
根据本发明，所述培养基可为任何可容许神经干细胞增殖的培养基。所述培养基可为，但不限于NeuroCultTM NS-A增殖培养基(StemCell Technologies，温哥华，BC，加拿大)、StemlineTM神经干细胞扩张培养基(Sigma)(附带加入20ng/ml表皮生长因子(Sigma)和10ng/ml白血病抑制因子(Chemicon))、NS-A培养基(Euroclone)(附带加入1xN2和10ng/ml EGF(PeproTech)和10ng/ml bFGF)、NS-A基底无血清培养基(Euroclone)(附带加入20人类重组EGF ng/ml、10ng/ml人类重组FGF2、2mM L-麸酰胺酸、0.6％葡萄糖、9.6μg/ml腐胺(putrescine)、6.3ng/ml孕酮、5.2ng/mls亚硒酸钠、0.025mg/ml胰岛素和0.1mg/ml转铁(钠盐，II等级；Sigma；控制培养基))、Dulbecco’s基本必需培养基(DMEM)/F12(1∶1)(附带加入B27补充剂(1∶50)、2mM麸酰胺酸、50单位/ml盘尼西林、50μg/ml链霉素(Gibco)、20ng/ml人类重组EGF和20ng/ml bFGF(R&D Systems))、Dulbecco’s改质Eagle’s培养基(DMEM)/HAMS-F12(3∶1，Gibco)(附带加入盘尼西林G/链霉素/两性霉素B(1％v/v；Gibco)、B27补充剂(2％v/v；Gibco)、表皮生长因子(EGF，20ng/ml，Sigma)、纤维母细胞生长因子2(FGF-2，20ng/ml，R&D Systems)和肝素(5mg/ml，Sigma))。
本发明亦提供经分离的人类神经干细胞或其衍生物，其具有与自本发明的方法获得的神经干细胞全部相同的特性。所述细胞可用作细胞治疗时的细胞来源。例如，所述细胞可移植以回复受损的神经回路和/或回复大脑功能。
于某些实施例中，所述经分离的细胞或其衍生物系存在于医药组合物中。据此，所述包含此等神经干细胞的医药组合物另包含医药上可接受的载剂，例如一或多个缓冲剂(中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐水)、使制剂呈等渗透的溶质、接受者的低渗透或弱高渗透血液、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。
在某些实施例中，所述医药组合物系调配成单位剂量可注射型式，例如溶液、悬浮液或乳液。适于注射细胞的医药组合物通常为无菌的水溶液和分散剂。可注射制剂 的载体可以是溶剂或分散介质，其包含，例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)，和其混合物。
本领域的技术人员可容易地确定于本发明的医药组合物中细胞和任选的添加剂、赋型剂和/或载剂的含量。通常地，任何添加剂(除所述细胞)在例如磷酸盐缓冲盐水的溶液中的存在量为约0.001至约50重量％。活性成分的存在量为微克至毫克，例如约0.0001至约5重量％；优选为约0.0001至约1重量％；更优选为约0.0001至约0.05重量；或约0.001至约20重量％；优选为约0.01至约10重量％；更优选为约0.05至约5重量％。
神经干细胞可用来移植至异源、自体或异种的宿主。所述神经干细胞的后代可施用于任何罹患因任何方式导致的不正常神经或神经退化性症状的动物，包含导因于机械、化学或电解病变，或为局部缺血或神经区域缺氧，或为老化过程的结果。
因此，本发明又关于一种于有需要的哺乳动物中治疗神经状态的方法，其包含给予本发明的医药组合物至所述哺乳动物。
如本文所用的术语“治疗”表示减缓、中断、阻止或终止疾病或症状的进展，但不一定要求完全消除所有疾病的症状和表征。“预防”意指包括所述神经状态的预防，其中“预防”应理解为可任何程度地抑制发病时间或疾病或状态的表征或症状严重性，其包含但不限于完全防止疾病或状态。
根据本发明可治疗的神经状态可大致分为三类：具有缺血性或缺氧机制的疾病、神经退化性疾病和与神经细胞死亡相关的神经和精神疾病。根据本发明可治疗的其他神经状态包含增强认知能力和脑肿瘤(如成胶质细胞瘤(glioblastomas)、星形细胞瘤(astrocytomas)、脑膜瘤(meningiomas)和神经鞘瘤(neurinomas))的治疗。
具有缺血性或缺氧机制的疾病可进一步分为一般疾病和大脑缺血。涉和缺血性或缺氧机制的所述一般疾病的实例包括心肌梗塞、心机能不全、心脏衰竭、充血性心脏衰竭、心肌炎、心包炎、心包心肌炎、冠心病(冠状动脉狭窄)、心绞痛、先天性心脏病、休克、肢端缺血、肾动脉狭窄、糖尿病性视网膜病变、与疟疾相关的血塞、人工心脏瓣膜、贫血、脾性症候群、气肿、肺纤维化、和肺水肿。大脑缺血疾病的实例包括中风(以和出血性中风)、大脑微血管病变(小血管疾病)、分娩中大脑缺血、心跳骤停或复苏期间/后大脑缺血、由于手术中问题所致的大脑缺血、颈动脉手术期间的大脑缺血、由于至大脑的供血动脉狭窄所致的慢性大脑缺血、大脑静脉的窦血塞或血塞、大脑血管畸形、和糖尿病性视网膜病变。
神经退化性疾病的实例包括肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森氏病(Parkinson′s disease)、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)、威尔逊氏疾(Wilson′s disease)、多系统萎 缩、阿兹海默氏症(Alzheimer′s disease)、皮克氏病(Pick′s disease)、路易体病(Lewy-body disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、扭转张力障碍、遗传感觉运动神经病(HMSN)、格斯特曼氏病(disease)、克雅氏病(Creutzfeld-Jakob-disease)、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)、弗里德赖希共济失调症(Friedreich ataxia)、非弗里德赖希共济失调症、妥瑞症候群(Gilles de la Tourette syndrome)、家族性震颤、橄榄体脑桥小脑变性、副肿瘤大脑症候群、遗传痉挛性截瘫、遗传眼神经病变(Leber)、色素性视网膜炎、施塔加特病(Stargardt disease)、和卡-赛症候群(Kearns-Sayre syndrome)。
与神经细胞死亡相关的神经和精神疾病的实例包括败血性休克、脑内出血、蛛膜下出血、多发性硬化痴呆、发炎疾病(诸如血管炎、多发性硬化症和格林-巴利-症候群(Guillain-Barre-syndrome))、神经外伤(诸如脊髓外伤和大脑外伤)、周边神经病、多发性神经病、癫痫、精神分裂症、忧郁症、代谢脑病、和中枢神经系统感染(病毒、细菌、真菌)。
因由本发明所分离的人类神经干细胞可于体外形成神经球、进行长时间的扩展和分化为星形胶质细胞、寡树突神经胶质细胞、和多巴胺激导性神经元，所述经分离的人类神经干细胞适于药物研发和神经毒性测试。
因此，本发明更关于一种体外筛选药物候选物的方法，其中所述方法包含使自本发明的方法获得的经分离的人类神经干细胞与一药物候选物接触；和测定所述细胞的一或多个细胞状态，如经测定的一或多个细胞状态与未接触所述药物候选物的细胞的相同状态相比更好，则表示所述药物候选物具有治疗神经状态的潜力。
此外，本发明可包含一种细胞毒性测试方法，所述方法于体外实施，并包含下列步骤：使自本发明的方法获得的经分离的人类神经干细胞与一药物候选物接触；和测定所述细胞的一或多个细胞状态，如经测定的一或多个细胞状态与未接触所述药物候选物的细胞的相同状态相比更差，则表示所述药物候选物可能具有细胞毒性。
根据本发明，所述经分离的人类神经干细胞可以神经球培养物或单层培养物的型态提供，且所述测试药物候选物可为有机或有机物、胜肽、聚肽或蛋白质；且所述测定的细胞状态可包含，但不限于神经球形成、细胞凋亡、增殖、分化、移行、和其任意的组合。
所述细胞状态可以本领域已知的任何方法来测定，以观察其细胞的表型和/或基因型的变化。举例而言，神经球形成、细胞凋亡、增殖、分化、和移行可使用相位差显微镜观察。也可使用比色法或基于免疫荧光的分析法。再者，例如基因表现、电活动 测量、和代谢组学(metabonomics)等技术亦可作为使用工具。举例而言，可使用量测一细胞标志的mRNA量来代表细胞发育和成熟的特定阶段。
根据本发明，“更好”乙词系指经与药物候选物接触的人类神经干细胞的细胞状态的程度(例如细胞计数、神经球直径和/或随时间测量的代谢活性)“高于”未与药物候选物接触的人类神经干细胞的细胞状态；“更差”乙词系指经与药物候选物接触的人类神经干细胞的细胞状态的程度(例如细胞计数、神经球直径和/或随时间测量的代谢活性)“低于”未与药物候选物接触的人类神经干细胞的细胞状态。于本发明的实施例中，“更好”乙词代表至少0.5倍高，优选为至少1倍高；而“更差”表示0.5倍以下；优选为至少1倍以下。
以下的非限制性的实例有助于本領域的技術人員实施本发明。所述实例不应视为过度地限制本发明。本領域的技術人員可在不背离本发明的精神或范畴的情况下对本文所讨论的实施例进行修改和变化，而仍属于本发明的范围。
实施例
材料与方法
样本收集
用于此研究的羊水样本系获得自台湾台北的国泰综合医院(Cathay General Hospital)和台湾桃园的长庚纪念医院(Chang Gung Memorial Hospital)。年龄为25至35岁，16周与20周的间妊娠的怀孕女性经历基于诊断目的而执行的羊水取样，并藉由超音波和筛选母体血清来诊断胎儿患有无脑NTD或未患有NTD。所有程序经国泰综合医院和长庚纪念医院的机构审查委员会(Institutional Review Board)批准，且所有参与者提供书面知情同意以参与此研究。
AF-NSC的培养
以1,000rpm离心各羊水样本5分钟，且在37℃下于5％CO2潮湿大气中使细胞集结粒再悬浮于T25烧瓶中的NeuroCultTM NS-A增殖培养基(StemCell Technologies，温哥华，BC，加拿大)中。3-5天后，可自NTD样本观察到一些附着的神经样细胞，接着藉由更换培养基来移除悬浮细胞和残渣。添加新调制的NeuroCultTM NS-A增殖培养基后，使附着的神经样细胞复制且聚拢以形成初级神经球。为了维持此等细胞，每2-3天添加1/5体积的额外培养基。将细胞培养(plating)3-4周后可观察到初始成熟神经球。此等细胞即为人类羊水衍生神经干细胞(AF-NSC)。
当神经球直径生长至50-100μm时，使此等细胞继代。首先，以800rpm离心细胞5min，且在37℃下用TrypLE(Life Technologies，盖瑟斯堡，MD，USA)处理3分钟。在移 除TrypLE溶液的离心步骤后，将细胞再悬浮于NeuroCult NS-A增殖培养基中，小心地混合(pipetting)获得单一细胞悬浮液并避免气泡形成。以0.5-1×104/cm2的密度接种AF-NSC且维持在如上文所描述的条件。神经球每10-14天继代，且AF-NSC在体外可扩展大于8个月。亦可冷冻保存神经球以用于后续实验。
为了确定最佳的接种密度，在T25培养盘中以1,000-20,000细胞/平方公分的密度分散AF-NSC，且以如先前所描述的条件培养。10天后，收集神经球且使其以胰蛋白酶处理。用血球计执行细胞计数，且计算每个继代的倍增时间。所描述的每一实验进行三重复。
在累积细胞数目测试中，在T25烧瓶中以5,000细胞/平方公分接种AF-NSC，且以如先前所描述的条件培养。细胞每10-14天继代，且将各继代执行细胞计数，计算细胞的增加倍数以和总细胞数目。
流式细胞仪
将AF-NSC以胰蛋白酶处理使其呈单一细胞形式后再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。于直接分析时，将经或未经透化处理(permeabilization)的细胞以CytofixTM(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)固定，且用以下抗人类抗体免疫标记所述细胞：CD73-藻红素(PE)、CD105-异硫氰酸荧光素(FITC)、CD117-PE、HLA-I-PE、HLA-DR-PE、Nanog-PE、Oct-4-FITC、Sox2-PE、ABCG2-PE(均来自BD Biosciences)、SSEA-1-PE、SSEA-3-FITC、SSEA-4-PE、TRA-1-60-PE、TRA-1-81-PE、巢蛋白-FITC(均来自R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)或CD133-PE(Merck Millipore，Billerica，MA，USA)。于间接分析时，将所述细胞固定、用Perm缓冲液II(BD Biosciences)透化处理、阻断、用Musashi-1(R&D Systems)免疫标记细胞、和用Alexa Fluor 488染料(Life technologies)染色。使用FACSCantoII流式细胞仪(BD Biosciences)处理所有样本，且于每个样本收集至少30,000个细胞资料。使用FACSDiva 6.0(BD Biosciences)和FCSExpress V3.00(De Novo Software，Thornhill，Canada)执行数据采集和分析。
免疫细胞化学
用4％多聚甲醛(Merck Millipore)固定细胞，且用0.1％Triton X-100(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)进行细胞膜穿透。用10％特异性正常血清在PBS中阻断30min后，用以下适当初级抗体培育所述细胞1小时：Tuj-1(Sigma)、巢蛋白、Sox2、微管相关蛋白2(MAP2)、神经微丝重链(NFH)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、人类神经元特异性核蛋白(hNeuN)、酪胺酸羟化酶(TH)(均来自Merck Millipore)、Musashi-1、O4或芳族L-胺基酸去羧酶(AADC)(均来自R&D system)。洗涤两次后，在室温下随后用经Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 546共轭的二级抗体(Life Technologies)与所述细胞培育1小时。在共轭焦显微镜(TCS-SP5-X AOBS，Leica，Solms，Germany)或荧光显微镜(Axio Observer.Z1，Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)下观测所得免疫反应性细胞。
端粒酶活性分析
使用市售可得的TRAPeze RT套组(Millipore)，藉由端粒重复扩增(TRAP)量测端粒酶活性。在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上分离扩增TRAP反应产物且观察TRAP梯级分布。
定量聚合酶链反应(qPCR)
用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)萃取总RNA，且根据制造商提供的方法，使用M-MuLV逆转录酶(Thermo Scientific，San Jose，CA，USA)和寡聚-dT引物，合成第一股cDNA。藉由SYBR Green PCR主混合物(Thermo Scientific)，使用ABIPrism 7700序列侦测系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)执行qPCR。β-肌动蛋白的相对表现量用作内部对照以使各样本中的基因表现标准化。根据△△Ct方法测量标记基因的相对定量。用于此研究的引物对列举于表1。
表1.用于此研究的寡核苷酸引物.
AF-NSC分化
使AF-NSC衍生神经球(继代#10-12)经胰蛋白酶处理，且培养于涂布100μg/ml聚-L-离胺酸(Sigma-Aldrich)和10μg/ml层黏连蛋白(Sigma-Aldrich)的培养皿上，以5×104细胞/平方公分的密度将其接种于NeuroCultTM NS-A增殖培养基中。细胞附着至培养皿底部后，根据制造商提供的方法，藉由添加NeuroCultTM NS-A分化培养基(StemCell Technologies)来诱发神经分化。诱发后，用4％多聚甲醛固定分化细胞以用于免疫细胞化学，或收集以用于mRNA萃取和后续的qPCR。为了诱导特异性细胞类型的分化，在NS-A增殖培养基存在下，将AF-NSC以5×104细胞/平方公分的密度接种于涂布有100μg/ml聚-L-离胺酸的平盘上。附着后，根据先前公开的方法[27]，将培养基改成特异性诱发培养基来产生星形胶质细胞、寡树突神经胶质细胞和多巴胺激导性神经元。
局部缺血和AF-NSC移植
所有史泊格多利大白鼠(Sprague-Dawley rat)(8周龄，250-300g)系获自Lasco(宜兰，台湾)，且将其圈养于中兴大学(National Chung Hsing University)的动物机构中。所有实验程序均以动物福利出发点设计且经中兴大学的实验动物照护和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。使大鼠(n＝12)的大脑右半球接受1.5小时长时间的中大脑动脉闭塞(MCAO)后缝合[28]。手术后第一天，在AP:-0.4R:3.4DV:5的位置将1×106AF-NSC(继代#10-12，10μL，1μL/min)移植入受损波纹体(n＝6)。手术后4周处死动物，且藉由灌注4％多聚甲醛来固定其大脑。
行为分析
将MCAO大鼠进行旋杆和握力分析。于MCAO前，旋杆测试中，当旋杆在300s内自4rpm加速至40rpm时，大鼠需仍可保持于圆柱上。于测试其握力时，大鼠需能以其前脚抓握拉杆，其握力藉由连接至所述拉杆的电子传感器来定量。在训练一周后，所有实验大鼠于二设备的表现需具有相近的结果始可纳入试验。MCAO处理后，移植AF-NSC与未移植的对照组，皆同时进行旋杆和握力测试，并分别记录各大鼠的三重复试验结果。
TTC染色和免疫组织化学染色
将MCAO大鼠大脑以冠向切割(sectioned coronally)成6个切片，随后在37℃下将其浸泡于2％2，3，5-氯化三苯四锉(TTC)中30分钟，接着再用福尔马林固定(formalin fixation)。梗塞区为浅色，而正常大脑组织则被染成红色。为与健康脑半球区比较，将中风脑半球的剩余部分中浅梗塞、空心液化和已变小的正常组织区域指定为萎缩区。用计算机影像分析系统(Image-Pro Plus，Media Cybernetics，Carlsbad，CA，USA)估算梗塞和萎缩区，且组织损伤的程度的计算为对侧健康半球的总面积的百分比。
于免疫组织化学分析中，使用蔗糖梯度使大脑脱水，并浸润于OCT(Sakura Fine Technical，Tokyo，Japan)，将大脑在-70℃下冷冻且以40μm厚度冰冻切片。于免疫染色中，将切片在含有0.1％Tween-20(PBST)的PBS中冲洗，用0.1％Triton X-100透化且用于PBS中的10％特异性正常血清阻断30min，随后将其与初级抗体(包括人类细胞核(Merck Millipore)和巢蛋白(Merck Millipore))培育隔夜。然后，将切片用PBST洗涤两次，且将其与经若丹明(rhodamine)或FITC共轭的适当二级抗体(Thermo Scientific)在室温下培育1小时。最后，使用荧光显微镜观察标记细胞的分布。
统计分析
实例中的所有结果均呈现为平均值±标准偏差(SD)。使用史都登氏t-测试(Student′s t-test)比较两个平均值的间的显著差异。若比较两个以上组，则使用单因子变异数分析的Scheffe′s post hoc测试评定显著差异。当p＜0.05时，认为结果为统计显著的。
实例1：自羊水分离NSC
为了自羊水分离NSC，藉由羊膜穿刺术收集正常(n＝7)和NTD(无脑症n＝6，非无脑症n＝6)衍生的羊水样本。当在NeuroCultTM NS-A增殖培养基中培养自此等样本中分离的细胞时，在前3-5天期间仅于的无脑症样本产生一些略微附着的神经样细胞和群落(图1A)。谨慎移除未附着的细胞和细胞残渣后，在3周后此神经样细胞可增殖且聚集并悬浮生长而形成的初级神经球(图1A)。继代后，将神经球经胰蛋白酶处理成单一细胞，且在各继代中，细胞可在悬浮液中增殖并再形成神经球(图1B)。神经球的直径范围为约50μm至100μm，且其在其外表面上具有典型的微突起(microspikes)(图1B)。此等AF-NSC可藉由连续继代扩展。重要的是，应注意AF-NSC仅可自诊断有无脑的NTD病患的羊水样本中建立并获得(表2)。AF-NSC细胞株可自6个无脑样本中的4个建立(成功率67％)，且所有4个细胞株皆具有正常核型(图6)。
表2.羊水样本的来源和结果.
神经球生长速率受接种的AF-NSC的密度影响。最佳的接种密度经测定为5,000-10,000细胞/平方公分(图1C)，当密度低于2,500细胞/平方公分时几乎零生长。当将细胞以10,000细胞/平方公分密度分布时，AF-NSC以109.4±14.8小时的速率倍增。
为了测试AF-NSC的长期增殖潜能，吾人将2个不同细胞株(以继代5起始)于体外生长几个月。两个细胞株皆能维持恒定生长达至少5个月(图1D)，且其中一个细胞株可繁殖超过8个月。此两个细胞株可增殖超过105-1010倍。
实例2：AF-NSC的表征
为了鉴定AF-NSC的表征，使用免疫细胞化学和流式细胞仪来侦测NSC特异性标志的表现。共轭焦显微镜显示AF-NSC衍生神经球的细胞质内会大量地表现巢蛋白与Musashi-1。Sox2(一种细胞核蛋白)亦可在神经球中观察到(图2A)。
流式细胞仪显示AF-NSC会表现巢蛋白、Sox2、Musashi-1、和ABCG2NSC特异性标志(图2B)。CD133首先以低量表现，但信号强度随着后续继代增加。吾人亦分析胚胎干(ES)细胞特异性标志的表现，且确定吾人的AF-NSC与ES细胞皆会表现类似的转录因子组，包括Nanog、Oct-4、和Sox2，和低量的SSEA-1；然而，其皆不表现SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和TRA-81。此外，AF-NSC中的人类白细胞抗原(HLA)的表现模式与大多数基质细胞类似，其表现HLA-I但不表现HLA-II。当与来自先前研究中所得的羊水的干细胞(AFSC，其表现CD73、CD105和部分表现CD117)相比时，吾人的AF-NSC不表现CD105和CD117，而仅会偶尔表现CD73。特别引起关注的是，吾人所侦测AF-NSC的所有标志，在其体外时间内(经由继代#20-22)皆维持其的表现模式。
吾人亦使用qPCR量测多个继代中此等标志的表现量，且发现巢蛋白、Sox2、Oct-4、Nanog、和hTERT均一致地在20个继代过程中表现(图2C)，此结果亦证实了吾人先前藉由流式细胞仪的观察结果。最后，评定吾人的AF-NSC的端粒酶活性，发现即使在增加继代数的长期培养物中，AF-NSC仍能维持端粒酶的活性程度(图2D)。
实例3：AF-NSC的体外神经分化
为了确定AF-NSC是否可分化成神经元，将细胞解离成单个细胞悬浮液，在NeuroCultTM分化培养基中培养且随后藉由免疫细胞化学分析。2天诱发后，AF-NSC开 始进行形态变化，且巢蛋白和Tuj-1在此阶段会在细胞内表现(图3A)。7天诱发后，可侦测到额外的神经元特异性标志，其包括巢蛋白、Tuj-1、MAP2、hNeuN和NFH(图3B)。吾人亦使用qPCR来测定此等神经元特异性基因的转录程度，并发现7天分化后Tuj-1和MAP2分别上调5.2倍和6.2倍。相反地，巢蛋白(NSC特异性基因)的表现在此相同期间则显著地降低(图3C)。
然后，吾人藉由将AF-NSC暴露于经定义分化培养基来使其诱发为星形胶质细胞、寡树突神经胶质细胞、和多巴胺激导性神经元。大多数(＞80％)AF-NSC可经诱发而变为GFAP阳性星形胶质细胞(图4A)，此可由诱发2周后GFAP的表现显著增加4,700倍来确定(图4B)。O4抗原的免疫染色可用来侦测寡树突神经胶质细胞(图4A)。与未分化AF-NSC相比，经定义培养基中的诱发引起寡树突神经胶质细胞特异性基因CNP、MBP、和O2的表现分别升高至2.15倍、4.97倍和1.9倍。另外，1个月后TH阳性细胞和AADC阳性细胞的存在表示AF-NSC可产生多巴胺激导性神经元(图4A)。此观察结果可藉由qPCR分析验证，确定对多巴胺激导性神经元所具有的特异性标志(包括AADC、Pax2、Lmx-1b、和Nurr-1)在分化后显著上升(图4B)。
实例4：将AF-NSC移植入缺血性中风大鼠中且诱导功能恢复
为了确定AF-NSC是否能在体内诱导中风的功能恢复，将1×106个细胞移植入已经MCAO处理的大鼠脑的缺血性边界区中。藉由旋转杆和握力测试评估，与健康对照组相较下，MCAO假注射(仅注射不含细胞的培养液)大鼠一致地显示较弱的运动效能。
在旋杆测试中，当与假注射的MCAO对照大鼠相比时，移植了AF-NSC的MCAO组显示复原了43±18％的时间，此表示AF-NSC的存在改善了缺血性中风大鼠中所观察到的运动缺陷。值得注意的是，AF-NSC在注射后的第一周期间即可使运动功能迅速恢复(85±26％)，且此改善可维持到移植后4周(98±18％；图5A)。
利用握力测试观察到类似的功能改善(图5B)。MCAO显著地降低大鼠的最大握力。在其接受AF-NSC移植一周后，此等缺血性中风大鼠的最大握力与假注射对照组的最大握力相当。然而，接受AF-NSC的大鼠可在移植3至4周后可恢复其正常握力，而假注射对照组仍较弱。
为了确定MCAO后的损伤程度，在AF-NSC移植4周后用TTC将经移植的大脑染色。移植后梗塞区的尺寸显著减小(假注射：22.17±1.12％；AF-NSC移植：0.62±0.15％)，而萎缩区域仍相同(假注射：7.21±0.48％；AF-NSC移植：5.26±0.57％；图5C)。随后，吾人使用免疫组织化学分析，藉由用针对巢蛋白的抗体和人类细胞核抗体对冷冻切片进行双重标记来确定移植后AF-NSC是否在大鼠脑中存活。结果显示，巢蛋白/人类核双重 阳性细胞紧密靠近注射区(图5D)，此显示移植的AF-NSC可存活且嵌入入宿主大脑细胞间。
讨论
在过去的二十年，已可自胎儿与成人CNS中分离出初级神经干细胞。最新研究建议，具有成为神经元的潜能的细胞亦可于羊水中发现[23，25，29]；然而，却尚未有自羊水分离且培养出人类神经干细胞的相关研究。Turner等人报导，NSC可自经历产前暴露于网膜酸(Retinoic acid)而导致NTD的史泊格多利大白鼠的羊水中分离且培养；然而，此等细胞并不存在于健康对照大鼠中[26]。此等AF衍生细胞展现典型的神经祖细胞形态且稳健地表现NSC特异性标志巢蛋白和Sox-2。先前研究亦已报导，当与仅患有露脑畸形或患有脊柱裂(spina bifida)与露脑畸形的彼等动物相比时，衍生自患有脊柱裂的大鼠羊水的神经干细胞的数目具有统计上显著增加[30]。在此研究中，吾人能够自已诊断罹患无脑症的人类胎儿的羊水中分离出AF-NSC(67％)，但未能自正常病患或自罹患非无脑症NTD的彼等病患分离出AF-NSC。此等结果显示罹患NTD的彼等胎儿羊水中，神经干细胞的比例较高。前神经管未能闭合时出现无脑，且导致颅顶和大脑半球完全或部分不存在，闭合不全使脑脊髓液朝外流入羊水中，而此发现目前亦已用于诊断NTD[30-32]，因此神经干细胞存在于羊水中可能由暴露神经组织和/或脑脊髓液渗漏入羊膜腔中所引起。
神经干细胞可自我更新分化成所有CNS细胞类型，且在体外无血清条件下通常会生长成神经球[33]。在吾人的研究中，吾人建立的所有4个AF-NSC细胞株皆可呈神经球形式并维持大于5个月，且在其表面上发育出典型的微突起结构。先前研究已表明，自人类胚胎分离的神经前驱物细胞具有降低的端粒酶活性，其在族群倍增20次后会降低至不可侦测的程度[34]。反的，吾人的AF-NSC可扩展几个月，且甚至在后续继代数下维持其端粒酶活性。虽然AF-NSC可维持其端粒酶活性，但其在体内不会形成畸胎瘤。自6-14.5周龄人类胎儿的各种CNS结构中分离出的典型人类NSC细胞，其在体外的倍增时间长(8-10天)[35]。相对而言，吾人的AF-NSC每4-5天即可分裂。由于NSC的生长会受额外细胞-细胞相互作用而影响细胞密度，因此神经球数目在较高细胞密度下比在较低细胞密度下为大[36，37]。吾人发现，当以较低密度(＜2,500细胞/平方公分)接种时，AF-NSC仍处于静止状态(＜1倍增/继代)，而其将在较高细胞密度培养物(5,000-10,000细胞/平方公分)条件下继续增殖。然而，当密度过高(≥20,000细胞/平方公分)时，细胞反而无法生长。
巢蛋白、Sox2、ABCG2、SSEA-1和Musashi-1先前已经建立为NSC特异性标志 [38，39]。吾人的AF-NSC在长期体外培养期间下可维持其此等标志的表现。CD133为可用于分离造血干细胞和神经干细胞的细胞表面标志[40]。在此研究中，在其培养时间，CD133在AF-NSC中的表现增加。羊水已被认定为分离胎儿多潜能干细胞(AFSC)的理想来源[24，41]。AFSC与间质干细胞共享一些标志，诸如CD73、CD105和CD117，且与多能性干细胞共享一些标志，诸如Oct-4、Nanog和Sox2等。然而，AF-NSC不表现CD105和CD117，其仅在表面上表现CD73。虽然AF-NSC确实会表现Nanog和Oct-4，但任何胚胎干细胞标志，包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81都不会在其上被染色。综合而言，此等结果显示AF-NSC不同于先前已鉴别出的AFSC。
NSC的另一特点为其能够分化成多种CNS细胞类型。吾人已证明，AF-NSC具有体外变为神经元、星形胶质细胞、寡树突神经胶质细胞、和多巴胺激导性神经元的潜能。在寡树突神经胶质细胞发育期间，O4在寡树突神经胶质细胞前驱物与成熟寡树突神经胶质细胞中表现，而CNP和MBP仅在成熟髓鞘化寡树突神经胶质细胞中表现[42]。AF-NSC可成功地在体外诱发成O4免疫反应性细胞；然而，此等细胞不以蛋白层次表现CNP或MBP(数据中未显示)，但可藉由多AF-NSC细胞株中的qPCR侦测出其mRNA的显著增加。此不一致性可反映AF-NSC需要进一步体外刺激以产生成熟寡树突神经胶质细胞。先前研究已证明，大脑衍生NSC可分化成神经元且提供缺血性中风大鼠行为改善的功能[43-44]。如同胎儿NSC，在大鼠中风模型中，未分化AF-NSC可有效地移植接近至损害区域。此外，AF-NSC可诱发因缺血导致握力和旋杆效能减少的恢复。另一个假设为，NSC移植可能系由于此等细胞可减弱发炎反应、增加抗凋亡活性或减小梗塞尺寸而诱发组织修复[43，45]。此处，吾人观察到注射AF-NSC后，缺血性大鼠大脑中所标记的梗塞尺寸减小。综上所述，上述结果显示AF-NSC不仅具有体外分化的潜能，且亦具有对缺血性大鼠的神经保护作用。
将人类NSC用于细胞疗法中的主要障碍通常为可获得来源的限制、复杂的分离方法和耗时的扩展。在此研究中，吾人已证明，衍生自患有NTD的病患的AF-NSC可有效率地于体外分离和增殖，且展现与其他NSC来源类似的生理特征。使用高分辨率超音波检查和羊水穿刺术侦测怀孕期间的NTD将允许人类AF-NSC的有效收集。因此，人类AF-NSC库可为临床和临床前测试的目的而建立。
结论
总结而言，自罹患NTD胎儿的AF-NSC与其他来源的人类NSC具有共同的特征，包含形成神经球的能力、表现干细胞特异标志、经历长时间增殖的能力、于体外分化的 潜力、和在中风大鼠模式中具有医疗效果。因此此新颖人类NSC来源于未来移植和治疗研究中具有显著的影响。
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